CN109270143B - 一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法 - Google Patents
一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,将葡萄糖氧化酶加入到含有硅烷偶联剂的水溶性光敏树脂单体溶液中,通过光聚合将酶包埋在固化后光敏树脂的网状结构中。通过在水溶性光敏树脂中加入硅烷偶联剂,能大大增加固化后树脂膜的透氧率,从而有效提高固定化葡萄糖氧化酶的活性。本发明方法步骤简单,所使用的试剂具有良好的生物相容性,并且所制得的传感器对葡萄糖有良好的检测效果和快的响应速度。
Description
技术领域
本发明涉及一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,属于固化酶技术领域。
背景技术
糖尿病是一种因体内胰岛素分泌缺陷或组织细胞的胰岛素抵抗引起的高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病的主要临床表现为“三多一少”,即多饮、多尿、多食和体重下降。糖尿病可以引起多种并发症。急性并发症有低血糖症、酮症酸中毒、非酮高渗性昏迷等。慢性的长期并发症包括心血管疾病、慢性肾衰竭、视网膜病变、神经病变、微血管病变及糖尿病足等。引起慢性并发症的主要原因是长期血糖过高。如果对糖尿病患者进行早期的诊断和治疗,有效控制血糖浓度并结合良好的生活习惯,可以有效地降低并发症的危险。因此研究开发简便快捷又测量准确的葡萄糖检测手段成为人们关注的热点。
血糖浓度检测方法主要分为采血式单点测量和连续血糖监测两大类。采血式单点测量法是目前最常用的个人血糖测量手段,该方法通过指端釆血,将血液滴在专用的试纸条上,并将试纸条插入血糖测量仪,从测量仪上就可以直接读取血糖浓度值。该法快速、便宜、操作简单。而连续血糖监测设备根据传感器是否穿透皮肤可以分为无创血糖监测、经皮血糖监测、微创介入式血糖监测和全植入式血糖监测。无创血糖监测以光学方法为主,光学传感器通过不同波段的光,并利用光与葡萄糖分子之间的相互作用来检测葡萄糖。经皮血糖监测主要通过反向离子电渗、超声促渗、真空抽吸、微孔和微针等方法来实现。微创介入式血糖监测釆用针状传感器电极,电极上固定GOx,GOx催化葡萄糖生成产物过氧化氢,过氧化氢的浓度与葡萄糖浓度相关,通过检测过氧化氢可以得到葡萄糖的浓度。全植入式血糖监测系统是将酶传感器电极与恒电势检测电路、信号处理电路和无线通讯电路以及电源模块都集成到一起,实现整个监测功能,并通过生物相容性材料进行系统封装,以避免系统植入生物体内后引起强烈的免疫排斥反应。
综上所述,在血糖浓度检测方法中主流的技术手段是电化学酶电极技术,通过GOx等特异性酶对待测反应物进行催化反应,再通过电化学电极检测反应物的消耗或产物的生成来检测葡萄糖浓度。电化学酶电极技术广泛应用于釆血式单点血糖测量仪、连续血糖监测系统以及植入式血糖传感器之中。在电化学酶电极技术中最为关键的是酶在电极表面的修饰,它能直接影响到检测技术的性能优劣。酶是由生物体产生的具有催化活性的化合物,它有许多如催化效率高,催化条件温和,专一性强,反应产物污染小,能耗低,反应易控制等其它化学催化剂无法比拟的优点。但在具体使用中,它又有一些不足之处。因为大多数酶的化学本质是蛋白质,其生物活性容易受到外界环境的影响,对酸、碱、热及有机溶液等外界环境的改变反应敏感,容易发生酶蛋白的变性作用,降低或失去其生物活性。而且酶催化反应通常是在溶液中进行,会有回收困难以及产品生化分离提纯操作上的困难,增加生产工艺步骤,提高生产成本。而使用游离酶,酶反应只能分批进行,难于连续化、自动化操作。这严重地阻碍了酶工程的发展应用。将游离酶固定化是克服上述缺点的方法之一。固定酶技术是把从生物体内提取出来的酶,用人工方法固定在载体上或用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。酶固定化技术于20世纪60年代产生,并在近几十年中得到迅速发展。与游离酶相比,固定化酶具有以下优点:(1)固定化酶一般对温度和pH的适应范围增大,稳定性提高,对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低;(2)反应完成后固定化酶可通过简单的方法回收,回收的固定化酶可重复使用,同时固定化酶不易游离到产品中,便于产品的分离和纯化;(3)固定化酶的研究使批量或连续操作模型的实现成为可能,更适于连续化、自动化、产业化生产。
