JP2002523747A - 電気化学的アフィニティーアッセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
リガンド−リガンドレセプター結合の検出のための電気化学的アフィニティーアッセイシステム。リガンド−リガンドレセプター対の第１要素は、レドックスポリマーに固定化されている。第２要素は、前記第１要素に結合されている。第３要素は検出マーカーである西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダーゼでラベル化されている。第２要素を通じた電極へのラベル化第３要素の結合は、ペルオキシダーゼおよびレドックスポリマー間の電気伝導を生じる。これは、導電性ポリマーを通じたペルオキシダーゼの反応中心と電極との電気的接触が原因である。このような接触は、フィルムを、固定化された基質生成酵素によりフィルム内において生産される過酸化水素の電気還元のための触媒に交換する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、タンパク質（特に抗体）もしくは核酸のような生物学的リガンドの
検出のためのアフィニティーアッセイに関する。特に、本発明は、全血中および
動物、植物ならびに他の生物の流体（体液）における抗体のような二機能性（二
官能性）の生物学的リガンド、または、２以上の生物学的リガンドでラベルされ
たＤＮＡの有効な検出を含む、さらに、本発明は、リガンドレセプターに対する
このようなリガンドの結合が、電流または電位のような電気化学的シグナルを生
じるアフィニティーアッセイに関する。
検出のためのアフィニティーアッセイに関する。特に、本発明は、全血中および
動物、植物ならびに他の生物の流体（体液）における抗体のような二機能性（二
官能性）の生物学的リガンド、または、２以上の生物学的リガンドでラベルされ
たＤＮＡの有効な検出を含む、さらに、本発明は、リガンドレセプターに対する
このようなリガンドの結合が、電流または電位のような電気化学的シグナルを生
じるアフィニティーアッセイに関する。
【０００２】 （発明の背景） アフィニティーアッセイシステムは、臨床および非臨床の場で、特殊なリガン
ドの同定、量もしくは存在を、検出、モニターまたは確認するために一般に使用
されている。例としては、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）のような、抗体または抗原の検出のためのイムノアッ
セイを含む。このようなアフィニティーアッセイは、血液または他の体液のよう
な複合サンプルにおける特殊なリガンドの分析に特異性および感度を与える。
ドの同定、量もしくは存在を、検出、モニターまたは確認するために一般に使用
されている。例としては、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）のような、抗体または抗原の検出のためのイムノアッ
セイを含む。このようなアフィニティーアッセイは、血液または他の体液のよう
な複合サンプルにおける特殊なリガンドの分析に特異性および感度を与える。
【０００３】 従来の標識化および検出の技術を用いる従来のアフィニティーアッセイは、一
般に、洗浄および／または分離工程を必要とする。加えて、多くのアフィニティ
ーアッセイシステムは、分光光度計もしくは蛍光計のような機械装置での検出を
必要とする。これらは、全血中におけるリガンドの検出、および生物学的流体を
吸収または拡散する他の強い光の検出が望まれる場合に実用的でない。このよう
な装置を必要としないいくつかの従来のアフィニティーアッセイは、リガンドの
検出のために、可視色の変化を頼りにしており、これもまた、血液のように不透
明または着色された流体においては実用的でない。その上、従来のアッセイで一
般に使用されている過酸化水素のような検出化合物は、血液や他の組織において
発見されたカタラーゼのような保護酵素によって迅速に消失する。
般に、洗浄および／または分離工程を必要とする。加えて、多くのアフィニティ
ーアッセイシステムは、分光光度計もしくは蛍光計のような機械装置での検出を
必要とする。これらは、全血中におけるリガンドの検出、および生物学的流体を
吸収または拡散する他の強い光の検出が望まれる場合に実用的でない。このよう
な装置を必要としないいくつかの従来のアフィニティーアッセイは、リガンドの
検出のために、可視色の変化を頼りにしており、これもまた、血液のように不透
明または着色された流体においては実用的でない。その上、従来のアッセイで一
般に使用されている過酸化水素のような検出化合物は、血液や他の組織において
発見されたカタラーゼのような保護酵素によって迅速に消失する。
【０００４】 複合サンプル媒体におけるリガンドの高感度で、効率的かつ迅速な検出、特に
全血における検出を供給するアフィニティーアッセイが必要とされている。 好ましいアッセイは、洗浄または分離工程、分析のための機械類でのサンプル除
去を必要としない。最も好ましくは、アッセイは、分析される生物学的流体に利
用でき、または、添加された場合に生物学的流体において酵素により迅速に分解
されない、プローブ、材料に含まれるまたは生成される材料のみを利用する。こ
れらの基準を満足するアフィニティーアッセイは、全血におけるリガンドを検出
するためのアフィニティーアッセイシステムの製造を可能にする。このようなア
フィニティーアッセイシステムは、当該発明において述べられている。
全血における検出を供給するアフィニティーアッセイが必要とされている。 好ましいアッセイは、洗浄または分離工程、分析のための機械類でのサンプル除
去を必要としない。最も好ましくは、アッセイは、分析される生物学的流体に利
用でき、または、添加された場合に生物学的流体において酵素により迅速に分解
されない、プローブ、材料に含まれるまたは生成される材料のみを利用する。こ
れらの基準を満足するアフィニティーアッセイは、全血におけるリガンドを検出
するためのアフィニティーアッセイシステムの製造を可能にする。このようなア
フィニティーアッセイシステムは、当該発明において述べられている。
【０００５】 （発明の要約） 本発明のアフィニティーアッセイシステムは、前記第２要素が、前記検出電極
上のレドックスポリマーフィルム上または前記フィルム内に配置されている場合
に、前記第３要素の前記第２要素への結合により、前記第３要素の電気接触が基
礎となる。前記電極に対する検出マーカーの接続は、前記導電性レドックスポリ
マーを介する。本発明のアフィニティーアッセイは、タンパク質や核酸を含む多
様な特異的リガンドの検出および／または量の測定を、洗浄または分離工程なし
に行うことが可能である。本発明のアフィニティーアッセイシステムは、全血、
および組織ならびに生細胞培養のような他の未分離の生物学的流体について、毒
性または不安定な薬剤を添加することなく作動する。
上のレドックスポリマーフィルム上または前記フィルム内に配置されている場合
に、前記第３要素の前記第２要素への結合により、前記第３要素の電気接触が基
礎となる。前記電極に対する検出マーカーの接続は、前記導電性レドックスポリ
マーを介する。本発明のアフィニティーアッセイは、タンパク質や核酸を含む多
様な特異的リガンドの検出および／または量の測定を、洗浄または分離工程なし
に行うことが可能である。本発明のアフィニティーアッセイシステムは、全血、
および組織ならびに生細胞培養のような他の未分離の生物学的流体について、毒
性または不安定な薬剤を添加することなく作動する。
【０００６】 本発明のアフィニティーアッセイシステムは、導電性レドックスポリマー、好
ましくはレドックスハイドロゲルでコートされた電極を含む。前記レドックスポ
リマーは、多数の速いレドックス中心を有する。前記システムは少なくとも３つ
の要素を有している。第１ならびに第２要素、および第２ならびに第３要素もま
た、お互いにコンジュゲートしやすく、そのためお互いが結合することが可能で
ある。前記リガンド−リガンドレセプター対の前記第１要素は、アフィニティー
反応を通じてまたは共有結合のいずれかにより、前記レドックスポリマー内に固
定されている。前記リガンド−リンガンドレセプター対の第２要素は、前記第１
要素に結合する。第３要素は、ペルオキシダーゼのような増幅する検出マーカー
でラベルされている。検出化合物、すなわち検出マーカーの基質の生成は、コリ
ンオキシダーゼのような他の酵素により触媒される。前記検出化合物の生成を触
媒する酵素は、前記レドックスポリマー内に固定化されるが、前記電極が作動電
位で平衡を保っている場合に、その反応中心は、前記ポリマーの酸化型レドック
ス中心により酸化されず、また前記ポリマーの還元型レドックス中心により酸化
されないことが好ましい。
ましくはレドックスハイドロゲルでコートされた電極を含む。前記レドックスポ
リマーは、多数の速いレドックス中心を有する。前記システムは少なくとも３つ
の要素を有している。第１ならびに第２要素、および第２ならびに第３要素もま
た、お互いにコンジュゲートしやすく、そのためお互いが結合することが可能で
ある。前記リガンド−リガンドレセプター対の前記第１要素は、アフィニティー
反応を通じてまたは共有結合のいずれかにより、前記レドックスポリマー内に固
定されている。前記リガンド−リンガンドレセプター対の第２要素は、前記第１
要素に結合する。第３要素は、ペルオキシダーゼのような増幅する検出マーカー
でラベルされている。検出化合物、すなわち検出マーカーの基質の生成は、コリ
ンオキシダーゼのような他の酵素により触媒される。前記検出化合物の生成を触
媒する酵素は、前記レドックスポリマー内に固定化されるが、前記電極が作動電
位で平衡を保っている場合に、その反応中心は、前記ポリマーの酸化型レドック
ス中心により酸化されず、また前記ポリマーの還元型レドックス中心により酸化
されないことが好ましい。
【０００７】 好ましい形態において、前記アフィニティーアッセイシステムは、ｓｓ−ＤＮ
Ａもしくはｓｓ−ペプチドＤＮＡ（「ｓｓ」とは一本鎖を意味する）、アビジンま
たはストレプトアビジン、および過酸化水素を生成するコリンオキシダーゼのよ
うな基質生成酵素のように、生体コンジュゲート対の強力な結合要素が固定化さ
れている電子伝導性レドックスポリマーでコーティングされた電極を含む。リガ
ンド−リガンドレセプター対の前記第１要素は、ビオチン化、またはＤＮＡもし
くはペプチドＤＮＡでラベル化されており、ＤＮＡハイブリダイゼーションまた
はアビジン−ビオチン結合を介して前記レドックスポリマーに結合している。そ
れから、前記第２要素は、前記第１の要素に結合している。前記第３要素は、前
記検出マーカーである西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダー
ゼでラベルされている。前記ラベル化された第３要素は、前記第２要素を介して
前記電極に結合することによって、前記導電性レドックスポリマーを通じた前記
電極に対するペルオキシダーゼラベルの前記反応中心の電気接触が原因となり、
前記ペルオキシダーゼと前記レドックスポリマーとの間で電気的接触を生じる。
このような接触は、固定化された基質生成酵素により、前記フィルムを、前記フ
ィルム内で生成された過酸化水素の電気的還元のための触媒に交換する。
Ａもしくはｓｓ−ペプチドＤＮＡ（「ｓｓ」とは一本鎖を意味する）、アビジンま
たはストレプトアビジン、および過酸化水素を生成するコリンオキシダーゼのよ
うな基質生成酵素のように、生体コンジュゲート対の強力な結合要素が固定化さ
れている電子伝導性レドックスポリマーでコーティングされた電極を含む。リガ
ンド−リガンドレセプター対の前記第１要素は、ビオチン化、またはＤＮＡもし
くはペプチドＤＮＡでラベル化されており、ＤＮＡハイブリダイゼーションまた
はアビジン−ビオチン結合を介して前記レドックスポリマーに結合している。そ
れから、前記第２要素は、前記第１の要素に結合している。前記第３要素は、前
記検出マーカーである西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダー
