ITVI20120166A1 - Biosensore - Google Patents

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ITVI20120166A1
ITVI20120166A1 IT000166A ITVI20120166A ITVI20120166A1 IT VI20120166 A1 ITVI20120166 A1 IT VI20120166A1 IT 000166 A IT000166 A IT 000166A IT VI20120166 A ITVI20120166 A IT VI20120166A IT VI20120166 A1 ITVI20120166 A1 IT VI20120166A1
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IT
Italy
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methyl methyl
photodefinable
hydrogel
foil
electrode layer
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IT000166A
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Maria Fortuna Bevilacqua
Angela Cimmino
Matteo Andrea Di
Palma Vincenza Di
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St Microelectronics Srl
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Description

DESCRIZIONE
Dell’ invenzione dal t i tolo “BIOSENSOREâ€
Campo del l’ invenzione
La presente invenzione riguarda i l campo dei biosensori e , in particolare, l ’ immobilizzazione di elementi d i bioriconoscimento come, ad esempio, recettori cellulari , anticorpi o acidi nucleici , su superfici di sensore, in particolare su lamine flessibili , t ramite idrogel .
STATO DELL’ARTE DELL’INVENZIONE
Un biosensore à ̈ un dispositivo per i l r i levamento di un analita. Un biosensore comprende un elemento di bioriconoscimento (elemento biologico sensibile) e un elemento rilevatore che trasforma un segnale risultante dall ’ interazione dell’analita con l ’elemento biologico in un altro segnale che può essere più facilmente misurato e quantificato. L’immobilizzazione dell’elemento di bioriconoscimento può essere ottenuta tramite adsorbimento passivo, legame covalente tramite una adeguata chimica di linker e intrappolamento entro matrici di idrogel o polimeri solidi e tramite inclusione in strati ot tenuti t ramite fusione di vescicole.
Gli idrogel sono material i part icolarmente interessanti per la fabbricazione di biosensori elettrochimici poiché un gel idratato fornisce un eccellente incapsulamento in matrice di enzimi funzionali , vaccini e sequestro di cellule e r i levamento di metaboliti . In part icolare, l ’ambiente molle e idratato di un idrogel r igonf iato può fornire al le proteine condizioni quasifisiologiche che minimizzano la denaturazione e le aiutano a svolgere le loro piene funzioni biologiche. La geometria tridimensionale degl i idrogel consente loro di contenere una quanti tà molto più grande di reagente di rilevamento, aumentandone i l rapporto segnale-rumore e sensibil i tà . Membrane di idrogel fotodefinibili sono state introdotte per fornire immobilizzazione di elementi di bioriconoscimento.
Tuttavia, nonostante i l recente progresso nell’ ingegnerizzazione nel campo dei biosensori , vi à ̈ ancora una necessità di rendere disponibil i biosensori con immobilizzazione migliorata, in part icolare nel contesto della miniaturizzazione e dell’ integrazione con dispositivi elettronici a base di silicio, strati elettrodo, ecc. Inoltre, nel caso di membrane di idrogel fotodefinibili , l ’adesione a pellicole flessibili o ad al tr i substrati s i à ̈ d imostra ta scarsa nella prat ica.
Descrizione dell’ invenzione
La presente invenzione aff ronta i problemi summenzionati , e di conseguenza, rende disponibile un biosensore comprendente
una lamina, ad esempio, una lamina polimerica flessibile; uno stra to di elettrodo (che fa parte di un sensore elettrochimico) al di sopra della lamina;
una prima membrana di idrogel fotodefinibile senza elemento di bioriconoscimento disposta parzialmente al di sopra dello strato di elettrodo e parzialmente dire t tamente sulla lamina; e una seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato al di sopra dello strato di elettrodo, in part icolare fornito parzia lmente sullo strato di elettrodo in diret to contatto con lo stesso.
L’elemento di bioriconoscimento può essere qualsiasi elemento biologico sensibile noto nell’ar te, ad esempio un recettore cellulare , un enzima, un anticorpo o un acido nucleico. Diversamente dall ’arte, sono rese disponibil i due membrane di idrogel fotodefinibili , una delle quali ( la prima membrana) à ̈ formata sulla lamina e conferisce rigidità strutturale e adesione affidabile, mentre l’al tra ( la seconda membrana bioattiva) à ̈ formata a l di sopra dell’elettrodo, in part icolare, direttamente sulla porzione dello strato di elettrodo che non à ̈ coperta dalla prima membrana di idrogel foto definibile . Alla seconda membrana di idrogel foto definibile viene conferi ta la proprietà di r i levazione dall’elemento di bioriconoscimento incluso. La seconda membrana di idrogel fotodefinibile può essere disposta parzialmente su e a diret to contatto con la prima membrana di idrogel fotodefinibile e parzia lmente su e a diret to contatto con lo strato di elettrodo. In part icolare, la prima membrana di idrogel fotodefinibile può lasciare esposta una porzione del lo strato di elettrodo e, in questo caso, la seconda membrana di idrogel fotodefinibile à ̈ formata diret tamente su e a contatto con lo strato di elettrodo e a parziale copertura del la prima membrana di idrogel fotodefinibile. Col termine “fotodefinibile†si indica genericamente che le membrane possono essere strutturate/modellate tramite irraggiamento, ad esempio irraggiamento UV, in part icolare nell’ambito di processi l i tografici .
