JP2002522748A - サンプル中の標的の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
置、システム、方法ならびにキットに関する。
出は医学、産業および防衛などの分野においては日常的な手順となっている。医
学においては、血液サンプル、尿サンプルなどである、患者から得られるサンプ
ル中の臨床上また生物化学的に重要な分析物をモニターするために、検出は日常
的に実施されている。
ムノアッセイ法などの周知の免疫検定技術を用いることにより実施される。
者における微生物感染の検出、汚染を検出するための食物または環境上のサンプ
ルの分析、変異によって引き起こされる遺伝的疾患の検出などを含むさまざまな
適用法がある。多数の異なる核酸配列の同時検出、すなわち、さまざまな生物体
の完全なゲノムの配列決定がゲノム計画において、とくにヒトゲノム計画で重要
になってきている。こうした配列決定は典型的には、多数の、短くて、部分的に
重複している核酸配列の検出を含み、そしてそれにもとづいて全遺伝子地図が構
築される。「ハイブリダイゼーションによる配列決定」(SBH)と呼称される
こうした技術には、長いDNA分子を加水分解してより小さな断片にすることと
、そののちの短いプローブの配置(array)によるハイブリダイゼーションが含
まれる。もう1つの適用には、遺伝子発現および診断のための、多数の異なった
核酸配列の同時検出が含まれる。
列により特異的なハイブリダイゼーションが可能な標識プローブによって検出す
ることができる。しかし、プローブによる直接的な検出は現在の技術では、標的
DNAまたはRNAが比較的高い濃度のものに限定されている。この問題を克服
するために、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、LCR(リガーゼ連鎖反応)
法および3SR(自己維持配列複製(self-sustained sequence replication))
法を含めた、核酸配列を増幅するための方法が開発された。増幅方法はすべて、
かなりの時間と労力とを費やし、増幅酵素の活性および複雑な実験装置に対する
特定の条件が必要となる。
発する試みがなされてきた。センサは一般的には、分析物との相互作用の結果と
して、物理的、電気的または光学的特性における変化を検出する。
ける変化にもとづき、抗体の振動子への結合として、サンプル中の抗体を検出す
る1つのシステムを開示している。米国特許第4,822,566号明細書は、
被検物の生物化学的宿主系に対する生物特異的結合がセンサの誘電特性を改変す
ることによって、流動媒体における被検物の存在を検出し、および/または分析
物の濃度を測定するための1つの装置を開示している。
相補的配列に結合する、サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列の検出のための
ボルタンメトリーセンサを開示している。電極の電気的反応における変化が、サ
ンプル中の標的配列の存在を示し、さらに固定されたヘテロ二本鎖をボルタンメ
トリー的に検出するための手段が含まれる。
含む、サンプル中の特定核酸配列検出のための装置を開示している。その膜は、
イオンチャンネルおよびイオノフォアの組込みに適している電極/イオン溜め/
絶縁二層の組み合わせに集約される、修飾された脂質分子から構成される。こう
した膜のコンダクタンスは、分析物が存在するか、または存在しないかによる。
特定の核酸配列が存在する場合は、その後に測定される膜のインピーダンスが変
化する。
用することにより、結合の発生または特定物質間の複合体形成反応を検出し、ま
たその後にその回路の電気的な状態における変化を測定するための方法を開示し
ている。この方法によると、抗原などの生物遺伝的物質が、非導電性基板上に被
せられ、その基板上に重ねて載せられている一対の電極の間に置かれる。抗原と
特異的に結合する抗体などのほかの生物遺伝的物質は、導電性粒子に結合するよ
うに、事前に処理される。それらに結合する抗体を有する粒子は、そののちに非
導電性基板上に置かれる抗原層に添加される。導電性粒子は、それによって、ま
た抗原と抗体の間の結合により、その基板に結合し、したがって、その回路を改
変する電気的に導電性のある粒子の集合体を形成する。その粒子はそののちに前
記粒子にだけ本質的に結合する導電性物質により選択的に被覆することができ、
また2つの電極により形成される電気的回路およびそれらのあいだに形成される
凝集塊の導電性を向上させるため、電極間の経路のそのほかのものとは結合しな
い。
の意味は以下の通りである。
酸、タンパク質、脂質、抗体、ホルモンなど)、いくつかの生物学的分子の複合
体、細菌、ウイルス、細胞(多細胞または単細胞生物体の)、細胞オルガネラ(
核、ヌクレオザイム、ミトコンドリア)である。
くとも1つは生物学的実体であって、互いに特異的に結合(以下を参照)するこ
とができるグループ。親和性グループの例は、核酸配列の2本の相補鎖;抗体−
抗原、リガンド−受容体;酵素−基質、糖タンパク質−レクチン、細菌とその抗
体;DNA−DNA結合タンパク質などである。非生物学的実体を含有する親和
性グループの一例は、抗体とその特異的非生物学的ハプテンである。
用(イオン性、ファンデルワールス性、水素性、疎水性など)であって、たとえ
ば、核酸配列とその特異的相補配列間の相互作用、1つの抗体とその抗原の間の
相互作用である。
体であり得る標的は、認識部分(以下を参照)であるほかのメンバーとともに親
和グループの1つのメンバーである。標的はサンプルの中に元々存在している非
修飾被検物であり得、または標的は、その認識部分に対するその結合親和性を改
善するために修飾された、および/または核生成−中心形成実体(以下を参照)
もしくは、核生成−中心形成実体(以下を参照)がその後に結合し得る1つのグ
ループのそれらとの結合により修飾されたかのいずれかの、そういった被検物で
ある。
て、1つの親和性グループの2つのメンバーである。認識部分はサンプル中にあ
る標的の検出の用途で使用される。認識部分は電極(以下を参照)、または2つ
の電極間に置かれている基板に付着(以下を参照)させることができる。
共通の特性を示す実体のグループに結合することを意味する半特異的結合であっ
て、たとえば、特定電荷を有する分子に対する結合、一般的にmRNAに対する
結合、抗体の1つのクラスに対する結合、たとえばすべてのヒトIgG抗体に対
する結合など)で、標的に結合することができる部分のいずれかに集合的に用い
られる用語である。
または電極間の基板)との間の相互作用であって、それによって前記部分が前記
基板上で固定されるようになる。その相互作用は共有または非共有結合によるも
のであってよい。
導電性架橋は、少なくとも1つの電極上、または両電極の間にある基板上に存在
する認識部分が、認識部分と標的との間で複合体を形成するために標的に結合す
る場合にのみ、電極間で形成することができる。認識部分と標的との複合体は、
その複合体に結合される核生成−中心形成実体(以下を参照)とともに、導電性
架橋を産み出すために電極間にある導電性物質の増殖に対する基盤として役に立
つ。代替的には、複合体は、重合に際して、導電性ポリマーを形成する重合可能
な単量体の結合に対する1つの基盤として役立たち得る。1つの導電性架橋は、
本明細書においては、「ワイヤ」と呼称されることもときとしてある。
性物質の増殖に関する触媒として役に立つ実体である。核生成−中心形成実体は
、たとえば、標的に事前に付着させたグループに特異的または非特異的に結合す
ることを可能にする部分を有することにより、検定セット上の標的−認識部分複
合体に特異的に結合する。核生成−中心形成実体はまた、標的が検定セット上の
認識部分と複合化される前にその標的に付着させることができる。核生成−中心
形成実体の実施例は、金コロイド、ほかの金属コロイド、または金もしくは他の
金属原子含有種、あるいは共役ポリマー形成前駆体である。核生成−中心形成実
体は、たとえば、ビオチングループを有する標的実体に結合することができるス
トレプトアビジンに、またはあるいは、抗二本鎖DNA抗体に付着することがで
きる。
しは導電性材料により被覆されてよい導電性基板であり、認識ないしは結合部分
を外的電子ないしは電気的構成要素ないしは回路に結び付けるのに役立ち、した
がって、外的構成要素または回路との入力/出力(I/O)インターフェイスと
して役立つ。
素−両電極に対して電気的に外部に位置している、電子もしくは電気回路、また
は電子もしくは電気構成要素であって、典型的には、標準的な固体状態の微小電
子構成要素を含む、先行技術の電気もしくは電子構成要素からなる。
用し、したがって電極または基板に認識部分を付着させることに役立つ媒介物(
agent)(分子、分子の複合体、超分子構造、巨大分子、集合体、コロイド粒子、
分子クラスターなど)である。リンカーは、一方では、電極もしくは基板への、
また他方では、認識部分への共有または非共有固定(たとえば、複合化もしくは
吸着など)のための化学的基を有してもよい。リンカーの実例は、核酸結合タン
パク質、特異的核酸配列に結合する能力を有する合成分子、たとえば、電極に結
合することを可能にするために「付着末端」を有し、またその他方末端で修飾さ
れている短い、一本鎖、もしくは多量鎖の核酸配列(たとえば、オリゴヌクレオ
チド)、被覆アルキルシランのような非生物学的分子などである。
medium)である。典型的には血液、尿、ミルク、食物懸濁液などの生物学的源か
ら得られる液体である。
の両方に対して集合的に用いられる用語である。
発明は、物理的に互いに離れている1つまたはそれ以上の電極のセットからなる
検定装置からなるシステムを活用している。各電極セットは、そのセットのうち
の少なくとも1つの電極上か、または電極間の基板上か、または両電極上かのい
ずれかに固定されている認識部分とともに、検定セット(本明細書中、以下、「
検出部位」とも機会があるごとに呼称される)を形成する。システムはさらに、
セットの少なくとも2つの電極間にある導電性架橋の形成を決定することができ
る外部回路(電気ないしは電子モジュール)からなる。導電性架橋の形成は、本
明細書中、以下で説明されるように、認識部分と標的との間に複合体が形成され
る場合のみ、電極間の導電性物質を増殖するための試薬の存在下で起こる。電極
間の電流、コンダクタンスまたは抵抗の測定により前記導電性架橋の形成が示さ
れ、その形成はまたサンプル中の標的の存在に依存する。言い換えれば、サンプ
ル中の標的の存在下で、電気的に導電性のある架橋が電極間で作り出され、つい
で電気または電子回路を利用する電気的測定を行なうことにより検出される。最
低限、本発明のシステムを利用する検出測定法により、サンプル中の標的の存在
に関する定性的結果、すなわち、「はい」または「いいえ」の答えが出される。
ほかのケースでは、電位/電流の関係を、本明細書中、以下で詳細に説明される
ように、サンプル中の標的の濃度に関するゲージとして、役立たせることができ
る。
る複合体上に結合されるかまたは置かれるかのいずれかである核生成−中心形成
実体上の導電性物質を増殖させることにより形成される。
検定するためのシステムであって、 (a)1つまたはそれ以上の検定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有する検定装置であり、各検定セットは、少なくとも
2つの電極ならびに、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に、および/
または少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定されている認識部分か
らなり、該認識部分は標的の1つに特異的に結合する能力を有する検定装置、 (b)各検定セットの少なくとも2つの電極間の電気的コンダクタンスを測定す
るための電気または電子モジュール、および (c)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上に置かれるまたは結
合される核生成−中心形成実体から導電性物質を増殖させるための薬剤であって
、該物質が1組のセットの少なくとも2つの電極間に導電性架橋を形成する薬剤
からなるシステムを提供する。
子のコロイドだけでなくそのような金属のクラスターおよび複合体である。
物は、核生成−中心形成実体がその形成後、複合体に結合することを可能にする
ことか、あるいは、サンプルを、標的への核生成−中心形成実体の付着を可能に
る装置に接触させる前に、該核生成−中心形成実体と反応させることのいずれか
により達成され得る。一実施態様によれば、核生成−中心形成実体は直接複合体
または標的に結合する。あるいは、核生成−中心形成実体は標的または複合体上
の特異的な部分を認識する試薬に結合される。たとえば、核生成−中心形成実体
はアビジンに結合され、また標識は、そののちもう一方にそれが結合できるよう
にビオチン実体からなる。このようなビオチン実体は、サンプルと適当な試薬と
の反応の前ステップによって被検物に結合されてもよい。前期ビオチン−アビジ
ンの例では、核生成中心はサンプル中でフリーの標的に、または複合体に添加さ
れてもよい。標的および認識部分の両方が一本鎖核酸配列である場合に適用可能
なもう1つの例は、二本鎖核酸配列に対する抗体に付着された核生成−中心形成
実体である。このような場合には、核生成−中心形成実体が、標識と認識部分と
の間に形成される複合体に付着される。
その場合、本発明は、サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を検定するシステ
ムであって、 (a)1つまたはそれ以上の検定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有する検定装置であり、各検定セットは、少なくとも
2つの電極ならびに、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に、または少
なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定されている認識部分からなり、
