JP2003344407A - 電気化学的発光によって分子識別を検出するための方法 - Google Patents
電気化学的発光によって分子識別を検出するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料内のターゲット分子を正確にかつ感度良
くかつ定量的にかつ定性的に検出し得るような方法を提
供すること。 【解決手段】 支持体（ｓｕ）上に取り付けられたセン
サ分子（Ｓ）とターゲット分子（Ｃ）との間における分
子識別を検出するための方法であって、ａ）支持体上に
導電性フィルム（ｆ）を成膜しさらにフィルム上にセン
サ分子を取り付け、ターゲット分子をルミノール（Ｌ）
によってマーキングし、ｃ）ターゲット分子を支持体に
対して接触させ、ｄ）過剰のルミノールを除去するため
に支持体を濯ぎ、導電性フィルムを介してのターゲット
分子と支持体との間の直接的または間接的な電子移動に
よってトリガーされた電気化学的発光信号を読み取る。
くかつ定量的にかつ定性的に検出し得るような方法を提
供すること。 【解決手段】 支持体（ｓｕ）上に取り付けられたセン
サ分子（Ｓ）とターゲット分子（Ｃ）との間における分
子識別を検出するための方法であって、ａ）支持体上に
導電性フィルム（ｆ）を成膜しさらにフィルム上にセン
サ分子を取り付け、ターゲット分子をルミノール（Ｌ）
によってマーキングし、ｃ）ターゲット分子を支持体に
対して接触させ、ｄ）過剰のルミノールを除去するため
に支持体を濯ぎ、導電性フィルムを介してのターゲット
分子と支持体との間の直接的または間接的な電子移動に
よってトリガーされた電気化学的発光信号を読み取る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、電気化学的発光に
よって分子識別を検出するための方法に関するものであ
る。大まかには、本発明においては、支持体上に取り付
けられた第１分子と、試料内において検出対象をなす第
２分子と、の間における特定の分子識別の定性的検出と
定量的検出とに関心がある。
よって分子識別を検出するための方法に関するものであ
る。大まかには、本発明においては、支持体上に取り付
けられた第１分子と、試料内において検出対象をなす第
２分子と、の間における特定の分子識別の定性的検出と
定量的検出とに関心がある。
【０００２】本発明においては、特定の分子識別とは、
やや複雑な２つの分子どうしの間の特定の相互作用によ
って、これら２つの分子の結合時にこれら２つの分子を
検出可能とし得る程度に十分に安定的なものとして、こ
れら２つの分子の結合または一体化が引き起こされるこ
と、として定義される。本発明においては、このような
特定の分子識別には、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮ
Ａ）のハイブリッド化、抗原／抗体タイプの識別反応、
タンパク質／タンパク質タイプの相互作用、酵素／基質
タイプの相互作用、等がある。
やや複雑な２つの分子どうしの間の特定の相互作用によ
って、これら２つの分子の結合時にこれら２つの分子を
検出可能とし得る程度に十分に安定的なものとして、こ
れら２つの分子の結合または一体化が引き起こされるこ
と、として定義される。本発明においては、このような
特定の分子識別には、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮ
Ａ）のハイブリッド化、抗原／抗体タイプの識別反応、
タンパク質／タンパク質タイプの相互作用、酵素／基質
タイプの相互作用、等がある。
【０００３】本発明による方法は、例えば、広範な意味
での『バイオチップ』分野における検出に応用すること
ができる。すなわち、核酸チップや、タンパク質チップ
や、センサ−生物学的基質のターゲット認識の研究にお
けるマルチアレイシステムも含めた他の任意のシステム
における検出に応用することができる。このような検出
には、例示するならば、例えばバイオチップ上における
ハイブリッド化のスクリーニングあるいは検出の範疇と
いったような、水性媒体中におけるあるいは空気中にお
ける固体支持体上においての核酸のハイブリッド化の検
出がある。
での『バイオチップ』分野における検出に応用すること
ができる。すなわち、核酸チップや、タンパク質チップ
や、センサ−生物学的基質のターゲット認識の研究にお
けるマルチアレイシステムも含めた他の任意のシステム
における検出に応用することができる。このような検出
には、例示するならば、例えばバイオチップ上における
ハイブリッド化のスクリーニングあるいは検出の範疇と
いったような、水性媒体中におけるあるいは空気中にお
ける固体支持体上においての核酸のハイブリッド化の検
出がある。
【０００４】本発明による方法は、電気化学的発光シス
テムによって導体表面をマーキングするという目的にお
いてはすべてのものに対して適用することができる。
テムによって導体表面をマーキングするという目的にお
いてはすべてのものに対して適用することができる。
【０００５】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】小型
化されたバイオセンサすなわちバイオチップは、現在、
かなり経済的な興味をなす対象である。この経済的興味
は、数千回の分析を並列的に行い得ることによって、お
よび、医療診断や環境制御や農業ビジネス制御や薬学分
野への応用可能性によって、説明される。
化されたバイオセンサすなわちバイオチップは、現在、
かなり経済的な興味をなす対象である。この経済的興味
は、数千回の分析を並列的に行い得ることによって、お
よび、医療診断や環境制御や農業ビジネス制御や薬学分
野への応用可能性によって、説明される。
【０００６】システムは、センサ分子を備えており、セ
ンサ分子とは、一般的には、例えばＤＮＡフラグメント
といったような生物学的分子であり、より一般的には、
非常に小さい表面上に固定されたオリゴヌクレオチド
（あるいは、ＯＤＮ）フラグメントである。上記センサ
は、例えばＤＮＡやＯＤＮからなる相補的ストランドと
いったようなターゲット分子と称される与えられた生物
学的要素を、特定的に認識する能力のために、バイオセ
ンサに対して認識選択性をもたらす。
ンサ分子とは、一般的には、例えばＤＮＡフラグメント
といったような生物学的分子であり、より一般的には、
非常に小さい表面上に固定されたオリゴヌクレオチド
（あるいは、ＯＤＮ）フラグメントである。上記センサ
は、例えばＤＮＡやＯＤＮからなる相補的ストランドと
いったようなターゲット分子と称される与えられた生物
学的要素を、特定的に認識する能力のために、バイオセ
ンサに対して認識選択性をもたらす。
【０００７】バイオセンサの感度は、センサ分子／ター
ゲット分子認識現象を明確化するために使用されている
技術に、部分的には、依存する。多数のツールが開発さ
れている。より詳細には、これらツールのいくつかにお
いては、大きな検出感度をもたらす蛍光マーカーを使用
している。
ゲット分子認識現象を明確化するために使用されている
技術に、部分的には、依存する。多数のツールが開発さ
れている。より詳細には、これらツールのいくつかにお
いては、大きな検出感度をもたらす蛍光マーカーを使用
している。
【０００８】しかしながら、上記技術は、ターゲット生
物分子上にグラフトされている蛍光物質に対してのレー
ザー励起を必要とする。また、これには、支持体および
生物分子の照射による残留寄生発光が付随してしまう。
物分子上にグラフトされている蛍光物質に対してのレー
ザー励起を必要とする。また、これには、支持体および
生物分子の照射による残留寄生発光が付随してしまう。
【０００９】本明細書においては、参考文献を参照し、
参考文献は、［］によって示している。
参考文献は、［］によって示している。
【００１０】電気化学的発光（Electrochemiluminescen
ce，ＥＣＬ）、あるいは、電気的に生成された化学発光
とは、電気化学的反応による光の放出をベースとした現
象のことである。ＥＣＬは、文献［１］［２］におい
て、検出手段として使用された。最も一般的に使用され
ている電気化学的発光マーカーの中で、例えばＲｕ
（２，２’−ビピリジン）３ ２＋ 錯体といったような
有機金属タイプの化合物、および、例えばルミノールや
その派生体といったような有機化合物は、格別のもので
ある。
ce，ＥＣＬ）、あるいは、電気的に生成された化学発光
とは、電気化学的反応による光の放出をベースとした現
象のことである。ＥＣＬは、文献［１］［２］におい
て、検出手段として使用された。最も一般的に使用され
ている電気化学的発光マーカーの中で、例えばＲｕ
（２，２’−ビピリジン）３ ２＋ 錯体といったような
有機金属タイプの化合物、および、例えばルミノールや
その派生体といったような有機化合物は、格別のもので
ある。
【００１１】文献［１］においては、同じＥＣＬという
用語によって指定されているけれども、先の２種類のも
のは、非常に異なるＥＣＬ機構をもたらす。特に、有機
金属化合物は、反応によって消耗することがなく、適切
な電圧が維持されかつ補基質が存在していれば、ＥＣＬ
発光が連続的である。これに対し、ルミノール分子また
はその派生物は、不可逆的に消費される。この電気的に
トリガーされる化学発光（electro-triggered chemilum
inescence,ＥＴＣＬ）の場合について考察する。
用語によって指定されているけれども、先の２種類のも
のは、非常に異なるＥＣＬ機構をもたらす。特に、有機
金属化合物は、反応によって消耗することがなく、適切
な電圧が維持されかつ補基質が存在していれば、ＥＣＬ
発光が連続的である。これに対し、ルミノール分子また
はその派生物は、不可逆的に消費される。この電気的に
トリガーされる化学発光（electro-triggered chemilum
inescence,ＥＴＣＬ）の場合について考察する。
【００１２】Blackburn 氏他は、タンパク質および核酸
上に予め錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋をグラフトすること
によるポリメラーゼ（ＰＣＲ）の連鎖反応に起因する生
成物の検出に際して、ＥＣＲによる検出を初めて使用し
た［３］。検出限界は、６桁以上の線形性においてサブ
ピコモル近辺であった。さらに、上記マーカーは、非常
に大きな安定性を示し、雰囲気温度において暗所内で１
年以上にわたって貯蔵することができる。最後に、反応
性を損なうことなくかつ認識特性を損なうことなく、同
一の生物分子上に複数のＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋ マーカ
ーをグラフトすることができる。また、Xu氏他は、ＥＣ
Ｌによるこの検出方法を、アルミニウムアルカンビスホ
スホン酸からなる分子アセンブリによってコーティング
された電極上に固定された単純なＤＮＡストランドを備
えたＤＮＡバイオセンサに対して、適用した［４］。固
定されたＤＮＡフラグメントと溶液内の相補的ストラン
ドとの間のハイブリッド化現象は、インターカレーター
として挿入されたあるいは相補的ストランド上に予めグ
ラフトされたＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋ 錯体のＥＣＬによ
って、強調された。
上に予め錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋をグラフトすること
によるポリメラーゼ（ＰＣＲ）の連鎖反応に起因する生
成物の検出に際して、ＥＣＲによる検出を初めて使用し
た［３］。検出限界は、６桁以上の線形性においてサブ
ピコモル近辺であった。さらに、上記マーカーは、非常
に大きな安定性を示し、雰囲気温度において暗所内で１
年以上にわたって貯蔵することができる。最後に、反応
性を損なうことなくかつ認識特性を損なうことなく、同
一の生物分子上に複数のＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋ マーカ
ーをグラフトすることができる。また、Xu氏他は、ＥＣ
Ｌによるこの検出方法を、アルミニウムアルカンビスホ
スホン酸からなる分子アセンブリによってコーティング
された電極上に固定された単純なＤＮＡストランドを備
えたＤＮＡバイオセンサに対して、適用した［４］。固
定されたＤＮＡフラグメントと溶液内の相補的ストラン
ドとの間のハイブリッド化現象は、インターカレーター
として挿入されたあるいは相補的ストランド上に予めグ
ラフトされたＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋ 錯体のＥＣＬによ
って、強調された。
【００１３】また、ルミノールは、発ガン性を潜在的に
有した除草剤として公知の２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸（以下、「２，４−Ｄ」と略す）の検出のための免
疫センサにおいて、ＥＣＬマーカーとして使用された
［５］。２，４−Ｄは、活性化されたエステルの形態で
もって、アミノヘキサンチェインを付帯したカーボン電
極上に予めアンカー止めされる。抗体を付帯したルミノ
ールによってそのような除草剤を認識することによっ
て、Ｈ２Ｏ２の存在下で発光物質のＥＣＬによって生成
された発光の強度により、固定された除草剤の量を評価
することができた。ＥＣＬによる２，４−Ｄの免疫検出
は、０．２μｇ／ｌに等しい限界濃度を検出できること
を示した。
有した除草剤として公知の２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸（以下、「２，４−Ｄ」と略す）の検出のための免