In part icolare, la seconda membrana di idrogel fotodefinibile può essere una matrice biocompatibile per incapsulamento di enzimi di bioriconoscimento che può essere def inita su elettrodi tramite tecnologia litografica. La seconda membrana di idrogel fotodefinibile può avere la proprietà di fotoreticolazione di un polimero solubile tramite gruppi laterali fotoreattivi del polimero oppure tramite aggiunta di fotosensibilizzatore o fotoiniziatore in un reticolo polimerico o gel . L’immobilizzazione tramite reticolazione fornisce vettori in cui non si formano legami covalenti con l ’enzima. L’enzima può essere f isicamente intrappolato nel volume interno di un polimero o nella maglia di un reticolo polimerico gonfiato. I l biosensore comprende ulteriormente uno strato adesivo disposto sulla lamina e f ra una parte della prima membrana di idrogel fotodefinibile e la lamina. Lo strato adesivo può essere fornito per aumentare la rigidità/ integrità s trutturale del biosensore. Ad esempio à ̈ adatta una composizione a base di si lano per lo strato adesivo.
I problemi summenzionati sono anche aff rontati t ramite i l metodo per la fabbricazione di un biosensore secondo la rivendicazione 9, comprendente le fasi di
rendere disponibile una lamina, ad esempio una lamina polimerica flessibile;
formare uno strato di elettrodo sulla lamina;
formare una prima membrana di idrogel fotodefinibile senza elemento di bioriconoscimento parzialmente sullo strato di elettrodo e parzialmente direttamente sulla lamina;
formare una seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato al d i sopra dello strato di elettrodo.
Secondo un esempio, la fase di formazione del primo idrogel fotodefinibile parzialmente sullo st ra to di elettrodo comprende le fasi eseguite in successione di deposito di un pr imo materiale di idrogel fotodefinibile diret tamente sullo st rato di elettrodo e def iniz ione tramite l i tograf ia del primo materiale di idrogel fotodefinibile per lasciare esposta una porzione dello strato di elettrodo (che funzionerà effet t ivamente come elettrodo di rilevamento nel prodotto f inito) .
La fase di formazione della seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento al di sopra dello strato di elettrodo può comprendere le fasi esegui te in successione di
deposito di un secondo materiale di idrogel fotodefinibile diret tamente sulla prima membrana di idrogel fotodefinibile e diret tamente sulla porzione della regione di elettrodo lasciata esposta dalla prima membrana di idrogel fotodefinibile; esposizione al la radiazione della sola regione del secondo materiale di idrogel fotodefinibile diret tamente depositata sulla porzione della regione di elettrodo esposta dal la prima membrana di idrogel fotodefinibile al la radiazione; e
r imozione della regione del secondo materia le di idrogel fotodefinibile che non era stato esposta al la radiazione.
In al ternativa, la fase di formazione della seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento sopra lo strato di elettrodo può comprendere le fasi eseguite in successione di formazione di un secondo materiale di idrogel fotodefinibile solo diret tamente sulla porzione della regione dell ’elettrodo lasciata esposta dalla prima membrana di idrogel fotodefinibile ed eseguita in modo tale che i l secondo materiale di idrogel foto definibile si sovrapponga parzialmente al la pr ima membrana di idrogel fotodefinibi le e esposizione ad irraggiamento del secondo materia le di idrogel fotodefinibile.
Secondo un esempio, lo strato di elettrodo à ̈ formato su una parte della lamina e i l metodo comprende ulteriormente le fasi di formazione di uno stra to adesivo su porzioni del la lamina che non sono coperte dallo strato di elettrodo e di forma zione della prima membrana di idrogel fotodefinibile sullo strato adesivo.
In tutt i gl i esempi summenzionat i , lo strato di elettrodo può essere formato su una parte della lamina e possono inoltre essere at tuate le fasi di formazione di uno strato adesivo su porzioni della lamina che non sono coperte dallo st rato di elettrodo e di formazione della prima membrana di idrogel fotodefinibile sullo s trato adesivo.
Lo strato adesivo può essere formato su una base di silano. La formazione dello strato adesivo di silano può comprendere le fasi attuate in successione di
trattamento al plasma, in par t icolare trattamento al plasma O2, della lamina (con lo strato di elettrodo presente);
immersione della lamina in una soluzione di silano (per esempio preparata t ramite idrolisi e condensazione di oligomer i di silano) ;
r isciacquo della lamina in un solvente; e
formazione di un legame aff idabile lamina-silano scaldando la lamina con lo st rato adesivo di silano.
Queste fasi possono essere at tuate in presenza di un photoresist formato sullo strato di elettrodo per proteggere lo strato di elettrodo durante i l processo di formazione dello strato adesivo. In questo caso, i l fotoresist à ̈ r imosso tramite un diluente adat to dopo aver r iscaldato la lamina con lo s trato adesivo di silano.