該認識部分は標的の1つに特異的に結合する能力を有する検定装置、 (b)各検定セットの少なくとも2つの電極間の電気的コンダクタンスを測定す
るための電気または電子モジュール、および (c)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上に結合することがで
きる導電性ポリマーのモノマーからなる薬剤であり、それによってモノマーの重
合化の際に1組のセットの少なくとも2つの電極間に導電性架橋が形成される薬
剤 からなるシステムを提供する。
つの実施態様では、ポリマーはドーピングのステップによって導電性になる(ポ
リマーを導電性にするためのドーピングのやり方は当業者に周知である)。
で、ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン複合体を、この複合体が、標的と認
識部分との間の複合体からなる検出検定にのみ結合するように、ハイブリダイゼ
ーション後に添加する。そののち、アニリンおよびペルオキサイド源が、ペルオ
キシダーゼが存在する場所でのみ重合化ができるように添加され、そして、最終
的に、導電性を付与するためのポリマーのドーピングによって処理が完了される
。
、または認識部分と標的との間の複合体のいずれかに結合され得る核生成−中心
形成実体を利用して成長され得る。
、標的配列の少なくとも一部に相補的な核酸を有するオリゴヌクレオチドであっ
てもよい。
形態でよい。
でもよい。標的がタンパク質の場合、認識部分は抗体、または完全な抗体のタン
パク質結合特性を保持したままの抗体断片のようなタンパク質結合物質でよい。
検定装置はその場合、抗体チップの形態でよい。
極間に物理的接続を形成しなくても、2つの電極間の完全な導電性架橋の形成を
可能にする(核生成−中心形成実体およびそこでの導電性基質の層の成長か、ま
たは2つの電極間での導電性ポリマーの形成のいずれかを利用して)。たとえば
、もし、認識部分が1組のセットの2つの電極間に存在する基板に固定されてい
る場合、標的(核生成−中心形成実体を有する)と認識部分との間に形成される
複合体は2つの電極間は物理的には接続されない。核生成−中心形成実体は導電
性基質が増殖する核として役立つと考えられ、最終的には、2つの電極間は電極
間の導電性架橋の形成によって接続される。したがって、本発明のシステムは、
高感度で、1組の検定セットの電極間または電極上に形成される標的と認識部分
との間の複合体がほどんどない、または1つだけある場合にさえ、導電性架橋の
形成が可能である。
分に荷電標的を向ける(directing)ための電場を作り出すのに使用されてもよ
い。したがって、本発明の一実施態様によれば、電気または電子回路が測定電極
と同じかまたは測定電極とは異なった電極かのいずれかにより、こうした電場を
作り出すために適応される。電場はまた、検定セットの電極の間に架橋を形成す
るステップにおいて助けとなり得る。
方法は、本発明のシステムの第1局面の概念にもとづいてもよく、導電性層は、
認識部分と標的の間の複合体に置かれるかまたは結合される、核生成−中心形成
実体上に形成される。したがって、本発明は、サンプル中の1つまたはそれ以上
の標的を検定するための方法であって、 (a)1つまたはそれ以上の測定セットを有し、測定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有している測定装置と、少なくとも2つの電極と、少
なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に対して、または少なくとも2つの電
極間の基板上のいずれかに固定される認識部分とからなる各測定セットと、標的
のうちの1つに特異的に結合する能力を有する認識部分と、を提供するステップ
と、 (b)特異的な認識部分への標的の結合を可能にする条件下で前記サンプルと前
記測定装置とを接触させるステップ、 (c)標的と認識部分との間に形成される複合体上に核生成−中心形成実体を形
成するために第1の試薬溶液と前記装置とを接触させるステップ、 (d)前記少なくとも2つの電極の間に導電性架橋を産み出すのに十分な時間の
間、前記核生成中心から導電性金属物質を増やすために第2の試薬溶液と前記装
置を接触させるステップ、 (e)前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定する電気または電子
モジュールに対して前記少なくとも2つの電極を接触させるステップ、および (f)閾値コンダクタンスを超えるコンダクタンスは、サンプル中のそれぞれの
標的の存在を示す、前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定するス
テップ からなる方法を提供する。
、または遊離標的上に析出されてもよい。そして、その場合本発明はサンプル中
の1つまたはそれ以上の標的を検定する方法であって、 (a)サンプル標的を、該標的に核生成−中心形成実体を結合させるために、第
1の試薬溶液と反応させるステップ、 (b)1つまたはそれ以上の測定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有している検定装置であり、各検定セットは少なくと
も2つの電極と、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に対して、または
少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定される認識部分とからなり、
該認識部分が標的のうちの1つに特異的に結合する能力を有する装置を提供する
ステップ、 (c)特異的な認識部分への標的の結合を可能にする条件下で前記サンプルと前
記測定装置とを接触させるステップ、 (d)前記少なくとも2つの電極の間に導電性架橋を産み出すのに十分な時間の
間、前記核生成−中心形成実体から導電性金属物質を増やすために第2の試薬溶
液と前記装置を接触させるステップ、 (e)前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定する電気または電子
モジュールに対して前記少なくとも2つの電極を接触させるステップ、および (f)閾値コンダクタンスを超えるコンダクタンスは、サンプル中のそれぞれの
標的の存在を示す、前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定するス
テップ からなる方法を提供する。
電性架橋は導電性ポリマーで構成される。したがって、本発明はサンプル中の1
つまたはそれ以上の標的を検定する方法であって、 (a)1つまたはそれ以上の測定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有している検定装置であり、各検定セットは少なくと
も2つの電極と、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に対して、または
少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定される認識部分とからなり、
該認識部分が標的のうちの1つに特異的に結合する能力を有する装置を提供する
ステップ、 (b)特異的な認識部分への標的の結合を可能にする条件下で前記サンプルと前
記測定装置とを接触させるステップ、 (c)前記装置に、前記モノマーが標的と認識部分との間に形成される複合体に
結合するように導電性ポリマーのモノマーからなる第1の試薬溶液を接触させる
ステップ、 (d)前記モノマーが導電性ポリマーを形成するために重合するように前記装置
を処理し、それにより少なくとも1つの検定セットの少なくとも2つの電極の間
に導電性架橋を形成するステップ、および (e)閾値コンダクタンスを超えるコンダクタンスは、サンプル中のそれぞれの
標的の存在を示す、前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定するス
テップ からなる方法を提供する。
ための核生成中心を形成できる実体を含有する第2溶液と反応させ、それによっ
て該実体が、サンプル中に前記標的が存在する場合に該標的に結合するステップ
を有していてもよい。
するための核生成中心を形成できる実体を含有する第2試薬溶液を接触させ、そ
れにより該実体が、前記認識部分に結合された場合は、前記標的に結合するステ
ップ を有していてもよい。
中心形成実体は、標的もしくは複合体に直接付着されてもよく、または、たとえ
ば、ビオチン−アビジン抗体、そのほかなどの部分の使用によって間接的に標的
もしくは複合体に付着されてもよい。
説明されるように、濃度を測定するのに使用することができる。さらに、複数の
検出部位が使用されてもよく、そこでは導電性部位の割合が、本明細書中で以下
に説明されているように、濃度を示すものである。
されている定量的な測定に対してだけではなく、架橋の形態において歪曲するた
めの(「はい」または「いいえ」の答えに到達するための)定性的測定の両方に
対して集合的に呼称されていると理解すべきである。
またはそれ以上の検定セットからなる。一実施態様によれば、各検定セットの少
なくとも1つの電極、好ましくは2つの電極は、その上に固定された認識部分を
有している。各検定セットのほかの電極は、その上に固定された結合部分(すな
わち、半特異的ないしは非特異的なやり方で標的に結合することができる部分)
、またはそれに標的が非特異的に結合することを可能にしている表面特性を有し
ている結合部分を有している。認識部分は、検定セットの少なくとも2つの電極
上に固定されている場合は、これらの認識単位は同じでもよく異なっていてもよ
い(同じ標的には結合するが)。たとえば、ある認識部分は、標的の1つのエピ
トープに特異的に結合することができ、またほかの認識部分が別のエピトープに
特異的に結合することができると考えられる。1つの特異的な例は核酸配列の場
合であって、そこでは、ある認識部分は、標的核酸配列の一部のそれに相補的で
ある1つの配列からなり、またほかの認識部分は、標的核酸配列の別の部分に相
補的である1つの配列からなる。
に固定される。
気的装置に関する。該装置は、 N1導体の第1群とN2導体の第2群からなり、それらの間にN1×N2接続部を定
義している構成回路と、2つの電極からなる電子モジュールにより形成され、各
1つは導体の1つの構成部分として連結または定義され、また導体の第1群から
導体の第2群への方向にのみ電子モジュールを通じて電流が流れることを可能に
するダイオードもしくは非線形構成要素からなるこうした各接続部であって、そ
れによって第1群の1つの導体と第2群の1つの導体の間を流れる電流がそれら
の間の単一接続点を定義しているが、その接続部と、検定セットの一部を形成し
ている各一対の電極と、電極の少なくとも1つかまたはその電極間に配置される
非導電性物質かのいずれかに結合される認識部分を有する各検定セットと、から
なる。
の異なった複数の標的を測定するため、サンプル中の単一の標的の濃度を測定す
るため、またはサンプル中の異なった複数の標的の濃度を測定するために使用し
てもよい。
めに使用されることがあり、したがって、本明細書で以下に説明されているよう
に、サンプル中で各標的が異なった濃度で存在する複数の標的を同時に検定する
際に、動態範囲(dynamic range)を拡張するために用いられてもよい。
多重化試験が可能である場合には、配置の形態になっている。本発明の電子装置
の長所は、各検定セットの中心から隣接する検定セットの中心の間の距離が10
0μM以下であるようなその小さな寸法であり、したがって、比較的小さな面積
の中に複数の検定セットの形成を可能にしている。
されてもよい。しかし、好ましくは、各検定セットの電極を、非導電性(すなわ
ち、絶縁性)層によってもう1つから分離されている基板の導電性層の開放端に
する。こうした装置は、前述のように非導電性層により分離されている導電性層
から構成される複数層基板から形成され、電極は、層に対して基本的に直角の方
向に、穴を開けるか、または基板の中に開口部を切って開けるか、または基板の
部分を切り取るかのいずれかにより形成される。認識部分は、導電性層の開放端
上に固定されるか、または導電性層の2つの開放端(電極)の間の非導電性層の
開放端に固定されてもよい。
ル中の標的の存在が示される。当業者には明らかであることであろうが、電気的
に小さなコンダクタンスが、したがって電極の間に電圧印加する場合には電流が
、制御条件下(たとえば、サンプルの標的がない測定条件と同じ条件下)でも検
定セットの電極間に存在することもある。このように、電流の存在を本明細書中
で論じる場合はいつも、制御条件下でよりも大きい電流であることを意味してい
ると理解すべきである。検定は、全部かもしくは無かというように(「はい」か
「いいえ」という答えを与えるため)標的の検出に限定される一方で、本発明の
いくつかの実施態様によると、検定はまた、サンプル中の標的の含有量の定量的
測定、たとえば、その量(分量または濃度)を測定する目的で行なうこともある
。
ての認識部分は、同じ標的に結合することが可能である。同じ標的に結合するこ
とができるすべての検定セットは、通常、1つの空間的に別々の領域において、
本発明の電子装置と一緒にグループ化されそれらがグループ化される領域を「ハ
イブリダイゼーション部位」と呼ぶ。ハイブリダイゼーション部位における各個
々の検定セットは本明細書中で以下「検出部位」と称される。単一のハイブリダ
イゼーション部位における電気を伝導する検出部位の割合は、サンプル中の標的
の分量または濃度に対する割合であることになる。
トのグループ、各グループ中のセットはすべて、同じ標的に結合するために認識
部分を有している)からなる場合には、そのシステムは複数の異なった標的に対
する同時に測定することができ、また、1つのハイブリダイゼーション部位にお
いて導電性である検出部位の割合を測定することにより、サンプル中の各標的の
量を同時に出すこともできる。
かの検定セット(すなわち、検出部位)は、標的がない場合であっても導電性で
あることもあるので、複数の検出部位が各ハイブリダイゼーション部位(1つの
標的の検出に適している)に対して有用であるという事実は、「シグナルに対す