ゼでラベルされている。前記ラベル化された第３要素は、前記第２要素を介して
前記電極に結合することによって、前記導電性レドックスポリマーを通じた前記
電極に対するペルオキシダーゼラベルの前記反応中心の電気接触が原因となり、
前記ペルオキシダーゼと前記レドックスポリマーとの間で電気的接触を生じる。
このような接触は、固定化された基質生成酵素により、前記フィルムを、前記フ
ィルム内で生成された過酸化水素の電気的還元のための触媒に交換する。
【０００８】 （発明の詳細な説明） （定義） ここで使用するように、続く用語および語句は、以下に示す定義である。
【０００９】 レドックスハイドロゲル ： 架橋されたレドックスポリマーの水和形態
【００１０】 基質生成酵素 ： 検出マーカーの基質を生成または生産する酵素であり、一
般にレドックスハイドロゲル内に固定化されている。前記検出マーカーは、通常
、酵素であり、また、前記第３要素に共有結合している。酵素により生成される
基質の例としては、Ｈ2Ｏ2がある。Ｈ2Ｏ2は、例えば、Ｏ2とコリンとの反応を
触媒する前記基質生成酵素コリンオキシダーゼにより生成される。前記電極が平
衡を保つ電位において、前記レドックスポリマーと電子を交換しない基質生成酵
素が好ましい。電子交換は、酵素からレドックスハイドロゲル、またはレドック
スハイドロゲルから酵素への電子の移動を意味する。
般にレドックスハイドロゲル内に固定化されている。前記検出マーカーは、通常
、酵素であり、また、前記第３要素に共有結合している。酵素により生成される
基質の例としては、Ｈ2Ｏ2がある。Ｈ2Ｏ2は、例えば、Ｏ2とコリンとの反応を
触媒する前記基質生成酵素コリンオキシダーゼにより生成される。前記電極が平
衡を保つ電位において、前記レドックスポリマーと電子を交換しない基質生成酵
素が好ましい。電子交換は、酵素からレドックスハイドロゲル、またはレドック
スハイドロゲルから酵素への電子の移動を意味する。
【００１１】 結合剤 ： 生体分子の薬剤を結合した高分子。結合剤の例としては、アビジ
ン、ストレプトアビジン。一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡお
よびペプチドオリゴヌクレオチドまたはペプチドＤＮＡを含む。前記結合剤は、
前記レドックスハイドロゲル内またはレドックス上に固定化される。
ン、ストレプトアビジン。一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡお
よびペプチドオリゴヌクレオチドまたはペプチドＤＮＡを含む。前記結合剤は、
前記レドックスハイドロゲル内またはレドックス上に固定化される。
【００１２】 前記リガンド−リガンドレセプター対の第１要素 ： 前記結合剤に、また前
記対の第２要素に結合した分子、または前記レドックスハイドロゲルに結合され
第２の要素に結合する分子。第１および第３要素は、同一ではない。第１要素の
例としては、ビオチン化された抗原がある。
記対の第２要素に結合した分子、または前記レドックスハイドロゲルに結合され
第２の要素に結合する分子。第１および第３要素は、同一ではない。第１要素の
例としては、ビオチン化された抗原がある。
【００１３】 前記リガンド−リガンドレセプター対の第２要素 ： 第１および第３要素へ
結合する。第２要素の例としては、前記第１要素の抗原および第３要素の抗原の
両方に対する抗体または抗体のＦ（ａｂ’）2フラグメントである。本発明の電
子化学的アフィニティーアッセイは、通常、第２要素である。
結合する。第２要素の例としては、前記第１要素の抗原および第３要素の抗原の
両方に対する抗体または抗体のＦ（ａｂ’）2フラグメントである。本発明の電
子化学的アフィニティーアッセイは、通常、第２要素である。
【００１４】 前記検出マーカーでラベルされた第３要素 ： 前記第２要素に結合し、検出
マーカーでラベル化されており、好ましくは酵素のような触媒であり、最も好ま
しくはオキシドリダクターゼである。第３要素の例としては、ペルオキシダーゼ
ラベル化抗体がある。
マーカーでラベル化されており、好ましくは酵素のような触媒であり、最も好ま
しくはオキシドリダクターゼである。第３要素の例としては、ペルオキシダーゼ
ラベル化抗体がある。
【００１５】 検出マーカー ： 触媒であり、通常は酵素、好ましくはオキシドリダクター
ゼであり、第３の要素をラベル化する。前記検出マーカーは電子を移動でき、ま
たは、前記電極上の前記レドックスハイドロゲルから電子を受け取ることができ
る。これらの過程において、前記検出マーカーは、電気酸化または電気還元され
る。電気酸化される場合、前記検出マーカーは検出化合物を酸化できる。電気還
元される場合、前記検出マーカーは検出化合物を還元できる。
ゼであり、第３の要素をラベル化する。前記検出マーカーは電子を移動でき、ま
たは、前記電極上の前記レドックスハイドロゲルから電子を受け取ることができ
る。これらの過程において、前記検出マーカーは、電気酸化または電気還元され
る。電気酸化される場合、前記検出マーカーは検出化合物を酸化できる。電気還
元される場合、前記検出マーカーは検出化合物を還元できる。
【００１６】 検出化合物 ： 分子もしくはイオン、または分子もしくはイオンの前駆体で
あり、それらの電気酸化または電気還元は、通常、電流または電位のような検出
される電気化学的シグナルを生産する。前記検出化合物は、前記レドックスポリ
マーフィルムにおいて電気酸化または電気還元される。電気還元される検出化合
物の例としては、過酸化水素がある。
あり、それらの電気酸化または電気還元は、通常、電流または電位のような検出
される電気化学的シグナルを生産する。前記検出化合物は、前記レドックスポリ
マーフィルムにおいて電気酸化または電気還元される。電気還元される検出化合
物の例としては、過酸化水素がある。
【００１７】 図１Ａおよび１Ｂの概略図に示すように、本発明のアフィニティーアッセイは
、レドックスポリマー１２、好ましくはレドックスハイドロゲルでコートされた
電極１０を含み、レドックスポリマー内においてアビジンのような結合剤１１を
介して第１要素１４が固定化されている。前記結合剤１１は、好ましくは前記レ
ドックスポリマー１２に共有結合されている。
、レドックスポリマー１２、好ましくはレドックスハイドロゲルでコートされた
電極１０を含み、レドックスポリマー内においてアビジンのような結合剤１１を
介して第１要素１４が固定化されている。前記結合剤１１は、好ましくは前記レ
ドックスポリマー１２に共有結合されている。
【００１８】 本発明のアッセイにおいて、前記リガンド−リガンドレセプター対の第２要素
１６は、前記第１要素１４とコンジュゲートし、それにより結合している。それ
から、前記第２要素１６は第３要素２０とコンジュゲートし、そして結合してい
る。前記第３要素２０は、検出マーカー１８でラベル化されている。「サンドイ
ッチ」型イムノアッセイにおいて、前記第２要素は抗体である。しかしながら、
前記第１および第３要素が、前記第２要素抗原の異なる領域に対する非特異的抗
体である場合は、第２要素は抗原であってもよい。前記レドックスハイドロゲル
１２はさらに少なくとも１つの基質生成酵素２２（前記検出化合物を生成する酵
素を意味する）を含んでいる。必要でないけれども、好ましくは、前記レドック
スポリマーフィルム１２が前記電極１０と接触し、前記電極が作動電位で平衡を
保つ場合に、前記基質生成酵素２２の反応中心は、前記レドックスポリマーの還
元型レドックス中心により還元されることも、前記レドックスポリマーの酸化型
レドックス中心により酸化されることもない。前記検出化合物は、好ましくは、
前記検出マーカー１８の基質であり、それは好ましくはオキシドリダクターゼで
ある。前記第１要素１４の前記第２要素１６への結合、および前記第２要素１６
の前記第３要素１８への結合は、電極を通じて流れる電流の増加を生じる。電流
の増加は、電極上における前記検出マーカー１８および前記レドックスハイドロ
ゲル１２の結合された存在において、前記検出化合物の電気化学的還元または酸
化反応の触媒作用により生じる。電流の増加は、リガンド対の第２要素１６の結
合と相関関係にあり、これにより、サンプルにおける前記第２要素１６の量と相
関関係を示す。この好ましいアッセイシステムは、分離または洗浄工程を必要と
せず、生物学的流体のインシトゥ（in situ）でのアッセイシステムに使用でき
る。前記アッセイは、血液のような着色された光散乱媒体において、または外部
から過酸化水素のような検出化合物を添加した媒体において実行できる。当該ア
ッセイにおいて、過酸化水素は、前記電極上の前記フィルム内で生成され、前記
第３要素に結合された前記検出マーカーの固定化を通じて前記フィルムが電気触
媒に変わる場合に、少なくとも部分的に電気還元に利用できる。
１６は、前記第１要素１４とコンジュゲートし、それにより結合している。それ
から、前記第２要素１６は第３要素２０とコンジュゲートし、そして結合してい
る。前記第３要素２０は、検出マーカー１８でラベル化されている。「サンドイ
ッチ」型イムノアッセイにおいて、前記第２要素は抗体である。しかしながら、
前記第１および第３要素が、前記第２要素抗原の異なる領域に対する非特異的抗
体である場合は、第２要素は抗原であってもよい。前記レドックスハイドロゲル
１２はさらに少なくとも１つの基質生成酵素２２（前記検出化合物を生成する酵
素を意味する）を含んでいる。必要でないけれども、好ましくは、前記レドック
スポリマーフィルム１２が前記電極１０と接触し、前記電極が作動電位で平衡を
保つ場合に、前記基質生成酵素２２の反応中心は、前記レドックスポリマーの還
元型レドックス中心により還元されることも、前記レドックスポリマーの酸化型
レドックス中心により酸化されることもない。前記検出化合物は、好ましくは、
前記検出マーカー１８の基質であり、それは好ましくはオキシドリダクターゼで
ある。前記第１要素１４の前記第２要素１６への結合、および前記第２要素１６
の前記第３要素１８への結合は、電極を通じて流れる電流の増加を生じる。電流
の増加は、電極上における前記検出マーカー１８および前記レドックスハイドロ
ゲル１２の結合された存在において、前記検出化合物の電気化学的還元または酸
化反応の触媒作用により生じる。電流の増加は、リガンド対の第２要素１６の結
合と相関関係にあり、これにより、サンプルにおける前記第２要素１６の量と相
関関係を示す。この好ましいアッセイシステムは、分離または洗浄工程を必要と
せず、生物学的流体のインシトゥ（in situ）でのアッセイシステムに使用でき
る。前記アッセイは、血液のような着色された光散乱媒体において、または外部
から過酸化水素のような検出化合物を添加した媒体において実行できる。当該ア
ッセイにおいて、過酸化水素は、前記電極上の前記フィルム内で生成され、前記
第３要素に結合された前記検出マーカーの固定化を通じて前記フィルムが電気触
媒に変わる場合に、少なくとも部分的に電気還元に利用できる。
【００１９】 図２は本発明のアフィニティーアッセイシステムにおける電子の流れの概略を
示す。基質生成酵素２２であるコリンオキシダーゼは、前記レドックスポリマー
１２内に存在し、前記レドックスハイドロゲル１２内で過酸化水素を生成する。
ペルオキシダーゼでラベルされた第３要素２０の、リガンド−リガンドレセプタ
ー対の固定化第２要素１６への結合は、過酸化水素をペルオキシダーゼで触媒す
る電気還元を可能にする。反応は、電子が、電極１０から前記レドックスハイド
ロゲル１２、前記レドックスハイドロゲル１２からペルオキシダーゼ、および、
ペルオキシダーゼから過酸化水素に流れて、過酸化水素が水に電気還元にされる
反応である。
示す。基質生成酵素２２であるコリンオキシダーゼは、前記レドックスポリマー
１２内に存在し、前記レドックスハイドロゲル１２内で過酸化水素を生成する。
ペルオキシダーゼでラベルされた第３要素２０の、リガンド−リガンドレセプタ
ー対の固定化第２要素１６への結合は、過酸化水素をペルオキシダーゼで触媒す