Caratteristiche e vantaggi aggiuntivi della presente invenzione verranno descri t t i facendo riferimenti ai disegni. Nella descrizione si fa r iferimento al le f igure al legate che sono intese i l lustrare forme di realizzazione preferi te dell’ invenzione. È inteso che tal i forme di realizzazione non rappresentano l ’ intera portata del l’ invenzione.
Figura 1 i l lustra una fase di produzione di un biosensore secondo un esempio della presente invenzione, in cui viene formato uno strato di elettrodo.
Figura 2 i l lustra una fase successiva di produzione di un biosensore secondo l ’esempio del la presente invenzione in cui viene formato uno strato adesivo di silano.
Figura 3 i l lustra una fase di produzione di un biosensore secondo l’esempio della presente invenzione in cui viene formata una pr ima membrana di idrogel fotodefinibile.
Figura 4a i l lustra una fase di produzione di un biosensore secondo l’esempio della presente invenzione in cui una seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato à ̈ formata secondo una prima alternativa.
Figura 4b i l lustra una fase di produzione di un biosensore secondo l’esempio della presente invenzione in cui una seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato à ̈ formata conformemente ad una seconda alternativa .
Figura 5 i l lustra una fase di produzione di un biosensore secondo l’esempio della presente invenzione dopo la rimozione di un substrato di supporto.
Un biosensore secondo una forma di realizzazione del la presente invenzione comprende una lamina. La lamina può essere una pellicola polimerica flessibile, ad esempio fatta di o comprendente PET (polietilen tereftalato), PEN (polietilen naftalato), PEEK (polietere etere chetone) o PI (poliimmide). I l biosensore comprende uno st rato di elettrodo, ad esempio fat to di o comprendente un metallo (ad esempio oro) o un polimero elettricamente conduttivo.
I l biosensore comprende una prima ed una seconda membrana di idrogel fotodefinibili . Secondo un esempio dif ferente, la prima e la seconda membrana di idrogel fotodefinibil i sono fat te dello stesso materiale o di material i differenti . I l materiale della prima membrana di idrogel fotodefinibile può essere scelto con part icolare at tenzione al le proprietà adesive. Secondo un esempio, le membrane di idrogel fotodefinibili sono fat te di material i idrofili gonfiati dall’acqua che sono costituiti da catene polimeriche reticolate f ra loro in modo covalente oppure in modo non covalente. I loro monomeri o prepolimeri sono solubili in acqua, mentre i polimeri sono insolubili in acqua a temperatura, valore di pH e forza ionica fisiologici . Essi si gonfieranno f ino ad un valore di equilibrio del 10 % al 98 % di H2O a temperatura, valore di pH e forza ionica fisiologici . I l contenuto d’acqua (% H2O) à ̈ definito come % H2O = 100 x (peso del polimero gonfiato – peso del polimero a secco) / peso polimero gonfiato. I polimeri possono avere un peso molecolare nell’ intervallo 500-200000 dalton e le loro proprietà, ivi inclusa viscosità, temperatura di rammollimento e di degrado, sono ottimizzate sulla base della specifica applicazione.
La membrana fotodefinibile di idrogel può essere composta da un monomero, o ligomero o prepolimeri ( i l peso molecolare del prepolimero controlla proprietà meccaniche e viscosità) o da un legante che garantisce proprietà meccaniche della miscela (adesione, forza chimica, ecc.) ; da un solvente che controlla una serie di proprietà meccaniche (ad esempio la viscosità della miscela) ; e da materiali fotoattivi (PAC) o fotoiniziatori (PhI) .
La membrana fotodefinibile di idrogel si comporta come un fotoresist negativo utilizzato in un processo fotolitografico negativo, in cui uno sviluppo in acqua rimuove la porzione di fotoresist che non era stata esposta ad irraggiamento. In questo caso, nel materiale della membrana fotodefinibile di idrogel che contiene i monomeri o oligomeri o prepolimero precursori , avviene una reazione di fotopolimerizzazione e/o di foto reticolazione, ad esempio per l’esposizione a radiazione UV incidente. La reticolazione del la membrana determina un aumento del suo peso molecolare, che induce una diminuzione vantaggiosa di solubilità della membrana in acqua.
Esempi di membrane fotodefinibili di idrogel composte da monomeri semplici o da una miscela di monomeri differenti sono:
Esempi di membrane fotodefinibili di idrogel composte da oligomeri o prepolimeri sono:
Nel seguito, verranno forniti alcuni esempi per la fabbricazione delle membrane fotodefinibili di idrogel .
Esempio di poliHEMA poli(2-idrossietil metacrilato) : idrogel reticolati sono stati preparati a temperatura ambiente tramite polimerizzazione di HEMA avviata da UV utilizzando un fotoiniziatore e vari reticolanti per regolare la densità di reticolazione, modificando in tal modo le proprietà di rigonfiamento e meccaniche degli idrogel .