るノイズの割合」を改善することを可能とする。その割合がある一定の閾値以上
である、検出部位の所定の割合が電流を伝導する場合のみ、これは、その後に、
正の結果(すなわち、サンプル中の標的が存在すること)を示すものとみなされ
るであろう。この閾値は、すべてのハイブリダイゼーション部位に対して同一で
ある必要はない。たとえば、サンプル中に豊富であると予測される標的を検定す
るためのハイブリダイゼーション部位については、閾値は、検出部位(検定セッ
ト)の導電性が50%に設定されることが考えられるが、一方、サンプル中に稀
少であると予測される別の標的については、その閾値は検出部位の導電性が15
%に設定されることが考えられる。したがって、本発明の電子装置の「動態範囲
」は非常に広範であると考えられる。
ダイゼーション部位すべてにより装置を形成することも可能である。たとえば、
ある部位は、認識部分の高分量により、または、サンプル中の標的の低濃度の存
在下であっても1つのシグナルを起こすであろう標的により高い親和性を有する
認識部分により形成されることがある。一方、ほかの部位は、認識部分の低分量
により、または標的により低い親和性を有する認識部分により形成されることが
考えられ、したがって、前者の部位に比較して、濃度範囲を超えて標識の定量的
な測定を可能にする。こうした装置であれば、標的の濃度は、数倍まで1つのサ
ンプルからほかのものまで、バラツキがあると考えられる数多くの異なったサン
プルを測定する用途の単一装置の使用を可能にする。
セットの場合、すべて同じ標的特異性を有し、すなわち、複数の検出部位を備え
た単一ハイブリダイゼーション部位を有してもよい(すなわち、すべての検出部
位の認識部分は同じ標識を結合する)。前記で指摘されているように、この場合
では、異なった検定セット(検出部位)における電極間の架橋の程度は、その後
に、サンプル中の標的の濃度に関する定量的な測定法として役立たせることが考
えられる。あるいは、装置は、異なった標的特異性を備えた認識部分を有するこ
とによってそれぞれが特徴付けられる2つまたはそれ以上のグループからなり、
対応する2つまたはそれ以上の異なった標的実体(たとえば、異なった核酸配列
)のパネルを検定するための多重化検定において装置は有用となる。
レオチド配列に対して特異的である。こうした電子装置は、さまざまな多重化診
断適用において有用であり得、すなわち、いくつかの標的の同時検出、異なった
検定セット(たとえば、無作為に調製される核酸配列であるが、それぞれ1つの
異なった検定セットにおける認識部分を形成する)における認識部分の1つにそ
れが結合すること(また、したがって架橋形成)によって特徴付けられる、未知
の標的の検出において有用である場合がある。1つの特定の実施例は、高度スル
ープット検定の場合であって、たとえば、1つの分子、たとえば別の分子に特異
的に結合するペプチド、たとえば受容体を見つけ出すという目的、未知のヌクレ
オチド鎖(たとえば、ゲノム配列)の配列決定のための検定、そのほかの目的が
あるこうした測定である。配列決定検定の場合、複数の異なった配列は、異なっ
た検定セットの電極に対するリンカーによって付着することができ、またその後
に特異的検定セット(そこでは特異的な核酸配列が認識部分として役に立ってい
る)において形成される架橋が特定の配列を同定する。
、細胞膜、そのほか多数を含むさまざまな広範な実体のいずれか1つであり得る
。細胞、細胞膜、ウイルス粒子、巨大分子複合体、そのほかなどの大きな実体の
場合は、大きな実体の全体または認識部分に結合するそのほんの一部を、標的と
してみなすことが可能である。たとえば、微生物の場合、微生物全体を標的とし
てみなしてもよく、または認識部分がその細胞の表面上にある特異的な抗原に結
合する場合には、ときとして、こうした抗原を標的としてみなすことができる。
本鎖配列、抗体、受容体、レクチン、糖、抗原、そのほかであり得る。認識部分
およびその標的はこのように、親和性グループのメンバーである。つまり、その
親和性グループの1つのメンバーは標的であり、そのグループのほかのメンバー
は、認識部分として役に立つ。
識部分に対して共有結合もしくは複合化することができる広範なさまざまな分子
から選択可能なリンカーを使用することによって、電極および/またはその電極
間に存在する非電極基板上に固定され得る例は、硫黄含有部分により金、銀、プ
ラチナ、そのほかなどの金属基板に関連してビームを放つことができるさまざま
な硫黄含有分子である。こうしたリンカーは、認識部分に共有結合されるか、ま
たはそれに対して複合化されることが考えられる。
測定することにより、または架橋により電流の通過を示すほかの測定を行なうこ
とにより、直接的に実施することができる。たとえば、架橋は導電性電流に加え
て、これは光も放射する様式で処理されてもよく、その場合には、架橋の電気的
な接続性は光の放射により測定してもよい。
図示説明される。理解されることであろうが、以下の説明は例示的なものであり
、添付の請求項に定義されているような本発明の範囲を制限するように解釈すべ
きものではない。
つの電極104および106を備えた単一検定セットから構成される本発明のシ
ステムの一部を形成する検定装置102を図示する図1である。電極104およ
び106上に固定されているのは、認識部分110および112である。(a)
には、電極104と106との間に電気的な接触はない。
が、2つの電極104および106の間に形成される。それに続くステップ(以
下を参照)により、導電性架橋が形成され、電流は、B方向の矢印118(b)
により表わされているように、モジュール108の2つの末端の間にあるその架
橋を通じて流すことができる。図1に示されている実施態様においては、検定セ
ットは2つの電極からなる。
こに固定されている3つの異なる認識部分130、132および134をそれぞ
れ有する3つの電極124、126および128からなる。これら3つの電極は
電気または電子制御モジュール136に接続される。各固定された認識部分13
0、132および134は標的138の異なる領域に結合することが可能である
。
(b1)、(b2)および(b3)の下に略図的に図示されている様式の1つで
異なる電極に結合することができる。導電性架橋を産み出すために引き続き行な
われるステップの後、電流は、矢印140、142および144により図示され
ているように、形成された導電性架橋を通じて流すことが可能である。形成され
た回路のうちの1つ、すなわち、モジュール136の末端146−148、14
6−150の間、または148−156の間のいずれかにおける電流の測定が、
標的上の情報を産生する。
配置を示す。図3Aに示されている検定セット160においては、電極162お
よび164のそれぞれは、そこに認識部分166および168をそれぞれ固定し
ている。たとえば、認識部分166、168は、標的核酸配列170における末
端配列に相補的なオリゴヌクレオチドであることが考えられる。
、前者のみが、そこに1つの認識部分175、たとえば、標的核酸分子178の
末端配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを固定している。標的核酸分子17
8は、認識部分175に特異的に結合しており、また電極176には非特異的に
、ないしは半特異的に結合する。
態様のなかでは異なる抗体である固定認識部分186および188を伴い2つの
電極182および184を有する検定セット180を図示する。
を有しており、そのそれぞれが、この特定の場合においては、短いオリゴヌクレ
オチド202である標的に対する認識部分を構成するその末端配列である、比較
的長いオリゴヌクレオチド198および200をそれぞれ、その電極に固定して
いる。
分216および218を有する2つの電極212および214から構成されてい
る。
セットの少なくとも1つの電極上に固定される。図4A〜4Cに図示されている
検定セット222と234と244の実施態様の場合に対しては、それぞれの電
極224と226、236と238、245と246上には固定されていない。
この場合はむしろ、検定セット222、235および244が電極以外の、それ
ぞれ基板228、240および247をそれぞれ有しており、そのそれぞれの認
識部分230、242’および242”ならびに248はそこに固定されている
。検定セット222の場合は、部材228上に固定されているのは、この特定の
実施態様において、標的232(この標的は核酸配列、ポリマー、ポリペプチド
などであると考えられる)のエピトープに結合する単一認識部分230である。
検定セット234の場合は、部材240が、標的核酸配列244の部分に対して
相補的である2つのオリゴヌクレオチド基板242’および242”をそこに固
定している。両方の場合において、認識部分に結合した後、検定セットの2つの
電極の間の導電性架橋が、非特異的または半特異的な結合もしくは連合により、
また典型的には標的上または標的と認識部分との間にある複合体に存在する核生
成中心由来の導電性層の増殖により形成される。検定セット244の場合は、オ
リゴヌクレオチド標的249が認識部分248に結合した後、それは、ほかの核
酸配列の合成に対する鋳型を提供し、また、この合成が最終的には、2つの電極
245および246の間の経路249Aを形成する。
図示説明されている実施態様は、各検定セットの中に2つより多くの電極の場合
にも適用されると容易に理解されることであろう。
方法の実施様式の略図である。検定セット250(a)は、経路252(b)を
形成するために標的251と接触させる。さまざまなステップ(本明細書中で以
下に説明されているように)の後、導電性架橋253が形成される(c)。
示す。検定セット256の電極258および259のそれぞれは、そこに、それ
ぞれ複数の認識部分260および261を固定している。標的264と接触後、
電極間の1つまたはそれ以上の経路が形成される。標的264(b1)が低濃度
の場合は、少数の経路がある任意の期間に(単一経路266により本出願では図
示されている)形成され、また高濃度の場合(b2)は、6つの経路268によ
り本出願では図示されている多数の経路が同じ期間内に形成された。導電性架橋
を産み出すために経路を処理するためのステップが実施された後、同じ期間の間
測定された抵抗は、低濃度に比較して高濃度の場合でより低くなることが明らか
となっている。電位/電流関係におけるこの差異は、したがって、サンプル中の
標的264の濃度の測定法(適切な校正の後)として役立つ。
部分を有している、複数の検定セット271を有する装置の略図である。単純な
検定装置270が、任意の一定期間標的272と接触された場合には、低濃度の
場合は、各検定セットの異なる電極間の経路はいくつかの検定セットでのみ形成
され、また一方、高濃度(b2)の場合は、多く(ときにはすべて)の架橋が形
成される。導電性架橋を産生するためのステップが実施された後、電流が検出さ
れる単位数を数え、サンプル中の標的272の濃度を示す。
グループが異なる標的を結合させるために設計される。このことは、サンプル中
のいくつかの標的実体の同時検出用の診断用検定を可能にする。図においては、
検定セットのそれぞれまたは検定セット282A〜282Dのグループが、固定
された認識部分283A〜283Dのそれぞれの異なる形状により図示説明され
ているように、異なる標的特異性を有している。検定装置280が、たとえば、
標的実体284Aおよび284Dからなるサンプルと接触される場合には、経路
は、それから導電性架橋に形成後、その後、サンプル中のそれぞれの各標的の存
在の指標として役立つ検定セット282Aおよび282Dにおいてのみ形成され
る。
それ自体が電極を有している。しかしながらときとして、2つないしはそれ以上
の検定セットが共通の電極を有することもある。ある意味では、図2の検定セッ
ト122は異なる検定セットを定義する各2つの電極を備えた3つの検定セット
として見ることができる。各2つの隣接した検定セットが1つの電極を分け合っ
ている一実施態様の図は、図9にみることができる。この図の(a)に図示され
ているように、検定装置289は、3つ、290AB、290BCおよび290
CDを見ることができる複数の検定セットを有する。この図でみられるのは、そ
れぞれ認識部分292A、292B、292Cおよび292Dをそこに固定して
いる4つの連続して隣接している電極、291A、291B、291Cおよび2
91Dである。各2つの隣接する電極、たとえば、検定セット290ABを規定
している電極291Aおよび291Bは検定セットのうちの1つを規定し、各2
つの隣接している検定セットが1つの共通電極を分かち合うことになる。すなわ
ち、検定セット290ABと290BCとが電極291Bを分かち合い、検定セ
ット290BCと290CDとが電極291Cを分かち合う。
プ294A、294B、294Cおよび294Dに結合する。したがって、検定
セット290ABは、エピトープ294Aおよび294Bを有する標的293A
Bに特異的であり、検定セット290BCはエピトープ294Bおよび294C
を有する標的293BCに特異的であり、また検定セット290CDは、エピト
ープ294Cおよび294Dを有する標的293CDに特異的である。その結果
、サンプルと接触するときに、架橋が、(b1)、(b2)、(b3)下に図示
説明されているように、サンプル中の標的のタイプによって、検定セットの中で
形成される。
10の検出のための検定装置および方法を図示している。検出は、そののちに最
終的に導電性架橋320を産生するように、典型的には金、プラチナ、銀などの
金属により被覆される、2つの電極300の間の経路312の形成により実施さ
れる。検定装置の形成に関しては、電極300がまず、分子302および304
のその後の結合を容易にするための様式で処理されることが考えられる。この目
的のため、電極をまず、それぞれが一本鎖オリゴヌクレオチドであり、認識部分
(それぞれ、「オリゴA」および「オリゴB」)として役立ち、電極に対して分
子302および304の付着のため、ジスルフィド基により誘導された、分子3
02、または304のいずれかを含有する溶液により別々に湿らせる。オリゴヌ
クレオチド302と304は、それぞれ標的DNA配列310の2つの末端配列