る電気還元を可能にする。反応は、電子が、電極１０から前記レドックスハイド
ロゲル１２、前記レドックスハイドロゲル１２からペルオキシダーゼ、および、
ペルオキシダーゼから過酸化水素に流れて、過酸化水素が水に電気還元にされる
反応である。
【００２０】 作用極 前記作用極１０は、一般に、絶縁基板上に導電性材料が配置された薄膜である
。前記基板に適当な材料としては、例えば、絶縁シリコン、電解シリコンジオキ
シド、シリケートガラス、アルミナ、アルミノケイ酸セラミック、エポキシ、エ
ポキシで強化されたグラスファイバーのようなエポキシ組成物、ポリエステル、
ポリイミド、ポリアミドまたはポリカーボネートが含まれる。
。前記基板に適当な材料としては、例えば、絶縁シリコン、電解シリコンジオキ
シド、シリケートガラス、アルミナ、アルミノケイ酸セラミック、エポキシ、エ
ポキシで強化されたグラスファイバーのようなエポキシ組成物、ポリエステル、
ポリイミド、ポリアミドまたはポリカーボネートが含まれる。
【００２１】 導電性材料の様々な種類が、前記作用極１０を形成するために使用できる。適
当な材料としては、例えば、炭素、導電性ポリマーおよび金属が含まれる。有用
な金属の例としては、金、プラチナ、パラジウム、タンタル、タングステン、お
よびそれらのアロイ、ならびに窒化チタンおよび二酸化ルテニウムのような金属
化合物が含まれる。前記好ましい導電体は、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）の電位
のプラス０．２ボルトの電位が供給される場合に、中性ｐＨ付近の０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ炭酸水溶液中において早急に腐食しない。腐食電流密度は、好ましくは、
１０-4Ａ ｃｍ-2以下であり、より好ましくは１０-7Ａ ｃｍ-2以下である。
当な材料としては、例えば、炭素、導電性ポリマーおよび金属が含まれる。有用
な金属の例としては、金、プラチナ、パラジウム、タンタル、タングステン、お
よびそれらのアロイ、ならびに窒化チタンおよび二酸化ルテニウムのような金属
化合物が含まれる。前記好ましい導電体は、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）の電位
のプラス０．２ボルトの電位が供給される場合に、中性ｐＨ付近の０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ炭酸水溶液中において早急に腐食しない。腐食電流密度は、好ましくは、
１０-4Ａ ｃｍ-2以下であり、より好ましくは１０-7Ａ ｃｍ-2以下である。
【００２２】 これらの材料の薄膜は、例えば、スパッタリング、反応スパッタリング、物理
蒸着、プラズマ蒸着、化学蒸着、印刷およびその他のコーティング方法を含む様
々な方法により形成できる。分離した導電性成分は、例えば、パターンマスクを
使用して、前記作用極をそれぞれ形成するために配置（deposited）できる。ま
た、連続した導電性フィルムを前記基板に配置してもよく、それから、前記作用
極を前記フィルムからパターニングできる。
蒸着、プラズマ蒸着、化学蒸着、印刷およびその他のコーティング方法を含む様
々な方法により形成できる。分離した導電性成分は、例えば、パターンマスクを
使用して、前記作用極をそれぞれ形成するために配置（deposited）できる。ま
た、連続した導電性フィルムを前記基板に配置してもよく、それから、前記作用
極を前記フィルムからパターニングできる。
【００２３】 金属および他の材料の薄膜のパターニング技術は、半導体分野においてよく知
られており、フォトリソグラフィー技術を含む。具体的な技術は、導電性材料の
薄膜を配置し、それから前記薄膜を覆ってフォトレジスト層を配置することを含
む。一般的なフォトレジストは、特異的な波長または波長範囲の光に曝露するこ
とによって変化する化学薬品、多くの場合有機化合物である。光に曝露すること
により、フォトレジストは、化学薬剤により多少除去されやすくなる。フォトレ
ジスト層を供給した後、前記フォトレジストを、マスクを通じて、光または電磁
波照射に曝露する。また、フォトレジストは、エレクトロンのような帯電粒子の
ビーム下でパターニングされる。前記マスクは、フォトレジストの種類に応じた
、ポジティブまたはネガティブマスクでもよい。前記マスクは、前記検出マーカ
ーおよび前記レドックスハイドロゲルが両方電極上に存在し固定化されている場
合に、電気触媒反応を起こす電極である作用極の所望のパターンを含む。一度曝
露されると、作用極間のフォトレジスト部分および前記薄膜は、例えば、アレイ
の絶縁された作用極を除去するための、基本的なエッチング技術（ドライまたは
ウエット）を使用することによって選択的に除去される。
られており、フォトリソグラフィー技術を含む。具体的な技術は、導電性材料の
薄膜を配置し、それから前記薄膜を覆ってフォトレジスト層を配置することを含
む。一般的なフォトレジストは、特異的な波長または波長範囲の光に曝露するこ
とによって変化する化学薬品、多くの場合有機化合物である。光に曝露すること
により、フォトレジストは、化学薬剤により多少除去されやすくなる。フォトレ
ジスト層を供給した後、前記フォトレジストを、マスクを通じて、光または電磁
波照射に曝露する。また、フォトレジストは、エレクトロンのような帯電粒子の
ビーム下でパターニングされる。前記マスクは、フォトレジストの種類に応じた
、ポジティブまたはネガティブマスクでもよい。前記マスクは、前記検出マーカ
ーおよび前記レドックスハイドロゲルが両方電極上に存在し固定化されている場
合に、電気触媒反応を起こす電極である作用極の所望のパターンを含む。一度曝
露されると、作用極間のフォトレジスト部分および前記薄膜は、例えば、アレイ
の絶縁された作用極を除去するための、基本的なエッチング技術（ドライまたは
ウエット）を使用することによって選択的に除去される。
【００２４】 前記作用極１０は、例えば、正方形、長方形、円形、楕円形等を含む様々な形
状をとることができる。前記作用極は、５０μｍ以下の大きさ（例えば、長さ、
幅または直径）でもよい。実施形態において、前記作用極は、三次構造であり、
表面積が１×１０-4ｃｍ2以下でもよい。多種の電極がアレイに使用できる。
状をとることができる。前記作用極は、５０μｍ以下の大きさ（例えば、長さ、
幅または直径）でもよい。実施形態において、前記作用極は、三次構造であり、
表面積が１×１０-4ｃｍ2以下でもよい。多種の電極がアレイに使用できる。
【００２５】 対極および比較電極は、前記作用極を含む前記基材の表面から離れて、電解液
中に存在する。また、前記対極および比較電極は、前記作用極を含む基材上に形
成されてもよく、例えば、作用極と同じまたは異なる表面上に位置してもよい。
それぞれの作用極は、専用の対極または比較電極を有する必要はない。同じ対極
または比較電極は、アレイの多種多様な電極、また全ての電極として働く。Ａｇ
／ＡｇＣｌ電極のような単一電極は、対極および比較電極の両方として作用でき
る。好ましくは、前記比較電極は、イオンを浸出せず、また一定の電位を維持で
きるものである。前記比較電極は、例えば、電解液に接触させる銀線または構造
（structure）をでもよい。前記銀線または構造の表面は、ＡｇＣｌを化学的ま
たは電気化学的に生産するために、部分的に酸化されてもよい。
中に存在する。また、前記対極および比較電極は、前記作用極を含む基材上に形
成されてもよく、例えば、作用極と同じまたは異なる表面上に位置してもよい。
それぞれの作用極は、専用の対極または比較電極を有する必要はない。同じ対極
または比較電極は、アレイの多種多様な電極、また全ての電極として働く。Ａｇ
／ＡｇＣｌ電極のような単一電極は、対極および比較電極の両方として作用でき
る。好ましくは、前記比較電極は、イオンを浸出せず、また一定の電位を維持で
きるものである。前記比較電極は、例えば、電解液に接触させる銀線または構造
（structure）をでもよい。前記銀線または構造の表面は、ＡｇＣｌを化学的ま
たは電気化学的に生産するために、部分的に酸化されてもよい。
【００２６】 レドックスポリマー 前記電極は、レドックスポリマー１２の薄膜と接触している。前記レドックス
ポリマー１２は、前記電極１０の上に配置されている。多種の作用極が使用され
る場合は、レドックスポリマー１２は、電極１０の間で基材上に配置されない。
このように、それぞれの作用極の電気分離を維持する。レドックスポリマーを専
ら電極上に配置できることによる他の特異的な方法は、電気泳動法である。これ
は、電極の直径が小さい、通常５０μｍ以下である場合に、アレイの電極をコー
ティングするための好ましい方法である。
ポリマー１２は、前記電極１０の上に配置されている。多種の作用極が使用され
る場合は、レドックスポリマー１２は、電極１０の間で基材上に配置されない。
このように、それぞれの作用極の電気分離を維持する。レドックスポリマーを専
ら電極上に配置できることによる他の特異的な方法は、電気泳動法である。これ
は、電極の直径が小さい、通常５０μｍ以下である場合に、アレイの電極をコー
ティングするための好ましい方法である。
【００２７】 レドックスハイドロゲルは、水溶液中に浸漬した架橋されたレドックスポリマ
ーで形成される。前記レドックスハイドロゲルは、前記電極と前記検出マーカー
との間における電子の移動を提供する。レドックスポリマーのある種類は、一般
に少なくとも１０％の水分を含むレドックスハイドロゲルである。水溶性分子は
、通常、前記レドックスハイドロゲルを通じて迅速に浸透する。前記レドックス
ハイドロゲルの電子伝導は、つなぎとめられているポリマーセグメント間の電子
交換を通じて生じると考えられ、浸出されないが、それにもかかわらず限られた
小さい半径内において移動可能である
ーで形成される。前記レドックスハイドロゲルは、前記電極と前記検出マーカー
との間における電子の移動を提供する。レドックスポリマーのある種類は、一般
に少なくとも１０％の水分を含むレドックスハイドロゲルである。水溶性分子は
、通常、前記レドックスハイドロゲルを通じて迅速に浸透する。前記レドックス
ハイドロゲルの電子伝導は、つなぎとめられているポリマーセグメント間の電子
交換を通じて生じると考えられ、浸出されないが、それにもかかわらず限られた
小さい半径内において移動可能である
【００２８】 一般に、前記レドックスポリマーは、電気還元および電気酸化機能、すなわち
レドックス中心を含む。これらは、標準カロメル電極（ＳＣＥ）のレドックス電
位の上下数百ｍＶのレドックス電位を有する。好ましくは、前記ポリマー電位の
前記レドックス中心は、ＳＣＥに対して、約−４００ｍＶより還元されず、約８
００ｍＶより酸化されない。そして、最も好ましくは、中性ｐＨにおいて、ＳＣ
Ｅに対して、約−１５０ｍＶより還元されず、約＋４００ｍＶより酸化されない
。最も好ましいレドックスポリマーは、オスミウム、ルテニウム、またはコバル
トレドックス中心を有し、また、ＳＣＥに対して約−１５０ｍＶから約＋４００
ｍＶの範囲のレドックス電位を有する。
レドックス中心を含む。これらは、標準カロメル電極（ＳＣＥ）のレドックス電
位の上下数百ｍＶのレドックス電位を有する。好ましくは、前記ポリマー電位の
前記レドックス中心は、ＳＣＥに対して、約−４００ｍＶより還元されず、約８
００ｍＶより酸化されない。そして、最も好ましくは、中性ｐＨにおいて、ＳＣ
Ｅに対して、約−１５０ｍＶより還元されず、約＋４００ｍＶより酸化されない
。最も好ましいレドックスポリマーは、オスミウム、ルテニウム、またはコバル
トレドックス中心を有し、また、ＳＣＥに対して約−１５０ｍＶから約＋４００
ｍＶの範囲のレドックス電位を有する。
【００２９】 一般に、本発明の使用に安定なレドックスポリマーは、サンプルを分析する一
定期間の間、レドックス種の外向きの拡散または損失を防止もしくは実質的に減
少する結合を有し、または荷電している。前記レドックス種と前記ポリマーとの
結合は、共有、配位またはイオン結合でもよい。有用なレドックスポリマーおよ