疫センサにおいて、ＥＣＬマーカーとして使用された
［５］。２，４−Ｄは、活性化されたエステルの形態で
もって、アミノヘキサンチェインを付帯したカーボン電
極上に予めアンカー止めされる。抗体を付帯したルミノ
ールによってそのような除草剤を認識することによっ
て、Ｈ２Ｏ２の存在下で発光物質のＥＣＬによって生成
された発光の強度により、固定された除草剤の量を評価
することができた。ＥＣＬによる２，４−Ｄの免疫検出
は、０．２μｇ／ｌに等しい限界濃度を検出できること
を示した。
【００１４】うまくないことに、上記方法は、マルチア
レイシステムを形成することができない。実際、２，４
−Ｄ検体のアンカー止めは、複数のアミノヘキサンチェ
インの中の１つに付帯されたアミノ基と２，４−Ｄ分子
上に付帯された活性化エステル形態での酸性基との間の
単純な化学結合によって、アミノヘキサンチェインから
なる自己取付層上において、非特定な態様で行われる。
レイシステムを形成することができない。実際、２，４
−Ｄ検体のアンカー止めは、複数のアミノヘキサンチェ
インの中の１つに付帯されたアミノ基と２，４−Ｄ分子
上に付帯された活性化エステル形態での酸性基との間の
単純な化学結合によって、アミノヘキサンチェインから
なる自己取付層上において、非特定な態様で行われる。
【００１５】文献［６］においては、ＤＮＡのハイブリ
ッド化を検出するに際して、電気化学的発光インターカ
レーターが使用された。この方法においては、電気化学
的セルのベースを形成する電極上に、ターゲットＤＮＡ
試料を固定し、その後、ＤＮＡセンサおよびダブルスト
ランドに対しての特定の結合特性を有したＥＣＬ物質
を、添加する。例えばアクリジンやルシゲンといったよ
うな化学発光インターカレーターが、ＥＣＬ検出のため
に使用された。この文献においては、ＤＮＡのインター
カレーターではないルミノールは、ＥＴＣＬ機構におい
て使用されずに、化学的方法によってトリガーされた化
学発光機構において使用された。ルミノールが溶液内に
配置されかつセンサシーケンスがペルオキシダーゼによ
ってグラフトされる、あるいは、ルミノールがセンサシ
ーケンス上にグラフトされる。
ッド化を検出するに際して、電気化学的発光インターカ
レーターが使用された。この方法においては、電気化学
的セルのベースを形成する電極上に、ターゲットＤＮＡ
試料を固定し、その後、ＤＮＡセンサおよびダブルスト
ランドに対しての特定の結合特性を有したＥＣＬ物質
を、添加する。例えばアクリジンやルシゲンといったよ
うな化学発光インターカレーターが、ＥＣＬ検出のため
に使用された。この文献においては、ＤＮＡのインター
カレーターではないルミノールは、ＥＴＣＬ機構におい
て使用されずに、化学的方法によってトリガーされた化
学発光機構において使用された。ルミノールが溶液内に
配置されかつセンサシーケンスがペルオキシダーゼによ
ってグラフトされる、あるいは、ルミノールがセンサシ
ーケンス上にグラフトされる。
【００１６】しかしながら、ＤＮＡ／インターカレータ
ー相互作用は、常に選択的ではない。さらに、インター
カレーターは、単一のＤＮＡセンサストランドに対して
非特定態様で相互作用し、フィルム上に吸着される。こ
れにより、寄生信号が誘起される。その結果、インター
カレーションによるＥＣＬセンサの上記固定方法は、並
列的なマルチアレイ読取を許容しない。
ー相互作用は、常に選択的ではない。さらに、インター
カレーターは、単一のＤＮＡセンサストランドに対して
非特定態様で相互作用し、フィルム上に吸着される。こ
れにより、寄生信号が誘起される。その結果、インター
カレーションによるＥＣＬセンサの上記固定方法は、並
列的なマルチアレイ読取を許容しない。
【００１７】したがって、従来技術における各手法は、
必ずしも正確ではなく、多くの場合、マルチアレイシス
テムにおいて、また、CisBio社（登録商標）によって市
販されているＭＩＣＡＭチップタイプのシステムにおい
て、使用することができない。
必ずしも正確ではなく、多くの場合、マルチアレイシス
テムにおいて、また、CisBio社（登録商標）によって市
販されているＭＩＣＡＭチップタイプのシステムにおい
て、使用することができない。
【００１８】
【非特許文献１】文献［１］： Fahnrich K.A.氏、Prav
da M.氏、および、Guibault G.G.氏によるTalanta 200
1, 54(4), 531-559 における“Recent applications of
electro-generated chemiluminescence in chemical a
nalysis”と題する文献。
da M.氏、および、Guibault G.G.氏によるTalanta 200
1, 54(4), 531-559 における“Recent applications of
electro-generated chemiluminescence in chemical a
nalysis”と題する文献。
【特許文献１】文献［２］： Martin M.T.氏による“El
ectrochemiluminescence enzyme bio-sensors”と題す
る国際公開特許第９６３９５３４号。
ectrochemiluminescence enzyme bio-sensors”と題す
る国際公開特許第９６３９５３４号。
【非特許文献２】文献［３］： Blackburn G.F.氏、Sha
h H.P.氏、Kenten J.H.氏、Leland J.氏、Kamin R.A.
氏、Link J.氏、Peterman J.氏、Powell M.J.氏、Shah
A氏、TalleyD.B.氏、Tyagi S.K.氏、Wilkins E.氏、Wu
T.G.氏、および、Massey R.J.氏による Clin. Chem 199
1, 37, 1534 における文献。
h H.P.氏、Kenten J.H.氏、Leland J.氏、Kamin R.A.
氏、Link J.氏、Peterman J.氏、Powell M.J.氏、Shah
A氏、TalleyD.B.氏、Tyagi S.K.氏、Wilkins E.氏、Wu
T.G.氏、および、Massey R.J.氏による Clin. Chem 199
1, 37, 1534 における文献。
【特許文献２】文献［４］： Bard A.J.氏および Xu X-
H 氏による“Biosensor for and methodof electrogene
rated chemiluminescent detection of nucleic acid a
dsorbedto a solid surface”と題する国際公開特許第
９６０６９４６号。
H 氏による“Biosensor for and methodof electrogene
rated chemiluminescent detection of nucleic acid a
dsorbedto a solid surface”と題する国際公開特許第
９６０６９４６号。
【非特許文献３】文献［５］： Marquette C.A.氏およ
び Blum L.J.氏による Sensors Actuat. B1998, 51, 10
0-106 における“Electrochemiluminescence of lumino
l for 2,4-D optical immunosensing in a flow inject
ion analysis system” と題する文献。
び Blum L.J.氏による Sensors Actuat. B1998, 51, 10
0-106 における“Electrochemiluminescence of lumino
l for 2,4-D optical immunosensing in a flow inject
ion analysis system” と題する文献。
【特許文献３】文献［６］： K. Hashimoto 氏、K. Ito
氏、Y. Ishimori 氏、および M. Gotoh氏による“Gene
detection method” と題する米国特許明細書第５，７
７６，６７２号。
氏、Y. Ishimori 氏、および M. Gotoh氏による“Gene
detection method” と題する米国特許明細書第５，７
７６，６７２号。
【非特許文献４】文献［７］： A. Dupont-Filliard
氏、A. Roget 氏、T. Livache 氏、およびM. Billon 氏
による Anal. Chem. Acta 2001, 449, 45-50における
“Reversibleoligonucleotide immobilization based o
n biotinylated polypyrrole film”と題する文献。
氏、A. Roget 氏、T. Livache 氏、およびM. Billon 氏
による Anal. Chem. Acta 2001, 449, 45-50における
“Reversibleoligonucleotide immobilization based o
n biotinylated polypyrrole film”と題する文献。
【非特許文献５】文献［８］： R.J. Foster 氏および
C.F. Hogan 氏による Anal. Chem. 2000(72), 5576 に
おける文献。
C.F. Hogan 氏による Anal. Chem. 2000(72), 5576 に
おける文献。
【非特許文献６】文献［９］： Analytical Chemistry,
Vol. 48, No. 13, November 1976, pp.1933 における
文献。
Vol. 48, No. 13, November 1976, pp.1933 における
文献。
【非特許文献７】文献［１０］： Analytical Biochemi
stry, 111, 87-96 (1981), pp 87 における文献。
stry, 111, 87-96 (1981), pp 87 における文献。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、支持体
上に取り付けられたセンサ分子と試験対象をなす試料内
において検出されるべきターゲット分子との間の分子識
別を検出するための方法に関して、試料内にターゲット
分子が存在する場合にはターゲット分子を正確にかつ感
度良くかつ定量的にかつ定性的に検出し得るような方法
を提供することによって、従来技術における上記問題点
を克服することである。
上に取り付けられたセンサ分子と試験対象をなす試料内
において検出されるべきターゲット分子との間の分子識
別を検出するための方法に関して、試料内にターゲット
分子が存在する場合にはターゲット分子を正確にかつ感
度良くかつ定量的にかつ定性的に検出し得るような方法
を提供することによって、従来技術における上記問題点
を克服することである。
【００２０】本発明による方法は、
ａ）支持体上に、電子伝導または酸化還元伝導に基づく
導電性フィルムを成膜するとともに、このフィルム上に
センサ分子を取り付けることによって、試験用支持体を
形成するステップと； ｂ）ステップｃ）の前にあるいはステップｃ）の後に、
ターゲット分子を、電気化学的発光性マーカーによって
マーキングするステップと； ｃ）ターゲット分子を、センサ分子とターゲット分子と
の間における特定のアセンブリ形成に基づく分子識別を
可能とするような物理的化学的条件下において、試験用
支持体に対して接触させるステップと； ｄ）過剰の電気化学的発光性マーカーを除去するととも
に同時にステップｃ）に基づくセンサ分子とターゲット
分子との間における特定のアセンブリ形成を維持し得る
ようにして、試験用支持体を濯ぐステップと； ｅ）ステップｄ）において得られた濯ぎ済み試験用支持
体において、導電性フィルムを介してのターゲット分子
と支持体との間の直接的または間接的な電子移動によっ
てトリガーされた電気化学的発光信号を読み取るステッ
プと；を具備している。
導電性フィルムを成膜するとともに、このフィルム上に
センサ分子を取り付けることによって、試験用支持体を
形成するステップと； ｂ）ステップｃ）の前にあるいはステップｃ）の後に、
ターゲット分子を、電気化学的発光性マーカーによって
マーキングするステップと； ｃ）ターゲット分子を、センサ分子とターゲット分子と
の間における特定のアセンブリ形成に基づく分子識別を
可能とするような物理的化学的条件下において、試験用
支持体に対して接触させるステップと； ｄ）過剰の電気化学的発光性マーカーを除去するととも
に同時にステップｃ）に基づくセンサ分子とターゲット
分子との間における特定のアセンブリ形成を維持し得る
ようにして、試験用支持体を濯ぐステップと； ｅ）ステップｄ）において得られた濯ぎ済み試験用支持
体において、導電性フィルムを介してのターゲット分子
と支持体との間の直接的または間接的な電子移動によっ
てトリガーされた電気化学的発光信号を読み取るステッ
プと；を具備している。
【００２１】ステップｅ）における化学的発光の検出に
より、支持体上に取り付けられたセンサ分子と、検出対
象をなすターゲット分子と、の間における上記意味での
分子識別によるアセンブリ形成が明らかにされ、これに
より、試験試料内におけるターゲット分子の存在が明ら
かにされる。
より、支持体上に取り付けられたセンサ分子と、検出対
象をなすターゲット分子と、の間における上記意味での
分子識別によるアセンブリ形成が明らかにされ、これに
より、試験試料内におけるターゲット分子の存在が明ら
