RU2733935C2 - Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода - Google Patents
Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода Download PDFInfo
- Publication number
- RU2733935C2 RU2733935C2 RU2019108681A RU2019108681A RU2733935C2 RU 2733935 C2 RU2733935 C2 RU 2733935C2 RU 2019108681 A RU2019108681 A RU 2019108681A RU 2019108681 A RU2019108681 A RU 2019108681A RU 2733935 C2 RU2733935 C2 RU 2733935C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- electrode
- azide
- film
- proteins
- working electrode
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризующийся погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25%-ный раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu0 в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II) и инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут. Изобретение обеспечивает сокращение длительности процедуры иммобилизации. 2 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 ил.
Description
Изобретение относится к способам иммобилизации рецепторного слоя электрохимических биосенсоров. Изобретение создано с целью совершенствования конструкций современных электрохимических биосенсоров, а именно: сокращения временных, материало- и трудозатрат, миниатюризации и автоматизации. Изобретение может быть использовано в микробиологии, биотехнологии, медицине, технологии изготовления биосенсорных устройств.
Известен способ ковалентной иммобилизации белковых молекул на поверхность предметного стекла посредством реакции CuAAC [P.-C. Lin, S.-H. Ueng, M.-C. Tseng, J.-L. Ko, K.-T. Huang, S.-C. Yu, A. K. Adak, Y.-J. Chen, C.-C. Lin / Site-Specific Protein Modification through CuI-Catalyzed 1,2,3-Triazole Formation and Its Implementation in Protein Microarray Fabrication// Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 4286-4290]. Предметное стекло функцианолизировали азидными группами, после чего проводили реакцию CuAAC катализируемую системой "CuSO4-трис(карбоксиэтил)-фосфин" с алкин-функцианализированными белками, в течение 12 часов.
Описан метод [E. Sánchez-Tirado, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño, J. M. Pingarrón / Carbon nanotubes functionalized by click chemistry as scaffolds for the preparation of electrochemical immunosensors. Application to the determination of TGF-beta 1 cytokine // Analyst 14 (2016) 5730-5737] к иммобилизации антител на рабочий электрод посредством CuAAC реакции на поверхности азид-функционализированных углеродных нанотрубок. CuAAC реакция протекала в объеме суспензии, содержащей предварительно синтезированные конъюгаты антител с пропаргил-N-гидроксисукцинимидом, после чего на рабочий электрод капали нанотрубки с иммобиллизованными антителами. В качестве катализатора авторы применяли систему "CuSO4-аскорбиновая кислота", время реакции составляло12 часов.
Известен способ адресной иммобилизации белков на поверхности силиконового носителя с использованием реакции CuAAC [T. Vrankena, E. S. Redeker, A. Miszta, B. Billena, W. Hermens, B. de Laat, P. Adriaensens, W. Guedensa, T. J. Cleij / In situ monitoring and optimization of CuAAC-mediated proteinfunctionalization of biosurfaces // Sensors and Actuators B 238 (2017) 992–1000]. В предложенном способе поверхность карбоксилированной силиконовой подложки модифицировали азидным линкером, белковую молекулу алкилиовали эфиром N-гидроксисукцинимида. После этого между азидной группой функционализированной подложки и ацетиленфункционализированным белком проводили реакцию CuAAC, катализируемую системой "CuSO4-аскорбат натрия". Общее время иммобилизации превышало 4 часа.
Также известен метод [N. Meini, M. Ripert, C. Chaix, C. Farre, G. De Crozals, R. Kherrat, N. Jaffrezic-Renault / Label-free electrochemical monitoring of protein addressing through electroactivated “click” chemistry on gold electrodes // Materials Science and Engineering C 38 (2014) 286–291] адресной иммобилизации стрептавидина на поверхности золотого электрода. Поверхность электрода модифицировали гексинил-терминальным дитиол фософорамидитом, после чего между ацетиленовой группой данного соединения и предварительно синтезированным конъюгатом «азид-полиэтиленгликоль-биотин» проводили клик-реакцию, катализируемую ионами меди Cu(I), электрогенерируемыми из раствора CuSO4. Далее модифицированный рабочий электрод инкубировали в суспензии стрептавидина. Общее время иммобилизации составило 2 часа 30 минут.
Другим известным техническим решением служит способ иммобилизации фермента пероксидазы хрена на поверхности рабочего электрода с использованием реакции CuAAC [G. Rydzek, T. G. Terentyeva, A. Pakdel, D. Golberg, J. P. Hill, K. Ariga / Simultaneous Electropolymerization and Electro-Click Functionalization for Highly Versatile Surface Platforms // American Chemical Society 5(2014) 5240-5248]. В предложенном способе на поверхности рабочего электрода из оксида индия-олова проводили реакцию электрополимеризации 4-азиданилина с одновременным протеканием реакции CuAAC, катализируемой ионами Cu(I), электровосстановленными из раствора сульфата меди в течении 450 циклов. В реакцию азид-алкинового циклоприсоединения вступали азидные группы электроосажденной пленки полимера и уницидиновая кислота, после чего посредством карбодиимидной сшивки происходила иммобилизация на электрод фермента. Существенным недостатком предложенного способа является длительность (более 4 часов) и многостадийность процедуры иммобилизации.