のうちの1つに相補的である。これらの認識部分が電極300上に置かれるとき
、適当な条件下であれば、ジスルフィド基が電極300に結合し、認識部分を形
成する。
本鎖ないしは二本鎖DNA配列310であるが、標的ヌクレオチド配列からなる
と思われるサンプルと接触させる。このサンプルは、血液サンプル、食物サンプ
ル、水サンプル、などであり得る。標的が二本鎖配列である場合には、サンプル
中の標的は二本鎖標的DNA310の末端で一本鎖付着末端を形成するように処 理されることが考えられる。これらの付着末端は認識部分306および308に おけるオリゴヌクレオチド配列に対して相補的である。電極300は、標的DN A310ならびに認識部分306および308を組み合わせた長さを超えない距 離でもう1つとは間隔が空けられる。電極を、標的DNA配列310からなるサ ンプルと接触させるときには、標的終末末端は、2つの電極300(ステップ( b))間の経路312を形成するように認識部分306および308におけるそ れらに相補的なオリゴヌクレオチド配列に接続される。標的が二本鎖である場合 は、ハイブリダイゼーション後、認識部分306および308を標的核酸配列3 10に結合することにより、共有結合を形成するように、DNA鎖の切れ目を結 合することにより強化されることがある。
標的310のハイブリダイゼーションに関する分散に頼ることは実際的ではない
ことがある。こうした場合には、標的310は、1つの電極に接続され、その後
に、第1電極から第2電極への液体の方向性をもった流れにより、または電場を
適用することにより、核酸架橋は、その末端が第2電極に達するように伸長され
る。
とするため、適当な溶液がときとしては必要になることがある。さらに、ハイブ
リダイゼーション後、水洗い(rinsing)がときとしては、結合されていない核
酸鎖を取り除くためには必要になることがある。
アルカリ性溶液に、核酸線維(nucleic acid fiber)を曝露させることを含むイ
オン交換ステップによって、電極間の導電性架橋の形成が始まる。銀イオンは、
核酸分子および負に荷電されている核酸配列を伴う複合体に通常関連しているナ
トリウムイオンまたはほかのイオンに取って代わる(ステップ(c))。(Ag + イオンは、さまざまなほかの方法で、とくに挿入により核酸分子に結合するよ
うに作成されることもあることに留意)。これらのステップは、銀イオン316
を負荷される核酸配列314を生じる。銀イオン以外にも、たとえば、コバルト
、銅、ニッケル、鉄、金、などを含め、広範なさまざまなほかのイオンもまた使
用できる。さらに、金属集合体、半導体粒子、複合体またはクラスター、たとえ
ば、コロイド金、コロイド銀、金クラスターなどもさまざまな異なる相互作用を
介して核酸配列上に析出されることがある。導電性オリゴマーおよびポリマーも
また、核酸架橋を導電性にするのに役立つと考えられる。
ンまたは電磁放射線に曝露させ、核生成部位318を形成する金属銀のなかにイ
ンサイチュで金属イオンを還元する。異なる実施態様では、金属核生成中心が、
配列特異的または非特異的な様式でDNA経路にコロイドもしくはクラスターの
宿主を付着させることにより形成されることが考えられる。金属イオンと還元剤
、たとえば、ヒドロキノンからなる試薬溶液を洗浄後、酸性条件下で添加される
。これらの条件下では、イオンは、核生成部位でのみ、金属に変換され、またそ
の後に核生成中心は成長し、また互いに溶け合って導電性機能化架橋320を形
成する(ステップ(e))。
されることになるが、それには、たとえば、架橋の厚さと均一性を増加させるこ
とを意図する熱処理、たとえば、アルカンチオールに曝すことにより、電気化学
的もしくは光学化学的なポリマーを使用したワイヤの被覆により、架橋の周囲に
電気的絶縁層を形成する目的の不動態化処理(passivation treatment)などが
含まれる。
つの例示的な電流−電圧関係を図示している。導体のタイプおよび機能化プロセ
スなどに依存して異なる電流−電圧関係が得られる。
ており、導電性架橋が、導電性ポリマーPPV(ポリ−p−フェニレンビニレン
)を析出することにより形成される。電極400は、図10に図示されている電
極300と同じである。検出方法の最初の2つのステップは(ステップ(a)お
よび(b))、図10において対応しているステップと同一である(同一構成要
素は、図10において対応している構成要素と最後の2桁の数字は同じ参照数字
を付与されている。たとえば、402は、302と同じ、404は304と同じ
、などである)。形成された経路412は、2つの電極を接続する経路414を
産生するために、経路410が認識部分406および408に共有結合すること
により、前記と同様に、強化され得る(ステップ(c))。
電により、前PPV416は負に荷電したDNA経路414と複合化される(ス テップ(d))。次のステップでは、テトラヒドロチオフェン基と塩酸とを各反 復ユニットから取り除くことにより、共役が誘導され、発光PPV架橋を産生す る(ステップ(e))。この構成要素は、光学的検出に適している。あるいは、 PPVは、電子欠損(穴)を引き起こすか、または、余分な電子を生じるかのい ずれかを引き起こす試薬をドープされ、そのようにして導電性ポリマーに変換さ れる。ドーピングは、たとえば、H2SO4蒸気に曝露するなどの数多くの公知の 方法により行なわれてもよい。ドーピングの程度がPPVワイヤの導電性を決定 する。
PPVに加えて使用されてもよい。これには、バックボーンに正荷電基を備えた
ポリマー、核酸線維に結合することができる認識基を備えたポリマー、またはD
NAと複合化するポリマーだけではなく、正荷電側鎖を備えたさまざまなポリマ
ーが含まれる。さらに、同様なやり方で、ミュータティス ミュータンディス(
mutatis mutandis)、ほかのタイプの導電性物質(n型またはp型)が線維に結
合されてもよい。
においては、図12のそれらに同一な構成要素が、最後の2桁の数字が同じ参照
数字により図示されている。図12に参照して説明されている認識プロセスによ
り形成されるヌクレオチド架橋514は、モノマーオリゴマー、またはポリマー
516を含有する溶液に曝露される。結果として、イオン交換またはほかの複合
化が起こり、物質516を負荷されたヌクレオチド架橋514が残る。ついで重
合化ステップが、抗体の使用による抗原の検出に関係している電極を接続する導
電性架橋517を形成するように、適用される。ドーピングプロセスは、機能化
された架橋を導電性にする。
て役に立つ遊離5’部位を有するオリゴヌクレオチドの合成(その3’側から開
始される)に使用される。オリゴヌクレオチドは、従来からのDNA合成装置を
使用して作製される(図16の図解を参照)。
、遊離チオールが得られる。
分は特定の配列を有するオリゴヌクレオチドに付着される。ビオチン−オリゴヌ
クレオチドは、片側にビオチン部分(図15も参照)と、またもう片側にチオー
ルまたはジスルフィド基を含有するもう1つの分子に、ストレプトアビジンを介
して結合される。
。認識部分として役に立っているDNA配列は、レプレッサーが結合する特定配
列をも含有して合成される。DNAは前記特定配列によりレプレッサーに結合さ
れる。
る)は、従来からのDNA合成装置を使用して実施され、チオリン酸塩含有ヌク
レオチドは標準的なヌクレオチドの代わりに使用される。
ur=プリン)を結合することが知られているRh(Phen)2Phiのよう
な合成部位特異的部分は、チオール基に共有結合される。
または任意の液体ディスペンサーにより、適当なリンカーの溶液に曝される。こ
うした液体ディスペンサーはコンピュータ制御されているマニュピレータ上に固
定されていてもよい。別々のタイプのリンカーが各電極上に析出することができ
る。さらに、別々のタイプのリンカーは、別々の電極上に連続的に析出すること
ができる。
を選択的に曝露させるのに使用される。こうした技術を利用することにより、高
度な精度、解像度を得て、また生産の速度を向上させ、大規模生産を容易にする
ことが可能である。
アプイニシオ(ab−initio)製造(最初から作成すること)に利用され
ている。たとえば、不活性基板上の電極の検定セットから構成される基板は、2
つのタイプの電極を産生するように不活性被膜により部分的に被覆される。すな
わち、被膜電極(A)と非被膜電極(B)である。基板は、認識部分として最終
的には役に立つであろう配列のDNA合成に対する1つのシードとして役に立つ
、核酸配列にリンクするチオールリンカーの溶液に曝される。不活性被膜のため
に、非被膜B電極のみがチオールに反応する。標準的なDNA合成技術を使用し
て、認識部分である事前に定義された配列が、B電極上で作り出される。基板は
その後に洗浄され、またマスクされた電極はB電極の選択的な被膜の後にその覆
いを外される。この手法により、そこに結合する認識部分のタイプにより、1つ
の電極がほかの電極と異なる、2つの電極のタイプの生産が可能になる。 同じ
技術でもいくつかの追加ステップを備えたもの(遮蔽および非遮蔽のいくつかの
ステップ)は、そこに結合する、異なる認識部分を備えた数多くの異なる電極を
有するさまざまな基板の製造を可能にする。
とが含まれる。不活性開始点基は、ヌクレオチドと反応することができない。遮
蔽および/または光導体および/またはいずれかのほかのアドレス可能な光源と
いう手段により選択的な照射を使用して、異なる選択電極の活性化は、選択電極
上DNA合成シード由来の保護基の光除去により達成される。
チド合成のために作製される。一旦、認識部分として役に立つDNA配列が、電
極の1組の検定セット上で完了されると、終結基(ブロッカー)がオリゴヌクレ
オチドに付着され、その不活性を確実なものにする。ほかの配列はさらに、前の
ステップにより作製されるが、しかしこのステップにより活性になっている、異
なる電極上で合成することができる。前のステップで構築されたリンカーの検定
セットは、その終点に付着されたブロッカーのために影響されることはないこと
に留意すべきである。
ドは、そこに付着されているリンカーおよび認識部分を有する導電性金属パッド
を形成するために、制御可能な方法で拡散される。調合は前記に概要された、異
なる技術により、または何らかの通常技術により達成することが可能である。電
極は導電性にすることが、最優先でまたはその作成の最後で導電性にするという
ことになる。
とが可能である。
着は、DNA結合タンパク質を使用して実施される。たとえば、その基板(たと
えば、プラスチック基板)とDNAとの両方に結合することができる細菌起源由
来のリプレッサー(lacリプレッサーまたはλリプレッサー)は、したがって
その2つは一緒になる。こうした結合は後に維持され、たとえば、2つの電極を
接続するときに、核酸線維とともに、架橋を導電性にする。あるいは、こうした
結合は、電気的機能性に組み込まれることなく、担体基板に対して導電性架橋を
安定化させるために単に役立つ可能性がある。
機ポリマー、または、機能化した架橋の製造もしくは機械的な固定、もしくは安
定化のための支えとして働くことができる何らかのほかの物質から構成される。
その基板は電気的な機能を提供できる。
I)水で洗浄し、その後に1N NaOH溶液のなかにさらに10分間浸し、そ
してDI水で洗浄する。洗浄されたガラスを、完全に乾燥し、ついで、テトラク
ロロエタン中アルキルトリクロロシラン(オクチルトリクロロシラン、トリメチ
ルトリクロロシランなど)(1:5v/v)の溶液のなかに約12時間浸す。ガ
ラス板をその後慎重にテトラクロロエタンおよびイソプロパノールで数回洗浄し
、その後に完全に乾燥する。
上での標準光、電子、またはX線リトグラフおよびその後の導電性基質(たとえ
ば、金属)の析出。あるいは、導電性物質がまず析出され、それから次にパター
ン化される。(ii)表面上に電極組立体(electrode assembly):つまりポリエ
チレンイミド、ポリアルコール、ポリ酸、ポリピリジンなどの高分子電解質、ま
たは、チオールモノマー(分子骨格上の反対部位にあるチオールとシラン部分と
を含む有機化合物から製造される)などのほかの結合薬剤を使用してガラス表面
のパターン化を行ない、その後に、基板上の導電性電極の組立てを可能にする金
コロイドなどの電気的に伝導性のある化合物の固定が行なわれる。
の形成 (i)2つの相補的核酸配列から作られる経路を、適当な金属イオンを含有す
る溶液に曝し、したがって、イオン交換がその溶液に曝された核酸骨格のリン酸
基で起こる。核酸内部にイオンを挿入することによっても、ある一定の条件下で
起こり得る。
還元するか、または電磁放射線に曝露することにより還元する。
り返すことが可能である。あるいは、導電性金属架橋の形成には、以下のステッ
プが含まれるが、それらを独立型のプロセスとして、またはステップ(i)およ
び(ii)を一緒に、または以下の技術の1つないしはそれ以上を組み合わせるこ
とも含まれる。
定混合液に曝す。還元は、ステップ(i)および(ii)により形成される金属ク
ラスターの表面でのみ起こる。したがって、金属クラスター間のギャップはその
金属析出プロセスにより架橋される。
化学的処理装置にかけ、核酸高分子電解質に負荷されるイオンを金属導体に転換
する。さらに、核酸分子に沿った電気化学的プロセスはそれに沿った金属ワイヤ
のベクトル的成長を促進する。
ば、DNAと静電気的に相互作用を行なっている高分子電解質の上にある特定の
部位に結合することが可能である、たとえば特定の配列、配列選択的構成要素を
使用して核酸架橋の上に吸着する。これらのクラスターおよび/またはコロイド
は、前記プロセス(iii)〜(v)に対する触媒として役に立つ。
ける欠損は、熱アニーリング処理、電着法などの種々の方法を使用してアニーリ
ングすることができる。
10.5、NH4OH、0.1M AgNO3)に曝する。DNA高分子電解質が
、銀イオンにより交換された後、基板を脱イオン水(DI)により慎重に洗浄し
、また乾燥する。
ン(0.05M、pH=5)の塩基性溶液に曝す。ステップ(i)および(ii)
は電気的に伝導性のあるワイヤが形成されるまで連続して繰り返される。
実施される。
が行なわれた後)を、DI水での最終洗浄後、ヒドロキノンの酸性溶液(クエン
酸緩衝液、pH=3.5、0.05Mヒドロキノン)および、AgNO3(0.