酶固定化的方法因分类依据的不同而分类不同。从固定化操作过程与方式来看可分为吸附法、包埋法、交联法和共价键偶联法(键合法)。吸附法是指酶被吸附于不溶性的载体上的固定化方法。吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。酶蛋白质分子中含有疏水基团,还有氨基、羟基和羧基等功能基团,可以通过静电作用、氢键和范德华力将酶吸附于载体上。物理吸附法对于保持酶的活性中心和高级结构效果较好,对酶活性的影响较小;然而,由于酶与载体之间的结合力弱,酶容易脱落。利用各种多孔材料将酶包埋,达到固定化酶的效果叫做包埋法。包埋法有网格型和微囊型两种。网格型是指将酶分子包埋在高分子凝胶的细微网格中(或者内部的微孔中),常用的载体有明胶、淀粉、海藻酸等天然高分子化合物和聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、光交叉树脂等合成高分子化合物。微囊型是指将酶分子包埋在由高分子聚合物制备的小球(球状体的大小从几微米到几百微米)中。靠网格和微囊的结构将酶固定在载体内,酶分子不能渗入到周围介质中,但底物和产物可以自由进出,而且包埋法中酶蛋白分子中的氨基酸残基一般不参与结合反应,很少使酶的高级结构发生改变,有较高的酶活性回收率。然而,载体对于底物和产物的扩散阻力会使酶的动力学行为改变,固定化酶的表观活性会降低。因此,包埋法只适用于底物和产物为小分子的酶,不适用于大分子底物的对应酶。交联法是指借助多功能或者双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。这种方法利用酶蛋白分子上的氨基、巯基、咪唑基和酚基与交联剂形成共价键来参与交联反应。这种方法中,由于酶蛋白的功能基团参与了反应,酶的活性损失比较大,但是固定化的酶结合稳固,可以长时间使用。利用酶分子与载体上的有机基团,通过共价键发生键合使酶固定的方法称作共价键合法。通过共价键合法制得的固定化酶与载体结合牢固,不会因为过高浓度的底物或盐类的存在等原因而使酶分子从载体上脱落,提高了固定化酶的操作稳定性。但由于这种方法的反应条件苛刻,操作复杂,酶分子易失活,所以,制得的固定化酶比活力一般不高,有的甚至会可能使酶的性质发生一些改变(如酶的底物专一性)。
鉴于上述背景,本发明提出一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法。该方法以光敏性水溶性树脂为固化酶的主体,通过光固化树脂将酶修饰到电极表面。相比于其他方法固化酶,该方法步骤简单,所使用试剂具有良好的生物相容性,并且所制得的传感器对葡萄糖有良好的检测效果,具有较快的响应速度。由于其良好的生物相容性,简便的固化步骤,未来可拓展到柔性器件中酶的固定技术中。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是提供一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,该方法利用水溶性光敏树脂固化葡萄糖氧化酶,通过包埋法将葡萄糖氧化酶固化在电极表面,本发明方法使酶与载体结合力强,不易脱落,而且酶仍具有很高的催化活性。
发明内容:为解决上述技术问题,本发明所采用的技术手段为:
一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,将葡萄糖氧化酶加入到含有硅烷偶联剂的水溶性光敏树脂单体溶液中,通过光聚合将酶包埋在固化后光敏树脂的网状结构中。
上述高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,具体包括如下步骤:
步骤1,配制含硅烷偶联剂的水溶性光敏树脂单体溶液,然后往溶液中加入所需量的光引发剂和交联剂,得到混合溶液;
步骤2,将葡萄糖氧化酶加入混合溶液中,制得含酶光敏树脂单体溶液;
步骤3,将含酶光敏树脂单体溶液滴涂到电极表面,在紫外灯下固化一段时间;
步骤4,将紫外灯下固化后的电极利用水化去除电极表面未反应的单体或低聚体,得到表面固化有葡萄糖氧化酶的电极。
其中,步骤1中,所述水溶性光敏树脂单体溶液中含有至少两种光敏树脂单体,其中,光敏树脂单体为甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟丙酯或2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱。
其中,所述水溶性光敏树脂单体溶液中还含有硅烷偶联剂,其中,硅烷偶联剂为乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷或乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷。在水溶性光敏树脂中引入硅烷偶联剂,能增加固化后树脂膜的透氧率,从而有效提高固定化葡萄糖氧化酶的活性。