かにされる。
【００２２】本発明による方法においては、センサ分子
と、マーキングされたターゲット分子と、の間の識別の
検出は、電気的に生成された化学発光あるいは電気化学
的発光（ＥＣＬ）をベースとしている。本発明による方
法においては、従来技術による方法における欠点を克服
することを可能とするとともに同時に光学的検出器の感
度を維持し得るような光学的検出を行う。実際、化学発
光に関する電気的トリガーの実行は、化学発光性マーカ
ーだけを対象とするものであり、試験用支持体や生物分
子を対象とするものではない。さらに、バイオチップに
対して適用された上記新規な検出方法は、蛍光による検
出の場合とは異なり、センサ分子／ターゲット分子識別
の定量測定を可能とする。最後に、本発明に基づく電子
インパルスによる励起は、従来技術において使用されて
いるような高価なレーザー励起を必要とすることなく、
空間的制御と迅速かつ容易な使用を可能とする。
と、マーキングされたターゲット分子と、の間の識別の
検出は、電気的に生成された化学発光あるいは電気化学
的発光（ＥＣＬ）をベースとしている。本発明による方
法においては、従来技術による方法における欠点を克服
することを可能とするとともに同時に光学的検出器の感
度を維持し得るような光学的検出を行う。実際、化学発
光に関する電気的トリガーの実行は、化学発光性マーカ
ーだけを対象とするものであり、試験用支持体や生物分
子を対象とするものではない。さらに、バイオチップに
対して適用された上記新規な検出方法は、蛍光による検
出の場合とは異なり、センサ分子／ターゲット分子識別
の定量測定を可能とする。最後に、本発明に基づく電子
インパルスによる励起は、従来技術において使用されて
いるような高価なレーザー励起を必要とすることなく、
空間的制御と迅速かつ容易な使用を可能とする。
【００２３】本発明は、バイオチップという分野に応用
することができ、その場合、本発明に基づき、導電性フ
ィルムが上面上に成膜された支持体が、バイオチップを
形成する。
することができ、その場合、本発明に基づき、導電性フ
ィルムが上面上に成膜された支持体が、バイオチップを
形成する。
【００２４】本発明においては、支持体は、バイオチッ
プの製造のために当業者によって使用されている任意の
支持体とすることができる。本発明を限定する意味では
なく単に例示するならば、例えばＡｕやＰｔ等といった
ような金属製支持体、ガラス／ＩＴＯ支持体、金属化さ
れたガラス支持体、金属化された石英支持体、プラスチ
ック／ＩＴＯ支持体、金属化されたプラスチック支持
体、ガラス質のカーボン支持体、あるいは、絶縁性基体
または上記のいずれかの支持体の上に導電性材料がスク
リーンプリントによって成膜されてなる支持体、を使用
することができる。
プの製造のために当業者によって使用されている任意の
支持体とすることができる。本発明を限定する意味では
なく単に例示するならば、例えばＡｕやＰｔ等といった
ような金属製支持体、ガラス／ＩＴＯ支持体、金属化さ
れたガラス支持体、金属化された石英支持体、プラスチ
ック／ＩＴＯ支持体、金属化されたプラスチック支持
体、ガラス質のカーボン支持体、あるいは、絶縁性基体
または上記のいずれかの支持体の上に導電性材料がスク
リーンプリントによって成膜されてなる支持体、を使用
することができる。
【００２５】本発明においては、導電性フィルムは、本
来的に電子伝導性のフィルムまたは酸化還元的に電子伝
導性のフィルムとすることができる。
来的に電子伝導性のフィルムまたは酸化還元的に電子伝
導性のフィルムとすることができる。
【００２６】導電性フィルムに関し、導電性フィルム
は、例えば当業者がバイオチップの製造のために使用し
ているとともに上面上にセンサがグラフトされるフィル
ムといったような、導電性ポリマーフィルムとすること
ができる。例えば、ポリマーは、例えば、“Techniques
de l'Ingenieur”−Ａ３１４０− において“真性の導
電性ポリマー”の章に記載されているような導電性ポリ
マーとすることができる。これらは、共役結合を有した
分子から形成されたポリマーであって、適切であれば、
電子供与性ドーパントや電子受容性ドーパントによって
ドーピングされている。このような導電性ポリマーに
は、例えば、ポリ（アセチレン）、ポリ（サルファーナ
イトライド）、ポリフェニレン、ポリピロール、ポリ
（フェニレンサルファイド）、ポリチオフェン、ポリア
ニリン、等がある。
は、例えば当業者がバイオチップの製造のために使用し
ているとともに上面上にセンサがグラフトされるフィル
ムといったような、導電性ポリマーフィルムとすること
ができる。例えば、ポリマーは、例えば、“Techniques
de l'Ingenieur”−Ａ３１４０− において“真性の導
電性ポリマー”の章に記載されているような導電性ポリ
マーとすることができる。これらは、共役結合を有した
分子から形成されたポリマーであって、適切であれば、
電子供与性ドーパントや電子受容性ドーパントによって
ドーピングされている。このような導電性ポリマーに
は、例えば、ポリ（アセチレン）、ポリ（サルファーナ
イトライド）、ポリフェニレン、ポリピロール、ポリ
（フェニレンサルファイド）、ポリチオフェン、ポリア
ニリン、等がある。
【００２７】本発明においては、導電性フィルムは、例
えば電気的成膜や電気的重合といったような当業者に公
知の古典的技術を使用することによって、支持体上に成
膜することができる。
えば電気的成膜や電気的重合といったような当業者に公
知の古典的技術を使用することによって、支持体上に成
膜することができる。
【００２８】本発明においては、導電性フィルムは、単
にピロールタイプのモノマーから形成することができ
る、あるいは、例えばオリゴチオフェンといったような
予備的に合成されたオリゴマーから形成することができ
る、あるいは、電気重合可能ユニットを付帯した例えば
フェナントロリンやフェニルピリジン等といったような
遷移金属錯体ユニットのような、ポリマー形成時に共役
系が形成されるような、より複雑な分子システムから形
成することができる。
にピロールタイプのモノマーから形成することができ
る、あるいは、例えばオリゴチオフェンといったような
予備的に合成されたオリゴマーから形成することができ
る、あるいは、電気重合可能ユニットを付帯した例えば
フェナントロリンやフェニルピリジン等といったような
遷移金属錯体ユニットのような、ポリマー形成時に共役
系が形成されるような、より複雑な分子システムから形
成することができる。
【００２９】本発明においては、導電性フィルムが酸化
還元タイプのものである場合には、導電性フィルムは、
ビピリジンによって錯体化された例えばオスミウムやル
テニウム等の遷移金属といったような酸化還元中心を含
有したポリ（ビニルイミダゾール）タイプのポリマーマ
トリクスといったような、酸化還元ポリマーとすること
ができる。本発明において使用可能であるような電気化
学的発光特性を有したルテニウム錯体を含有したポリ
（４−ビニルピリジン）の一例は、文献［８］に記載さ
れている。
還元タイプのものである場合には、導電性フィルムは、
ビピリジンによって錯体化された例えばオスミウムやル
テニウム等の遷移金属といったような酸化還元中心を含
有したポリ（ビニルイミダゾール）タイプのポリマーマ
トリクスといったような、酸化還元ポリマーとすること
ができる。本発明において使用可能であるような電気化
学的発光特性を有したルテニウム錯体を含有したポリ
（４−ビニルピリジン）の一例は、文献［８］に記載さ
れている。
【００３０】本発明においては、センサ分子は、例え
ば、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、タンパク質、
あるいは、酵素とすることができ、また、上述したよう
な特定の識別およびアセンブリ形成を行い得るような任
意の分子または生物分子とすることができる。
ば、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、タンパク質、
あるいは、酵素とすることができ、また、上述したよう
な特定の識別およびアセンブリ形成を行い得るような任
意の分子または生物分子とすることができる。
【００３１】本発明においては、導電性フィルムが導電
性ポリマーフィルムである場合に、導電性フィルム上へ
のセンサ分子の取付は、バイオチップに対してセンサを
取り付けるに際して使用されている古典的な化学的技術
を使用して行うことができる。支持体とセンサとの間の
結合は、吸着による結合や、静電的結合や、自己集合や
シラナイゼーションによって得られた化学結合や、ある
いは、例えば自己集合やアンカー止めや結合特性や化学
的重合可能性や電気化学的重合可能性や感光性反応によ
る光化学的または光電気化学的重合可能性をもたらす基
によって基付加されたセンサ分子を成膜するに際して当
業者に公知の他の任意の化学的・電気化学的・光化学的
等の方法によって得られた化学結合、とすることができ
る。
性ポリマーフィルムである場合に、導電性フィルム上へ
のセンサ分子の取付は、バイオチップに対してセンサを
取り付けるに際して使用されている古典的な化学的技術
を使用して行うことができる。支持体とセンサとの間の
結合は、吸着による結合や、静電的結合や、自己集合や
シラナイゼーションによって得られた化学結合や、ある
いは、例えば自己集合やアンカー止めや結合特性や化学
的重合可能性や電気化学的重合可能性や感光性反応によ
る光化学的または光電気化学的重合可能性をもたらす基
によって基付加されたセンサ分子を成膜するに際して当
業者に公知の他の任意の化学的・電気化学的・光化学的
等の方法によって得られた化学結合、とすることができ
る。
【００３２】本発明においては、支持体上に成膜された
フィルムとセンサとの間の結合は、例えば MICAMプロセ
ス（登録商標）といったようなプロセスにより、ワンス
テップで得ることができる。
フィルムとセンサとの間の結合は、例えば MICAMプロセ
ス（登録商標）といったようなプロセスにより、ワンス
テップで得ることができる。
【００３３】例えば、仏国特許出願公開明細書第２ ７
８７ ５８１号、仏国特許出願公開明細書第２ ７８７
５８２号、および、米国特許明細書第５，８１０，９８
９号には、本発明において使用可能であるような、フィ
ルムを成膜する技術およびセンサ分子を取り付ける技術
が、開示されている。そのような技術には、例えば、シ
リカ基板といったような支持体上における、例えばオリ
ゴヌクレオチドといったような本発明によるセンサ分子
によって基付加された例えばピロールモノマーといった
ようなモノマーに由来した例えばピロール前駆体分子と
いったような導電性ポリマー前駆体分子の電気重合があ
る。この技術においては、識別センサ分子の取付が得ら
れるようにして、基体上に導電性ポリピロールフィルム
を接着することができる。
８７ ５８１号、仏国特許出願公開明細書第２ ７８７
５８２号、および、米国特許明細書第５，８１０，９８
９号には、本発明において使用可能であるような、フィ
ルムを成膜する技術およびセンサ分子を取り付ける技術
が、開示されている。そのような技術には、例えば、シ
リカ基板といったような支持体上における、例えばオリ
ゴヌクレオチドといったような本発明によるセンサ分子
によって基付加された例えばピロールモノマーといった
ようなモノマーに由来した例えばピロール前駆体分子と
いったような導電性ポリマー前駆体分子の電気重合があ
る。この技術においては、識別センサ分子の取付が得ら
れるようにして、基体上に導電性ポリピロールフィルム
を接着することができる。
【００３４】本発明においては、また、センサを、支持
体上に例えば電気的グラフトによって成膜された例えば
ポリピロール（Ｐｐｙ）フィルムといったような支持体
上のフィルムに対して、例えばアビジン／ビオチンシス
テムやこれと等価なシステムまたはこれらの派生物とい
ったような親和性識別システムによって、フィルムを成
膜した後に基付加することができる。
体上に例えば電気的グラフトによって成膜された例えば
ポリピロール（Ｐｐｙ）フィルムといったような支持体
上のフィルムに対して、例えばアビジン／ビオチンシス
テムやこれと等価なシステムまたはこれらの派生物とい
ったような親和性識別システムによって、フィルムを成
膜した後に基付加することができる。
【００３５】これにより、本発明において使用可能であ
るような、例えば、Ｐｐｙ−ＤＮＡ；Ｐｐｙ−ビオチン
／アビジン／ビオチン−ＤＮＡ；Ｐｐｙ−ビオチン／ア
ビジン−タンパク質；Ｐｐｙ−ビオチン／アビジン／ビ
オチン−抗体；といったような、導体−センサ分子フィ
ルム構造がもたらされる。このような構造は、例えば、
金（Ａｕ）製支持体やシリカ製支持体や導電性ポリマー
のグラフトを可能とする任意の支持体の上において使用
することができる。
るような、例えば、Ｐｐｙ−ＤＮＡ；Ｐｐｙ−ビオチン
／アビジン／ビオチン−ＤＮＡ；Ｐｐｙ−ビオチン／ア
ビジン−タンパク質；Ｐｐｙ−ビオチン／アビジン／ビ
オチン−抗体；といったような、導体−センサ分子フィ
ルム構造がもたらされる。このような構造は、例えば、
金（Ａｕ）製支持体やシリカ製支持体や導電性ポリマー
のグラフトを可能とする任意の支持体の上において使用
することができる。
【００３６】このような取付は、例えば、センサのアド
レッシングによって行うことができる。アドレッシング
には、例えば、光化学的アドレッシング、例えば分配ロ
ボットを使用したミクロピペッティングといったような
機械的アドレッシング、および、電気化学的アドレッシ
ング、がある。ポリマーフィルム上にセンサを取り付け
るためのそのような技術は、当業者には公知である。ア