びそれらを生産するための方法は、ここに引例として組込んだ米国特許第５，２
６４，１０４号、第５，３５６，７８６号、第５，２６２，０３５号、第５，３
２０，７２５号および第５，６６５，２２２号に記載されている。多くの無機ま
たは有機金属レドックス中心は、ポリマー内に組込まれるか、結合され、本発明
のシステムにおいて使用される。好ましいレドックス種は、遷移金属複合体であ
る。より好ましい遷移金属複合体は、オスミウム、ルテニウム、鉄およびコバル
ト化合物または複合体である。最も好ましいものは、オスミウムおよびルテニウ
ム複合体である。
定期間の間、レドックス種の外向きの拡散または損失を防止もしくは実質的に減
少する結合を有し、または荷電している。前記レドックス種と前記ポリマーとの
結合は、共有、配位またはイオン結合でもよい。有用なレドックスポリマーおよ
びそれらを生産するための方法は、ここに引例として組込んだ米国特許第５，２
６４，１０４号、第５，３５６，７８６号、第５，２６２，０３５号、第５，３
２０，７２５号および第５，６６５，２２２号に記載されている。多くの無機ま
たは有機金属レドックス中心は、ポリマー内に組込まれるか、結合され、本発明
のシステムにおいて使用される。好ましいレドックス種は、遷移金属複合体であ
る。より好ましい遷移金属複合体は、オスミウム、ルテニウム、鉄およびコバル
ト化合物または複合体である。最も好ましいものは、オスミウムおよびルテニウ
ム複合体である。
【００３０】 ある種のレドックスポリマーは、ポリマーに共有結合したレドックス種を含む
。このようなポリマーの一例としては、ポリ（ビニルフェロセン）がある。レド
ックスポリマーの他の種類は、静電気的に結合したレドックス種を含む。一般に
、このタイプのレドックスポリマーは、反対に荷電したレドックス種と結合した
荷電ポリマーを含む。このタイプのレドックスポリマーの具体例としては、１以
上のオスミウムまたはルテニウムポリピリジルカチオンを含む正荷電したレドッ
クス種が分布している、商品名Ｎａｆｉｏｎ（デュポン社）のような負に荷電し
たポリマーを含む。このようなポリマーの他の例は、４級化（quaternized）ポ
リ（４−ビニルピリジン）またはポリ（１−ビニルイミダゾール）のような正荷
電された官能基（function）、およびフェリシアナイドならびにフェロシアナイ
ドのような負電荷レドックス種を有するポリマーである。前記レドックスポリマ
ーは、それ自体が重合体であり、レドックスポリマー内に静電気的に結合され反
対に荷電されたポリマーを有している高荷電のレドックス種から構成されてもよ
い。
。このようなポリマーの一例としては、ポリ（ビニルフェロセン）がある。レド
ックスポリマーの他の種類は、静電気的に結合したレドックス種を含む。一般に
、このタイプのレドックスポリマーは、反対に荷電したレドックス種と結合した
荷電ポリマーを含む。このタイプのレドックスポリマーの具体例としては、１以
上のオスミウムまたはルテニウムポリピリジルカチオンを含む正荷電したレドッ
クス種が分布している、商品名Ｎａｆｉｏｎ（デュポン社）のような負に荷電し
たポリマーを含む。このようなポリマーの他の例は、４級化（quaternized）ポ
リ（４−ビニルピリジン）またはポリ（１−ビニルイミダゾール）のような正荷
電された官能基（function）、およびフェリシアナイドならびにフェロシアナイ
ドのような負電荷レドックス種を有するポリマーである。前記レドックスポリマ
ーは、それ自体が重合体であり、レドックスポリマー内に静電気的に結合され反
対に荷電されたポリマーを有している高荷電のレドックス種から構成されてもよ
い。
【００３１】 本発明の他の実施形態においては、安定なレドックスポリマーは、ポリマーに
配位結合したレドックス中心を含む。例えば、前記レドックス種は、オスニウム
イオン、ルテニウムイオンまたはコバルトイオンを、２，２’−ビピリジルと、
さらにポリ（１−ビニルイミダゾール）もしくはポリ（４−ビニルピリジン）と
、またはこれらのいずれかのコポリマーと、複合するによって形成してもよい。
配位結合したレドックス中心を含む。例えば、前記レドックス種は、オスニウム
イオン、ルテニウムイオンまたはコバルトイオンを、２，２’−ビピリジルと、
さらにポリ（１−ビニルイミダゾール）もしくはポリ（４−ビニルピリジン）と
、またはこれらのいずれかのコポリマーと、複合するによって形成してもよい。
【００３２】 好ましいレドックス種は、遷移金属の複合体であり、最も好ましくはオスミウ
ム、ルテニウムまたはコバルトの複合体である。前記複合体は、２，２’−ビピ
リジン、１，１０−フェナントロリン、２，２’，２”−テルピリジンまたはこ
れらの誘導体のような、各リガンドが２以上の環を有し、各環が１以上の窒素原
子を有する、１以上の複素環リガンドを含む。より好ましい複合体は、２つのリ
ガンドと複合されたオスミウムカチオンを含み、各リガンドは２，２’−ビピリ
ジン、１，１０−フェナントロリンまたはこれらの誘導体を含み、前記２つのリ
ガンドは同じである必要はない。好ましいオスミウム、ルテニウムまたはコバル
トの複合体において、金属イオンの３つ以上の配位部位は、窒素で占められてお
り（Nitrogen occupied）、リガンドの数は、１〜３の範囲である。最も好まし
い複合体において、前記配位部位の５つは、窒素で占められており、リガンドの
数は２〜３の範囲である。
ム、ルテニウムまたはコバルトの複合体である。前記複合体は、２，２’−ビピ
リジン、１，１０−フェナントロリン、２，２’，２”−テルピリジンまたはこ
れらの誘導体のような、各リガンドが２以上の環を有し、各環が１以上の窒素原
子を有する、１以上の複素環リガンドを含む。より好ましい複合体は、２つのリ
ガンドと複合されたオスミウムカチオンを含み、各リガンドは２，２’−ビピリ
ジン、１，１０−フェナントロリンまたはこれらの誘導体を含み、前記２つのリ
ガンドは同じである必要はない。好ましいオスミウム、ルテニウムまたはコバル
トの複合体において、金属イオンの３つ以上の配位部位は、窒素で占められてお
り（Nitrogen occupied）、リガンドの数は、１〜３の範囲である。最も好まし
い複合体において、前記配位部位の５つは、窒素で占められており、リガンドの
数は２〜３の範囲である。
【００３３】 好ましいレドックス種は、前記複合体が迅速に電気還元および電気酸化される
ため、自己交換として知られるプロセスにおいてお互い、また、前記作用極とも
迅速に電子を交換する。これらが前記レドックスポリマーにおいて静電気的に保
持されている間、好ましいレドックス種は、前記ポリマーに配位的にまたは共有
的に結合されている。前記金属イオン複合体のイオンに配位的に結合する好まし
いポリマーは、ピリジン、イミダゾールまたはこれらの誘導体のような窒素を含
む複素環を有している。これらは、リガンドとして、レドックス種のカチオンに
結合する。
ため、自己交換として知られるプロセスにおいてお互い、また、前記作用極とも
迅速に電子を交換する。これらが前記レドックスポリマーにおいて静電気的に保
持されている間、好ましいレドックス種は、前記ポリマーに配位的にまたは共有
的に結合されている。前記金属イオン複合体のイオンに配位的に結合する好まし
いポリマーは、ピリジン、イミダゾールまたはこれらの誘導体のような窒素を含
む複素環を有している。これらは、リガンドとして、レドックス種のカチオンに
結合する。
【００３４】 オスニウム複合体のようなレドックス種との複合体生成のために好ましいポリ
マーは、上述のように、ポリ（１−ビニルイミダゾール）（「ＰＶＩ」という）
、ポリ（４−ビニルピリジン）（「ＰＶＰ」という）およびピリジニウム−修飾
ポリ（アクリル酸）のようなポリマーおよびコポリマーを含む。ポリ（１−ビニ
ルイミダゾール）の安定なコポリマー置換体は、アクリロニトリル、アクリルア
ミド、アクリルヒドラジンおよび置換または４級化（quaternized）Ｎ−ビニル
イミダゾールを含む。オスミウム複合体は、ポリマーのイミダゾール基およびピ
リジン基と配位的に結合する。非配位化合物（ｍｅｒｓ）、またはアクリルアミ
ドもしくはアクリロニトリルのような弱い配位化合物（ｍｅｒｓ）、およびＮ-
ビニル−イミダゾールまたは４−ビニルピリジンのような強力な配位化合物（ｍ
ｅｒｓ）を含むコポリマーにおいて、オスミウム複合体と、イミダゾール基およ
び／またはピリジン基の比は、１：１０〜１：１の範囲であり、好ましくは１：
２〜１：１、より好ましくは３：４〜１：１である。また、複合された遷移金属
原子の数と重合されたビニル官能基（function）の比は、約１：２〜約１：３０
であり、より好ましくは約１：５〜約１：２０である。
マーは、上述のように、ポリ（１−ビニルイミダゾール）（「ＰＶＩ」という）
、ポリ（４−ビニルピリジン）（「ＰＶＰ」という）およびピリジニウム−修飾
ポリ（アクリル酸）のようなポリマーおよびコポリマーを含む。ポリ（１−ビニ
ルイミダゾール）の安定なコポリマー置換体は、アクリロニトリル、アクリルア
ミド、アクリルヒドラジンおよび置換または４級化（quaternized）Ｎ−ビニル
イミダゾールを含む。オスミウム複合体は、ポリマーのイミダゾール基およびピ
リジン基と配位的に結合する。非配位化合物（ｍｅｒｓ）、またはアクリルアミ
ドもしくはアクリロニトリルのような弱い配位化合物（ｍｅｒｓ）、およびＮ-
ビニル−イミダゾールまたは４−ビニルピリジンのような強力な配位化合物（ｍ
ｅｒｓ）を含むコポリマーにおいて、オスミウム複合体と、イミダゾール基およ
び／またはピリジン基の比は、１：１０〜１：１の範囲であり、好ましくは１：
２〜１：１、より好ましくは３：４〜１：１である。また、複合された遷移金属
原子の数と重合されたビニル官能基（function）の比は、約１：２〜約１：３０
であり、より好ましくは約１：５〜約１：２０である。
【００３５】 他のレドックス種の例としては、キノンおよびナイルブルーやインドフェノー
ルのような酸化状態でキノイド構造を有する種を含む。好ましいキノンおよびキ
ノイドは、六員環内に水素原子を有していない。
ルのような酸化状態でキノイド構造を有する種を含む。好ましいキノンおよびキ
ノイドは、六員環内に水素原子を有していない。
【００３６】 前記レドックスポリマー１２も、好ましくはリガンド−リガンドレセプター対
の前記第１要素１４に結合するための結合剤１１を含む。好ましい実施形態にお
いて、前記結合剤１１は、アビジンまたはストレプトアビジンである。ビオチン
化された第１要素１４に結合することにより、前記電極上の前記第１要素１４に
固定化される。
の前記第１要素１４に結合するための結合剤１１を含む。好ましい実施形態にお
いて、前記結合剤１１は、アビジンまたはストレプトアビジンである。ビオチン
化された第１要素１４に結合することにより、前記電極上の前記第１要素１４に
固定化される。
【００３７】 前記結合剤１１は、好ましくは、例えば、前記ポリマー上のヒドラジド官能基
に対するアビジンまたはストレプトアビジンのカルボキシル基のカルボジイミド
結合により、前記ポリマーに共有結合されている。前記結合剤１１がオリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡの場合、カルボジイミドおよび類似するカップリング剤は
、好ましくは、図３のＰＡＨのようなポリマーのヒドラジン官能基に共有結合で
きるこれらの分子の末端リン酸官能基を活性化する。
に対するアビジンまたはストレプトアビジンのカルボキシル基のカルボジイミド
結合により、前記ポリマーに共有結合されている。前記結合剤１１がオリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡの場合、カルボジイミドおよび類似するカップリング剤は
、好ましくは、図３のＰＡＨのようなポリマーのヒドラジン官能基に共有結合で
きるこれらの分子の末端リン酸官能基を活性化する。
【００３８】 また、前記第１要素１４は、カルボジイミドカップリングのような方法により
、前記レドックスポリマーに直接、好ましくは共有的に結合できる。