其中,步骤1中,所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮;所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。
其中,所述光引发剂2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的添加量为单体溶液质量百分比的0.3~0.5%(单体溶液是指含硅烷偶联剂的水溶性光敏树脂单体溶液);所述交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯的添加量为单体溶液质量百分比的0.3~0.4%。光引发剂2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮能引发聚合反应,而加入的二甲基丙烯酸乙二醇酯作为交联剂,在聚合过程中,能在其它线型分子间起架桥作用,从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构,提高葡萄糖氧化酶的负载量。
其中,步骤2中,葡萄糖氧化酶与混合溶液的质量体积比:每加入1mg葡萄糖氧化酶,所需10μL混合溶液。
其中,步骤3中,光聚合中,固化用紫外灯的波长为250~398nm,强度为4~30mW/cm2,固化时间为30~60min。
其中,步骤4中,将固化后的电极于常温下浸泡于水、生理盐水或PBS缓冲溶液中,使其溶胀,同时,除去电极表面残余未反应或聚合度低的单体,浸泡时间为20~30min。
本发明方法整个制备过程如下:首先将含有光敏树脂单体混合物、聚合引发剂、交联剂的溶液加入到棕色的反应小瓶内,磁力搅拌2-4h后,取适量葡萄糖氧化酶溶于一定量的该混合溶液中,待酶全部溶解后,取适量该溶液滴加到Pt电极表面,然后进行光引发自由基聚合固化,光聚合完成后葡萄糖氧化酶被固定在电极表面。对于光聚合过程,需要将Pt电极垂直放置,然后照射紫外线进行聚合。聚合结束后,将Pt电极表面的树脂膜进行水化处理。水化处理,是指将固化后的电极放在PBS缓冲溶液中,使其溶胀(溶剂膨胀),同时,洗去树脂膜中残余、未反应或聚合度低的单体。
相比于现有技术,本发明技术方案具有的有益效果为:
本发明在水溶性光敏树脂单体溶液中加入一种或多种硅烷偶联剂,利用交联共聚的原理,将酶包埋在固化后光敏树脂的网状结构中,加入硅烷偶联剂后得到的固化后树脂膜具有高的透氧性,从而能有效提高固定化酶的催化活性(透氧性的提高能提升酶的活性,有利于酶催化葡萄糖反应);其次,本发明方法工艺简单,所使用的试剂具有良好的生物相容性,光聚合固化后,只需2~3次水化,即可将树脂膜中残余、未反应或聚合度低的单体除去;最后,采用本发明方法制得的传感器对葡萄糖具有良好的检测效果和快的响应速度。
附图说明
图1为本发明制备方法的流程图;
图2为本发明实施例1以HEMA、NVP为亲水单体的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;
图3为本发明实施例2以HPMA、NVP为亲水单体的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;
图4为本发明实施例3以HPMA、NVP为亲水单体,以VTEO为硅烷偶联剂制得的传感器对葡萄糖的电流响应;
图5为本发明实施例4以HPMA、NVP为亲水单体,以VTMO为硅烷偶联剂制得的传感器对葡萄糖的电流响应;
图6为本发明实施例5以HPMA、NVP为亲水单体,以A-172硅烷为硅烷偶联剂制得的传感器对葡萄糖的电流响应;
图7为本发明实施例6以HPMA、NVP为亲水单体,未加入硅烷偶联剂制得的传感器对葡萄糖的电流响应。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。
本发明方法中所用试剂均购买于Sigma Aldrich公司。其中,各物质的缩写为:甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、乙烯基三乙氧基硅烷(VTEO)、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMO)、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷(A-172硅烷)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(D1173)、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)。