1M)に曝す。サイクル(iii)はワイヤ幅が所望の寸法に達するときに終結さ
れる。そのプロセスは、光感受性にすることができ、そして照明条件により制御
することもできる。
実施される。その目的のために、(i)+(ii)プロセスの前にアルカンチオー
ルによる前処理が行なわれる。これは電気化学的金属析出に対して金属電極の不
活性化を確実なものにする。(i)+(ii)サイクルの1つまたはそれ以上を行
なった後、DNA被覆金属ワイヤを通じて接続される電極を、電流またはバイア
ス制御された電源に接続し、またDNA線維の該当部分を金属イオン(特定のプ
ロトコルにより異なる濃度)の溶液に曝す。導電性ドメイン間のギャップは、電
気化学的金属析出により充填される。
電気化学的プロセスと類似のやり方で、しかし、駆動プロセスとして光学化学的
反応を使用して行なわれる。たとえば、DNA線維の金属化は電子供与体(トリ
エタノールアミン、シュウ酸、DTTなど)、光増感剤(Ru−ポリピリジン複
合体、キサンテン染料、TiO2、CdSなどの半導体粒子)、異なったビピリ
ジニウム塩類や該当する金属イオンもしくは金属複合体などの電子継電物質を使
用して得られると考えられる。光増感剤は、可能な配列のいずれかにおける電子
供与体や電子受容体を含む電子移送プロセスにより、吸収された光エネルギーを
熱力学ポテンシャルのなかに導入する。還元された電子受容体は、電子継電物質
として働き、また、電子により金属クラスター/コロイドを荷電する。荷電され
たクラスター/コロイドは、金属イオンの還元に関する触媒として働き、したが
って、金属導体の成長を誘導する。
る部分を、カチオン性チオール(ピリジニウムアルカンチオールなど)により事
前に被膜された(部分的)金コロイドの溶液に曝す。金コロイドは、イオン対形
成によりDNA骨格に吸着され、またワイヤの成長が1つまたはそれ以上の前記
技術を使用して達成される。あるいは、金コロイドは、たとえば、ビオチンによ
り修飾された、修飾ヌクレオチドに結合するビオチン−ストレプトアビジンなど
のさまざまな手段により付着される。
る欠損は、熱アニーリング処理(水素雰囲気(N2中に10%H2)、数時間にわ
たり300℃で)などの種々の方法を使用してアニーリングされる。
という事実に拠る。図10は、λ−DNAを検出することができる装置の製造を
概略している。カバーガラスをまず偽DNA結合に対して不活性化する。続いて
、2つの平行している金電極を、標準的なマイクロ電子技術を使用してそのカバ
ーガラス上に析出する。1つの金電極をその後に、12塩基、特異的配列オリゴ
ヌクレオチドを含有する水溶液のマイクロ寸法の小滴により湿らせ、その3’側
に付着されるジスルフィド基により誘導する。同様に、第2電極を異なるオリゴ
ヌクレオチド配列により標識する。その2つの配列(図のオリゴAおよびB)は
、λ−DNA付着末端に対して相補的である。洗浄後は、その装置は検出準備が
できている。
付着末端を有する、16μm長のλ−DNAを含有することが疑われている溶液
を、電極に対して直角に流れるようにする。その流れをDNAが伸長するように
誘導し、2つの離れた表面結合オリゴヌクレオチド(the two distance surface
-bound oligonucleotide)によりそのハイブリダイゼーションは可能となる。λ
−DNA分子を含有するサンプルの場合、それらは結合し、電極を接続する架橋
を形成する。図17は、こうした実験の結果を示している。すなわち、その2つ
の電極を架橋している蛍光的に標識されたλ−DNAである。
1013Ωよりも高い抵抗を有する絶縁体であることが証明される。DNA経路の
存在を検出するために、それらはまず、DNA分子に沿って銀金属をベクトル的
に析出することにより、電気的に伝導性となるように滴下される。3つのステッ
プの化学的析出プロセス(図10(c)〜(e))は、Ag+/Na+イオン交換
による、DNAに沿った銀イオンの選択的な局在化、および銀とDNA分子との
間の複合体の形成を基礎とする。洗浄後、銀イオン交換−DNA複合体を、塩基
性ヒドロキノン溶液を使用して還元する。このステップは、DNA骨格に結合さ
れるナノメーター寸法の金属銀集合体を形成するという結果になる。これらの銀
集合体は、以後のワイヤの成長に対して空間的に局在する核生成部位として役に
立つ。イオン交換プロセスは高度に選択的であり、またDNAにのみ限定されて
いる。DNAに結合する銀集合体は、標準的な写真の手法におけるのと多くの点
で同じように、ヒドロキノンの酸性混合液と銀イオンとを低光条件下で使用して
、さらに「発展」される。ヒドロキノンおよび銀イオンの酸性溶液は準安定的で
あるが、しかし突然の金属析出は通常は非常にゆっくりである。金属触媒(DN
A上の銀核生成部位などの)の存在は、そのプロセスを有意に加速する。こうし
た実験条件下では、したがって、金属析出は、DNA骨格に沿ってのみ起こり、
不活性化されたガラスは実際には銀がないまま残る。
は、図18に提示されている。はっきりとみえるように、ワイヤは、DNA骨格
に沿って析出された30〜50nm直径の粒からなる。図19は、図18に提示
されている銀のI−V曲線を示す。異なるワイヤにおけるゼロバイアスプラトー
の長さは、ゼロボルトからおおよそ10ボルトまで調整することができる。図2
0の実線は、たとえば、DNA上の銀成長がより伸長していた、別のワイヤのI
−V曲線を示している。結果として、そのプラトーはオームの挙動を付与するよ
うに除去することができる(図20の点線)。
きることを証明している。
プ(a)〜(b)は、図10に開示されているそうしたものとほぼ同じである。
ことが可能なカチオン性セグメントを含有する溶液に、または、化学的形質転換
により共役を受けることができるカチオン性非共役ポリマーを形成することが可
能なカオチン性セグメントを含有する溶液に曝される。したがって、イオン交換
プロセスは、その溶液に曝露されるDNA骨格のリン酸基において起こる。
性質にもとづいて処理される。電気的なコンダクタンスは、前者のプロセスによ
るかないしは連続的なドーピングによるかのいずれかにより達成される。ドーピ
ングは、プロトン化−脱プロトン化プロセスにより、電気化学的手段により、ま
たは光学化学的手段により、従来からの酸化還元プロセスを介して達成すること
ができる。さらに、DNA骨格と前記有機共役ポリマーを基礎とする導電性ワイ
ヤの構築ブロックの間の配列選択的プロセスは、ワイヤの生産に利用することが
できる。
とおりである。
液に曝す。DNA高分子電解質が、前PPVポリマーに置き換えられた後、その
基板を慎重に洗浄し、乾燥する。
とえば、1e-6bar、300℃、6時間)で反応させる。
従来からの方法を使用してドープされる。
る。
ビス−(テトラヒドロチオフェニウム)−p−キシレン二塩化物(図12(c)
)の溶液にさらす。DNA高分子電解質が、ビス−(テトラヒドロチオフェニウ
ム)−p−キシレン二塩化物により置き換えられた後、その基板を慎重に洗浄し
、乾燥する。
シレン二塩化物負荷DNA配列は、DNAバックボーンに付着された前PPVポ
リマーを形成するために、塩基性溶液中で重合化される(図12(d))。
ン(1e-6bar、300℃、6時間)で反応させる。
的の導電性を示すようになるまでドープされる。
。
に曝す。DNA高分子電解質がPANIポリマーにより置き換えられた後、その
基板を慎重に洗浄し、乾燥する。
まで従来からの方法を使用してドープされる。
る。
DNA高分子電解質がアニリニウムイオンにより置き換えられた後、その基板を
慎重に洗浄し、乾燥する。
酸イオンなどの酸化剤の溶液を使用して酸化し、ポリアニリンポリマーを産生す
る。結果的に生じるPANIポリマーは、目的の導電性を示すようになるまで従
来からの方法を使用してドープされる。
曝す(>1反復ユニット)。DNA高分子電解質がPANIオリゴマーにより置
き換えられた後、その基板を慎重に洗浄し、乾燥する。
シ二硫酸イオンなどの酸化剤の溶液を使用して酸化し、ポリアニリンポリマーを
産生する。結果的にPANIポリマーは、目的の導電性を示すようになるまで従
来からの方法を使用してドープされる。
とがある。結果的に生じるPPV構成要素は高度に発光性である。適当な作業機
能を有する電極間のPPV構成要素を製造することは、その後に電気発光装置を
形成する。
オ修飾特定配列に付着する。3’−メルカプト(N−(2−エチルスクシンイミ
ド)ピロール)オリゴヌクレオチドを含有する溶液の電気酸化は、特異配列オリ
ゴヌクレオチドを有するポリピロール被膜電極の形成を誘導する。ポリマーは、
陽極として異なる電極を使用するときはそれぞれ、目的の配列を含有する一連の
溶液のなかに電極検定セットを単に浸すことにより、複数の電極の選択的被膜を
可能にする陽極側で専ら析出される。ポリピロールはドーピング処理された状態
にある導体であるため、ポリマー層の電気的伝導性はその層を電気的ドーピング
処理すると可能になる。
れている。図21(B)では、短い、一本鎖オリゴヌクレオチド503の単層が
検定装置の一対の電極502の間にあるギャップに構築される。オリゴヌクレオ
チドの配列が、欠失すると思われる標的の配列に対して相補的である。オリゴヌ
クレオチドは、その3’末端にジデオキシ塩基を有しており、したがって、トラ
ンスフェラーゼの使用による核酸塩基の伸長ができない。
レオチド504が、認識部分503に結合し、したがって、認識グループ(二本
鎖DNA)505を形成する。異なる温度や異なる塩類濃度での洗浄などの異な
ったハイブリダイゼーション後処理は、デュプレックス形成における高度の選択
性を確実なものにする。
ラーゼを含有している溶液および3’デオキシ部位506におけるDNA骨格の
延長を誘導するビオチン化塩基と接触させる。
ニット507に結合している金コロイドを含有している溶液に曝す。結果として
生じる検定装置は、付属(pendant)金コロイド508とともにDNA分子を有
する。
SCN)2を含有する溶液に曝す。金は触媒中心として作用する金属表面上にの
み析出される。コロイドは成長し、また2つの金電極を架橋する導電性経路50
9を形成するために結合する。印加されたバイアスでの電流を検出することによ
り、溶液中の標的DNA配列の存在が伝えられる。
また電極間に金粒子の結合はない。金属核生成中心がない場合は、電極対間の導
電性経路の形成は妨げられる。バイアスが誘導される際に電流がない場合は、サ
ンプル中にその標的がないことが伝えられる。
または抗体である。認識部分は、さまざまな異なる方法の1つによって、たとえ
ば、金に結合できる別の基によりそれを複合化することにより、チオール基を付
着させることにより、電極に付着させる。あるいはそれは電極に直接共有連結す
ることができる。多くの場合で、ファンデルワース力は電極への認識部分の結合
を確実にするのに充分である。標的は、電極間のギャップを架橋するのに最終的
に役立っている修飾因子に付着させてもよい。たとえば、抗原はDNA線維の末
端に付着させることが可能であり、そしてこの付着された修飾因子により電極上
にあるその抗体に結合することが可能である。DNA線維の反対側は、検定セッ
トの中のもう1つの電極に選択的に結合することができ、あるいは非選択的にそ
れに付着させることができる。基板の不動態化、電極の定義、金属化および検出
は、たとえば、実施例8で前記概要されている一般的な原理に従っているもので
ある。
助けとなり得る。修飾ヌクレオチドの例は、ビオチン誘導ヌクレオチド、または
それらに結合された第一級アミン基を伴うヌクレオチドである。現存するDNA
もしくはRNA線維に沿った特定の位置において修飾ヌクレオチドの導入を可能
にする、または修飾ヌクレオチドの完全な配列により核酸鋳型のコピーを構築す
る、異なる標準的な分子生物学的手法がある。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)技術は修飾ヌクレオチドにより核酸鋳型を増幅するのに使用すること
ができる。この場合、修飾された塩基は、PCR溶液(非修飾塩基またはそうで
はないないものと混合される)のなかでヌクレオチドとして提供され、また提供