、前記レドックスポリマーに直接、好ましくは共有的に結合できる。
【００３９】 一実施形態において、前記ポリマーは、Ｏｓ（ｂｐｙ）2Ｃｌ+/2+がイミダゾ
ール官能基またはピリミジン官能基の各々に結合された、ポリアクリルアミド（
「ＰＡＡ」という）とＰＶＩまたはＰＶＰのコポリマーである。このレドックス
ポリマーのヒドラジド形成のために、前記結合剤１１の共有結合または第１要素
の結合に続いて、公知のプロセスに従って、アミド官能基の一部分が、ヒドラジ
ンとの反応によりヒドラジド官能基に交換される。一般的に、少なくとも５％の
アミド基が交換され、好ましくはアミド基の少なくとも１０％が交換され、より
好ましくはアミド基の少なくとも２０％が交換される。結果として得られるポリ
マーのヒドラジン修飾されたアミド基と非修飾アミド基の比は、一般的に１：１
〜１：２０、好ましくは１：２〜１：１０である。ＰＶＩまたはＰＶＰと、ＰＡ
Ａとの比は、一般に、５：１〜１：１５であり、好ましくは２：１〜１：１２、
およびより好ましくは１：１〜１：１０である。アミド部分がヒドラジドに交換
されるＰＡＡコポリマーは、ＰＡＨと呼ばれる。
ール官能基またはピリミジン官能基の各々に結合された、ポリアクリルアミド（
「ＰＡＡ」という）とＰＶＩまたはＰＶＰのコポリマーである。このレドックス
ポリマーのヒドラジド形成のために、前記結合剤１１の共有結合または第１要素
の結合に続いて、公知のプロセスに従って、アミド官能基の一部分が、ヒドラジ
ンとの反応によりヒドラジド官能基に交換される。一般的に、少なくとも５％の
アミド基が交換され、好ましくはアミド基の少なくとも１０％が交換され、より
好ましくはアミド基の少なくとも２０％が交換される。結果として得られるポリ
マーのヒドラジン修飾されたアミド基と非修飾アミド基の比は、一般的に１：１
〜１：２０、好ましくは１：２〜１：１０である。ＰＶＩまたはＰＶＰと、ＰＡ
Ａとの比は、一般に、５：１〜１：１５であり、好ましくは２：１〜１：１２、
およびより好ましくは１：１〜１：１０である。アミド部分がヒドラジドに交換
されるＰＡＡコポリマーは、ＰＡＨと呼ばれる。
【００４０】 他の実施形態において、前記ポリマーは、修飾ポリ（アクリル酸）である。前
記ポリ（アクリル酸）のカルボン酸官能基の部位は、ピリジンまたはイミダゾー
ルを有する官能基に交換される。これらは、４−（アミノアルキル）−ピリジン
、特に４−（２−アミノエチル）−ピリジンと形成されるようなアミドでもよく
、カルボジイミドカップリングを通じて共有結合してもよい。それから、ピリジ
ンおよびイミダゾール基は、オスニウム複合体との配位結合に使用できる。一般
的に、少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも
１０％のカルボン酸官能基が、ピリジンまたはイミダゾール環を有する官能基に
交換される。残存しているカルボン酸基の少なくとも一部分は、レドックスポリ
マーと架橋するため、また前記結合剤または前記第１要素と共有結合するために
、ヒドラジド基に交換される。一般的に、少なくとも２％、好ましくは少なくと
も５％、より好ましくは少なくとも１０％の残存カルボン酸基がヒドラジド基に
交換される。
記ポリ（アクリル酸）のカルボン酸官能基の部位は、ピリジンまたはイミダゾー
ルを有する官能基に交換される。これらは、４−（アミノアルキル）−ピリジン
、特に４−（２−アミノエチル）−ピリジンと形成されるようなアミドでもよく
、カルボジイミドカップリングを通じて共有結合してもよい。それから、ピリジ
ンおよびイミダゾール基は、オスニウム複合体との配位結合に使用できる。一般
的に、少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも
１０％のカルボン酸官能基が、ピリジンまたはイミダゾール環を有する官能基に
交換される。残存しているカルボン酸基の少なくとも一部分は、レドックスポリ
マーと架橋するため、また前記結合剤または前記第１要素と共有結合するために
、ヒドラジド基に交換される。一般的に、少なくとも２％、好ましくは少なくと
も５％、より好ましくは少なくとも１０％の残存カルボン酸基がヒドラジド基に
交換される。
【００４１】 様々な方法が、レドックスポリマーを電極表面に固定化するために使用される
。一つの方法は、吸着固定である。この方法は、相対的に高分子、例えば、約１
０4ダルトン（Ｄａ）以上、好ましくは約１０5ダルトン（Ｄａ）以上、より好ま
しくは約１０6ダルトン（Ｄａ）以上であるレドックスポリマーに特に有用であ
る。ポリマーの分子量は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ カタログ、１９９４、Ｔ１５
５〜Ｔ１６７頁に記載されているような、ジ−または多官能性架橋剤との架橋に
より増加してもよい。本発明において有用な架橋剤の官能基の具体例としては、
エポキシ、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、イミダート
、チオールおよびキノン官能基が含まれる。架橋剤の例としては、ポリ（エチレ
ングリコール）ジグリシジルエーテルおよび塩化シアヌル、最も好ましくは４０
０または６００ダルトン（Ｄａ）のポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエ
ーテル（ＰＥＧＤＧＥ）が含まれる。他の架橋剤も、また使用できる。
。一つの方法は、吸着固定である。この方法は、相対的に高分子、例えば、約１
０4ダルトン（Ｄａ）以上、好ましくは約１０5ダルトン（Ｄａ）以上、より好ま
しくは約１０6ダルトン（Ｄａ）以上であるレドックスポリマーに特に有用であ
る。ポリマーの分子量は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ カタログ、１９９４、Ｔ１５
５〜Ｔ１６７頁に記載されているような、ジ−または多官能性架橋剤との架橋に
より増加してもよい。本発明において有用な架橋剤の官能基の具体例としては、
エポキシ、アルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、イミダート
、チオールおよびキノン官能基が含まれる。架橋剤の例としては、ポリ（エチレ
ングリコール）ジグリシジルエーテルおよび塩化シアヌル、最も好ましくは４０
０または６００ダルトン（Ｄａ）のポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエ
ーテル（ＰＥＧＤＧＥ）が含まれる。他の架橋剤も、また使用できる。
【００４２】 他の実施形態において、前記レドックスポリマーは、共有結合により官能化電
極表面に固定化される。炭素表面は、例えば、ｐＨ６以下において二価鉄イオン
の存在下、ジアゾニウム塩の電気還元により、または過酸化水素との酸化により
、レドックスポリマーの共有結合のために修飾されてもよい。図のように、ｐ−
アミノ安息香酸のジアゾ化により形成されたジアゾニウム塩の還元は、フェニル
カルボン酸基で炭素表面を修飾する。それから、これらの基は、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイ
ミドにより活性化されてもよい。それから、活性化された基は、ヒドラジド、ま
たは、例えば、図３のポリマー、ＰＡＨのようなアミンで官能化されたレドック
ス対と結合する。
極表面に固定化される。炭素表面は、例えば、ｐＨ６以下において二価鉄イオン
の存在下、ジアゾニウム塩の電気還元により、または過酸化水素との酸化により
、レドックスポリマーの共有結合のために修飾されてもよい。図のように、ｐ−
アミノ安息香酸のジアゾ化により形成されたジアゾニウム塩の還元は、フェニル
カルボン酸基で炭素表面を修飾する。それから、これらの基は、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイ
ミドにより活性化されてもよい。それから、活性化された基は、ヒドラジド、ま
たは、例えば、図３のポリマー、ＰＡＨのようなアミンで官能化されたレドック
ス対と結合する。
【００４３】 好ましいレドックスハイドロゲル１２は、また本発明のアフィニティーアッセ
イにおいて有用な付加化合物を含む。特に、前記基質生成酵素２２を含む。この
酵素は、前記検出マーカー１８の基質である検出化合物の生成を触媒する。前記
酵素は、安定で好ましい非毒性試薬との反応により前記検出化合物を生成する。
電極上の前記フィルム内における前記検出化合物の内部生成(internal generat
ion)の結果として、分析される流体に対する不安定または毒性試薬の添加の必要
が回避できる。これは、例えば、過酸化水素のような第３要素の検出マーカーを
意味する検出化合物が迅速に分解される全血のアフィニティーアッセイを可能に
する。
イにおいて有用な付加化合物を含む。特に、前記基質生成酵素２２を含む。この
酵素は、前記検出マーカー１８の基質である検出化合物の生成を触媒する。前記
酵素は、安定で好ましい非毒性試薬との反応により前記検出化合物を生成する。
電極上の前記フィルム内における前記検出化合物の内部生成(internal generat
ion)の結果として、分析される流体に対する不安定または毒性試薬の添加の必要
が回避できる。これは、例えば、過酸化水素のような第３要素の検出マーカーを
意味する検出化合物が迅速に分解される全血のアフィニティーアッセイを可能に
する。
【００４４】 前記レドックスポリマーに固定化される基質生成酵素の一例は、電極上の前記
レドックスポリマーフィルム内において、ｉｎ ｓｉｔｕで過酸化水素を生成す
るコリンオキシダーゼである。前記第３要素の前記ペルオキシダーゼ検出マーカ
ーが前記レドックスハイドロゲルと接触する場合に、過酸化水素は、触媒により
電気還元される。ペルオキシダーゼ検出マーカーまたはレドックスポリマーのい
ずれかが不存在の場合、前記フィルムは、０．１Ｖ（ＳＣＥ）〜＋０．４Ｖ（Ｓ
ＣＥ）の供給された電位範囲において、Ｈ2Ｏ2還元のための電気的触媒反応を示
さず、前記フィルムは、ペルオキシダーゼおよびレドックスポリマーの両方が同
時固定化されている場合に、この範囲で電気的触媒反応を示す。コリンオキシダ
ーゼのレドックス中心または反応中心は、前記レドックスハイドロゲルのそれと
、電子を迅速に交換しないので、ハイドロゲルにおける酵素の存在およびコリン
の存在は、通常、電流または電位のシグナルを変化させない。コリンオキシダー
ゼは分子酸素とコリンとの反応を触媒し、これによって、過酸化水素およびベタ
インアルデヒドを形成する。
レドックスポリマーフィルム内において、ｉｎ ｓｉｔｕで過酸化水素を生成す
るコリンオキシダーゼである。前記第３要素の前記ペルオキシダーゼ検出マーカ
ーが前記レドックスハイドロゲルと接触する場合に、過酸化水素は、触媒により
電気還元される。ペルオキシダーゼ検出マーカーまたはレドックスポリマーのい
ずれかが不存在の場合、前記フィルムは、０．１Ｖ（ＳＣＥ）〜＋０．４Ｖ（Ｓ
ＣＥ）の供給された電位範囲において、Ｈ2Ｏ2還元のための電気的触媒反応を示
さず、前記フィルムは、ペルオキシダーゼおよびレドックスポリマーの両方が同
時固定化されている場合に、この範囲で電気的触媒反応を示す。コリンオキシダ
ーゼのレドックス中心または反応中心は、前記レドックスハイドロゲルのそれと
、電子を迅速に交換しないので、ハイドロゲルにおける酵素の存在およびコリン
の存在は、通常、電流または電位のシグナルを変化させない。コリンオキシダー
ゼは分子酸素とコリンとの反応を触媒し、これによって、過酸化水素およびベタ
インアルデヒドを形成する。
【００４５】 リガンド−リガンドレセプター対 リガンド−リガンドレセプター対は、第１要素および第２要素からなり、特異
的に結合することが知られている対を含む。このようなリガンド−リガンドレセ
プター対は、よく知られており、以下に示すものが含まれる。抗原−抗体、例え
ば、生育因子等のペプチド−レセプター、核酸−核酸結合タンパク質、核酸の相
補対、およびペプチド核酸もしくは核酸の相補対。