ドレッシングは、マルチアレイ分析を可能とする。
レッシングによって行うことができる。アドレッシング
には、例えば、光化学的アドレッシング、例えば分配ロ
ボットを使用したミクロピペッティングといったような
機械的アドレッシング、および、電気化学的アドレッシ
ング、がある。ポリマーフィルム上にセンサを取り付け
るためのそのような技術は、当業者には公知である。ア
ドレッシングは、マルチアレイ分析を可能とする。
【００３７】センサ分子のアンカー止めは、例えば活性
化されたエステルおよびアミンタイプといったような２
つの化学反応基の間における結合によって得ることがで
きる。２つの反応基の一方は、センサ分子に付帯され、
他方は、フィルム上にアンカー止めされる。センサ／フ
ィルム化学結合は、フィルムが付帯している化学基の活
性をブロックすることによって、妨害することができ
る。このような妨害は、解除あるいは『非妨害化』する
ことができ、これにより、例えば電気化学的活性化や光
化学的活性化によって、化学基を、再度、反応性とする
ことができる。この時点で、フィルム上におけるセンサ
の結合を、再度可能とすることができる。
化されたエステルおよびアミンタイプといったような２
つの化学反応基の間における結合によって得ることがで
きる。２つの反応基の一方は、センサ分子に付帯され、
他方は、フィルム上にアンカー止めされる。センサ／フ
ィルム化学結合は、フィルムが付帯している化学基の活
性をブロックすることによって、妨害することができ
る。このような妨害は、解除あるいは『非妨害化』する
ことができ、これにより、例えば電気化学的活性化や光
化学的活性化によって、化学基を、再度、反応性とする
ことができる。この時点で、フィルム上におけるセンサ
の結合を、再度可能とすることができる。
【００３８】本発明においては、マーカーは、当業者に
公知であるような複数の電気化学的発光性マーカーの中
の１つとすることができる。例えば、マーカーは、ルミ
ノール、イソルミノール、アミノフタルヒドラジン、お
よび、これらの派生物からなるグループの中から選択さ
れたものとすることができる。
公知であるような複数の電気化学的発光性マーカーの中
の１つとすることができる。例えば、マーカーは、ルミ
ノール、イソルミノール、アミノフタルヒドラジン、お
よび、これらの派生物からなるグループの中から選択さ
れたものとすることができる。
【００３９】本発明においては、ルミノールまたはイソ
ルミノールの派生物とは、以下の化学式を有した派生化
合物を意味している。
ルミノールの派生物とは、以下の化学式を有した派生化
合物を意味している。
【化２】
ここで、ＲまたはＲ’は、基付加を可能とするような活
性基である、すなわち、本発明に基づき、ターゲット分
子上へのマーカーの取付を可能とするような化学的修飾
である。本発明を限定するものではないが、例示するな
らば、ＲまたはＲ’は、Ｈ２Ｎ−（Ｈ２Ｃ）３−ＮＨ；
ＮＨ２−（ＣＨ２）４−（Ｃ２Ｈ５）Ｎ；アルキル鎖ま
たはアルコキシ鎖が置換されたもの；あるいは、これら
の派生物の組合せ；とすることができる。マーカーは、
市販されている。例えば、Ｎ−（４−アミノブチル）−
Ｎ−エチルイソルミノールは、ＡＢＥＩという商標名
で、SIGMA 社によって市販されている。
性基である、すなわち、本発明に基づき、ターゲット分
子上へのマーカーの取付を可能とするような化学的修飾
である。本発明を限定するものではないが、例示するな
らば、ＲまたはＲ’は、Ｈ２Ｎ−（Ｈ２Ｃ）３−ＮＨ；
ＮＨ２−（ＣＨ２）４−（Ｃ２Ｈ５）Ｎ；アルキル鎖ま
たはアルコキシ鎖が置換されたもの；あるいは、これら
の派生物の組合せ；とすることができる。マーカーは、
市販されている。例えば、Ｎ−（４−アミノブチル）−
Ｎ−エチルイソルミノールは、ＡＢＥＩという商標名
で、SIGMA 社によって市販されている。
【００４０】本発明においては、ターゲット分子とルミ
ノールとの間の結合は、ＲまたはＲ’置換基によって形
成される。したがって、これは、ターゲット分子の反応
基として選択されている。
ノールとの間の結合は、ＲまたはＲ’置換基によって形
成される。したがって、これは、ターゲット分子の反応
基として選択されている。
【００４１】その結合は、例えばＤＮＡ−ルミノールと
いったように直接的なものとすることも、また、例えば
ＤＮＡ（ターゲット）−ビオチン／アビジン−ルミノー
ルといったようにビオチン／アビジンタイプの親和性に
基づいた間接的なものとすることも、できる。
いったように直接的なものとすることも、また、例えば
ＤＮＡ（ターゲット）−ビオチン／アビジン−ルミノー
ルといったようにビオチン／アビジンタイプの親和性に
基づいた間接的なものとすることも、できる。
【００４２】本発明において使用可能なプロトコルの形
成は、例えば、文献［９］［１０］に記載されている。
成は、例えば、文献［９］［１０］に記載されている。
【００４３】本発明においては、ルミノールによるター
ゲットのマーキングは、ターゲット分子を試験用支持体
に接触させるというステップｃ）の、前においても、ま
た、後においても、行うことができる。言い換えれば、
ターゲット分子のマーキングは、試験用支持体に対して
ターゲット分子を接触させる前にすなわちセンサ分子／
ターゲット分子アセンブリが形成される前に試験試料上
において行うことも、また、ターゲット分子を試験用支
持体に対して接触させるというステップｃ）の後にすな
わちセンサ分子／ターゲット分子アセンブリが形成され
た後に試験試料上において行うことも、できる。当業者
であれば、例えば機能発揮を行うセンサ分子／ターゲッ
ト分子のタイプに依存して、本発明による方法を適切に
変形することができる。
ゲットのマーキングは、ターゲット分子を試験用支持体
に接触させるというステップｃ）の、前においても、ま
た、後においても、行うことができる。言い換えれば、
ターゲット分子のマーキングは、試験用支持体に対して
ターゲット分子を接触させる前にすなわちセンサ分子／
ターゲット分子アセンブリが形成される前に試験試料上
において行うことも、また、ターゲット分子を試験用支
持体に対して接触させるというステップｃ）の後にすな
わちセンサ分子／ターゲット分子アセンブリが形成され
た後に試験試料上において行うことも、できる。当業者
であれば、例えば機能発揮を行うセンサ分子／ターゲッ
ト分子のタイプに依存して、本発明による方法を適切に
変形することができる。
【００４４】ターゲット分子を試験用支持体に接触させ
るというステップｃ）は、明らかなように、センサ分子
とターゲット分子との間における特定のアセンブリ形成
に基づく分子識別を可能とするような物理的化学的条件
下において、行われる。このような条件は、例えば、核
酸センサとターゲット分子との場合には、相補的核酸ス
トランドのハイブリッド化を可能とする条件であり、ま
た、タンパク質タイプのセンサ／ターゲット分子の場合
には、タンパク質／タンパク質タイプの相互作用の識別
を可能とする条件である。それら条件は、当業者には公
知である。
るというステップｃ）は、明らかなように、センサ分子
とターゲット分子との間における特定のアセンブリ形成
に基づく分子識別を可能とするような物理的化学的条件
下において、行われる。このような条件は、例えば、核
酸センサとターゲット分子との場合には、相補的核酸ス
トランドのハイブリッド化を可能とする条件であり、ま
た、タンパク質タイプのセンサ／ターゲット分子の場合
には、タンパク質／タンパク質タイプの相互作用の識別
を可能とする条件である。それら条件は、当業者には公
知である。
【００４５】ステップｃ）において接触させた時のター
ゲット分子とセンサ分子との間の識別により、センサ分
子／ターゲット分子による特定のアセンブリ形成が起こ
る。このようなアセンブリ形成には、支持体上に固定さ
れたセンサと溶液内のターゲット検体との間の識別すな
わち親和性に起因した超分子集合または超二分子集合が
ある。これらの例は、上述したとおりである。
ゲット分子とセンサ分子との間の識別により、センサ分
子／ターゲット分子による特定のアセンブリ形成が起こ
る。このようなアセンブリ形成には、支持体上に固定さ
れたセンサと溶液内のターゲット検体との間の識別すな
わち親和性に起因した超分子集合または超二分子集合が
ある。これらの例は、上述したとおりである。
【００４６】濯ぐというステップｄ）においては、支持
体上の過剰のマーカーを除去する、すなわち、ターゲッ
ト分子に対して結合していないマーカー分子を除去す
る。これは、例えば、生理的水や、支持体上におけるセ
ンサ分子／ターゲット分子のアセンブリ形成を保存する
ような他の任意の溶液を使用して、行うことができる。
体上の過剰のマーカーを除去する、すなわち、ターゲッ
ト分子に対して結合していないマーカー分子を除去す
る。これは、例えば、生理的水や、支持体上におけるセ
ンサ分子／ターゲット分子のアセンブリ形成を保存する
ような他の任意の溶液を使用して、行うことができる。
【００４７】ステップｅ）においては、電気化学的発光
の読取を行う。本発明においては、発光は、導電性フィ
ルムを介して、ターゲット分子のマーカーと導電性支持
体との間における、直接的なまたは間接的な電子移動に
よってトリガーされる。
の読取を行う。本発明においては、発光は、導電性フィ
ルムを介して、ターゲット分子のマーカーと導電性支持
体との間における、直接的なまたは間接的な電子移動に
よってトリガーされる。
【００４８】このステップｅ）においては、上面上に導
電性フィルムが成膜されている支持体は、電気化学的発
光をトリガーし得るようにして支持体に対して電圧を印
加することによって電流を流すための、電極として機能
する。導電性フィルムは、明らかなように、上記電子移
動を可能とし得るよう、電気伝導可能な状態で配置され
る。
電性フィルムが成膜されている支持体は、電気化学的発
光をトリガーし得るようにして支持体に対して電圧を印
加することによって電流を流すための、電極として機能
する。導電性フィルムは、明らかなように、上記電子移
動を可能とし得るよう、電気伝導可能な状態で配置され
る。
【００４９】図１および図２は、本発明による方法にお
ける電気化学的発光の読取時における、導電性フィルム
を介しての、マーキングされたターゲット分子と支持体
との間での、直接的電子移動（図１）または間接的電子
移動（図２）を概略的に示している。図１，２におい
て、“ｓｕ”は、支持体を示しており、“ｆ”は、導電
性フィルムを示しており、“ｌｉ”は、導電性フィルム
とセンサ分子との結合を示しており、“Ｓ”は、センサ
分子を示しており、“Ｃ”は、ターゲット分子を示して
おり、“Ｌ”は、ルミノールを示しており、“ｅ− ”
は、直接的な電子移動を示しており（図１）、“ＭＯｘ
／ＭＲｅｄ ”は、間接的電子移動を可能とするよう
な、酸化還元伝達物質（Ｍ）と称される酸化還元対を示
している（Ox＝酸化剤、Red ＝還元剤）。
ける電気化学的発光の読取時における、導電性フィルム
を介しての、マーキングされたターゲット分子と支持体
との間での、直接的電子移動（図１）または間接的電子
移動（図２）を概略的に示している。図１，２におい
て、“ｓｕ”は、支持体を示しており、“ｆ”は、導電
性フィルムを示しており、“ｌｉ”は、導電性フィルム
とセンサ分子との結合を示しており、“Ｓ”は、センサ
分子を示しており、“Ｃ”は、ターゲット分子を示して
おり、“Ｌ”は、ルミノールを示しており、“ｅ− ”
は、直接的な電子移動を示しており（図１）、“ＭＯｘ
／ＭＲｅｄ ”は、間接的電子移動を可能とするよう
な、酸化還元伝達物質（Ｍ）と称される酸化還元対を示
している（Ox＝酸化剤、Red ＝還元剤）。
【００５０】本発明においては、支持体とルミノールと
の間における酸化還元伝達物質の目的は、ルミノールか
ら支持体に向けて電子を移動させることである。酸化還
元伝達物質は、溶液内に存在することも、また、アセン
ブリと一緒に支持体上に固定されることも、また、アセ
ンブリに対して結合されることも、できる。限定するも
のではないが、例示するならば、酸化還元伝達物質は、
例えばフェロセンまたはジフェロセンといったようなメ
タロセン族、溶液状態とされたあるいはポリピロールの
ような導電性フィルム上にグラフトされたあるいはセン
サ分子に対してグラフトされたような例えばコバルト錯
体といったような遷移金属錯体、あるいは、酸化還元特
性を有したＤＮＡのインターカレーターまたは酸化還元
基を備えたＤＮＡのインターカレーター、の中から選択
することができる。当業者であれば、機能発揮を行うタ
ーゲット分子およびセンサ分子に応じて、本発明による
方法を適切に変形することができる。
の間における酸化還元伝達物質の目的は、ルミノールか
ら支持体に向けて電子を移動させることである。酸化還
元伝達物質は、溶液内に存在することも、また、アセン
ブリと一緒に支持体上に固定されることも、また、アセ
ンブリに対して結合されることも、できる。限定するも
のではないが、例示するならば、酸化還元伝達物質は、
例えばフェロセンまたはジフェロセンといったようなメ
タロセン族、溶液状態とされたあるいはポリピロールの
ような導電性フィルム上にグラフトされたあるいはセン
サ分子に対してグラフトされたような例えばコバルト錯
体といったような遷移金属錯体、あるいは、酸化還元特
性を有したＤＮＡのインターカレーターまたは酸化還元
基を備えたＤＮＡのインターカレーター、の中から選択
することができる。当業者であれば、機能発揮を行うタ
ーゲット分子およびセンサ分子に応じて、本発明による
方法を適切に変形することができる。
【００５１】電気化学的発光読取という最終ステップ
は、放出された発光の強度を測定する照度計を使用する