1. HEMA-DEGDMA . Precursori di idrogel formati da 2-idrossietil metacrilato (HEMA), dietilen glicol dimetacrilato (DEGDMA) come reticolante.
2. HEMA-EGDMA . Precursori di idrogel formati da idrossietil metacrilato (HEMA), etilen glicol dimetacrilato (E-GDMA) e un fotoiniziatore.
3. PHEMA-co-PMMA . Precursori di idrogel formati da poli(2-idrossietil metacrilato-co-met il metacrilato PHEMA-co-PMMA, generatori di fotoacidi e reticolanti esterni tetrametossimetil glicolurile (TMMGU).
4. poli(HEMA-r-MMA-r-MAA) : poli( idrossietil metacrilato – r- metilmetacrilato –r- acido metacrilico). MAA à ̈ incorporato per rendere i l polimero reattivo al le varie condizioni di pH che possono essere utilizzate per fabbricare un sistema di trasporto del farmaco intelligente.
5. PHEMA-PPy . La miscela polimerica era formata da idrossietilmetacrilato (HEMA), dal reticolante tetraetilenglicol diacrilato (TEGDA), dal fotoiniziatore dimetossifenil acetofenone (DMPA), dal monomero pirrolo e dall’enzima.
6. HEMA-DHPMA con VP . Copolimero di idrossietil metacrilato (HEMA) e 2,3-diidrossipropil metacrilato (DHPMA). La porosità e le proprietà meccaniche degli idrogel sono state migliorate utilizzando N-vinil-2-pirrolidinone (VP) come rafforzante strutturale e etilenglicol dimetacrilato (EGDMA) come reticolante.
Polimeri derivatizzati metacrilizzati
1. Met-HA . Acido ialuronico derivatizzato metacrilato.
Met-PG . poliglicerolo iperramificato metacrilizzato Esempio di idrogel basato su PVA – alcol polivinilico 1. PVA fotoattivo . Una soluzione a base acquosa di PVA con dicromato di ammonio à ̈ un fotoresist negativo.
2. PVA acrilizzato . Soluzioni acquose di PVA modificato t ramite reazione con metacrilammido-acetaldeide dimetil acetale per derivatizzare il PVA con gruppi laterali reticolabili .
PPy-PVA . Film di PVA esposti ad una soluzione di pirrolo.
Esempio di poli (etilenglicole) PEG
Polietilenglicole, con i suoi gruppi idrossilici può essere acrilizzato a polietilen glicole diacrilato (PEG-DA) o polietilenglicole metil diacrilato. I monomeri di acrilato sono esteri contenenti gruppi vinile legati direttamente al l’atomo carbonilico. Una miscela di PEG-DA, con un peso molecolare appropriato e fotoiniziatore (ad esempio Darocure 1173) sotto esposizione UV forma un reticolo polimerico tridimensionale insolubile, membrana di idrogel . In particolare, i l fotoiniziatore genera un fotoframmento che avvia la polimerizzazione, attaccando i l doppio legame CC nei gruppi acrilici .
La copolimerizzazione di precursori d i idrogel differenti multipli , o utilizzando copolimeri nel precursore stesso o t ramite copolimerizzazione statistica durante i l processo litografico, fornisce un grado ulteriore di flessibilità nella scelta dell’appropriata membrana di idrogel fotodefinibile.
Polifosfazeni
I polifosfazeni rappresentano una classe altamente adattabile di polimeri che possiedono una catena di fosforo-azoto. Sono stat i preparati numerosi polifosfazeni idrosolubili che possono essere reticolati in modo covalente o ionicamente per formare idrogel . È stata dimostrata l’utilità di idrogel di polifosfazeni come piattaforme per l ’ immobilizzazione enzimatica e cellulare su scala macroscopica. In part icolare, i polifosfazeni con gruppi laterali di alchiletere e cinnamile per la formazione di idrogel tramite fotolitografia UV sono stat i studiati per l’ immobilizzazione enzimatica nell’uso in una gamma di biosensori a base enzimatica su scala microscopica.
1. MEEP .A soluzioni di pol i[bis(metossietossietossi)fosfazene]
2. Polifosfazeni con gruppi laterali di cinnamile .
I l biosensore del presente esempio può comprendere uno strato adesivo per legare la prima membrana di idrogel fotodefinibile alla lamina. Lo strato adesivo può essere uno strato adesivo a base di silano. Esso può comprendere un agente di organosilano con due funzionalità: un gruppo idrolizzabile, tipicamente alcossi , acilossi , alogeno o ammina (collegabile al substrano inorganico) e un gruppo organofunzionale (collegabile allo strato organico depositato):
gruppo organofunzionale gruppo idrolizzabile In part icolare, per la membrana di idrogel di metacrilato e acrilato, la superficie del substrato à ̈ modificata con un organosilano per creare gruppi metacrilato o acrilato aggrappati al la superficie in grado di legarsi in modo covalente con l’ idrogel durante la fotopolimerizzazione impedendo i l distacco dell’ idrogel immerso in acqua o soluzione tampone. Unità di metacrilato o acrilato sulla superficie della lamina, infatt i , partecipano alla polimerizzazione a radicali liberi e creano un legame covalente f ra gruppi acrilato presenti al l’ interno della massa del gel e quell i presenti sulla superficie, fissando così le strutture di idrogel alla lamina.