的に結合することが知られている対を含む。このようなリガンド−リガンドレセ
プター対は、よく知られており、以下に示すものが含まれる。抗原−抗体、例え
ば、生育因子等のペプチド−レセプター、核酸−核酸結合タンパク質、核酸の相
補対、およびペプチド核酸もしくは核酸の相補対。
【００４６】 抗体を使用する場合、Ｆ（ａｂ’）2断片のような断片を使用できる。核酸配
列を使用する場合は、約２００ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドが好まし
い。
列を使用する場合は、約２００ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドが好まし
い。
【００４７】 前記リガンド−リガンドレセプター対の第１要素１４は、前記レドックスポリ
マー１２に共有結合することにより、より好ましくは、前記結合剤１１との非共
有アフィニティー結合を通じて、前記電極１０上に固定化される。
マー１２に共有結合することにより、より好ましくは、前記結合剤１１との非共
有アフィニティー結合を通じて、前記電極１０上に固定化される。
【００４８】 前記リガンド−リガンドレセプター対の前記第２要素１６は、前記第１要素１
４に結合している。このような結合に対して安定な反応状態は、技術分野におい
て知られており、使用される特有の対の性質で変化する。
４に結合している。このような結合に対して安定な反応状態は、技術分野におい
て知られており、使用される特有の対の性質で変化する。
【００４９】 前記第３要素およびその検出マーカー 第３要素２０および第２要素１６もまた、リガンド−リガンドレセプター対で
ある。また、特異的に結合することが知られているこのような対は、前記対から
構成されてもよい。
ある。また、特異的に結合することが知られているこのような対は、前記対から
構成されてもよい。
【００５０】 有用な検出マーカーが知られており、前記検出化合物の酸化または還元、好ま
しくは電気酸化または電気還元されたレドックスポリマーによる電気酸化または
電気還元を促進する触媒を含む。電気化学的反応の促進は、通常レドックスポリ
マーと触媒を経た荷電の流れである、電極の電流を増加させる。第３要素２０が
検出マーカーでラベルされる場合、また、それが固定化された第２要素１６に結
合する場合、電極で生成された電流は、前記検出化合物の反応の電気触媒を通じ
て増加する。
しくは電気酸化または電気還元されたレドックスポリマーによる電気酸化または
電気還元を促進する触媒を含む。電気化学的反応の促進は、通常レドックスポリ
マーと触媒を経た荷電の流れである、電極の電流を増加させる。第３要素２０が
検出マーカーでラベルされる場合、また、それが固定化された第２要素１６に結
合する場合、電極で生成された電流は、前記検出化合物の反応の電気触媒を通じ
て増加する。
【００５１】 本発明の好ましいアフィニティーアッセイは、迅速、特異的、効率的であり、
高いシグナルとノイズの比、好ましくは１０以上で作動する。具体的なサンドイ
ッチ型イムノアッセイのスキームを図１Ａおよび１Ｂに示し、以下の実施例１に
おいて説明する。これは、約１５のシグナルとノイズ比で作動する。
高いシグナルとノイズの比、好ましくは１０以上で作動する。具体的なサンドイ
ッチ型イムノアッセイのスキームを図１Ａおよび１Ｂに示し、以下の実施例１に
おいて説明する。これは、約１５のシグナルとノイズ比で作動する。
【００５２】 本発明の好ましいアフィニティーアッセイは、分析される生物学的流体に対し
て添加することなく、もしくはコリンのような非毒性生化学薬品のみを添加する
ことによって行うことができる。前記アッセイは、また、血液のような、不透明
（opaque）で、着色されたまたは光散乱媒体において行うことができ、好ましい
形態は、分離または洗浄工程を必要とない。
て添加することなく、もしくはコリンのような非毒性生化学薬品のみを添加する
ことによって行うことができる。前記アッセイは、また、血液のような、不透明
（opaque）で、着色されたまたは光散乱媒体において行うことができ、好ましい
形態は、分離または洗浄工程を必要とない。
【００５３】 好ましい実施およびアッセイの実行 実施の好ましい形態において、前記電極１０は、レドックスハイドロゲル１２
内に双方ともに共有結合された結合剤１１および基質生成酵素２２を含む、架橋
されたレドックスポリマー１２でコーティングされている。それから、前記第１
要素１４は、前記レドックスポリマー１２に結合されている。これで、アッセイ
のための電極の調製が完了する。それから、電極は、第２要素の存在および／ま
たは量および／または濃度について分析される流体内に浸漬される。この浸漬の
間、前記電極に対して前記流体が移動、すなわち、例えば、循環のように前記電
極が流体内を移動し、もしくは前記電極が制止している時に、流体が流れること
が好ましい。前記第１要素１４との親和反応を経た電極への第２要素１６の結合
の後、もしくはそれと同時に、前記電極は第３要素２０にさらされる。前記電極
は、前記検出化合物の電気触媒による還元または酸化が起こる電位で平衡を保ち
、この電極反応は、前記第２要素１６への前記第３要素２０の結合における接触
のように、前記検出マーカーが前記レドックスポリマー１２に接触する場合に触
媒される。
内に双方ともに共有結合された結合剤１１および基質生成酵素２２を含む、架橋
されたレドックスポリマー１２でコーティングされている。それから、前記第１
要素１４は、前記レドックスポリマー１２に結合されている。これで、アッセイ
のための電極の調製が完了する。それから、電極は、第２要素の存在および／ま
たは量および／または濃度について分析される流体内に浸漬される。この浸漬の
間、前記電極に対して前記流体が移動、すなわち、例えば、循環のように前記電
極が流体内を移動し、もしくは前記電極が制止している時に、流体が流れること
が好ましい。前記第１要素１４との親和反応を経た電極への第２要素１６の結合
の後、もしくはそれと同時に、前記電極は第３要素２０にさらされる。前記電極
は、前記検出化合物の電気触媒による還元または酸化が起こる電位で平衡を保ち
、この電極反応は、前記第２要素１６への前記第３要素２０の結合における接触
のように、前記検出マーカーが前記レドックスポリマー１２に接触する場合に触
媒される。
【００５４】 第３要素の検出マーカー 様々な触媒が、検出マーカー１８として使用できる。具体的な触媒は、検出化
合物の電気化学的反応を触媒する酵素である。様々な酵素が有用であり、例えば
、過酸化水素と使用するペルオキシダーゼ、グルコースと使用するグルコースオ
キシダーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ、および乳酸と使用する乳酸オキ
シダーゼならびに乳酸デヒドロゲナーゼグルコースが含まれる。過酸化水素の場
合、前記検出化合物は触媒により電気還元され、また前記フィルムにおいて内部
生成され、血液のような生物学的流体において十二分であるグルコースまたは乳
酸の場合、前記検出マーカーは、外層（externally）に供給される。また、グル
コースオキシダーゼ検出マーカーまたは乳酸オキシダーゼ検出マーカーの両方が
、前記レドックスポリマーフィルム上またはフィルム内に固定化され、前記電極
が−０．３Ｖ（ＳＣＥ）〜＋０．７Ｖ（ＳＣＥ）の間、好ましくは−０．２Ｖ（
ＳＣＥ）〜＋０．５Ｖ（ＳＣＥ）の間、最も好ましくは−０．１Ｖ（ＳＣＥ）〜
＋０．３Ｖ（ＳＣＥ）の間の電位で平衡を保っている場合に、これらの検出化合
物は触媒により電気酸化される。好ましくは、熱安定性酵素（少なくとも３７℃
で１時間作用できる酵素）が使用される。ダイズペルオキシダーゼは、熱安定性
酵素の一例である。
合物の電気化学的反応を触媒する酵素である。様々な酵素が有用であり、例えば
、過酸化水素と使用するペルオキシダーゼ、グルコースと使用するグルコースオ
キシダーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ、および乳酸と使用する乳酸オキ
シダーゼならびに乳酸デヒドロゲナーゼグルコースが含まれる。過酸化水素の場
合、前記検出化合物は触媒により電気還元され、また前記フィルムにおいて内部
生成され、血液のような生物学的流体において十二分であるグルコースまたは乳
酸の場合、前記検出マーカーは、外層（externally）に供給される。また、グル
コースオキシダーゼ検出マーカーまたは乳酸オキシダーゼ検出マーカーの両方が
、前記レドックスポリマーフィルム上またはフィルム内に固定化され、前記電極
が−０．３Ｖ（ＳＣＥ）〜＋０．７Ｖ（ＳＣＥ）の間、好ましくは−０．２Ｖ（
ＳＣＥ）〜＋０．５Ｖ（ＳＣＥ）の間、最も好ましくは−０．１Ｖ（ＳＣＥ）〜
＋０．３Ｖ（ＳＣＥ）の間の電位で平衡を保っている場合に、これらの検出化合
物は触媒により電気酸化される。好ましくは、熱安定性酵素（少なくとも３７℃
で１時間作用できる酵素）が使用される。ダイズペルオキシダーゼは、熱安定性
酵素の一例である。
【００５５】 検出化合物 前記検出化合物は、前記検出マーカーの基質または検出要素の基質の前駆体で
ある。例えば、過酸化水素は、検出マーカーであるペルオキシダーゼの基質であ
る検出化合物である。
ある。例えば、過酸化水素は、検出マーカーであるペルオキシダーゼの基質であ
る検出化合物である。
【００５６】 （実施例） 本発明は、以下の実施例の記載によりさらに理解されるが、本発明の範囲をこ
れに限定する意図ではない。
れに限定する意図ではない。
【００５７】 実施例１ 電気化学的ＥＬＩＳＡ 非競争的なサンドイッチ型ＥＬＩＳＡは、レドックスポリマーＰＡＨをガラス
状炭素電極の上に固定化することにより開始した。ＰＡＨは、ダ ルムレイ−ウ
ッドイヤーら（de Lumley-Woodyear et al．）の１９９５、アナル ケム（A
nal.Chem）６７、１３３２−１３３８の記載により作製された。前記ポリマーの
構造を図３に示す。
状炭素電極の上に固定化することにより開始した。ＰＡＨは、ダ ルムレイ−ウ
ッドイヤーら（de Lumley-Woodyear et al．）の１９９５、アナル ケム（A
nal.Chem）６７、１３３２−１３３８の記載により作製された。前記ポリマーの
構造を図３に示す。
【００５８】 標準コーティングは、ポリマー２．５部（水に５ｍｇ／ｍＬ）、ポリ（エチレ
ングリコール４００ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ））１．５部（水に０
．５ｍｇ／ｍＬ）（テクニカルグレード、ポリサイエンス、＃０８２１０）、コ
リンオキシダーゼ１．０部（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3に２０ｍｇ／ｍＬ）（シグ
マ社製、＃Ｃ−５８９６）およびアビジン４部（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3に５ｍ
ｇ／ｍＬ）（シグマ社製、＃Ａ−９３９０）の混合により調製した。この溶液の
体積３μＬを直径３ｍｍのガラス状炭素電極に供給した。このフィルムは、湿っ
た雰囲気下で４８時間で硬化し、架橋することができた。それから、テスト前に
空気中において一晩乾燥した。
ングリコール４００ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ））１．５部（水に０
．５ｍｇ／ｍＬ）（テクニカルグレード、ポリサイエンス、＃０８２１０）、コ
リンオキシダーゼ１．０部（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3に２０ｍｇ／ｍＬ）（シグ
マ社製、＃Ｃ−５８９６）およびアビジン４部（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3に５ｍ
ｇ／ｍＬ）（シグマ社製、＃Ａ−９３９０）の混合により調製した。この溶液の
体積３μＬを直径３ｍｍのガラス状炭素電極に供給した。このフィルムは、湿っ
た雰囲気下で４８時間で硬化し、架橋することができた。それから、テスト前に