ことによって、行うことができる。放出された発光強度
は、センサ分子に対してアセンブリ形成されたターゲッ
ト分子の濃度に比例する。
は、放出された発光の強度を測定する照度計を使用する
ことによって、行うことができる。放出された発光強度
は、センサ分子に対してアセンブリ形成されたターゲッ
ト分子の濃度に比例する。
【００５２】本発明による方法においては、支持体から
ルミノールに向けての電子移動は、導電性フィルムを介
して得られる。これは、Xu氏他によって開発されたシス
テムにおける場合［４］および Marquette氏他によって
開発されたシステムにおける場合［５］とは、相違す
る。実際、それら従来技術によるシステムにおいては、
支持体上における電気化学的発光基のアンカー止めは、
それぞれアルミニウムアルカンビスホスホン酸およびア
ミノヘキサンといったような非導電層によって得られて
いる。
ルミノールに向けての電子移動は、導電性フィルムを介
して得られる。これは、Xu氏他によって開発されたシス
テムにおける場合［４］および Marquette氏他によって
開発されたシステムにおける場合［５］とは、相違す
る。実際、それら従来技術によるシステムにおいては、
支持体上における電気化学的発光基のアンカー止めは、
それぞれアルミニウムアルカンビスホスホン酸およびア
ミノヘキサンといったような非導電層によって得られて
いる。
【００５３】本発明による導電性フィルムの使用は、支
持体／ルミノール間の電子移動に適しており、ＥＣＬに
よる検出という上記態様における性能に適している。
持体／ルミノール間の電子移動に適しており、ＥＣＬに
よる検出という上記態様における性能に適している。
【００５４】さらに、本発明による方法においては、支
持体は、（ｉ）導電性フィルム内における生物学的対象
物の電気的に制御された固定、および、（ii）ルミノー
ルのＥＣＬプロセスのための『トリガー』としての活性
化、を可能とするという二重の活性機能を有している。
そのため、 MICAM（登録商標）タイプの電極ネットワー
クを使用してここ数年にわたって開発された技術をベー
スとした、バイオチップタイプのマルチアレイシステム
（並列処理型分析システム）に対して適用することを可
能とする。
持体は、（ｉ）導電性フィルム内における生物学的対象
物の電気的に制御された固定、および、（ii）ルミノー
ルのＥＣＬプロセスのための『トリガー』としての活性
化、を可能とするという二重の活性機能を有している。
そのため、 MICAM（登録商標）タイプの電極ネットワー
クを使用してここ数年にわたって開発された技術をベー
スとした、バイオチップタイプのマルチアレイシステム
（並列処理型分析システム）に対して適用することを可
能とする。
【００５５】与えられた試料内に存在する例えばＤＮＡ
シークエンスや他のＤＮＡシークエンスといったような
他の分子といったような特定の分子を特定の態様でもっ
て識別するような MICAM（登録商標）タイプのバイオチ
ップを備えた各ブロックは、分析時に同時に検出を行う
ことができる。本発明の応用においては、順次的な態様
であるいは並列的な態様で、そのようなバイオチップの
各ブロックに対して適用し、例えばルミノールといった
ようなマーカーのＥＣＬをトリガーするための電圧を印
加するだけで、十分である。よって、例えばＤＮＡの場
合には、発光を有した各ブロックにより、検体内に存在
するＤＮＡシークエンスを識別することができる。支持
体は、（ｉ）このＤＮＡの例においては、生物学的対象
物の電気的に制御された固定、および、（ii）ＥＣＬの
ためのトリガーとしての活性化、を可能とするという二
重の活性機能を有している。
シークエンスや他のＤＮＡシークエンスといったような
他の分子といったような特定の分子を特定の態様でもっ
て識別するような MICAM（登録商標）タイプのバイオチ
ップを備えた各ブロックは、分析時に同時に検出を行う
ことができる。本発明の応用においては、順次的な態様
であるいは並列的な態様で、そのようなバイオチップの
各ブロックに対して適用し、例えばルミノールといった
ようなマーカーのＥＣＬをトリガーするための電圧を印
加するだけで、十分である。よって、例えばＤＮＡの場
合には、発光を有した各ブロックにより、検体内に存在
するＤＮＡシークエンスを識別することができる。支持
体は、（ｉ）このＤＮＡの例においては、生物学的対象
物の電気的に制御された固定、および、（ii）ＥＣＬの
ためのトリガーとしての活性化、を可能とするという二
重の活性機能を有している。
【００５６】よって、本発明は、並列処理型（マルチア
レイ）の分析システム上における電気化学的発光方法の
実施を、史上初めて可能とする。その場合、固定用に使
用されている支持体は、化学発光のトリガーをも可能と
する。
レイ）の分析システム上における電気化学的発光方法の
実施を、史上初めて可能とする。その場合、固定用に使
用されている支持体は、化学発光のトリガーをも可能と
する。
【００５７】さらに、マルチアレイシステムに対する本
発明の適用は、Hashimoto 氏他による特許文献［６］に
記載されているような順次的位置決めデバイスを設ける
必要なく、マルチアレイおよび／または並列的読取を可
能とする。
発明の適用は、Hashimoto 氏他による特許文献［６］に
記載されているような順次的位置決めデバイスを設ける
必要なく、マルチアレイおよび／または並列的読取を可
能とする。
【００５８】さらに、本発明による方法は、測定時にお
ける蛍光による本質的背景ノイズという問題点を排除し
つつ、直接的定量分析の実施を可能とする。
ける蛍光による本質的背景ノイズという問題点を排除し
つつ、直接的定量分析の実施を可能とする。
【００５９】最後に、本発明においては、ルミノールマ
ーカーの固定は、厳密にターゲット分子上において行わ
れる。これは、文献［６］に記載されているように、Ｄ
ＮＡバイオセンサの場合に電気化学的発光性インターカ
レーターを使用するといったような、従来技術による方
法とは相違している。
ーカーの固定は、厳密にターゲット分子上において行わ
れる。これは、文献［６］に記載されているように、Ｄ
ＮＡバイオセンサの場合に電気化学的発光性インターカ
レーターを使用するといったような、従来技術による方
法とは相違している。
【００６０】
【発明の実施の形態】本発明の他の特徴点や利点は、添
付図面を参照しつつ、本発明を何ら限定するものではな
く単なる例示としての以下の実験例を読むことにより、
当業者には明瞭となるであろう。
付図面を参照しつつ、本発明を何ら限定するものではな
く単なる例示としての以下の実験例を読むことにより、
当業者には明瞭となるであろう。
【００６１】図１および図２は、本発明による電気化学
的発光読取時における、マーキングされたターゲット分
子と導電性フィルムを介した支持体との間の、直接的電
子移動（図１）および間接的電子移動（図２）を概略的
に示す図である。
的発光読取時における、マーキングされたターゲット分
子と導電性フィルムを介した支持体との間の、直接的電
子移動（図１）および間接的電子移動（図２）を概略的
に示す図である。
【００６２】［実験例］
［実験例１］ポリピロールフィルムによってコーティン
グされた電極上における溶液内でのルミノールの電気化
学的発光 本発明者らは、電気発光基をポリピロールフィルム上に
固定するのではなく電気発光基を溶液状態としたにして
も、例えばポリピロールといったような導電性ポリマー
によってコーティングされた支持体から、電気的に生成
された発光を活性化できることを確認するために、予
め、一連の電気化学的発光（ＥＣＬ）実験を行った。
グされた電極上における溶液内でのルミノールの電気化
学的発光 本発明者らは、電気発光基をポリピロールフィルム上に
固定するのではなく電気発光基を溶液状態としたにして
も、例えばポリピロールといったような導電性ポリマー
によってコーティングされた支持体から、電気的に生成
された発光を活性化できることを確認するために、予
め、一連の電気化学的発光（ＥＣＬ）実験を行った。
【００６３】ＥＣＬ実験は、カーボン製動作電極（Ｓ＝
０．２ｃｍ２ ）とＡｇＣｌ／Ａｇ参照電極とから構成
された電極（『スクリーンプリント』された電極）か
ら、行った。発光測定は、ｐＨ＝９の緩衝媒体をなす３
０ｍＭのベロナール−ＨＣｌ溶液内において所定濃度で
ルミノールを含有した２ｍｌの溶液を収容した測定セル
内に配置された『スクリーンプリント』電極から放出さ
れた発光強度を測定する照度計を使用して、行った。Ｅ
ＣＬ測定は、まず最初に、カーボン電極と参照電極との
間に＋０．４５０Ｖという電位差を印加し、次に、先の
混合体の中に、ベロナール緩衝媒体中の２ｍＭの過酸化
水素溶液を５５μｌだけ注入することにより、行った。
これらすべての操作は、磁気撹拌下でおよび光保護環境
内で行った。
０．２ｃｍ２ ）とＡｇＣｌ／Ａｇ参照電極とから構成
された電極（『スクリーンプリント』された電極）か
ら、行った。発光測定は、ｐＨ＝９の緩衝媒体をなす３
０ｍＭのベロナール−ＨＣｌ溶液内において所定濃度で
ルミノールを含有した２ｍｌの溶液を収容した測定セル
内に配置された『スクリーンプリント』電極から放出さ
れた発光強度を測定する照度計を使用して、行った。Ｅ
ＣＬ測定は、まず最初に、カーボン電極と参照電極との
間に＋０．４５０Ｖという電位差を印加し、次に、先の
混合体の中に、ベロナール緩衝媒体中の２ｍＭの過酸化
水素溶液を５５μｌだけ注入することにより、行った。
これらすべての操作は、磁気撹拌下でおよび光保護環境
内で行った。
【００６４】ポリピロールフィルムは、０．１ＭのＨ２
Ｏ／ＬｉＣｌＯ４内に５０ｍＭのピロールモノマーを含
有した溶液内において２０ｍＣ／ｃｍ２ という電荷密
度でもって『スクリーンプリント』電極を有したカーボ
ン電極上において＋０．８０Ｖ／ＥＣＳという印加電位
において電気化学的手段により、支持体上に予め電着さ
せた。この電気合成は、古典的な電気化学的セル内で行
った。形成後には、フィルムを、モノマーを含有してい
ない０．１ＭのＨ２Ｏ／ＬｉＣｌＯ４溶液内に浸漬する
ことによって、フィルムの濯ぎを行った。この操作の終
了後に、『スクリーンプリント』電極を測定セル内に配
置し、電気的に生成された発光の測定を行った。
Ｏ／ＬｉＣｌＯ４内に５０ｍＭのピロールモノマーを含
有した溶液内において２０ｍＣ／ｃｍ２ という電荷密
度でもって『スクリーンプリント』電極を有したカーボ
ン電極上において＋０．８０Ｖ／ＥＣＳという印加電位
において電気化学的手段により、支持体上に予め電着さ
せた。この電気合成は、古典的な電気化学的セル内で行
った。形成後には、フィルムを、モノマーを含有してい
ない０．１ＭのＨ２Ｏ／ＬｉＣｌＯ４溶液内に浸漬する
ことによって、フィルムの濯ぎを行った。この操作の終
了後に、『スクリーンプリント』電極を測定セル内に配
置し、電気的に生成された発光の測定を行った。
【００６５】このような条件下において、ポリピロール
フィルムによってコーティングされたカーボン電極上に
おいて、３ｐｍｏｌ（１．５ｎＭ）という最小量のルミ
ノールを検出することができた。この量に対し、信号／
雑音比は、３未満であった。このことは、本発明者らが
検出限界に到達したことを意味している。
フィルムによってコーティングされたカーボン電極上に
おいて、３ｐｍｏｌ（１．５ｎＭ）という最小量のルミ
ノールを検出することができた。この量に対し、信号／
雑音比は、３未満であった。このことは、本発明者らが
検出限界に到達したことを意味している。
【００６６】このＥＣＬ測定が、１．５ｎＭのルミノー
ルと５５μｌの２ｍＭの過酸化水素溶液とを含有したベ
ロナール緩衝溶液に対して接触した、裸のカーボン電極
からすなわちポリピロールフィルムによってコーティン
グされていないカーボン電極から再現されたときには、
収集された発光強度は、先の測定の場合よりも、３倍大
きいものであった。
ルと５５μｌの２ｍＭの過酸化水素溶液とを含有したベ
ロナール緩衝溶液に対して接触した、裸のカーボン電極
からすなわちポリピロールフィルムによってコーティン
グされていないカーボン電極から再現されたときには、
収集された発光強度は、先の測定の場合よりも、３倍大
きいものであった。
【００６７】したがって、電極がポリピロールフィルム
によってコーティングされたときには、発光量の２／３
が失われることがわかる。
によってコーティングされたときには、発光量の２／３
が失われることがわかる。
【００６８】［実験例２］過酸化ポリピロールフィルム
によってコーティングされた電極上における溶液内での
ルミノールの電気化学的発光 この実験例においては、本発明者らは、過酸化されたポ
リピロールフィルムによってコーティングされたカーボ
ン電極を使用した発光測定を行った。ポリピロールの成
膜は、実験例１の場合と同様にして行われた。
によってコーティングされた電極上における溶液内での
ルミノールの電気化学的発光 この実験例においては、本発明者らは、過酸化されたポ
リピロールフィルムによってコーティングされたカーボ
ン電極を使用した発光測定を行った。ポリピロールの成
膜は、実験例１の場合と同様にして行われた。
【００６９】ルミノール溶液のＥＣＬの発光測定は、実
験例１における手順を使用して、行った。
験例１における手順を使用して、行った。
【００７０】しかしながら、この実験例においては、Ｅ
ＣＬ測定の前に、かつ、ポリピロールフィルムの電気合
成後に、ポリピロールによってコーティングされたカー
ボン電極を、０．１ＭのＨ２Ｏ／ＬｉＣｌＯ４媒体内に
おいて１Ｖ／ＥＣＳという電位を５分間にわたって印加
した。このような条件下においては、ポリピロールフィ
ルムが電気伝導特性を消失することが、文献において示