Esempi di organosilani adatti per l’applicazione della domanda di brevetto sono:
* silani di acrilato e metacrilato, come ad esempio N-(3-acrilossi-2-idrossipropil)-3-amminopropiltrietossisilano, [3-(metacriloilossi)propil] trimetossisilano, 3-(acrilossipropil) trimetossisilano, N-(3-acrilossi-2-idrossipropil)-3-amminopropiltrietossisilano, O-(metacrilossietil)-N-(trietossisililpropil)uretano, N-(3-metacrilossi-2-idrossipropil)-3-(amminopropiltrietossisilano, metacrilossimetiltrietossisilano, metacrilossi metiltrimetossisilano, metacrilossipropiltrietossisilano, (3-acrilossipropil)metildimetossisilano, (metacrilossimetil)metildietossisilano, (metacrilossimetil)metildimetossisilano, metacrilossipropilmetildietossisilano, metacrilossiproprilmetildimetossisilano, metacrilossipropildimetiletossisilano, metacrilossipropildimetilmetossisilano;
* azasilani ciclici , come ad esempio N-allil-aza-2,2-dimetossisilaciclopentano, N-amminoetil-aza-2,2,4-trimetilsilaciclopentano, N-(3-amminopropildimetilsila)aza-2,2-dimetil -2-silaciclopentano, N-n-buti l-aza-2,2-dimetossisila-ciclopentano, 2,2-dimetossi-1,6-diaza-2-silaciclottano, N-metil-aza-2,2,4-trimetilsilaciclopentano, anidride 3-(trietossisilil )propilsuccinica.
* ammina dipodale, come ad esempio bis(trimetossisililpropil)urea, bis(metildietossisililpropil)ammina,bis(metildimetossisililpro pil)-N-meti lammina, bis[ (3-trimetossisilil )propil]etilendiammina, bis[ (3-trietossisilil )propil ]-urea, bis-( trimetossisililpropil)ammina; * silano con funzionalità amminica, come ad esempio ureidopropiltrietossisilano, N-(3-trietossisililpropi l )-4,5-diidroimidazolo, acetammidopropiltrimetossisilano, 2-(2-piridietil) tiopropiltrimetossisilano, 3-(1,3dimetilbutilidene)ammino-propiltrietossisilano, ureidopropiltrimetossisilano, N,N-diottil-N’-trietossisililpropilurea;
* carbossilato silano, come ad esempio sale sodico di carbossietilsilantriolo, acido trietossisililpropilmaleamico, sale trisodico dell’acido N-(trimetossisililpropil)etilene diammina triacetico.
Di seguito , viene descritto un esempio del processo di fabbricazione di un biosensore secondo la presente invenzione. Come mostrato in fig. 1, à ̈ reso disponibile un substrato di supporto 1. I l substrato di supporto 1 può essere fat to di vetro o silicio, ad esempio. Una lamina polimerica flessibile 2 agisce essa stessa da substrato oppure può essere posta sul substrato di supporto 1. Uno strato di elettrodo 3 à ̈ formato sulla lamina 2. Lo strato di elettrodo 3 può essere fat to di un metallo, ad esempio, oro, oppure una sua combinazione, oppure un materiale polimerico elettricamente conduttivo. Un fotoresist positivo à ̈ formato sullo strato di elettrodo ed esposto al l’ irraggiamento UV. L’irraggiamento UV à ̈ controllato tramite una fotomaschera 5 (di dielettrico). I l metallo dello strato di elettrodo 3, se formato da un metallo, può poi essere attaccato chimicamente nelle regioni esposte, dopo di che à ̈ possibile rimuovere il fotoresist 4. In al ternativa , il fotoresist 4 può essere depositato tramite spin coating, esposto ad irraggiamento e sviluppato, ed i l metallo, se lo strato di elettrodo 3 à ̈ fat to di un metallo, può essere depositato nelle regioni in cui i l fotoresist 4 à ̈ stato rimosso durante lo sviluppo, e successivamente viene rimosso i l fotoresist 4 rimanente che copre le regioni in cui non verrà formato alcuno strato di elettrodo.