されたプライマー(後者は、必要な場合は同じ修飾ヌクレオチドにより合成する
ことができる)とともに、その増幅プロセスを容易にする。あるいは、無作為プ
ライミング法はヌクレオチドを修飾ヌクレオチドに置き換えることを可能にする
。いくつかの場合では、鋳型に沿った重合化産物のライゲーションが連続的な繊
維を確保するために必要とされる。もう1つの可能性は、二本鎖DNA線維に沿
ってギャップを充填するために、または修飾塩基で付着末端を充填するために、
鎖ポリメラーゼ(たとえば、クレノウフラグメント)の1つを使用することであ
る。あるいは、DNA末端トランスフェラーゼは、核酸線維(一本鎖または二本
鎖)の3’側に修飾塩基を付着させるのに使用することができる。修飾塩基が核
酸線維上の特定の点に局在している場合には、それをほかの基に、たとえば、チ
オール基、ストレプトアビジンまたは別の核酸線維などに特異的にその線維を付
着させるのに使用することができる。
に選択的な金属化を達成するのが可能になる。この方法により、修飾塩基は、検
出の前に金属化を触媒するために核生成中心として役に立つことができる基また
は複合体に特異的に付着する。たとえば、アミン基で誘導されたヌクレオチドは
、導電性架橋を産生するために金または銀(および多くのほかの金属類)の析出
用のよく定義された核生成中心として役に立つ小さな金クラスターまたはコロイ
ドを特異的に結合することができる。もう1つの実施例は、ビオチンにより誘導
される塩基を使用し、またDNA線維に沿ってストレプトアビジンで被覆された
コロイドまたは金クラスターに付着させるものである。これらのコロイドまたは
金クラスターは再び、金属化プロセスのために核生成中心として役立つことがで
きる。
おける微量のDNAまたはRNAを検出するのに通常使用される比較的最近の技
術である。それはハイブリダイゼーション技術の高い選択性を使用し、たとえば
、組織切片と特定の配列を関連付けることを可能にし、PCR法の増幅力は、検
出感度を非常に大きな倍数にまで増加させる(この技術の最近の総説に関しては
、J.Gu編『インサイチュ ポリメラーゼ連鎖反応と関連技術(In situ Poly merase Chain Reaction and Related Technology)』、Eaton Publi shing,1995を参照のこと)。この技術は、検定セットの基板上で、ま たは電極上で、たとえば、微小な濃度で存在しているDNA配列といった特定の 標的増幅に対して用いることができる。
プトアビジン、アミン−チオールなどによりその基板に固定される相補的なDN
A配列による、ハイブリダイゼーションにより電極の検定セットの間に位置して
いる基板部材上に固定されている特定の認識部分に結合する。適当なプライマー
、最適濃度の塩基および適当な緩衝液、ならびに標準的なPCRポリメラーゼの
1つ(たとえば、Taqポリメラーゼ)を含有する溶液が添加され、ついで1つ
の熱サイクルを開始することができる。迅速で自動的な方法でその温度を制御し
、修飾することを可能にしている温度制御装置のなかに検定装置は置かれている
。温度は現在では、次のサイクルのための新しい鋳型を形成するために、各サイ
クルでとくに重複されるが、そのため、指数関数的な増幅が可能になる。新しい
鋳型は、インサイチュで生成され、また、元のDNA標的とのネットワークを形
成するためにその基板に付着することもある。これは、長いDNA線維の非特異
的結合により、または特異的結合により達成される場合もある。たとえば、光活
性化により、各サイクルの終結時に、新たに形成された鋳型に付着させる部分基
が、基板上のほかの複合体に結合することにつながり、あるいはほかの鋳型がす
でに基板に付着することにつながる場合もある。この結合はさらなる増幅のため
に次のサイクルでプライマーに結合するという可能性を干渉すべきではない。十
分なサイクル(たとえば、30)後に、基板に付着させるDNA線維のネットワ
ーク、元の標的の正確なコピーが、電極の検定セットの間のギャップを充填する
。金属化プロセスはその後に続き、前記に特定されている技術の1つにより、こ
のネットワーク架橋の形成の電気的検出を最終的に可能にする。
強いる2つの基板(たとえば、間近な間隔のスライドガラス、またはナイロン部
材)間の増幅手順を実行するというのは可能性のあることである。たとえば、プ
ライマー、塩基、ポリメラーゼおよび緩衝液は通過させるが、しかし長い鋳型は
通過されることがない適当にカットオフされたフィルター膜はその目的のために
役立たせることができる。この場合は、すべての必要な成分は鋳型を確実に逃が
さないようにするため、膜を通して連続的に供給することができる。こうした半
透過性膜はまた、金属化および検出の前に効率的な洗浄を可能にする。
ることにより、特定の配列を増幅するための1つの技術である。PCR技術に使
用されているものと同じサーモサイクラーを使用することにより、単一または複
数のDNA鎖の切れ目により連続的な核酸線維を形成するために、鋳型の変性が
行なわれ、その鋳型を正確に適合させるサブセクションのアニーリングがその後
に続く。これらの切れ目は、高温で働く特別なリガーゼ(たとえば、pfuリガ
ーゼ)により結合される。この技術は、前記実施例15と同様に、インサイチュ
で適用することができる。1つの可能な増幅に関する実施例は、電極間のギャッ
プを架橋するのに十分長くない鎖に2つの短いサブセクションを結合するもので
ある。この技術の増幅力(再び各サイクルの中で新たに形成された結合線維が次
のサイクルのために鋳型として役に立つ)のため、元々は単に微小な濃度で導入
された、検出すべき標的のコピーから特異的に作成された電極をまたぐ1つの架
橋を形成することが可能になる。
−分子 酵素(またはその基質)、またはタンパク質などの小さな分子の電気的検出を
可能にするため、それらは場合によっては修飾因子に付着される。たとえば、ビ
オチンは、アビジンまたはストレプトアビジンの検出を可能にするため、核酸線
維に付着することができる。場合によっては、その修飾因子は合成ポリマーであ
りうる。別の実施例では、後のステップで電気的検出を容易にする修飾因子とし
て導電性ポリマーを使用している。
の特定抗原に対する抗体でありうる。あるいは、ビオチン−アビジンまたは、分
子もしくは細菌膜上の超分子構造と電極もしくは電極間の基板上の適当な認識部
分との間のほかの特異的結合が可能である。細菌は電極にわたって架橋を形成す
る。金属化はその後、電気的検出を容易にする。電場は基板または電極上の適当
な位置に細菌を導く際に助けとなることがある。場合によっては、細菌により(
たとえば、細菌の天然イオンチャネルを使用する)イオン性電流(単独または電
子電流と組み合わせて)を電気的検出に使用する。電場もしくは磁場または光が
細菌用のピンセットとして使用することができ、金属化と電気的検出に先立ち電
極の間に捕捉する。
バーで処理し、チップ702とした。チップ702はその後、120℃でオーブ
ンのなかに置かれ、そして乾燥器のなかで室温まで冷却された。
ロピルシランを混合し、室温で5分間反応するよう放置し、その結果生じた溶液
は704と指定した。オーブンで乾燥させたチップ702は反応溶液704のな
かに2.5分間浸され、ついでエタノールと水それぞれ数10mL(several po
rtions)で連続的に洗浄され、回転乾燥され、表面付着ポリシロキサンの架橋の
ため120℃で1時間オーブンのなかに置かれた。ポリアミノプロピルシロキサ
ンの層で被膜されたチップ706は、静電気的付着、表面上の有機層への光誘発
核酸架橋、核酸のカルボキシ誘導体の付着、電気化学的付着などのいくつかの方
法のうちの1つによる選択位置への核酸プローブの固定に役に立つ。あるいは、
チップ上の有機層が、オリゴヌクレオチドのチップ上合成用の前駆体を付着させ
るため、アンカーとして使用されることがある。異なる特性を有する層が、当業
者には公知の異なる手法を使用して形成されてもよい。
EDACを、活性化エステル710を形成するために、リン酸緩衝液、pH=8
.0〜8.5に溶解した。溶液を、核酸が、選択された部位でそのチップに結合
するように、制御されたやり方で、チップ704(実施例19に説明されている
ように作成された)と接触させた。溶液を、プローブ核酸714を有する誘導チ
ップ712から、水による連続的な洗浄により取り除いた。
電極は導電性層717および719の開放端であり、非導電性層718により互
いに分離されている。電極は、非導電性層(ギャップ)718の開放端が認識部
分核酸714により誘導される誘導化チップに存在する1つの検出部位716の
一部である。この場合、電極は導電性層を重層することにより形成され、非導電
性層(ギャップ718として役立つ)により分けられ、ついで穴を切り開くこと
、開口部を穿つことなどにより、導電性層を露出させる。
in−Chem−Link、Cat.No.1812149、Boehring er Mannheim社製によるものである。核酸は、核生成−中心形成実体 を後に付着させる(アビジンを使用)ための第1ステップとして、ビオチンに付 着させた。標的核酸配列は、核酸配列におけるグアノシンおよびアデノシン塩基 のN7に結合するビオチン化シス−白金複合体などの薬剤により反応させる。以 下のプロセスを使用して、核酸は、マイナー副反応と切断とだけを伴い、シス− 白金複合体の1つまたはそれ以上に付着するようになる。標識基の核酸への結合 は、その相補的配列による効率的で選択的なハイブリダイゼーションをさらに可 能にする。
すると考えられるサンプル800は、シス−白金ビオチン複合対804と混合さ
れる。溶液は、30分間85℃まで熱され、その後に室温に冷却され、また、停
止液と混合される。典型的な停止液には、その薬剤に非可逆的に結合する1つま
たはそれ以上の化合物を含み、したがってそれを不活性化させる。こうした溶液
は、トリス−[ヒドロキシメチル]アミノエタン(>40mM)、EDTA(>
5mM)、酢酸マグネシウム(>100mM)などを含む溶液である。核酸80
6は、1つまたはそれ以上のビオチン断片を帯びている。結果として生じる、1
つまたはそれ以上のビオチン含有標的配列806の1つまたはそれ以上の分子を
含むビオチンを含むサンプル808は、サイズ排除クロマトグラフィーなどの種
々の精製手法を使用して精製することができる。
プローブとの間のハイブリダイゼーションプロセス ハイブリダイゼーション手法は図26に略図的に示す。種々のハイブリダイゼ
ーション手法が、特定の所望される要求により使用され得る。
×)、8mLのDenharts溶液(50×)、0.4mLのサケ精液溶液お
よび10% SDSが混合され、使用前に42℃まで30分間熱せられた。
ブリダイゼーション溶液に浸され、また42℃で30分間振とうされた。その後
に、ステップ4により処理されたビオチン含有サンプル822(実施例21に説
明されているように作製された)が、その溶液に加えられた。このチップは、誘
導化チップ820の表面上に存在する相補的配列826(認識部分)により、標
的824として役に立つものをハイブリダイゼーションするために、42℃にて
12時間溶液のなかで振とうされた。
から除去され、また振とうしながら、42℃にて0.2xSSC溶液のなかに浸
された。ストリンジェントなプロセスは、三度繰り返され、サンプル822のな
かに存在する場合には、ビオチン含有標的が認識部分に結合されるハイブリダイ
ゼーションされたチップ828を産出する。図27は、標的と、開放端が電極と
して役に立つ2つの導電性層834および835の間を分け隔てている非導電性
層により形成される絶縁性ギャップ832上に存在する認識部分との間にある複
合体の形成を示している。
トレプトアビジン−金共役(核生成中心として役に立つ)の付着 その付着を図28に略図的に示す。
ビジン含有核生成中心の付着 ストリンジェントな洗浄後のチップ840は、室温にて蒸留水のなかに乳遮断
溶液(milk blocking solution)を1:4の割合で入れた溶液のなかで40分間
振とうさせた。その後、ストレプトアビジン−金共役(ストレプトアビジン−ナ
ノ金、ナノプローブ)842の溶液が添加された。チップはさらに、室温で0.