されている（ポリピロールが過酸化された、と称され
る）。
ＣＬ測定の前に、かつ、ポリピロールフィルムの電気合
成後に、ポリピロールによってコーティングされたカー
ボン電極を、０．１ＭのＨ２Ｏ／ＬｉＣｌＯ４媒体内に
おいて１Ｖ／ＥＣＳという電位を５分間にわたって印加
した。このような条件下においては、ポリピロールフィ
ルムが電気伝導特性を消失することが、文献において示
されている（ポリピロールが過酸化された、と称され
る）。
【００７１】本発明者らは、３ｎＭのルミノールと５５
μｌの２ｍＭの過酸化水素溶液とを含有したベロナール
緩衝溶液においては、０．４５０Ｖという電位差を印加
したにしても、過酸化されたポリピロールフィルムによ
ってコーティングされたカーボン電極上において、発光
が得られないことを観測した。よって、このような条件
下において、ポリピロールフィルムが予め過酸化されて
いる場合には、ＥＣＬ現象は、もはや検出することがで
きない。
μｌの２ｍＭの過酸化水素溶液とを含有したベロナール
緩衝溶液においては、０．４５０Ｖという電位差を印加
したにしても、過酸化されたポリピロールフィルムによ
ってコーティングされたカーボン電極上において、発光
が得られないことを観測した。よって、このような条件
下において、ポリピロールフィルムが予め過酸化されて
いる場合には、ＥＣＬ現象は、もはや検出することがで
きない。
【００７２】この実験例により、フィルムの電気伝導状
態が、ルミノールのＥＣＬプロセスにおいて重要である
こと、さらに、電気的に生成された化学発光が、フィル
ム／溶液界面において起こること、がわかる。
態が、ルミノールのＥＣＬプロセスにおいて重要である
こと、さらに、電気的に生成された化学発光が、フィル
ム／溶液界面において起こること、がわかる。
【００７３】また、いずれの文献も、ポリピロールフィ
ルム内に固定された例えばルテニウムトリビピリジン錯
体といったような電気化学的発光ユニットによって誘起
されたＥＣＬによる発光の観測に関しては、言及してい
ないことに注意されたい。
ルム内に固定された例えばルテニウムトリビピリジン錯
体といったような電気化学的発光ユニットによって誘起
されたＥＣＬによる発光の観測に関しては、言及してい
ないことに注意されたい。
【００７４】［実験例３］ポリピロールフィルム上に固
定されたルミノールの電気化学的発光 ポリピロールフィルム上に固定されたルミノールに関す
る史上初のＥＣＬ研究を、市販のルミノール派生化合物
であるストレプトアビジン−イソルミノールを使用する
ことによって、行った。
定されたルミノールの電気化学的発光 ポリピロールフィルム上に固定されたルミノールに関す
る史上初のＥＣＬ研究を、市販のルミノール派生化合物
であるストレプトアビジン−イソルミノールを使用する
ことによって、行った。
【００７５】ストレプトアビジンは、イソルミノールか
ら派生した平均して３つの分子がグラフトされたタンパ
ク質であって、ＡＢＥＩ（６−（Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチル）アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４
−フタラジン−１，４−ジオン）のことである。ストレ
プトアビジン−イソルミノールは、ビオチンとストレプ
トアビジンとの分子どうしの間に存在する強力な相互作
用（親和性定数Ｋａ＝１０１５）を介して、ビオチンエ
ンティティを含有したポリピロール（ポリピロールビオ
チン）からなるフィルム上にアンカー止めされた。
ら派生した平均して３つの分子がグラフトされたタンパ
ク質であって、ＡＢＥＩ（６−（Ｎ−（４−アミノブチ
ル）−Ｎ−エチル）アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４
−フタラジン−１，４−ジオン）のことである。ストレ
プトアビジン−イソルミノールは、ビオチンとストレプ
トアビジンとの分子どうしの間に存在する強力な相互作
用（親和性定数Ｋａ＝１０１５）を介して、ビオチンエ
ンティティを含有したポリピロール（ポリピロールビオ
チン）からなるフィルム上にアンカー止めされた。
【００７６】ポリピロールビオチンフィルムは、０．１
ＭのＣＨ３ＣＮ／ｎＢｕ４ＰＦ６内に１０ｍＭのピロー
ルビオチンモノマー（Ａ）を含有した溶液において、２
０ｍＣ／ｃｍ２ という電荷密度でもってＡｇ＋１０２
Ｍ／Ａｇに対して−０．３Ｖ〜＋０．８Ｖという電位に
わたって５０ｍＶ／ｓでもって電位を連続的に走査する
ことによって、『スクリーンプリント』されたカーボン
電極上に電気合成された。
ＭのＣＨ３ＣＮ／ｎＢｕ４ＰＦ６内に１０ｍＭのピロー
ルビオチンモノマー（Ａ）を含有した溶液において、２
０ｍＣ／ｃｍ２ という電荷密度でもってＡｇ＋１０２
Ｍ／Ａｇに対して−０．３Ｖ〜＋０．８Ｖという電位に
わたって５０ｍＶ／ｓでもって電位を連続的に走査する
ことによって、『スクリーンプリント』されたカーボン
電極上に電気合成された。
【化３】
【００７７】ｐＨ＝７のＰＢＳ緩衝溶液内においてフィ
ルムを濯いだ後に、フィルムを、ストレプトアビジン−
イソルミノールを０．５ｇ／ｌで含有したｐＨ＝７のＰ
ＢＳ緩衝溶液に対して、５分間にわたって接触させた。
その後、電極を、ｐＨ＝９．５の５０ｍＭカーボネート
緩衝溶液によって、注意深く濯いだ。
ルムを濯いだ後に、フィルムを、ストレプトアビジン−
イソルミノールを０．５ｇ／ｌで含有したｐＨ＝７のＰ
ＢＳ緩衝溶液に対して、５分間にわたって接触させた。
その後、電極を、ｐＨ＝９．５の５０ｍＭカーボネート
緩衝溶液によって、注意深く濯いだ。
【００７８】ポリピロールビオチン／ストレプトアビジ
ン−イソルミノール分子アセンブリを使用して、ＥＣＬ
測定を行った。
ン−イソルミノール分子アセンブリを使用して、ＥＣＬ
測定を行った。
【００７９】上記のようにして修飾された『スクリーン
プリント』電極を、先の実験例と同様に、ｐＨ＝９．５
の５０ｍＭカーボネート緩衝溶液を２ｍｌだけ収容して
いる測定セル内に配置した。その後、カーボン電極とＡ
ｇＣｌ／Ａｇ電極との間に＋０．４５０Ｖという電位差
を印加し、次に、カーボネート緩衝溶液中に、２ｍＭの
過酸化水素溶液を５５μｌだけ注入した。そして、照度
計によって測定された発光強度の変化を、記録した。
プリント』電極を、先の実験例と同様に、ｐＨ＝９．５
の５０ｍＭカーボネート緩衝溶液を２ｍｌだけ収容して
いる測定セル内に配置した。その後、カーボン電極とＡ
ｇＣｌ／Ａｇ電極との間に＋０．４５０Ｖという電位差
を印加し、次に、カーボネート緩衝溶液中に、２ｍＭの
過酸化水素溶液を５５μｌだけ注入した。そして、照度
計によって測定された発光強度の変化を、記録した。
【００８０】過酸化水素の添加後には、１２０ａ．ｕ．
（arbitary unit,任意単位）に対応して、すなわち、２
０ｐｍｏｌ／ｃｍ２ というストレプトアビジン−イソ
ルミノールの固定された量に対応して、発光強度におけ
るかなりの変化が記録された。
（arbitary unit,任意単位）に対応して、すなわち、２
０ｐｍｏｌ／ｃｍ２ というストレプトアビジン−イソ
ルミノールの固定された量に対応して、発光強度におけ
るかなりの変化が記録された。
【００８１】ビオチンユニットを含有していないポリピ
ロールフィルムを使用して同様の実験（対照実験）を再
現することにより、そのようなポリマー上に単に吸着さ
れたストレプトアビジン−イソルミノールの量を、評価
することができた。ビオチン化されていないフィルム
は、化学式（Ｂ）によって表されるようなピロールモノ
マーを原料として電気合成された。
ロールフィルムを使用して同様の実験（対照実験）を再
現することにより、そのようなポリマー上に単に吸着さ
れたストレプトアビジン−イソルミノールの量を、評価
することができた。ビオチン化されていないフィルム
は、化学式（Ｂ）によって表されるようなピロールモノ
マーを原料として電気合成された。
【化４】
【００８２】ビオチン化されていないフィルムを使用し
て測定されたＥＣＬ強度の測定は、２８ａ．ｕ．すなわ
ち５ｐｍｏｌ／ｃｍ２ であった。
て測定されたＥＣＬ強度の測定は、２８ａ．ｕ．すなわ
ち５ｐｍｏｌ／ｃｍ２ であった。
【００８３】これら２つの測定により、ポリピロールビ
オチンフィルム上に本質的に固定されたストレプトアビ
ジン−イソルミノールの量は、１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２
であると評価することができる。
オチンフィルム上に本質的に固定されたストレプトアビ
ジン−イソルミノールの量は、１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２
であると評価することができる。
【００８４】この値は、石英微量天秤測定によって得ら
れた値と一致した。
れた値と一致した。
【００８５】［実験例４］電気化学的発光による、ポリ
ピロールビオチンフィルム上における相補ＯＤＮ／ＯＤ
Ｎ認識の検出 この実験例においては、本発明者らは、固定されたＯＤ
Ｎと、相補ＯＤＮターゲットと、の間の認識を、電気化
学的発光によって検出することができることを実証す
る。
ピロールビオチンフィルム上における相補ＯＤＮ／ＯＤ
Ｎ認識の検出 この実験例においては、本発明者らは、固定されたＯＤ
Ｎと、相補ＯＤＮターゲットと、の間の認識を、電気化
学的発光によって検出することができることを実証す
る。
【００８６】ここではストレプトアビジン−イソルミノ
ールとされたＥＣＬセンサは、特に相補ＯＤＮといった
ようなターゲット検体上に結合される。ＯＤＮセンサに
関しては、ＯＤＮセンサは、前もってアンカー止めされ
たアビジン分子の介在によってポリピロールビオチンフ
ィルム上に固定される。これにより、この実験例におい
て使用された分子アセンブリは、ポリピロールビオチン
／アビジン／ＯＤＮセンサ−ＯＤＮターゲット／ストレ
プトアビジン−イソルミノールという、多層システムに
対応している。
ールとされたＥＣＬセンサは、特に相補ＯＤＮといった
ようなターゲット検体上に結合される。ＯＤＮセンサに
関しては、ＯＤＮセンサは、前もってアンカー止めされ
たアビジン分子の介在によってポリピロールビオチンフ
ィルム上に固定される。これにより、この実験例におい
て使用された分子アセンブリは、ポリピロールビオチン
／アビジン／ＯＤＮセンサ−ＯＤＮターゲット／ストレ
プトアビジン−イソルミノールという、多層システムに
対応している。
【００８７】まず最初に、ポリピロールビオチンフィル
ムを、実験例３において説明した手順に従って、支持体
上に電気合成した。ＰＢＳ緩衝溶液内において濯いだ後
に、フィルムを、ＰＢＳ媒体内にアビジンを０．１２５
ｇ／ｌでもって含有している溶液内に、５分間にわたっ
て放置した。これにより、ビオチンとアビジンとの間の
強力な相互作用によって、ポリピロールビオチンフィル
ム上にアビジン分子が固定される。その後、電極を、Ｐ
ＢＳ緩衝溶液で濯ぎ、０．６μＭでもってビオチン化Ｏ
ＤＮセンサを含有した溶液に対して接触させた。
ムを、実験例３において説明した手順に従って、支持体
上に電気合成した。ＰＢＳ緩衝溶液内において濯いだ後
に、フィルムを、ＰＢＳ媒体内にアビジンを０．１２５
ｇ／ｌでもって含有している溶液内に、５分間にわたっ
て放置した。これにより、ビオチンとアビジンとの間の
強力な相互作用によって、ポリピロールビオチンフィル
ム上にアビジン分子が固定される。その後、電極を、Ｐ
ＢＳ緩衝溶液で濯ぎ、０．６μＭでもってビオチン化Ｏ
ＤＮセンサを含有した溶液に対して接触させた。
【００８８】各ＯＤＮセンサがそれぞれの端部にビオチ
ン基を付帯していることにより、ポリピロールビオチン
／アビジンアセンブリ上におけるＯＤＮセンサのアンカ
ー止めが、容易に実現される。それは、単なる接触によ
って、自由状態に維持されているアビジンサイトと、Ｏ
ＤＮセンサ上にグラフトされたビオチン分子と、の間の
相互作用が可能とされるからである。
ン基を付帯していることにより、ポリピロールビオチン
／アビジンアセンブリ上におけるＯＤＮセンサのアンカ
ー止めが、容易に実現される。それは、単なる接触によ
って、自由状態に維持されているアビジンサイトと、Ｏ
ＤＮセンサ上にグラフトされたビオチン分子と、の間の
相互作用が可能とされるからである。
【００８９】ＯＤＮセンサによるＯＤＮターゲットの認
識は、ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤＮセンサ
というアーキテクチャー（あるいは、構造物）上に固定
される。上述したのと同様に、これは、上記分子アーキ
テクチャーを、ＰＢＳ媒体中に相補ＯＤＮターゲット
（ビオチン化されたＯＤＮとも称される）を０．６μＭ
でもって含有した溶液に対して、単に接触することによ
って、得られた。ＯＤＮセンサとＯＤＮターゲットとの
間のハイブリッド化が実際に有効であることをＥＣＬに
よって確認するために、ストレプトアビジン−イソルミ
ノール分子を、ＯＤＮセンサに対して適合したＯＤＮタ
ーゲット上にグラフトした。この場合にも、グラフト
は、ＯＤＮターゲットがその端部にビオチン分子を付帯
していることが既知であることにより、ビオチンとアビ
ジンとの間の相互作用によって容易に得られる。
識は、ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤＮセンサ
というアーキテクチャー（あるいは、構造物）上に固定
される。上述したのと同様に、これは、上記分子アーキ
テクチャーを、ＰＢＳ媒体中に相補ＯＤＮターゲット
（ビオチン化されたＯＤＮとも称される）を０．６μＭ