Ad esempio, nel fabbricare lo strato di elettrodo 3 sotto forma di una matrice d’oro, 20 nm di Ti (strato seme) e 80 nm di Au sono formati tramite fascio elettronico sulla lamina flessibile 2 a base di PEN, i l prodotto commerciale Teonex Q83. Un fotoresist positivo à ̈ stato depositato tramite spin coating a 4000 rpm per 30 secondi. I l fotoresist à ̈ stato preriscaldato per 2 minuti a 85°C. Successivamente utilizzando un allineatore di maschera in modali tà di contatto duro, i l fotoresist à ̈ stato esposto a luce UV a 365 nm a 15 mW/cm<2>per 3 secondi. Una soluzione di sviluppo à ̈ stata uti l izzata per r imuovere i l fotoresist non modellato litograficamente. Successivamente à ̈ stato uti l izzato un trattamento ad attacco chimico in umido a base di soluzioni che attaccano rispett ivamente Ti e Au per r imuovere lo strato seme e d’oro al f ine di ot tenere una matrice di numerosi microelettrodi di lavoro tracciati su PEN. Come mostrato in figura 2, uno strato adesivo 6 à ̈ formato in una posizione adiacente al lo strato di elettrodo 3 rimanente mentre i l fotoresist 4 à ̈ mantenuto in cima allo strato di elettrodo 3. Rendendo disponibile lo strato adesivo 6, si può aumentare in modo significativo l’adesione di una pr ima membrana di idrogel fotodefinibile formata successivamente. Come già descri t to sopra, la formazione dello strato adesivo 6 sulla lamina 2 può includere trattamento al plasma, in part icolare trattamento al plasma di O2, della lamina 2 (con lo strato di elettrodo 3 presente) , immersione del la lamina 2 in una soluzione di silano (ad esempio preparata tramite idrolisi e condensazione di oligomeri di silano), risciacquo del la lamina 2 in un solvente e formazione di un legame laminasilano affidabile tramite riscaldamento della struttura con la lamina 2 e lo strato 6 adesivo di silano.
Ad esempio, lo strato adesivo 6 à ̈ formato sulla lamina 2 come segue. Per la lamina flessibile viene scelto Teonex Q83. La lamina 2 con lo strato di elettrodo 3 presente viene trattata tramite attacco con plasma di O2. Parallelamente , una soluzione di silano (2 % v/v) viene preparata con 3-(trimetossisilil )propil metacrilato in alcol isopropilico, regolando poi il pH a 4,5÷5 con acido acetico. La soluzione potrebbe alquanto intorbidirsi . In questo caso, à ̈ necessario attendere 30 minuti prima di applicarla per permettere l’ idrolisi del gruppo silano. La lamina 2 con lo strato di elettrodo 3 à ̈ immersa nella soluzione di silano per 5 minuti e poi risciacquata in alcol isopropilico e successivamente posizionata su di una piastra calda a T = 120°C per 60 minuti per creare gruppi metacrilato liberi sul substrato . L’esistenza dello strato di adesione 6 di silano sulla lamina flessibile 2 può essere confermata da una diminuzione dell’angolo di contatto da circa 90 a circa 68 dopo silanizzazione.
Dopo la formazione dello strato adesivo 6 sulla lamina 2, viene rimosso i l fotoresist 4. Dopo la rimozione del fotoresist 4 dallo strato di elettrodo 3, sullo strato di elettrodo 3 e sullo strato adesivo 6, viene formata una prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile (membrana di isolamento) come mostrato in f igura 3. La prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile à ̈ modellata mediante litografia tramite una fotomaschera 8 al f ine di isolare un elettrodo (elettrodo di rilevamento del prodotto finito) , aree terminali e piste, ad esempio dallo strato di elettrodo 3. Regioni della prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile che sono lasciate esposte dalle (finestre della) fotomaschera 8 sono irraggiate da radiazione UV allo scopo di aprire finestre per l’elettrodo e le aree terminali , ecc. Successivamente, si attua uno sviluppo in acqua per rimuovere le regioni non esposte della prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile.
Secondo un esempio, la prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile à ̈ formata come segue. Un prepolimero della membrana di idrogel fotodefinibile à ̈ stato preparato aggiungendo 2% di fotoiniziatore (2-idrossi-2-metilpropiofenone) a PEG-DA. Una soluzione prepolimerica di PEG-DA à ̈ stata depositata tramite spin coating a 800 rpm per 10 secondi su una lamina 2 di Teonex Q83 con uno strato di elettrodo d’oro 3. La fotomaschera 8 à ̈ s tata allineata con i l motivo formato dall ’elettrodo 3 ed esposta a luce UV a 365 nm a 15 mW/cm<2>per 30 secondi. I l prepolimero à ̈ stato convertito in idrogel fotodefinibile reticolato. La membrana non polimerizzata à ̈ s tata r imossa in acqua deionizzata nell ’arco di alcuni minuti .
Come fase successiva nell’esempio i l lustrat ivo per fabbricare un biosensore secondo l’ invenzione, viene formata una seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato come mostrato nelle figure 4a e 4b.
Secondo l’esempio mostrato in figura 4a, la seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva viene depositata tramite spin coating sulle parti r imanenti della prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile e le porzioni esposte del lo strato di elettrodo 3 ( in par t icolare l’elettrodo). Una delle porzioni esposte dello strato di elettrodo 3 funzionerà come elettrodo 10 mentre un’altra funzionerà come area terminale 11. La seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva mostrata in figura 4a à ̈ modellata o definita tramite fotolitografia attraverso una fotomaschera 12. A questo scopo, una porzione della seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva esposta dalla fotomaschera 12 à ̈ irraggiata tramite radiazione UV e le porzioni non esposte sono successivamente rimosse tramite sviluppo della struttura in acqua. Tramite la radiazione UV un elemento di bioriconoscimento, come, ad esempio, un enzima, à ̈ immobilizzato nella seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva senza denaturare l’enzima.