本发明方法将葡萄糖氧化酶加入到光敏树脂单体混合物中(光敏树脂单体混合物,主要进行自由基引发聚合,因此还需添加适量的自由基聚合引发剂,引发剂的加入量一般是反应试剂质量百分比的0.01~5%),进行光聚合得到固化酶的传感器,残余的未反应单体或低聚体利用水化过程去除。
实施例1
称取1.2g的HEMA,0.4g的NVP,向其中加入0.4%的光引发剂Darocur 1173,0.3%的交联剂EGDMA,搅拌均匀,得到混合溶液;取100μL混匀后的混合溶液,往其中加入10mg的葡萄糖氧化酶,超声处理使酶全部溶解。取7μL酶溶解后的溶液滴涂到Pt电极表面,在波长为365nm,强度30mW/cm2的紫外光下固化50分钟,固化后,将Pt电极放入常温PBS溶液中水化,去除未反应的单体,得到葡萄糖氧化酶修饰的电极。
实施例2
称取1g的HPMA,0.6g的NVP,向其中加入0.4%的光引发剂Darocur 1173,0.3%的交联剂EGDMA,搅拌均匀,得到混合溶液;取100μL混匀后的混合溶液,往其中加入10mg的葡萄糖氧化酶,超声处理使酶全部溶解。取7μL酶溶解后的溶液滴涂到Pt电极表面,在波长为365nm,强度30mW/cm2的紫外光下固化50分钟,固化后,将Pt电极放入常温PBS溶液中水化,去除未反应的单体,得到葡萄糖氧化酶修饰的电极。
图2为本发明实施例1以HEMA,NVP为亲水单体的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;图3为本发明实施例2以HPMA、NVP为亲水单体的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;由图2和图3可知,以HPMA、NVP为亲水单体制备的传感器对相同浓度的葡萄糖的电流响应值更大,对0~0.6mM浓度范围内的葡萄糖具有良好的线性响应关系。
实施例3
称取0.6g的HPMA,1g的NVP,0.4g的VTEO,向其中加入0.4%的光引发剂Darocur1173,0.3%的交联剂EGDMA,搅拌均匀,得到混合溶液;取100μL混匀后的混合溶液,往其中加入10mg的葡萄糖氧化酶,超声处理使酶全部溶解。取7μL酶溶解后的溶液滴涂到Pt电极表面,在波长为365nm,强度30mW/cm2的紫外光下固化50分钟,固化后,将Pt电极放入常温PBS溶液中水化,去除未反应的单体,得到葡萄糖氧化酶修饰的电极。
实施例4
称取0.6g的HPMA,1g的NVP,0.4g的VTMO,向其中加入0.4%的光引发剂Darocur1173,0.3%的交联剂EGDMA,搅拌均匀,得到混合溶液;取100μL混匀后的混合溶液,往其中加入10mg的葡萄糖氧化酶,超声处理使酶全部溶解。取7μL酶溶解后的溶液滴涂到Pt电极表面,在波长为365nm,强度30mW/cm2的紫外光下固化50分钟,固化后将Pt电极放入常温PBS溶液中水化,去除未反应的单体,得到葡萄糖氧化酶修饰的电极。
实施例5
称取0.6g的HPMA,1g的NVP,0.4g的A-172硅烷,向其中加入混合单体(HPMA、NVP和A-172硅烷)质量百分比为0.4%的光引发剂Darocur 1173,混合单体(HPMA、NVP和A-172硅烷)质量百分比为0.3%的交联剂EGDMA,搅拌均匀,得到混合溶液;取100μL混匀后的混合溶液,往其中加入10mg的葡萄糖氧化酶,超声处理使酶全部溶解。取7μL酶溶解后的溶液滴涂到Pt电极表面,在波长为365nm,强度30mW/cm2的紫外光下固化50分钟,固化后,将Pt电极放入常温PBS溶液中水化,去除未反应的单体,得到葡萄糖氧化酶修饰的电极。
图4为本发明实施例3以HPMA,NVP为亲水单体,VTEO作为硅烷偶联化试剂的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;图5为本发明实施例4以HPMA、NVP为亲水单体,VTMO作为硅烷偶联化试剂的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;图6为本发明实施例3以HPMA,NVP为亲水单体,A-172硅烷作为硅烷偶联化试剂的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应;由图4、图5、图6可知,以HPMA、NVP为亲水单体,以VTMO作为硅烷偶联剂配制的光敏树脂混合单体溶液固化酶,所得的传感器对相同浓度的葡萄糖的电流响应值更大,响应速度更快,对0~0.6mM浓度范围内的葡萄糖具有良好的线性响应关系。
实施例6
称取0.6g的HPMA,1g的NVP,向其中加入0.4%的光引发剂Darocur 1173,0.3%的交联剂EGDMA,搅拌均匀,得到混合溶液;取100μL混匀后的混合溶液,往其中加入10mg的葡萄糖氧化酶,超声处理使酶全部溶解。取7μL酶溶解后的溶液滴涂到Pt电极表面,随后在UV光下暴露50min,使光敏树脂固化。将Pt电极放入常温PBS溶液中水化,去除未反应的单体,得到葡萄糖氧化酶修饰的电极。