でもって含有した溶液に対して、単に接触することによ
って、得られた。ＯＤＮセンサとＯＤＮターゲットとの
間のハイブリッド化が実際に有効であることをＥＣＬに
よって確認するために、ストレプトアビジン−イソルミ
ノール分子を、ＯＤＮセンサに対して適合したＯＤＮタ
ーゲット上にグラフトした。この場合にも、グラフト
は、ＯＤＮターゲットがその端部にビオチン分子を付帯
していることが既知であることにより、ビオチンとアビ
ジンとの間の相互作用によって容易に得られる。
【００９０】ＥＣＬ測定自体を実行するに先立って、
『スクリーンプリント』された電極からなるカーボン電
極上にアンカー止めされたポリピロールビオチン／アビ
ジン／ＯＤＮセンサ−ＯＤＮターゲット／ストレプトア
ビジン−イソルミノールというアセンブリを、ｐＨ＝
９．５の５０ｍＭカーボネート緩衝溶液によって、注意
深く濯いだ。その後、上述したのと同様に、『スクリー
ンプリント』電極を、ｐＨ＝９．５のカーボネート緩衝
溶液を２ｍｌだけ収容している測定セル内に配置するこ
とにより、ＥＣＬ測定を行った。媒体中に、２ｍＭの過
酸化水素溶液を５５μｌだけ注入した後に、カーボン電
極と ＡｇＣｌ（ｓ）／Ａｇ参照電極との間に＋０．４
５０Ｖという電位差を印加した。ＥＣＬによって放出さ
れた発光強度の測定は、平均して６５ａ．ｕ．であっ
た。この数値は、ストレプトアビジン−イソルミノール
の１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２ という表面固定に相当する。
この結果により、導電性支持体の界面において起こるよ
うな、例えばＯＤＮセンサと相補ＯＤＮターゲットとの
間のハイブリッド化といったような生物学的事象の検出
および定量化を、ＥＣＬによって行うことができること
がわかる。
『スクリーンプリント』された電極からなるカーボン電
極上にアンカー止めされたポリピロールビオチン／アビ
ジン／ＯＤＮセンサ−ＯＤＮターゲット／ストレプトア
ビジン−イソルミノールというアセンブリを、ｐＨ＝
９．５の５０ｍＭカーボネート緩衝溶液によって、注意
深く濯いだ。その後、上述したのと同様に、『スクリー
ンプリント』電極を、ｐＨ＝９．５のカーボネート緩衝
溶液を２ｍｌだけ収容している測定セル内に配置するこ
とにより、ＥＣＬ測定を行った。媒体中に、２ｍＭの過
酸化水素溶液を５５μｌだけ注入した後に、カーボン電
極と ＡｇＣｌ（ｓ）／Ａｇ参照電極との間に＋０．４
５０Ｖという電位差を印加した。ＥＣＬによって放出さ
れた発光強度の測定は、平均して６５ａ．ｕ．であっ
た。この数値は、ストレプトアビジン−イソルミノール
の１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２ という表面固定に相当する。
この結果により、導電性支持体の界面において起こるよ
うな、例えばＯＤＮセンサと相補ＯＤＮターゲットとの
間のハイブリッド化といったような生物学的事象の検出
および定量化を、ＥＣＬによって行うことができること
がわかる。
【００９１】観測された電気化学的発光が、実際に、Ｏ
ＤＮセンサとＯＤＮターゲットとの間のハイブリッド化
によるものであることを確認するために、本発明者ら
は、ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤＮターゲッ
トというアセンブリを、この場合には、相補ＯＤＮター
ゲットではなく単に非相補ＯＤＮを含有した溶液に対し
て接触させるという、同様の実験を行った。この場合に
は、固定されたＯＤＮセンサと溶液中の非相補ＯＤＮと
の間において、ハイブリッド化による本質的認識は、引
き起こされなかった。
ＤＮセンサとＯＤＮターゲットとの間のハイブリッド化
によるものであることを確認するために、本発明者ら
は、ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤＮターゲッ
トというアセンブリを、この場合には、相補ＯＤＮター
ゲットではなく単に非相補ＯＤＮを含有した溶液に対し
て接触させるという、同様の実験を行った。この場合に
は、固定されたＯＤＮセンサと溶液中の非相補ＯＤＮと
の間において、ハイブリッド化による本質的認識は、引
き起こされなかった。
【００９２】その結果、ビオチンアンカー止めポイント
がないことにより、ストレプトアビジン−イソルミノー
ルは、ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤＮターゲ
ットシステム上において、自身を固定する。この理由に
より、予期されるように、２ｍＭの過酸化水素溶液を５
５μｌだけ注入しさらに電圧を印加したにしても、この
場合には、発光が検出されなかった。これにより、先に
観測された結果が、実際に、ＯＤＮセンサと相補ＯＤＮ
ターゲットとの間のハイブリッド化の結果であることが
実証された。
がないことにより、ストレプトアビジン−イソルミノー
ルは、ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤＮターゲ
ットシステム上において、自身を固定する。この理由に
より、予期されるように、２ｍＭの過酸化水素溶液を５
５μｌだけ注入しさらに電圧を印加したにしても、この
場合には、発光が検出されなかった。これにより、先に
観測された結果が、実際に、ＯＤＮセンサと相補ＯＤＮ
ターゲットとの間のハイブリッド化の結果であることが
実証された。
【００９３】［実験例５］ＥＣＬによる、ポリピロール
ビオチンフィルム上における相補ＯＤＮ／ＯＤＮ認識の
検出の再生可能性 文献［７］に示されているように、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(sodium dodecyl-sulphete,ＳＤＳ)という強力な界
面活性剤による補助により、ビオチン／アビジン相互作
用を破壊することができ、これにより、ポリピロール−
ビオチンというポリマーマトリクスの再生を誘起するこ
とができる。
ビオチンフィルム上における相補ＯＤＮ／ＯＤＮ認識の
検出の再生可能性 文献［７］に示されているように、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(sodium dodecyl-sulphete,ＳＤＳ)という強力な界
面活性剤による補助により、ビオチン／アビジン相互作
用を破壊することができ、これにより、ポリピロール−
ビオチンというポリマーマトリクスの再生を誘起するこ
とができる。
【００９４】したがって、本発明者らは、ポリピロール
ビオチン／アビジン／ＯＤＮセンサ−相補ＯＤＮターゲ
ット／ストレプトアビジン−イソルミノールというアセ
ンブリをさらなる他のＥＣＬ測定においても使用すると
いう２回の使用に関する再利用の可能性を研究した。
ビオチン／アビジン／ＯＤＮセンサ−相補ＯＤＮターゲ
ット／ストレプトアビジン−イソルミノールというアセ
ンブリをさらなる他のＥＣＬ測定においても使用すると
いう２回の使用に関する再利用の可能性を研究した。
【００９５】この理由のために、ポリピロールビオチン
／アビジン／ＯＤＮセンサ−相補ＯＤＮターゲット／ス
トレプトアビジン−イソルミノールというアセンブリ上
において１回目のＥＣＬ測定を行った後に、上記分子ア
ーキテクチャーを破壊してカーボン電極上にポリピロー
ルビオチンフィルムだけがアンカー止めされているよう
な状況とし得るよう、そのアセンブリを、５０ｍＭのＳ
ＤＳ水溶液によって６０℃において処理した。
／アビジン／ＯＤＮセンサ−相補ＯＤＮターゲット／ス
トレプトアビジン−イソルミノールというアセンブリ上
において１回目のＥＣＬ測定を行った後に、上記分子ア
ーキテクチャーを破壊してカーボン電極上にポリピロー
ルビオチンフィルムだけがアンカー止めされているよう
な状況とし得るよう、そのアセンブリを、５０ｍＭのＳ
ＤＳ水溶液によって６０℃において処理した。
【００９６】脱イオン水による注意深い濯ぎ後に、最初
のアセンブリ（ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤ
Ｎセンサ−相補ＯＤＮターゲット／ストレプトアビジン
−イソルミノール）と同等の新たなアセンブリが、再生
されたポリピロールビオチンフィルム上において、形成
された。
のアセンブリ（ポリピロールビオチン／アビジン／ＯＤ
Ｎセンサ−相補ＯＤＮターゲット／ストレプトアビジン
−イソルミノール）と同等の新たなアセンブリが、再生
されたポリピロールビオチンフィルム上において、形成
された。
【００９７】上記新たなアセンブリが形成された後に、
発光物質を、上述の場合と同様に、０．４５０Ｖという
電圧を印加した状態で、ｐＨ＝９．５０の５０ｍＭカー
ボネート緩衝溶液からなる２ｍｌの媒体中に電極を配置
しさらに媒体中に２ｍＭの過酸化水素溶液を５５μｌだ
け注入することによって、励起した。この実験時に記録
された発光強度変化は、５５ａ．ｕ．であった。この値
は、第１回目の測定時に得られた値よりもわずかに劣る
ものであり、８ｐｍｏｌ／ｃｍ２ というストレプトア
ビジン−イソルミノールの濃度に対応する。
発光物質を、上述の場合と同様に、０．４５０Ｖという
電圧を印加した状態で、ｐＨ＝９．５０の５０ｍＭカー
ボネート緩衝溶液からなる２ｍｌの媒体中に電極を配置
しさらに媒体中に２ｍＭの過酸化水素溶液を５５μｌだ
け注入することによって、励起した。この実験時に記録
された発光強度変化は、５５ａ．ｕ．であった。この値
は、第１回目の測定時に得られた値よりもわずかに劣る
ものであり、８ｐｍｏｌ／ｃｍ２ というストレプトア
ビジン−イソルミノールの濃度に対応する。
【００９８】この研究は、ポリピロールビオチンマトリ
クスの再生後においても、ＤＮＡのハイブリッド化をな
おも検出することができることを示している。
クスの再生後においても、ＤＮＡのハイブリッド化をな
おも検出することができることを示している。
【図１】 本発明による電気化学的発光読取時におけ
る、マーキングされたターゲット分子と導電性フィルム
を介した支持体との間の直接的電子移動を概略的に示す
図である。
る、マーキングされたターゲット分子と導電性フィルム
を介した支持体との間の直接的電子移動を概略的に示す
図である。
【図２】 本発明による電気化学的発光読取時におけ
る、マーキングされたターゲット分子と導電性フィルム
を介した支持体との間の間接的電子移動を概略的に示す
図である。
る、マーキングされたターゲット分子と導電性フィルム
を介した支持体との間の間接的電子移動を概略的に示す
図である。
ｅ− 直接的な電子移動
ｆ 導電性フィルム
ｌｉ 導電性フィルムとセンサ分子との結合
ｓｕ 支持体
Ｃ ターゲット分子
Ｌ ルミノール
ＭＯｘ 酸化剤
ＭＲｅｄ 還元剤
Ｓ センサ分子
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 21/76 Ｇ０１Ｎ 21/76
21/78 21/78 Ｃ
33/533 33/533
37/00 １０２ 37/00 １０２
// Ｇ０１Ｎ 33/483 33/483 Ｆ
(71)出願人 500140622
ユニヴェルシテ ジョセフ フーリエ
ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＪＯＳＥＰＨ Ｆ
ＯＵＲＩＥＲ
フランス国， 38041 グルノーブル セ
デ， ブワート ポスタル 53 イクス,
アベニュ サントラル， 621番地
(71)出願人 503161615
ウニベルシテ クロード ベルナール リ
ヨン １
フランス・69622・ヴィリュールバンヌ・
セデックス・ブールヴァール・デュ・11・
ノヴェンブレ・1918・43
(72)発明者 マーシャル・ビロン
フランス・38100・グルノーブル・シュマ
ン・バルラル・７・ビス
(72)発明者 ジェラール・ビダン
フランス・38100・グルノーブル・リュ・
デ・トロワ・エピ・３
(72)発明者 アグネス・デュポン・フィリアール
フランス・38000・グルノーブル・リュ・
ダギエル・５
(72)発明者 ロイク・ブラム
フランス・69300・カルイレ・ルト・ド
ゥ・ストラスブール・85
Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA20 DA36 DA37
FB02 FB03 FB05 FB13 FB15
GC15
2G054 AB04 CA21 CA22 CA23 CA28
CE08 EA01 GE01
4B063 QA01 QA13 QA18 QA19 QQ03
QQ42 QR32 QR48 QR55 QS33
QS34 QS36 QS39 QX02 QX04
Claims (10)
- 【請求項１】 支持体上に取り付けられたセンサ分子
と、試験対象をなす試料内における検出対象ターゲット
分子と、の間における分子識別を検出するための方法で
あって、 ａ）支持体上に、電子伝導または酸化還元伝導に基づく
導電性フィルムを成膜するとともに、このフィルム上に
センサ分子を取り付けることによって、試験用支持体を
形成するステップと； ｂ）前記ターゲット分子を、電気化学的発光性マーカー
によってマーキングするステップと； ｃ）前記ステップｂ）の後にあるいは前記ステップｂ）
の前に、前記ターゲット分子を、前記センサ分子と前記
ターゲット分子との間における特定のアセンブリ形成に
基づく前記分子識別を可能とするような物理的化学的条
件下において、前記試験用支持体に対して接触させるス
テップと； ｄ）過剰の電気化学的発光性マーカーを除去するととも
に同時に前記ステップｃ）に基づく前記センサ分子と前
記ターゲット分子との間における前記特定のアセンブリ