Secondo un esempio, la seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva con un elemento di bioriconoscimento, ad esempio un enzima, à ̈ depositata come segue. Una soluzione enzimatica à ̈ sta ta dissolta in un tampone PBS e glutaraldeide. L’enzima à ̈ stato aggiunto in concentrazione pari al 20% (v/v) ad un prepolimero che à ̈ stato preparato aggiungendo 2% di fotoiniziatore a PEG-DA e vinilferrocene. La miscela à ̈ stata agitata per 4-5 h fino a 4-5 gradi per omogeneizzare l’enzima. La soluzione à ̈ stata depositata tramite spin coating a 800 rpm per 10 secondi sulla superficie della lamina 2 di Teonex con lo strato 3 di elettrodo modellato e la prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile (membrana di isolamento) che era stata precedentemente modellata. La fotomaschera 12 à ̈ stata allineata con l’elettrodo 10 ed esposta a luce UV (365 nm) a 15 mW/cm<2>per 30 s. I l prepolimero à ̈ sta to convertito in idrogel fotodefinibile reticolato. La membrana non polimerizzata à ̈ sta ta rimossa in acqua deionizzata per alcuni minuti .
In un approccio alternativo e come mostrato in figura 4b la seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva non à ̈ formata mediante spin coating ma piuttosto stampata a getto di inchiostro sull’elettrodo esposto 10 in modo da sovrapporsi a porzioni adiacenti della prima membrana 7 di idrogel fotodefinibile.
Dopo la formazione della seconda membrana 9 di idrogel fotodefinibile bioattiva o tramite spin coating e strutturazione fotolitografica oppure tramite getto di inchiostro, i l substrato 1 di supporto viene rimosso e la struttura risultante mostrata in figura 5 Ã ̈ disponibile per la lavorazione di finitura (contattamento, ecc.) .
Tutte le forme di realizzazione precedentemente discusse non sono intese come limitazioni ma servono come esempi che illustrano caratteristiche e vantaggi dell’ invenzione. Va inteso che alcune o tutte le caratteristiche sopra descritte possono anche essere combinate in modi differenti .

Claims (17)

  1. Rivendicazioni 1. Un biosensore comprendente: una lamina flessibile, uno strato di elettrodo al di sopra del la lamina, uno strato adesivo, e una prima membrana di idrogel fotodefinibile senza elemento di bioriconoscimento disposta parzialmente al di sopra dello strato di elettrodo e parzialmente direttamente sulla lamina; e una seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato al di sopra dello strato di elettrodo.
  2. 2. Biosensore secondo la rivendicazione 1, in cui la seconda membrana di idrogel foto definibile à ̈ disposta parzialmente sopra e a diretto contatto con la prima membrana di idrogel foto definibile e parzialmente sopra e a diretto contatto con lo strato di elettrodo.
  3. 3. Biosensore secondo la rivendicazione 2, in cui la seconda membrana di idrogel fotodefinibile à ̈ a contatto con lo strato di elettrodo in una regione in cui la prima membrana di idrogel fotodefinibile lascia esposto lo strato di elettrodo.
  4. 4. Biosensore secondo una delle rivendicazioni precedenti , comprendente ulteriormente uno strato adesivo disposto sulla lamina e fra una parte della prima membrana di idrogel fotodefinibile e la lamina.
  5. 5. Biosensore secondo la rivendicazione 4, in cui lo strato adesivo comprende silano.
  6. 6. Biosensore secondo una delle rivendicazioni precedenti , in cui l’elemento di bioriconoscimento à ̈ un enzima.