图7为本发明实施例6以HPMA、NVP为亲水单体,未加入硅烷偶联化试剂的光敏树脂固化酶制得的传感器对葡萄糖的电流响应。
以HPMA、NVP为亲水单体,加入不同硅烷偶联剂以及不加入硅烷偶联剂修饰酶制得的传感器对不同浓度葡萄糖的电流响应如表1所示:
表1
表1为以HPMA、NVP为亲水单体,加入不同硅烷偶联剂以及不加入硅烷偶联剂修饰酶制备的传感器对不同浓度葡萄糖的电流响应值。经过对比发现,硅烷偶联剂的加入显著提高了葡萄糖传感器的检测性能。
Claims (6)
1.一种高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,其特征在于:将葡萄糖氧化酶加入到含有硅烷偶联剂的水溶性光敏树脂单体溶液中,通过光聚合将酶包埋在固化后光敏树脂的网状结构中;所述水溶性光敏树脂单体溶液中的硅烷偶联剂为乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷或乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷;
上述固定方法,具体包括如下步骤:
步骤1,配制含硅烷偶联剂的水溶性光敏树脂单体溶液,然后往溶液中加入所需量的光引发剂和交联剂,得到混合溶液;所述水溶性光敏树脂单体溶液中含有至少两种光敏树脂单体,其中,光敏树脂单体为甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟丙酯或2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱;
步骤2,将葡萄糖氧化酶加入混合溶液中,制得含酶光敏树脂单体溶液;
步骤3,将含酶光敏树脂单体溶液滴涂到电极表面,在紫外灯下固化一段时间;
步骤4,将紫外灯下固化后的电极利用水化去除电极表面未反应的单体或低聚体,得到表面固化有葡萄糖氧化酶的电极。
2.根据权利要求1所述的高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,其特征在于:步骤1中,所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮;所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。
3.根据权利要求1所述的高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,其特征在于:所述光引发剂2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的添加量为0.3~0.5%;所述交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯的添加量为0.3~0.4%。
4.根据权利要求1所述的高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,其特征在于:步骤2中,葡萄糖氧化酶与混合溶液的质量体积比:每加入1mg葡萄糖氧化酶,所需10µL混合溶液。
5.根据权利要求1所述的高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,其特征在于:步骤3中,固化用紫外灯的波长为250~398nm,强度为20~30mW/cm2,固化时间为50~60min。
6.根据权利要求1所述的高活性葡萄糖氧化酶的固定方法,其特征在于:步骤4中,将固化后的电极于常温下浸泡于水、生理盐水或PBS缓冲溶液中,除去电极表面残余未反应或聚合度低的单体,浸泡时间为20~30min。
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Bio-Smart Materials:Kinetics of Immobilized Enzymes in p(HEMA)/p(Pyrrole) Hydrogels in Amperometric Biosensors;Sean Brahim et.al;《Macromol.Symp》;20020831;第186卷;第63-73页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN109270143A (zh) | 2019-01-25 |
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