空気中において一晩乾燥した。
【００５９】 コーティングしたレドックスポリマー内に固定化されたアビジン（結合剤）お
よびコリンオキシダーゼ（基質生成酵素）を含む前記電極は、前記ポリマーハイ
ドロゲルを再水和し、非共有結合されたアビジンまたはコリンオキシダーゼを除
去するために、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳで１５分間洗浄した。
ｐＨ７．４のリン酸緩衝液ＰＢＳは、リン酸ナトリウム（０．００８Ｍ）とリン
酸カリウム（０．００２Ｍ）、および塩化ナトリウム（０．１４Ｍ）と塩化カリ
ウム（０．０１Ｍ）で調製した。それから再水和された電極は、ビオチンラベル
された抗ウサギＩｇＧ（リガンド−リガンドレセプター対の第１要素）９ｍｇを
含む５ｍＬ ＰＢＳに３０分間浸漬させ、続いて、未結合のビオチン−抗ＩｇＧ
を除去するためにＰＢＳで１０分間洗浄した。これで、ウサギＩｇＧアッセイの
ための電極調製が完了した。
よびコリンオキシダーゼ（基質生成酵素）を含む前記電極は、前記ポリマーハイ
ドロゲルを再水和し、非共有結合されたアビジンまたはコリンオキシダーゼを除
去するために、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳで１５分間洗浄した。
ｐＨ７．４のリン酸緩衝液ＰＢＳは、リン酸ナトリウム（０．００８Ｍ）とリン
酸カリウム（０．００２Ｍ）、および塩化ナトリウム（０．１４Ｍ）と塩化カリ
ウム（０．０１Ｍ）で調製した。それから再水和された電極は、ビオチンラベル
された抗ウサギＩｇＧ（リガンド−リガンドレセプター対の第１要素）９ｍｇを
含む５ｍＬ ＰＢＳに３０分間浸漬させ、続いて、未結合のビオチン−抗ＩｇＧ
を除去するためにＰＢＳで１０分間洗浄した。これで、ウサギＩｇＧアッセイの
ための電極調製が完了した。
【００６０】 それから、完成した電極を、２０ｍＭコリン含有ＰＢＳ１７．５ｍＬを含むテ
ストセルに配置し、ＳＣＥに対し−７０ｍＶの電位を供給した。前記電極は、１
０００ｒｐｍで回転させた。ＩｇＧ（リガンド−リガンドレセプター対の第２要
素）のサンプル量（sample amount）を添加し、そしてその混合物を３０分間イ
ンキュベートした。インキュベート段階の最後に、ＨＲＰ−ラベル化抗ウサギＩ
ｇＧ（第３要素、検出マーカーでラベル化）６．０μｇを添加し、そして、還元
電流が増加するという結果が観察された。電流は、ＨＲＰラベル化プローブの添
加後、３０分間記録された。
ストセルに配置し、ＳＣＥに対し−７０ｍＶの電位を供給した。前記電極は、１
０００ｒｐｍで回転させた。ＩｇＧ（リガンド−リガンドレセプター対の第２要
素）のサンプル量（sample amount）を添加し、そしてその混合物を３０分間イ
ンキュベートした。インキュベート段階の最後に、ＨＲＰ−ラベル化抗ウサギＩ
ｇＧ（第３要素、検出マーカーでラベル化）６．０μｇを添加し、そして、還元
電流が増加するという結果が観察された。電流は、ＨＲＰラベル化プローブの添
加後、３０分間記録された。
【００６１】 図４に、リガンド（ウサギＩｇＧ）の濃度に対する過酸化水素の電気還元電流
の依存性を示す。電流は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲以上のウサギＩｇＧ濃
度で、直線的に増加した。データの直線回帰分析は、Ｒ２値０．８９、およびウ
サギのＩｇＧ濃度がゼロである切片において負の電流をもたらした。これは、ウ
サギＩｇＧの一部が、パイレックス（登録商標）（Ｐｙｒｅｘ）ガラステストセ ルの非処理壁において、吸着を通じて溶液から失われたためと考えられる。
の依存性を示す。電流は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲以上のウサギＩｇＧ濃
度で、直線的に増加した。データの直線回帰分析は、Ｒ２値０．８９、およびウ
サギのＩｇＧ濃度がゼロである切片において負の電流をもたらした。これは、ウ
サギＩｇＧの一部が、パイレックス（登録商標）（Ｐｙｒｅｘ）ガラステストセ ルの非処理壁において、吸着を通じて溶液から失われたためと考えられる。
【００６２】 ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇＧプローブの濃度におけるシグナル−ノイズ比の
依存性を算定するため、リガンドＩｇＧに対するＨＲＰラベル化抗ウサギプロー
ブの分子比における電流密度の依存性を決定した。図５に示すように、リガンド
ＩｇＧの非存在下、ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇＧプローブの非特異的結合と関
連する非常にわずかなノイズが存在した。比率４：１において、シグナル（特異
的結合）とノイズ（非特異的結合）の比は１５であった。テストシステムの個々
の成分を除去したコントロール実験の全体の結果を、下の表１に示す。
依存性を算定するため、リガンドＩｇＧに対するＨＲＰラベル化抗ウサギプロー
ブの分子比における電流密度の依存性を決定した。図５に示すように、リガンド
ＩｇＧの非存在下、ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇＧプローブの非特異的結合と関
連する非常にわずかなノイズが存在した。比率４：１において、シグナル（特異
的結合）とノイズ（非特異的結合）の比は１５であった。テストシステムの個々
の成分を除去したコントロール実験の全体の結果を、下の表１に示す。
【００６３】 （表１）電極構成成分 抗原 抗体 試薬 シク゛ナル ホ゜リマー PEGDGE コリン アヒ゛シ゛ン ウサキ゛ ヒ゛オチン HRP コリン μA/cm2 400 オキシタ゛ーセ゛ IgG Ab Ab ＋ ＋ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 0 ＋ ＋ ＋ − ＋ ＋ ＋ ＋ 0.12 ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ ＋ ＋ 0-0.1 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ ＋ 0.17 ＋ ＋ ＋ ＋ − ＋ − ＋ 0.03 ＋ ＋ ＋ ＋ − − − ＋ 0.03 − − − − ＋ − ＋ − 0 − − − − − − − ＋ 0 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 1.03 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 1.06
【００６４】 必須成分のいくらかの削除に続き、残存電流密度は、分析物自体（ウサギＩｇ
Ｇ）が存在しない時の電流密度と等しいか、より小さかった。免疫試薬なしでコ
リン存在下、示すように電流密度はたった０．０３μＡ／ｃｍ2であり、コリン
オキシダーゼは、全く配置（wired）されてないわけではないが、配置（wired）
が不十分であり、コリンの電気還元は、アッセイを妨害すると予想される。アビ
ジン含有コーティングレドックスハイドロゲルが、ビオチンラベル化抗ウサギＩ
ｇＧで活性化されない場合、電流密度０．１７μＡ／ｃｍ2であり、一般のアッ
セイにおいて観察される約１／５である。
Ｇ）が存在しない時の電流密度と等しいか、より小さかった。免疫試薬なしでコ
リン存在下、示すように電流密度はたった０．０３μＡ／ｃｍ2であり、コリン
オキシダーゼは、全く配置（wired）されてないわけではないが、配置（wired）
が不十分であり、コリンの電気還元は、アッセイを妨害すると予想される。アビ
ジン含有コーティングレドックスハイドロゲルが、ビオチンラベル化抗ウサギＩ
ｇＧで活性化されない場合、電流密度０．１７μＡ／ｃｍ2であり、一般のアッ
セイにおいて観察される約１／５である。
【００６５】 ビオチンラベル化抗ウサギＩｇＧを負荷する電極における電流密度の依存性を
図６に示す。
図６に示す。
【００６６】 分離しないアッセイにおいて、ウサギＩｇＧのＦ（ａｂ’）2断片の濃度が８
６ｍｇ／ｍＬ、ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇＧが３４４ｍｇ／ｍＬであった場合
（ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、テスト溶液へのコリンのみの添加で
、１．５μＡｃｍ-2の電流密度が観察された。
６ｍｇ／ｍＬ、ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇＧが３４４ｍｇ／ｍＬであった場合
（ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、テスト溶液へのコリンのみの添加で
、１．５μＡｃｍ-2の電流密度が観察された。
【００６７】 テスト緩衝液のさまざまなイオン強度は、シグナルおよびノイズの両方のレベ
ルに影響した。ノイズレベルが、０．２Ｍ以上の塩濃度に対して実質的にゼロに
低下に伴い、シグナルとノイズの両方は、塩含量が増加するにつれて迅速に減少
した。
ルに影響した。ノイズレベルが、０．２Ｍ以上の塩濃度に対して実質的にゼロに
低下に伴い、シグナルとノイズの両方は、塩含量が増加するにつれて迅速に減少
した。
【００６８】 Ｆ（ａｂ’）2抗体断片が、全抗体に置き換えられた場合、シグナルとノイズ
との比は、同一の条件において約４：１であった。
との比は、同一の条件において約４：１であった。
【００６９】 ３つの試薬の濃度が、それぞれ１８００ｎｇ／ｍＬ、８６ｎｇ／ｍＬおよび３
４４ｎｇ／ｍＬの場合における、（ａ）ビオチンラベル化抗ウサギＩｇＧでの活
性化工程、（ｂ）ＩｇＧの結合工程、および（ｃ）ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇ
Ｇの結合工程の持続効果の研究を調べた。シグナル電流は、活性化工程において
１５分のインキュベート後に平坦（plateau）に達した。インキュベート時間が
７．５分に半減した時、電流の７５％が保持された。ウサギＩｇＧの曝露工程に
おいて、電流の平坦性は１５分で達し、インキュベート段階を１０分間に短縮す
ることにより、電流が１０％だけ減少する結果となった。ＨＲＰラベル化された
抗ＩｇＧを結合する最終工程で、電流は、３０分間安定しなかったが、時間とと
もに直線的に増加し、約５分間で容易に測定できるようになった。
４４ｎｇ／ｍＬの場合における、（ａ）ビオチンラベル化抗ウサギＩｇＧでの活
性化工程、（ｂ）ＩｇＧの結合工程、および（ｃ）ＨＲＰラベル化抗ウサギＩｇ
Ｇの結合工程の持続効果の研究を調べた。シグナル電流は、活性化工程において
１５分のインキュベート後に平坦（plateau）に達した。インキュベート時間が
７．５分に半減した時、電流の７５％が保持された。ウサギＩｇＧの曝露工程に
おいて、電流の平坦性は１５分で達し、インキュベート段階を１０分間に短縮す
ることにより、電流が１０％だけ減少する結果となった。ＨＲＰラベル化された
抗ＩｇＧを結合する最終工程で、電流は、３０分間安定しなかったが、時間とと
もに直線的に増加し、約５分間で容易に測定できるようになった。
【００７０】 これらのデータは、洗浄工程または分析される流体に対して毒性もしくは不安
定である添加剤を必要としない分離した電気化学的イムノアッセイシステムを証
明した。アッセイの基盤は、アビジンおよびコリンオキシダーゼが同時に固定化
されている、電子を伝導するレドックスハイドロゲルである。このハイドロゲル
は、抗体および酵素ラベルされた抗体を含む巨大生物学的分子に浸透できる。ゲ
ル中のコリンオキシダーゼは、コリンおよび酸素の反応を触媒し、これによりベ
タインアルデヒドおよび過酸化水素が検出層内で生産される。過酸化水素は、電
気触媒の成分がイムノアッセイのサンドイッチにより集合した後、この層におい
て、４００ｍＶ（ＳＣＥ）、好ましくは−７０ｍＶ（ＳＣＥ）〜＋１５０ｍＶ（