1×膜洗浄溶液で3回洗浄された(各洗浄溶液で5分間振とうされ)後、さらに
2時間の間、室温にて溶液のなかでさらに振とうされた。乾燥後、チップ840
は、以前のステップ5で検出されるビオチン含有標的配列がサンプル822のな
かに存在した場合は、ストレプトアビジン−金共役により誘導された標的および
認識部分の複合体846を有する。図29は図27と基本的に同じものを示して
いるが、そこでは、図24に図示説明されているように、開放端が電極として役
に立っている2つの導電性層853と854との間を分け隔てている非導電性層
により形成されるギャップ852上に存在する核生成中心850を、標的と認識
部分との複合体が有するように、核生成中心が標的と認識部分間の複合体上のビ
オチンに付着される。
μフィルターによりろ過された。
フィルターによりろ過された。
μフィルターによりろ過された。
調整された。その溶液は10mLに調整され、0.22μフィルターによりろ過
された。
ィルターによりろ過された。
生じたオレンジ沈殿物が回収され、また溶液eの5000mLのなかに再溶解さ
れ、溶液gを形成した。完全に透明になったら、可及的速やかに溶液cの120
0μLが溶液gに加えられ、溶液hを形成した。溶液hは0.22μフィルター
によりろ過され、すぐに使用された。
液iを形成した。溶液iは0.22μフィルターによりろ過され、すぐに使用さ
れた。
ャップ904により分け隔てられている露出した導電性層の開放端近傍に)から
なる1つの検出部位上での金析出プロセスが呈示されている。ギャップ904は
、それぞれが核生成中心908を含有しているストレプトアビジン−金共役90
6によって誘導される、標識標的と、認識部分との複合体を保持している。新鮮
に調製された溶液IまたはIIを、各核生成中心908が準安定的金溶液からの金
析出を触媒するように、その処理された物質と接触させ、電極900と901の
間の導電性架橋として役に立つ大きな単結晶および/または多結晶析出物910
を形成した。見ると分かるように、標的と認識部分との間の複合体は、それ自体
は電極間の物理的架橋を形成しないが、大きな結晶になると架橋を形成する。
とつのチップ上の3つの典型的な領域の代表的なAFM像である。図31(A)
は、DNA認識部分がなにもない表面を示す。図31(B)は、サンプル中の標
的の配列を部分的にしか補完しない1つの配列を有する認識部分を帯びる表面を
示す。また、図31(C)は、サンプル中の標的の配列を完全に補完する配列を
有する認識部分を帯びる表面を示す。見ると分かるように、実質的には標的金粒
子は適当な認識部分がない場合にはまったく形成されず、金粒子は、認識部分が
標的に対して部分的にしか特異的ではなかったところにはほとんど形成されなか
ったが、一方、標的に対して完全に相補的である認識部分に関しては、豊富な粒
子が形成されることが明らかになっている。
セットのAFM像を示す。左上の像はDNA認識部分がなにもない2つの電極か
らなる1組の検定セットの表面を示す。左下像(B)は、電気的なコンダクタン
スはまったく示さない前記検出部位の電流−電圧曲線を示す。右上像は、サンプ
ル中の標的の配列を完全に補完する配列を認識部分として有する1組の検定セッ
トの表面を示す。右下像(A)は、ストレプトアビジン−金共役により誘導され
たハイブリダイゼーションされた標的認識部分上の金析出が、電気的に絶縁して
いるギャップを架橋し、結果として電気的に導電性のある検出部位になっている
ことを示す上の検出部位の電流−電圧曲線を示す。したがって、検定セットの電
気的コンダクタンスは、標的と認識部分のハイブリダイゼーションされた複合体
の存在を測定するものである。
は、各電極対への直接的な接続よりもより洗練された読取りスキームが必要にな
る。こうした配列に関しては、多重化スキームが適用できる。こうしたスキーム
では、入力−出力ラインの数は、部位の数の平方根の2倍にしかならない。図3
3は、多重化配置検出装置の略図を示す。各検出部位は事実上、ダイオードない
しは非線形構成要素で連続している、垂直ラインおよび水平ラインの間のギャッ
プとして、ギャップが役に立っている、1つのギャップにより分け隔てられてい
る2つの電極である。バイアススキームは現在では、異なった部位のコンダクタ
ンスを読むために適用される。非線形要素は、異なる部位間の「クロストーク」
を防ぐために使用される。特定部位のコンダクタンスの検出は、読み取られる値
が正の電圧に設定されている、特定検出部位につながるものを除いて、ゼロバイ
アス設定にすべての垂直ラインを設定することにより達成される。水平ラインは
すべて、ゼロ設定された部位と同じ部位に接続されているものを除いて、正の電
圧に設定されている。2つの電極からなる1組の特定検定セットが、前述されて
いるように、検定セットに対する標識標的のハイブリダイゼーションと、析出プ
ロセスにより導電性にされている場合は、電気回路は閉じられる。したがって、
電流は、垂直ラインを通じて、ダイオードないしは非線形構成要素を通じて、試
験された検定セットの析出された架橋を通じて、ないしは電極の方への電圧源(
図示せず)の「プラスV」側と、電源の「マイナスV」側につながる水平ライン
の間を流れることが可能である。電流は、連続的に電流計(amperemeter)によ
りモニターすることができる。このスキームでは、たとえ導電性であっても、ほ
かの部位は、すべての該当するダイオードが負にバイアスされるため、そのシス
テムにおけるいずれの2つのラインの間のコンダクタンスにも貢献することはで
きない。すべての垂直ラインにわたる垂直な正の電圧をスキャニングし、また異
なる水平ラインに対してゼロバイアスを設定することで、すべての検出部位の導
電性をモニターすることができる。さらに、迅速なスキャニング技術が適用でき
、数秒またはそれ以下で、たった1000垂直および1000水平ラインのみを
用いて1,000,000検出部位についてのモニターが可能になる。
する検出部位で行なわれる(平方ミクロンという小さな断片の面積)。DNA(
またはRNA)試薬の1つのタイプを含むハイブリダイゼーション部位はより大
きい面積にわたり、またしたがって、多くの検出部位を含むことが考えられる。
個々の検出部位(図34に略図的に図示されている。間隔が空けてある電極の単
一電極構成要素とダイオードまたは非線形構成要素)と、ハイブリダイゼーショ
ン部位(個々の検出部位の電極対を架橋するギャップにすべて同じプローブ配列
を有する複数の個々の検出部位を含む、異なった領域として、図34に略図的に
図示されている)とを識別できるようになっていなければならない。ハイブリダ
イゼーション部位が、数多くの、識別可能な、個々の検出部位を含んでいるとい
う事実は、非常な長所であり、また、サンプルの標的量の定量的測定、ノイズに
対するシグナルの割合の増加、誤まった陽性結果の量を相当量減少させるのに使
用することができる。
に分割された多重化形態を略図的に示す。たとえば、10,000ハイブリダイ
ゼーション部位配置(すなわち、部位に付着もしくは部位で合成される10,0
00の異なるオリゴヌクレオチド、または異なる部位における10,000cD
NA)が、1,000,000部位多重配置を付与するため、ハイブリダイゼー
ション部位当たり100の個々の検出部位で構成することができる。
を考えてみる。検出部位は、十分に小さく作られており、そのため、任意の標的
サンプルにとっては、それに対してハイブリダイゼーションされる1つのDNA
(またはRNA)分子を有する確率は、1未満である。金析出プロセスの後、各
ハイブリダイゼーション部位において、われわれは、ハイブリダイゼーションお
よび金属架橋の形成のため、m<n導電性検出部位となっていることを発見する
ことであろう。標的分子の量の定量的測定は、各ハイブリダイゼーション部位内
でm/nである陽性導電性部位の画分を数えることにより実施することができる
。変性部位(meta-site)を作り出すために、pの異なった検出部位を一緒にま
とめることもできる。p>p臨界に対してのみ変性シグナルが陽性検出であると
考えられるように検出閾値を設定すると、適当なpを選択することにより誤まっ
た陽性を指数関数的に抑制することができる。したがって、ノイズに対するシグ
ナルの割合もまた、有意に向上させることが可能である。この方法は、異なるハ
イブリダイゼーション部位における検出部位を、異なる感度と閾値を許容する、
異なった変性部位サイズにまとめることができるため、測定の動態的範囲を増大
することが可能になる。電子多重化測定では、こうした操作を、たとえば、コン
ピュータ制御および適当なソフトウエアにより簡単に制御することが可能になる
。
イクロ電子実施態様1000を示す。基板1010は、ドーピング処理されたp
型シリコンで構成されている。フォトリトグラフィーにより定義されるフォトレ
ジストマスクを使用して、n型平行チャネル1012が、イオン注入技術を使用
して規定される。フォトレジストはその後に除去され、そして注入された領域は
熱により活性化される。薄い二酸化シリコン層がその後に、表面上に成長する。
第2のフォトレジストマスクが、ダイオードの陽極が作り出される場所であるp
型注入のための穴によって規定される。ウエハはp型領域1014を形成するた
めに注入されたp型であり、フォトレジストは除去され、また注入は熱により活
性化される。p型領域は、n型ストリップに比して、多重化読取りスキームに必
要とされる非線形要素1016を形成する。ついで、二酸化シリコンはエッチン
グされて削られ、また新しい層1018が成長する。穴はシリコンダイオード層
に開いており、また底の導電性電極1020は、蒸着およびリフトオフ(lift-o
ff)により析出される。低温酸化物層がその後に成長し、引き続いて、第2の導
電性層が成長する。一番上の導体と低温酸化物とは、他の電極1022および絶
縁ギャップ1024を形成するためにその後にエッチングされて二酸化シリコン
層まで下げられる。図36は、平面Aに沿って1000の断面(cross section
)を呈示しており、すなわち、チップ1000上のギャップ2030によって分
け隔てられている2つの電極の配置が、ギャップ1024により分け隔てられて
いる電極対1020および1022により規定されている。ギャップ1024は
、次に、前記で説明されているように、ハイブリダイゼーション部位として使用
される。
体工学 いくつかの適用では、小さなサンプル容量により作業するという能力は非常な
長所になる。こうした目的のため、マイクロ流体工学技術を利用している実施態
様が使用されていることがある。図37は、図35または36に示されているチ
ップ1000にほぼ同じ(同一ではないが)1つのチップによる断面である。図
25に示されているのと同一の要素は同じ参照番号を付してある。基板1001
はドーピング処理されたp型シリコンから構成されている。フォトリトグラフィ
ーにより規定されるフォトレジストマスクを使用して、n型平行チャネル100
2が、イオン注入技術を使用して規定されている。フォトレジストはその後に除
去され、そして注入された領域は熱により活性化される。薄い二酸化シリコン層
はその後に表面上で成長する。第2のフォトレジストマスクは、ダイオード陽極
が作れ出される場所であるp型注入のための穴により規定される。ウエハは、そ
の後、p型領域1003を形成するために注入されたp型であり、フォトレジス
トが除去され、その注入が熱により活性化される。p型領域はn型ストリップに
比して、多重化読み取りスキームに必要とされる非線形要素1004を形成する
。二酸化シリコンはその後にエッチングされて削られ、また新しい層1005が
成長する。穴は二酸化シリコン層に開いており、また底の導電性電極1006、
低温酸化物1008および上部アルミニウム電極1007は、蒸着により析出さ
れる。リフトオフはこのステップで終結する。第3のフォトレジストマスクが、
その装置の穴が作り出される場所にある穴により規定される。チップ1000上
の検出部位1009は、ギャップ1008により分け隔てられている電極対10
06および1007により規定される。ギャップ1008は、次に、ハイブリダ
イゼーション部位として使用される。チップ1000は、サンプル溶液のための
貯蔵槽1010として役に立つ2つの溶液ダクトの間に置かれる。溶液は、チッ
プの穴を通して貯蔵槽の2つの部分の間で駆動されて行なったり来たりし、した
がって、一方では低サンプル容量を維持しながら、ハイブリダイゼーション部位
1009とのサンプルとの効率的な接触を確かなものにする。
。
る。
のための検定装置の少なくとも1つの電極上に固定されている認識部分の異なる
組み合わせを示す。
発明の3つの実施態様の略図である。
略図である。
る。
ng)実施態様の略図である。
態様の略図である。
能化架橋に関する2つの例示的な電流−電圧関係を示す。
、サンプルの中のDNA配列の検出のための測定装置および方法を図示する。
の図式を示す。
されたλ−DNA架橋を示す。
いるDNA架橋の原子間力顕微鏡(AFM)画像と視野の寸法を示す。
曲線である。矢印は、電圧スキャン方向を示す。実線曲線は繰り返されるスキャ
ンであり、サンプルの安定度を示す。2つのスキャン方向に対応するI−V曲線
において異なった非対称性であることに注意。
曲線を示す。銀増殖がさらに進展すると、それだけ、0.5V程度、電流プラト
ーが小さくなり、抵抗は低くなる(図17における30MΩに対して13MΩ)
という結果となった。ワイヤを通じて大きな電流を走らせることにより、プラト
ーは、測定範囲全体にわたってオームの挙動を付与するように除去された(点線
)。
。
共有付着のための方法に関するステップの略図を示す。
である2つの電極からなる検定セットの略図を示す。
。
イゼーションを略図的に示す。
。
核生成−中心形成実体の付着を略図的に示す。
示す。
能にする試薬曝露のプロセスを行なったチップであり、DNA結合部分を欠くチ
ップのAFM図を示す。
能にする試薬曝露のプロセスを行なったチップであり、サンプル中の標的は異例
に部分的に相補的である結合部分を有する1つのチップのAFM図を示す。
能にする試薬曝露のプロセスを行なったチップであり、標的配列に完全に相補的
である認識部分を有する1つのチップのAFM図を示す。
)電極からなる単一検定セットのAFM図と、対応する電流電圧曲線(それぞれ
、右下と左下)とを示す。
化配置を略図的に示す。
のと同様の断面の詳細図を示す。
電気回路を改変する結合反応を利用することにより、結合の発生または特定物質
間の複合体形成反応を検出し、またその後にその回路の電気的な状態における変
化を測定するための方法を開示している。この方法によると、抗原などの生物遺
伝的物質が、非導電性基板上に被せられ、その基板上に重ねて載せられている一
対の電極の間に置かれる。抗原と特異的に結合する抗体などのほかの生物遺伝的
物質は、導電性粒子に結合するように、事前に処理される。それらに結合する抗
体を有する粒子は、そののちに非導電性基板上に置かれる抗原層に添加される。
導電性粒子は、それによって、また抗原と抗体の間の結合により、その基板に結
合し、したがって、その回路を改変する電気的に導電性のある粒子の集合体を形
成する。その粒子はそののちに前記粒子にだけ本質的に結合する導電性物質によ
り選択的に被覆することができ、また2つの電極により形成される電気的回路お
よびそれらのあいだに形成される凝集塊の導電性を向上させるため、電極間の経
路のそのほかのものとは結合しない。
Claims (42)
- 【請求項1】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を検定するシステム
であって、 (a)1つまたはそれ以上の検定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有する検定装置であり、各検定セットは、少なくとも
2つの電極ならびに、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に、および/
または少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定されている認識部分か
らなり、該認識部分は標的の1つに特異的に結合する能力を有する検定装置、 (b)各検定セットの少なくとも2つの電極間の電気的コンダクタンスを測定す
るための電気または電子モジュール、および (c)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上に置かれるまたは結
合される核生成−中心形成実体から導電性物質を増殖させるための薬剤であって
、該物質が1組のセットの少なくとも2つの電極間に導電性架橋を形成する薬剤
からなるシステム。 - 【請求項2】 請求項1記載のシステムであって、前記薬剤が、 (c1)サンプル中に存在する場合に前記標的に結合するための核生成−中心形
成実体からなる溶液、および (c2)前記実体上で前記金属物質の増殖を可能にするための、金属イオンと還
元剤との組み合わせ からなるシステム。 - 【請求項3】 請求項1記載のシステムであって、前記薬剤が、 (c1)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上への、前記核生成