Недостатками вышеописанных методов и способов являются длительность и многостадийность процедуры иммобилизации, необходимость предварительного получения и очистки конъюгатов. Кроме того, присутствие ионов меди в растворе на стадии инкубирования белков может приводить к уменьшению аффинности иммунорецептора и, следовательно, ухудшить чувствительность и точность определения.
Предлагаемый способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризуется погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25% раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu0 в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II), перемещением электрода в водный раствор эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида, наложением трех линейных разверток потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В при перемешивании, инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут. Частицы Cu0 электрохимически осаждают либо одновременно с формированием на электроде пленки поливинилбензилазида, добавляя в электрохимическую ячейку гексафторацетилацетонат меди (II), либо в заранее сформированную на электроде пленку поливинилбензилазида из водного раствора 0,01 М CuSO4 при потенциале -1 В в течение 120 секунд.
Общая схема процедуры иммобилизации и уравнения соответствующих химических реакций приведены в приложении 1.
Электрополимеризация винилбензилазида и электрохимическое осаждение частиц меди позволяет сформировать на поверхности электрода пленку, пригодную для последующего проведения реакции CuAAC при минимальных временных, материало- и трудозатратах, поскольку катализатор – ионы Cu1+ генерируется и локализуется непосредственно в области протекания реакции - приэлектродном слое, винилбензилазид иммобилизован на электроде, а эфир пропаргил-N-гидроксисукцинимида содержится в растворенном виде и непрерывно доставляется к электроду посредством перемешивания раствора. Адресность иммобилизации белка достигается за счет электрополимеризации винилбензилазида, а уменьшение числа материало- и трудозатрат - отсутствием стадии синтеза и очистки конъюгатов белков с пропаргил-N-гидроксисукцинимидом. Общее иммобилизации не превышает 60 минут, 30 минут из которых требуется для инкубации модифицированного электрода в суспензии белка. Иммобилизация белка в предложенном способе протекает в одну стадию без непосредственного контакта с ионами меди, что способствует сохранению нативной структуры белка.
Таким образом, предлагаемое техническое решение направлено создание на поверхности рабочего электрода адресно локализованного функционального покрытия для ковалентного связывания с белком посредством реакции CuAAC. Это позволит уменьшить число стадий и сократить длительность процедуры иммобилизации.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Стеклоуглеродный дисковый электрод помещают в раствор диметилформамида, содержащий 25% винилбензилазида, 0,01 М гексафторацетилацетоната меди и 0,1 М перхлората лития в качестве фонового электролита. Производят шестикратную циклическую развертку потенциала в диапазоне от -0,5 В до -3 В. Модифицированный электрод помещают в водный раствор, содержащий 0,1 М эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида и 0,1 М хлорида калия и производят трехкратную линейную развертку потенциала от 0 В до 1 В. После этого рабочий электрод инкубируют в растворе, содержащем антитела против карциноэмбрионального антигена в концентрации 0,1 мг/мл. О присутствии на электроде иммобилизованного белка судят по различию в величине переноса заряда на годографе электрохимического импеданса, зарегистрированном в водном растворе, содержащем 1 мМ K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], до (1) и после (2) инкубирования электрода в суспензии белка (фигура 1).
На фигуре 1 приведены годографы электрохимического импеданса, зарегистрированные на стеклоуглеродном дисковом электроде до (1) и после (2) проведения процедуры иммобилизации антител против карциноэмбрионального антигена.
Пример 2
Толстопленочный графитсодержащий электрод помещают в раствор диметилформамида содержащий 25 % винилбензилазида и 0,1 М перхлората лития в качестве фонового электролита. Производят шестикратную циклическую развертку потенциала в диапазоне от -0,5 В до -3 В. Электрод помещают в водный раствор, содержащий 0,01 М CuSO4 и выдерживают при потенциале -1 В в течение 120 секунд. Модифицированный электрод помещают в раствор, содержащий 0,1 М эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида и 0,1 М хлорида калия, и производят трехкратную линейную развертку потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В. После этого рабочий электрод инкубируют в суспензии бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 1 мг/мл. О присутствии на электроде иммобилизованного белка судят по различию в величине сопротивления переноса заряда на годографе электрохимического импеданса, зарегистрированном в водном растворе, содержащем 1 мМ K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], до (3) и после (4) инкубирования электрода в суспензии белка (фигура 2).
На фигуре 2 приведены годографы электрохимического импеданса, зарегистрированные на толстопленочном графитсодержащем электроде до (3) и после (4) проведения процедуры иммобилизации бычьего сывороточного альбумина.
Claims (3)
1. Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризующийся погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25%-ный раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu0 в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II), перемещением электрода в водный раствор эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида, наложением трех линейных разверток потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В при перемешивании, инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы Cu0 электрохимически осаждают одновременно с формированием на электроде пленки поливинилбензилазида, добавляя в электрохимическую ячейку гексафторацетилацетонат меди (II).