ＳＣＥ）の間の負の電位で、水に電気還元される。電子伝導性ハイドロゲルにお
いて同時にアビジンおよびコリンオキシダーゼが固定化されている基盤が配置さ
れると、プローブが所望のビオンチン化されたイムノ試薬で活性化される。もし
、分析される流体が相補的イムノ試薬を含み、また、イムノ試薬のペルオキシダ
ーゼ標識されたプローブが添加される場合、Ｈ2Ｏ2の触媒された電気還元の結果
として、カソード電流が流れる。アッセイの検出限界は、ＩｇＧ／抗ＩｇＧシス
テムで約４ｎｇ／ｍＬであり、サンプルの分析は、約２０分以内で完了する。
定である添加剤を必要としない分離した電気化学的イムノアッセイシステムを証
明した。アッセイの基盤は、アビジンおよびコリンオキシダーゼが同時に固定化
されている、電子を伝導するレドックスハイドロゲルである。このハイドロゲル
は、抗体および酵素ラベルされた抗体を含む巨大生物学的分子に浸透できる。ゲ
ル中のコリンオキシダーゼは、コリンおよび酸素の反応を触媒し、これによりベ
タインアルデヒドおよび過酸化水素が検出層内で生産される。過酸化水素は、電
気触媒の成分がイムノアッセイのサンドイッチにより集合した後、この層におい
て、４００ｍＶ（ＳＣＥ）、好ましくは−７０ｍＶ（ＳＣＥ）〜＋１５０ｍＶ（
ＳＣＥ）の間の負の電位で、水に電気還元される。電子伝導性ハイドロゲルにお
いて同時にアビジンおよびコリンオキシダーゼが固定化されている基盤が配置さ
れると、プローブが所望のビオンチン化されたイムノ試薬で活性化される。もし
、分析される流体が相補的イムノ試薬を含み、また、イムノ試薬のペルオキシダ
ーゼ標識されたプローブが添加される場合、Ｈ2Ｏ2の触媒された電気還元の結果
として、カソード電流が流れる。アッセイの検出限界は、ＩｇＧ／抗ＩｇＧシス
テムで約４ｎｇ／ｍＬであり、サンプルの分析は、約２０分以内で完了する。
【００７１】 観測される電流密度のマグニチュード（magnitude）２μＡ／ｃｍ2は、直径１
０μｍの電極に小型化するには十分に高く、質量輸送(mass transport)および
電子輸送の両方が放射状（radial）であることを十分に保証できる。配置された
酵素と電極の間の電子輸送が放射状（radial）である微小電極のため、電流密度
は、実施例の半無限面上電極におけるよりも４π倍まで高く、電流は、直径１０
μｍの電極において、約２０ピコアンペア（ｐＡ）と見積もられる。
０μｍの電極に小型化するには十分に高く、質量輸送(mass transport)および
電子輸送の両方が放射状（radial）であることを十分に保証できる。配置された
酵素と電極の間の電子輸送が放射状（radial）である微小電極のため、電流密度
は、実施例の半無限面上電極におけるよりも４π倍まで高く、電流は、直径１０
μｍの電極において、約２０ピコアンペア（ｐＡ）と見積もられる。
【００７２】 本発明は、特に前述の実施例には制限して考察されるべきではなく、むしろ、
添付したクレームにおいて完全に述べられる本発明ののすべての局面をカバーし
て理解するべきである。本発明が応用できる多数の構造と同様に、様々な変更、
同等のプロセスは、本発明の直接の当業者が当該明細書の再考により容易に理解
できる。
添付したクレームにおいて完全に述べられる本発明ののすべての局面をカバーし
て理解するべきである。本発明が応用できる多数の構造と同様に、様々な変更、
同等のプロセスは、本発明の直接の当業者が当該明細書の再考により容易に理解
できる。
【図１】 図１Ａおよび１Ｂは、カソード電流に対する、リガンド−リガンドレセプター
対の第２要素（ＩｇＧ）濃度の導入（transduction）を示す概略図である。
対の第２要素（ＩｇＧ）濃度の導入（transduction）を示す概略図である。
【図２】 図２は、本発明のイムノアッセイにおける、酵素ラベルされた第３要素の結合
における電子移動を示す概略図である。
における電子移動を示す概略図である。
【図３】 図３は、架橋により電子導電性ハイドロゲルを形成するレドックスポリマーＰ
ＡＨの構造を示す図である。
ＡＨの構造を示す図である。
【図４】 図４は、リガンド−リガンドレセプター結合対の第２要素の濃度における電流
密度の依存性を示すグラフである。
密度の依存性を示すグラフである。
【図５】 図５は、第３の要素ＨＲＰラベル化抗ＩｇＧと、一定濃度（８６ｎｇ／ｍＬ）
の第２要素ＩｇＧとの比におけにおける電流密度の依存性を示すグラフである。
の第２要素ＩｇＧとの比におけにおける電流密度の依存性を示すグラフである。
【図６】 図６は、一定濃度（８６ｎｇ／ｍＬ）のＩｇＧでの電極上のレドックスポリマ
ーフィルムにおける第１要素ビオチンラベル化抗ウサギＩｇＧへの装荷における
電流密度の依存性を示すグラフである。
ーフィルムにおける第１要素ビオチンラベル化抗ウサギＩｇＧへの装荷における
電流密度の依存性を示すグラフである。
【図７】 図７は、検出化合物Ｈ2Ｏ2の無毒および安定化前駆体であるコリン濃度におけ
る電流密度の依存性を示すグラフである。
る電流密度の依存性を示すグラフである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月３１日（２０００．８．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】 従来の標識化および検出の技術を用いる従来のアフィニティーアッセイは、一
般に、洗浄および／または分離工程を必要とする。加えて、多くのアフィニティ
ーアッセイシステムは、分光光度計もしくは蛍光計のような機械装置での検出を
必要とする。これらは、全血中におけるリガンドの検出、および生物学的流体を
吸収または拡散する他の光の検出が望まれる場合に実用的でない。このような装
置を必要としないいくつかの従来のアフィニティーアッセイは、リガンドの検出
のために、可視色の変化を頼りにしており、これもまた、血液のように不透明ま
たは着色された流体においては実用的でない。その上、従来のアッセイで一般に
使用されている過酸化水素のような検出化合物は、血液や他の組織において発見
されたカタラーゼのような保護酵素によって迅速に消失する。
般に、洗浄および／または分離工程を必要とする。加えて、多くのアフィニティ
ーアッセイシステムは、分光光度計もしくは蛍光計のような機械装置での検出を
必要とする。これらは、全血中におけるリガンドの検出、および生物学的流体を
吸収または拡散する他の光の検出が望まれる場合に実用的でない。このような装
置を必要としないいくつかの従来のアフィニティーアッセイは、リガンドの検出
のために、可視色の変化を頼りにしており、これもまた、血液のように不透明ま
たは着色された流体においては実用的でない。その上、従来のアッセイで一般に
使用されている過酸化水素のような検出化合物は、血液や他の組織において発見
されたカタラーゼのような保護酵素によって迅速に消失する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ 【要約の続き】
Claims (17)
- 【請求項１】 レドックスポリマーを含むフィルムでコーティングされた電極
、前記レドックスポリマーに固定化されたリガンド−リガンドレセプター対の第
１要素、前記第１要素に結合可能なリガンド−リガンドレセプター対の第２要素
、および前記第２要素に結合可能であり、検出マーカーでラベル化された第３要
素を含むアフィニティーアッセイシステムであって、前記電極に電位が供給され
た場合に、前記第１要素への前記第２要素の結合および前記第２要素への前記第
３要素の結合により、電極反応の速度の増加を生じるアフィニティーアッセイシ
ステム。 - 【請求項２】 前記電極反応が、前記レドックスポリマー内において生成され
る分子またはイオンの電気酸化である請求項１記載のアッセイ。 - 【請求項３】 前記電極に供給する電位が、約−０．１Ｖ(ＳＣＥ)より還元さ
れず、約＋０．３Ｖ（ＳＣＥ）よりも酸化されない請求項１記載のアッセイ。 - 【請求項４】 基質生成酵素が前記レドックスポリマーフィルムに固定化され
ている請求項１記載のアッセイ。 - 【請求項５】 前記電極をコーティングするフィルムからなる前記レドックス
ポリマーが、結合剤も含んでいる請求項４記載のアッセイ。 - 【請求項６】 前記電極反応が、前記レドックスポリマー内において生成され
た分子またはイオンの電気還元である請求項５記載のアッセイ。 - 【請求項７】 前記電位が、飽和カロメル電極に対する−０．０Ｖより還元さ
れず、前記飽和カロメル電極に対する＋０．４Ｖよりも酸化されない請求項１記
載のアフィニティーアッセイシステム。 - 【請求項８】 前記結合剤はアビジンまたはストレプトアビジンである請求項
５記載のアフィニティーアッセイシステム。 - 【請求項９】 前記第１要素がビオチン官能基（function）を有する請求項５
記載のアフィニティーアッセイシステム。 - 【請求項１０】 前記基質生成酵素の反応中心または複数の反応中心が、前記
電極に供給される電位で、電気還元または電気酸化されない請求項４記載のアッ
セイ。 - 【請求項１１】 前記基質生成酵素がコリンオキシダーゼである請求項４記載
のアッセイ。 - 【請求項１２】 前記検出マーカーがペルオキシダーゼである請求項１記載の
アフィニティーアッセイシステム。 - 【請求項１３】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼまたは
ダイズペルオキシダーゼである請求項６記載のアフィニティーアッセイ。 - 【請求項１４】 前記シグナルとノイズとの比が少なくとも１０である請求項
１記載のアフィニティーアッセイシステム。 - 【請求項１５】 サンプルを、請求項１記載のアフィニティーアッセイシステ
ムのコーティングされた電極に接触させ、前記電極の電流または電位を前記サン
プルにおける前記第２要素の量と相関させることを含む、リガンド−リガンドレ
セプター対の第２要素のアッセイ方法。 - 【請求項１６】 前記第２要素が抗体である請求項１５記載の方法。
- 【請求項１７】 前記接触させるサンプルが血液である請求項１５記載の方法
。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/138,888 US6281006B1 (en) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Electrochemical affinity assay |
| US09/138,888 | 1998-08-24 | ||
| PCT/US1999/019120 WO2000011474A1 (en) | 1998-08-24 | 1999-08-24 | Electrochemical affinity assay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002523747A true JP2002523747A (ja) | 2002-07-30 |
Family
ID=22484110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000566679A Withdrawn JP2002523747A (ja) | 1998-08-24 | 1999-08-24 | 電気化学的アフィニティーアッセイ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6281006B1 (ja) |
| EP (1) | EP1105736B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002523747A (ja) |
| AT (1) | ATE218708T1 (ja) |
| AU (1) | AU5579099A (ja) |
| DE (1) | DE69901714T2 (ja) |
| WO (1) | WO2000011474A1 (ja) |
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