形成を維持し得るようにして、前記試験用支持体を濯ぐ
ステップと； ｅ）前記ステップｄ）において得られた濯ぎ済み試験用
支持体において、前記導電性フィルムを介しての前記タ
ーゲット分子と前記支持体との間の直接的または間接的
な電子移動によってトリガーされた電気化学的発光信号
を読み取るステップと；を具備することを特徴とする方
法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法において、 前記ステップａ）においては、前記支持体上において、
導電性ポリマーの前駆体モノマーであるとともに前記セ
ンサ分子が付加された前駆体モノマーの電気的重合を行
うことを特徴とする方法。 - 【請求項３】 請求項１記載の方法において、 前記導電性フィルムを、ポリピロールフィルムとするこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法において、 前記センサ分子を、アビジン／ビオチンシステムによっ
て、前記導電性フィルム上に取り付けることを特徴とす
る方法。 - 【請求項５】 請求項１記載の方法において、 前記センサ分子を、ＤＮＡ、抗体、タンパク質、あるい
は、酵素とすることを特徴とする方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の方法において、 前記電気化学的発光性マーカーを、ルミノール、イソル
ミノール、アミノフタルヒドラジン、および、これらの
派生物からなるグループの中から選択されたものとする
ことを特徴とする方法。 - 【請求項７】 請求項１記載の方法において、 Ｒ，Ｒ’を、Ｈ２Ｎ−（Ｈ２Ｃ）３−ＮＨ、ＮＨ２−
（ＣＨ２）４−（Ｃ２Ｈ ５）Ｎ、あるいは、これらの派
生物の中から選択されたような、前記ターゲット分子の
マーキングを可能とする活性基としたときに、前記電気
化学的発光性マーカーを、 【化１】 という化学式を有しているような、ルミノールの派生物
またはイソルミノールの派生物からなるグループの中か
ら選択されたものとすることを特徴とする方法。 - 【請求項８】 請求項１記載の方法において、 前記ステップｅ）においては、前記導電性フィルムを介
しての前記ターゲット分子と前記支持体との間の電子移
動が間接的である場合に、例えばフェロセンまたはジフ
ェロセンといったようなメタロセン族、溶液状態とされ
たあるいは前記導電性フィルム上にグラフトされたある
いは前記センサ分子上にグラフトされたような例えばコ
バルト錯体といったような遷移金属錯体、あるいは、酸
化還元特性を有した前記センサ分子のインターカレータ
ーまたは酸化還元基を備えた前記センサ分子のインター
カレーターからなるグループの中から選択された酸化還
元伝達物質によって、前記電子移動が得られていること
を特徴とする方法。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載され
た方法の使用であって、 試料内に存在するターゲット分子の定量分析または定性
分析に対して使用することを特徴とする使用。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか１項に記載さ
れた方法の使用であって、 マルチアレイ分析システムおよび／または並列型分析シ
ステムにおいて使用することを特徴とする使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0205562 | 2002-05-03 | ||
| FR0205562A FR2839364B1 (fr) | 2002-05-03 | 2002-05-03 | Procede de detection d'une reconnaissance molecukaire par electrochimiluminescence |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003344407A true JP2003344407A (ja) | 2003-12-03 |
Family
ID=28800127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003126656A Pending JP2003344407A (ja) | 2002-05-03 | 2003-05-01 | 電気化学的発光によって分子識別を検出するための方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030232368A1 (ja) |
| EP (1) | EP1359421A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003344407A (ja) |
| FR (1) | FR2839364B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006030788A1 (ja) * | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Shinichiro Isobe | インターカレータ及びそれを用いた遺伝子検出方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101427354B1 (ko) * | 2005-07-28 | 2014-08-07 | 신이치로 이소베 | 생체분자용 표지색소 및 표지키트와 생체분자의 검출방법 |
| WO2010062787A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Washington University | Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo, methods, compositions and apparatuses therefor |
| CN107459487B (zh) * | 2017-08-02 | 2020-01-10 | 曲阜师范大学 | 一种双波长pH值比色传感材料鲁米诺衍生物及其功能化比色试纸的制作及应用 |
| CN109507174B (zh) * | 2019-01-16 | 2020-12-29 | 济南大学 | 基于姜黄素复合ZnO纳米粒子猝灭鲁米诺电化学发光传感器的制备 |
| CN112730386B (zh) * | 2020-12-17 | 2022-12-16 | 南京理工大学 | 一种基于电化学发光的异丙托溴铵/硒糖检测方法 |
| CN112649616A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-13 | 北京联众泰克科技有限公司 | 用于心肌肌钙蛋白i检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法 |
| CN113340881B (zh) * | 2021-06-04 | 2023-04-25 | 安徽师范大学 | 目标物和氧化还原双响应适配体传感器及其制备方法和应用以及鱼腥藻毒素的定量检测方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5832166A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-02-25 | Hitachi Ltd | 免疫定量用分析要素 |
| US5310687A (en) * | 1984-10-31 | 1994-05-10 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| US4721601A (en) * | 1984-11-23 | 1988-01-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Molecule-based microelectronic devices |
| US4839322A (en) * | 1986-05-05 | 1989-06-13 | The Lubrizol Corporation | High surface area polymers of pyrrole or copolymers of pyrrole |
| US5156810A (en) * | 1989-06-15 | 1992-10-20 | Biocircuits Corporation | Biosensors employing electrical, optical and mechanical signals |
| US5776672A (en) * | 1990-09-28 | 1998-07-07 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Gene detection method |
| JPH04324358A (ja) * | 1991-04-24 | 1992-11-13 | Teikoku Seiyaku Co Ltd | 糞便中のヒトヘモグロビン測定法 |
| US5264092A (en) * | 1991-10-02 | 1993-11-23 | Moltech Corporation | Redox polymer modified electrode for the electrochemical regeneration of coenzyme |
| FR2703463B1 (fr) * | 1993-03-29 | 1995-05-19 | Commissariat Energie Atomique | Film de polymère conducteur dopé par des hétéropolyanions mixtes, utilisable pour la détection des ions nitrites . |
| FR2703359B1 (fr) * | 1993-03-31 | 1995-06-23 | Cis Bio Int | Copolymère nucléotide(s)/polymère conducteur électronique ; son procédé de préparation et son utilisation . |
| WO1996028538A1 (en) * | 1995-03-10 | 1996-09-19 | Meso Scale Technologies, Llc | Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing |
| US6207369B1 (en) * | 1995-03-10 | 2001-03-27 | Meso Scale Technologies, Llc | Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing |
| US6319670B1 (en) * | 1995-05-09 | 2001-11-20 | Meso Scale Technology Llp | Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles |
| CA2230802C (en) * | 1995-09-01 | 2008-04-01 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Analytical element and method for the determination of a specific binding ligand using a vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme |
| US7014992B1 (en) * | 1996-11-05 | 2006-03-21 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Conductive oligomers attached to electrodes and nucleoside analogs |
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2002
- 2002-05-03 FR FR0205562A patent/FR2839364B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-04-17 US US10/417,265 patent/US20030232368A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-30 EP EP03101200A patent/EP1359421A1/fr not_active Withdrawn
- 2003-05-01 JP JP2003126656A patent/JP2003344407A/ja active Pending
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1359421A1 (fr) | 2003-11-05 |
| FR2839364B1 (fr) | 2004-12-24 |
| FR2839364A1 (fr) | 2003-11-07 |
| US20030232368A1 (en) | 2003-12-18 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071221 |