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в заранее сформированную на электроде пленку поливинилбензилазида электрохимически осаждают частицы Cu0 из водного раствора 0,01 М CuSO4 при потенциале -1 В в течение 120 секунд.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019108681A RU2733935C2 (ru) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019108681A RU2733935C2 (ru) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019108681A RU2019108681A (ru) | 2020-09-28 |
| RU2019108681A3 RU2019108681A3 (ru) | 2020-09-28 |
| RU2733935C2 true RU2733935C2 (ru) | 2020-10-08 |
Family
ID=72927160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019108681A RU2733935C2 (ru) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2733935C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2249818C2 (ru) * | 2002-07-17 | 2005-04-10 | Донской государственный аграрный университет | Способ определения содержания белков |
-
2019
- 2019-03-26 RU RU2019108681A patent/RU2733935C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2249818C2 (ru) * | 2002-07-17 | 2005-04-10 | Донской государственный аграрный университет | Способ определения содержания белков |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LIN P.-C. et al. Site-specific Protein Modification Through Cu(I)-catalyzed 1,2,3-triazole Formation and Its Implementation in Protein Microarray Fabrication. Angew Chem Int Ed Engl. 2006 Jun 26; 45(26): 4286-90. MEINI N. et al. Label-free Electrochemical Monitoring of Protein Addressing Through Electroactivated "Click" Chemistry on Gold Electrodes. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2014 May 1; 38: 286-91. WANG Y. et al. Voltammetric myoglobin sensor based on a glassy carbon electrode modified with a composite film consisting of carbon nanotubes and a molecularly imprinted polymerized ionic liquid. Microchim Acta. 2017; 184: 195-202. * |
| LIN P.-C. et al. Site-specific Protein Modification Through Cu(I)-catalyzed 1,2,3-triazole Formation and Its Implementation in Protein Microarray Fabrication. Angewandte Chemie Int Ed Engl. 2006 Jun 26; 45(26): 4286-90. * |
| MEINI N. et al.Label-free Electrochemical Monitoring of Protein Addressing Through Electroactivated"Click" Chemistry on Gold Electrodes. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2014 May 1;38: 286-91. * |
| WANG Y. et al. Voltammetric myoglobin sensor based on a glassy carbonelectrode modified with a composite film consisting of carbon nanotubes and a molecularlyimprinted polymerized ionic liquid. Microchim Acta. 2017; 184: 195-202. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019108681A (ru) | 2020-09-28 |
| RU2019108681A3 (ru) | 2020-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1105736B1 (en) | Electrochemical affinity assay | |
| US10591476B1 (en) | Serially deposited biomolecules | |
| Le Goff et al. | Enzymatic biosensors based on SWCNT-conducting polymer electrodes | |
| EP1472361B1 (en) | Biosensor carrying redox enzymes | |
| EP1423688B1 (en) | Methods for producing highly sensitive potentiometric sensors | |
| KR100950140B1 (ko) | 효소 전극, 효소 전극의 제조 방법, 그리고, 이 효소 전극을 이용한 센서 또는 연료 전지 | |
| Varfolomeev et al. | Direct electron transfer effect biosensors | |
| IL124322A (en) | Detection of an entity in a sample | |
| He et al. | One-step synthesis of potassium ferricyanide-doped polyaniline nanoparticles for label-free immunosensor | |
| CA2763842A1 (en) | An electrochemical method and apparatus of identifying the presence of a target | |
| Labib et al. | Electrochemical analysis of HIV-1 reverse transcriptase serum level: Exploiting protein binding to a functionalized nanostructured surface | |
| KR100377946B1 (ko) | 덴드리머를 이용한 단분자막의 제조방법 | |
| Tsuji et al. | Enzyme immunosensors based on electropolymerized polytyramine modified electrodes | |
| US8679772B2 (en) | Immunoassay | |
| JP2005515469A (ja) | 化学発光検出のために最適化された固相 | |
| Sigrist et al. | Light–dependent, covalent immobilization of biomolecules on ‘inert’surfaces | |
| RU2733935C2 (ru) | Способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности рабочего электрода | |
| Campbell et al. | Towards immunoassay in whole blood: separationless sandwich-type electrochemical immunoassay based on in-situ generation of the substrate of the labeling enzyme | |
| Wang et al. | Sensitive electrochemiluminescence analysis of lung cancer marker miRNA-21 based on RAFT signal amplification | |
| Habermüller et al. | Conducting redoxpolymer-based reagentless biosensors using modified PQQ-dependent glucose dehydrogenase | |
| Tang et al. | Immunosensor for the determination of okadaic acid based on screen-printed electrode | |
| CN110161093B (zh) | 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法 | |
| US4797181A (en) | Flavin cofactor modified electrodes and methods of synthesis and use | |
| JP2003344407A (ja) | 電気化学的発光によって分子識別を検出するための方法 | |
| WO1994005742A1 (en) | Method of making acridinium derivative luminesce and method of detecting test material therewith |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210327 |