  7. 7. Biosensore secondo una delle rivendicazioni precedenti , in cui la prima e/o la seconda membrana di idrogel fotodefinibile comprende almeno uno fra monomeri e prepolimeri , ad esempio,
  8. 8. Biosensore secondo una delle rivendicazioni precedenti , in cui la prima e/o la seconda membrana di idrogel fotodefinibile comprende almeno uno fra oligomeri e prepolimeri , ad esempio,
  9. 9. Biosensore secondo una delle rivendicazioni precedenti , in cui lo strato adesivo sulla pellicola flessibile comprende, almeno, uno di questi organosilani: : * silani di acrilato e metacrilato, come ad esempio N-(3-acrilossi-2-idrossipropil)-3-amminopropiltrietossisilano, [3-(metacriloilossi)propil] trimetossisilano, 3-(acrilossipropil) trimetossisilano, N-(3-acrilossi-2-idrossipropil)-3-amminopropiltrietossisilano, O-(metacrilossietil)-N-(trietossisililpropil)uretano, N-(3-metacrilossi-2-idrossipropil)-3-(amminopropiltrietossisilano, metacrilossimetiltrietossisilano, metacrilossimetiltrimetossisilano, metacrilossipropiltrietossisilano, (3-acrilossipropil)metildimetossisilano, (metacrilossimetil)metildietossisilano, (metacrilossime til )metildimetossisilano, metacrilossipropilmetildietossisilano, metacrilossiproprilmetildimetossisilano, metacrilossipropildimetiletossisilano, metacrilossipropildimetilmetossisilano; * azasilani ciclici , come ad esempio N-allil-aza-2,2-dimetossisilaciclopentano, N-amminoetil-aza-2,2,4-trimetilsilaciclopentano, N-(3-amminopropildimetilsila)aza-2,2-dimetil -2-silaciclopentano, N-n-butil-aza-2,2-dimetossisila-ciclopentano, 2,2-dimetossi-1,6-diaza-2-silaciclottano, N-metil-aza-2,2,4-trimetilsilaciclopentano, anidride 3-(trietossisilil)propilsuccinica. * ammina dipodale, come ad esempio bis(trimetossisililpropil)urea, bis(metildietossisililpropil)ammina,bis(metildimetossisililpro pil)-N-metilammina, bis[ (3-trimetossisilil )propil]etilendiammina, bis[ (3-trietossisilil )propil ]-urea, bis-( trimetossisililpropil)ammina; * silano con funzionalità amminica, come ad esempio ureidopropiltrietossisilano, N-(3-trietossisililpropil )-4,5-diidroimidazolo, acetammidopropiltrimetossisilano, 2-(2-piridietil) tiopropiltrimetossisilano, 3-(1,3-dimetilbutilidene)ammino-propiltrietossisilano, ureidopropiltrimetossisilano, N,N-diottil-N’-trietossisililpropilurea; * carbossilato silano, come ad esempio sale sodico di carbossietilsilantriolo, acido trietossisililpropilmaleamico, sale trisodico dell’acido N-(trimetossisililpropil)etilene diammina triacetico.
  10. 10. Metodo per la fabbricazione di un biosensore, comprendente: rendere disponibile una lamina; formare uno strato di elettrodo sulla lamina; formare uno strato adesivo sul la lamina; formare una prima membrana di idrogel fotodefinibile senza elemento di bioriconoscimento parzialmente sullo strato di elettrodo e parzialmente direttamente sulla lamina; formare una seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento immobilizzato al di sopra dello strato di elettrodo
  11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui la formazione del primo idrogel fotodef inibile parzialmente sopra lo strato di elet trodo comprende le fasi , attuate in successione di: depositare un primo materiale di idrogel fotodefinibile direttamente sul lo strato di elettrodo; e definire l i tograficamente i l primo materiale di idrogel fotodef inibile per lasciare esposta una porzione dello strato di elettrodo.
  12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui la formazione del la seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento al di sopra dello strato di elettrodo comprende le fasi , attuate in successione di : depositare un secondo materiale di idrogel fotodef inibile diret tamente sulla prima membrana di idrogel fotodefinibile e direttamente sulla porzione della regione di elettrodo lasciata esposta dalla prima membrana di idrogel fotodefinibile; esporre ad irraggiamento solo la regione del secondo materiale di idrogel fotodefinibile direttamente depositata sulla porzione della regione di elettrodo lasciata esposta dal la prima membrana di idrogel fotodefinibile; e rimuovere la regione del secondo materiale di idrogel fotodefinibile che non era stata esposta al l’ irraggiamento.
  13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui la formazione del la seconda membrana di idrogel fotodefinibile con un elemento di bioriconoscimento al di sopra dello strato di elettrodo comprende le fasi attuate in successione di: formare un secondo materiale di idrogel fotodefinibile direttamente solo sulla porzione del la regione di elettrodo lasciata esposta dalla prima membrana di idrogel fotodefinibile in modo tale che detto secondo materiale di idrogel fotodefinibile sia parzialmente sovrapposto al primo materiale di idrogel fotodefinibile; e esporre i l secondo materiale di idrogel fotodefinibile ad irraggiamento.
  14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 12 o 13, in cui la lamina agisce essa stessa come substrato oppure à ̈ formata su di un substrato di supporto e comprendente ulteriormente la rimozione del substrato di supporto dopo che sono state completate tut te le fasi del metodo secondo la rivendicazione 12 o 13.
  15. 15. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 10 a 14, in cui lo strato di elettrodo à ̈ formato su parte della lamina e ulteriormente comprendente: formazione di uno strato adesivo su porzioni della lamina che non sono coperte dallo strato di elettrodo e formazione della prima membrana di idrogel fotodefinibile sullo strato adesivo.
  16. 16. Metodo secondo la rivendicazione 15, in cui la fase di formazione dello strato adesivo comprende le fasi attuate in successione di: trattamento a l plasma, in particolare trattamento a l plasma di O2, della lamina; immersione della lamina in una soluzione di silano; risciacquo della lamina in un solvente; e riscaldamento della lamina con lo strato di adesivo di silano.
  17. 17. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui le fasi sono attuate in presenza di un fotoresist formato sullo strato di elettrodo e ulteriormente comprendente la rimozione del fotoresist dopo i l riscaldamento della lamina con lo strato di adesivo di silano.
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