−中心形成実体の析出および/または形成を可能とするための1つまたはそれ以
上の薬剤、および (c2)前記実体から前記金属物質の増殖を可能にするための、金属イオンと還
元剤との組み合わせ からなるシステム。 - 【請求項4】 前記核生成−中心形成実体がコロイド粒子である請求項2ま
たは3記載のシステム。 - 【請求項5】 前記核生成−中心形成実体が金属複合体および/またはクラ
スターである請求項2または3記載のシステム。 - 【請求項6】 前記コロイド粒子がコロイド金粒子である請求項4記載のシ
ステム。 - 【請求項7】 前記金属複合体および/またはクラスターが金複合体および
/またはクラスターである請求項5記載のシステム。 - 【請求項8】 前記コロイド粒子がコロイド白金粒子である請求項4記載の
システム。 - 【請求項9】 前記金属複合体および/またはクラスターが白金複合体およ
び/またはクラスターである請求項5記載のシステム。 - 【請求項10】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を検定するシステ
ムであって、 (a)1つまたはそれ以上の検定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有する検定装置であり、各検定セットは、少なくとも
2つの電極ならびに、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に、および/
または少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定されている認識部分か
らなり、該認識部分は標的の1つに特異的に結合する能力を有する検定装置、 (b)各検定セットの少なくとも2つの電極間の電気的コンダクタンスを測定す
るための電気または電子モジュール、および (c)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上に結合することがで
きる導電性ポリマーのモノマーからなる薬剤であり、それによってモノマーの重
合化の際に1組のセットの少なくとも2つの電極間に導電性架橋が形成される薬
剤 からなるシステム。 - 【請求項11】 前記モノマーがポリアニリンのモノマーである請求項6記
載のシステム。 - 【請求項12】 前記1つまたはそれ以上の標的が1つまたはそれ以上の核
酸配列である請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載
のシステム。 - 【請求項13】 前記認識部分が、前記1つまたはそれ以上の標的のうちの
1つの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る請求項12記載のシステム。 - 【請求項14】 認識部分が各検定セットの少なくとも1つの電極上に固定
されている請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12また
は13記載のシステム。 - 【請求項15】 検定セットの少なくとも2つの電極が、それらに固定され
た各認識部分を有する請求項14記載のシステムであって、同一または異なって
いる該認識部分が特異的に同じ標的に結合するシステム。 - 【請求項16】 請求項14または15記載のシステムであって、認識部分
が、認識部分との共役または複合リンカーであって電極に共有または非共有結合
で付着されたリンカーによって、電極上に固定されているシステム。 - 【請求項17】 認識部分が電極以外の担体基板に固定されている請求項1
、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15また
は16記載のシステム。 - 【請求項18】 電極を有する複数の検定セットからなる請求項1、2、3
、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16または
17記載のシステム。 - 【請求項19】 電極を有する検定セットがすべて同じ標的を検定するため
のものである請求項18記載のシステム。 - 【請求項20】 電極を有する別々の検定セット、または検定セットの別々
の群が、別々の標的を検定するためのものである請求項18記載のシステム。 - 【請求項21】 サンプル中の異なる標的の同時測定のための請求項20記
載のシステム。 - 【請求項22】 標的がタンパク質またはポリペプチドで、認識部分が標的
タンパク質に特異的に結合するタンパク質結合分子である請求項1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10または11記載のシステム。 - 【請求項23】 前記認識部分が、抗体または少なくとも抗体の抗原結合ド
メインからなる抗体画分である請求項22記載のシステム。 - 【請求項24】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を検定する方法で
あって、 (a)1つまたはそれ以上の測定セットを有し、測定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有している測定装置と、少なくとも2つの電極と、少
なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に対して、または少なくとも2つの電
極間の基板上のいずれかに固定される認識部分とからなる各測定セットと、標的
のうちの1つに特異的に結合する能力を有する認識部分とを提供するステップと
、 (b)特異的な認識部分への標的の結合を可能にする条件下で前記サンプルと前
記測定装置とを接触させるステップ、 (c)標的と認識部分との間に形成される複合体上に核生成−中心形成実体を形
成するために第1の試薬溶液と前記装置とを接触させるステップ、 (d)前記少なくとも2つの電極の間に導電性架橋を産み出すのに十分な時間の
間、前記核生成中心から導電性金属物質を増やすために第2の試薬溶液と前記装
置を接触させるステップ、 (e)前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定する電気または電子
モジュールに対して前記少なくとも2つの電極を接触させるステップ、および (f)閾値コンダクタンスを超えるコンダクタンスは、サンプル中のそれぞれの
標的の存在を示す、前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定するス
テップ からなる方法。 - 【請求項25】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を検定する方法で
あって、 (a)サンプル標的を、該標的に核生成−中心形成実体を結合させるために、第
1の試薬溶液と反応させるステップ、 (b)1つまたはそれ以上の測定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有している検定装置であり、各検定セットは少なくと
も2つの電極と、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に対して、または
少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定される認識部分とからなり、
該認識部分が標的のうちの1つに特異的に結合する能力を有する装置を提供する
ステップ、 (c)特異的な認識部分への標的の結合を可能にする条件下で前記サンプルと前
記測定装置とを接触させるステップ、 (d)前記少なくとも2つの電極の間に導電性架橋を産み出すのに十分な時間の
間、前記核生成−中心形成実体から導電性金属物質を増やすために第2の試薬溶
液と前記装置を接触させるステップ、 (e)前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定する電気または電子
モジュールに対して前記少なくとも2つの電極を接触させるステップ、および (f)閾値コンダクタンスを超えるコンダクタンスは、サンプル中のそれぞれの
標的の存在を示す、前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定するス
テップ からなる方法。 - 【請求項26】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を検定する方法で
あって、 (a)1つまたはそれ以上の測定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有している検定装置であり、各検定セットは少なくと
も2つの電極と、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に対して、または
少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定される認識部分とからなり、
該認識部分が標的のうちの1つに特異的に結合する能力を有する装置を提供する
ステップ、 (b)特異的な認識部分への標的の結合を可能にする条件下で前記サンプルと前
記測定装置とを接触させるステップ、 (c)前記装置に、前記モノマーが標的と認識部分との間に形成される複合体に
結合するように導電性ポリマーのモノマーからなる第1の試薬溶液を接触させる
ステップ、 (d)前記モノマーが導電性ポリマーを形成するために重合するように前記装置
を処理し、それにより少なくとも1つの検定セットの少なくとも2つの電極の間
に導電性架橋を形成するステップ、および (e)閾値コンダクタンスを超えるコンダクタンスは、サンプル中のそれぞれの
標的の存在を示す、前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスを測定するス
テップ からなる方法。 - 【請求項27】 請求項26記載のシステムであって、ステップ(a)の前
に以下のステップ(a0): (a0)サンプルを、前記モノマーから導電性ポリマーがその実体から成長する
ための核生成中心を形成できる実体を含有する第2溶液と反応させ、それによっ
て該実体が、サンプル中に前記標的が存在する場合に該標的に結合するステップ
からなる方法。 - 【請求項28】 請求項26記載の方法であって、(a)の後に以下のステ
ップ(a1): (a1)前記検定装置に、前記モノマーから導電性ポリマーがその実体から成長
するための核生成中心を形成できる実体を含有する第2試薬溶液を接触させ、そ
れにより該実体が、前記認識部分に結合された場合は、前記標的に結合するステ
ップ からなる方法。 - 【請求項29】 前記標的が核酸配列であり、認識部分がそれぞれ前記標的
の配列の1つに相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである請求項24
、25、26、27または28記載の方法。 - 【請求項30】 測定コンダクタンスレベルが、サンプル中の標的の濃度測
定として役立つ請求項24、25、26、27、28または29記載の方法。 - 【請求項31】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検定に用いるキ
ットであって、 (a)1つまたはそれ以上の検定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有する検定装置であり、各検定セットは、少なくとも
2つの電極ならびに、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に、および/
または少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定されている認識部分か
らなり、該認識部分は標的の1つに特異的に結合する能力を有する検定装置、お
よび (b)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上に置かれるまたは結
合される核生成−中心形成実体由来の導電性物質を増殖させるための薬剤であっ
て、該物質が1組のセットの少なくとも2つの電極間に導電性架橋を形成する薬
剤 からなるキット。 - 【請求項32】 請求項31記載のキットであって、前記薬剤が (b1)前記標的がサンプル中に存在する場合、前記標的に結合するための核生
成−中心形成実体からなる溶液、および (b2)前記実体上で前記金属物質の増殖を可能にするための、金属イオンと還
元剤との組み合わせ からなるキット。 - 【請求項33】 請求項31記載のキットであって、前記薬剤が (b1)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体上への、前記核生成
−中心形成実体の析出および/または形成を可能とするための1つまたはそれ以
上の薬剤、および (b2)前記実体から前記金属物質の増殖を可能にするための、金属イオンと還
元剤との組み合わせ からなるキット。 - 【請求項34】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的の検定に用いるキ
ットであって、 (a)1つまたはそれ以上の検定セットを有し、検定される各標的に対して少な
くとも1つの検定セットを有する検定装置であり、各検定セットは、少なくとも
2つの電極ならびに、少なくとも2つの電極の1つまたはそれ以上に、および/
または少なくとも2つの電極間の基板上のいずれかに固定されている認識部分か
らなり、該認識部分は標的の1つに特異的に結合する能力を有する検定装置、お
よび (b)前記認識部分と前記標的との間に形成される複合体に結合することができ
る導電性ポリマーのモノマー上からなる薬剤であって、それによりモノマーの重
合化の際に1組のセットの少なくとも2つの電極間に導電性架橋が形成される薬
剤 からなるキット。 - 【請求項35】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を測定する電子装
置であって、 N1導体の第1群およびN2導体の第2群からなり、それらの間にN1×N2接続部
を定義している構成回路であって、各接続部は2つの電極からなる電子モジュー
ルにより形成され、各1つは導体の1つの構成部分として連結または定義され、
また導体の第1群から導体の第2群への方向にのみ電子モジュールを通じて電流
が流れることを可能にするダイオードもしくは非線形構成要素からなるこうした
各接続部であって、それによって第1群の1つの導体と第2群の1つの導体の間
を流れる電流がそれらの間の単一接続点を定義しているが、その接続部と、検定
セットの一部を形成している各一対の電極と、電極の少なくとも1つかまたはそ
の電極間に配置される非導電性物質かのいずれかに結合される認識部分を有する
各検定セットと、 からなる装置。 - 【請求項36】 1つの検定セットの中心から隣接する検定セットの中心と
の距離が100μMまたはそれより短い請求項35記載の装置。 - 【請求項37】 サンプル中の1つまたはそれ以上の標的を測定する電気装
置であって、 1つまたはそれ以上の第一層においてストリップとして規定されている第1群の
導体、および該装置の1つまたはそれ以上の第二層においてストリップとして規
定されている第2群の導体をもち、複数の層を有するマイクロ電子装置であって
、該第二層のそれぞれは、非導電性基板によって第一層から分け隔てられており
、装置の電極は、層を通して垂直方向に開けるまたは切り出すことによって導体
の開放端として形成されている装置、 検定セットの一部を形成している各電極対、電極の少なくとも1つ、または電極
間にある非導電性基板のいずれかに結合する認識部分を有する検定セット からなる装置。 - 【請求項38】 前記装置が請求項35、36または37にもとづき規定さ
れている請求項18、19、20、21、22または23記載のシステム。 - 【請求項39】 前記装置が請求項35、36または37にもとづき規定さ
れている請求項24、25、26、27、28、29または30記載の方法。 - 【請求項40】 前記装置が検定されるべき各標的に対する複数の検定セッ
トを有する請求項39記載の方法であって、該方法は、1つの標的に対する全検
定セット中における、閾値以上のコンダクタンスを呈示する検定セットの割合を
測定することからなり、そのような測定法がサンプル中の標的の濃度を決定する
方法。 - 【請求項41】 多重化によってサンプル中の1つまたはそれ以上の標的を
検出する方法であって、 (i)標的が認識部分に結合することができる条件下で、請求項35記載の電子
装置にサンプルを接触させること、および (ii)各検定セットにおいてコンダクタンスを測定すること からなる方法。 - 【請求項42】 前記少なくとも2つの電極間のコンダクタンスレベルが、
サンプル中の標的濃度の基準である請求項24、25または26記載の方法。
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