KR100950140B1 - 효소 전극, 효소 전극의 제조 방법, 그리고, 이 효소 전극을 이용한 센서 또는 연료 전지 - Google Patents
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Abstract
효소 내의 활성 사이트 혹은 그 활성 사이트 근방의 다른 제어된 위치에 금속 착체에 배위 결합 가능한 아미노산을 도입한다. 따라서, 효소 내에 매개체를 도입할 때에, 그 매개체 도입 위치가 활성 사이트에 또는 그 근방에 유지되도록 제어한다.
Description
본 발명은 효소 전극 및 이 효소 전극의 제조 방법에 관한 것이다.
산화환원 효소는, 기질과 반응할 때에, 기질과 보조인자 사이에 전자를 전달하므로, 이들 전자를 도전성 부재에 전달할 수 있다면, 효소의 특징을 살린 센서 및 연료 전지를 실현할 수 있다.
그런데, 많은 경우, 산화환원 효소의 산화환원 중심은 3차원 구조인 단백질 내부에 깊숙히 위치되어 있다(이 산화환원 중심은 활성 부위 또는 활성 사이트라고도 칭한다). 그 때문에, 해당 활성 사이트와 도전성 부재 사이의 전자의 전달을 효율적으로 검출하는 것은 일반적으로 곤란하다.
이러한 곤란성을 극복하기 위해서, 효소와 도전성 부재를 매개체라 불리는 물질에 의해서 전기적으로 연결하는 수법이 개발되어 있다. 상기 매개체는 효소를 구성하는 단백질의 내부에 진입할 수 있으므로, 상기 활성 사이트 근방에 이 매개체가 위치할 경우, 산화환원 반응 동안 생긴 전하를, 매개체를 통해서 도전성 부재 에까지 전달할 수 있다. 즉, 효소 반응에 의해 생성된 전하는 활성 사이트에 대해서 전자의 전달에 가담한 매개체의 확산, 또는 매개체간의 전자 도약(hopping)의 결과로서 도전성 부재를 통해 검출되게 된다.
일본국 공개 특허 평 8-271472호 공보에는, 매개체로서 기능하는 페로센을 공유결합에 의해 효소 본체나 효소의 곁사슬에 도입하는 기술이 개시되어 있다.
그러나, 일본국 공개 특허 평 8-271472호 공보에 개시된 기술에 의해서 효소에 도입되고 있는 매개체는, 그 도입 위치에 대해서 제어되지 않고 있다. 따라서, 상기 매개체는 효소 내의 랜덤한 위치에 도입되고 있다.
상기 매개체가 이러한 방법으로 도입된 경우, 우연히 활성 사이트 근방에 페로센이 위치되어 있는 경우를 제외하고, 활성 사이트로부터의 효율적인 전하의 전달은 기대될 수 없다. 특히, 개시된 기술이 효소 센서에 적용되는 경우, 기질의 농도, 즉, 측정대상 물질의 농도를 엄밀하게 감지할 필요가 있고, 한층 더 개량이 요구되고 있다.
본 발명은 효소 내에 매개체를 도입할 때에, 그 매개체 도입 위치를 활성 사이트 근방으로 제어하는 기술에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 측면에 따르면, 효소 전극은 효소; 상기 효소가 고정화되어 있는 도전성 부재; 상기 도전성 부재에 전기적으로 접속된 금속 착체; 및 상기 효소 내의 활성 사이트에 혹은 상기 활성 사이트 근방의 제어된 위치에 배열된 아미노산을 포함하되, 상기 아미노산은 상기 금속 착체와 배위 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 제 2 측면에 따르면, 효소 전극의 제조 방법은, 금속 착체가 고정화되어 있는 도전성 부재를 준비하는 단계; 효소를 암호화하는 유전자를 유전 자 공학적 조작에 의해 재조합해서, 상기 효소 내의 활성 사이트에 혹은 그 활성 사이트 근방의 제어된 위치에 아미노산을 배열시키는 단계; 및 상기 아미노산과 상기 금속 착체를 서로 배위 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 특징은 첨부 도면을 참조한 이하의 예시적인 실시형태의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 실시예의 효소 전극에 있어서는, 분자생물학적 수법에 의해 서양산 고추냉이(Armoracia rusticana) 퍼옥시다제의 활성 사이트를 제공하는 헴(heme) 근방, 또는 글루코스 옥시다제의 활성 사이트로서 역할하는 FAD(flavin adenine dinucleotide) 근방의 위치에 금속 착체에 배위 결합하는 능력을 지닌 히스티딘을 도입한다. 도입된 히스티딘에 대해, 이탈기의 형태로 염소를 분자 내에 함유하는 코발트 착체를 결합시킴으로써, 활성 사이트 근방에 매개체로서 기능하는 코발트 착체를 고정화한다.
따라서, 종래의 효소 분자 중에 매개체가 랜덤하게 도입된 효소를 이용한 효소 전극과 비교해서, 효소의 활성 사이트로부터 매개체 분자로 전자가 더욱 신속하게 이동될 수 있다.
이것에 의해서, 효소의 활성 중심으로부터 전자 수송이 효소 반응의 속도결정단계로 되는 계에 있어서, 실시예들의 효소 전극은 속도결정단계를 해소할 수 있다. 그 결과, 종래의 계의 것보다 많은 턴오버수, 전류치, 적산 전하량을 나타내는 효소 전극을 얻을 수 있다. 이러한 특성은 다음과 같이 실제 이용할 수 있다.
1. 실시예들의 효소 전극은, 효소의 활성 중심으로부터의 전자의 전달이 효소 반응의 속도결정단계로 되고 있는 계, 즉 기질 농도가 높고, 기질의 확산 과정이 속도결정단계가 되기 어려운 계에 있어서, 큰 전류를 제공할 수 있다. 이러한 특성을 이용함으로써, 상기 효소 전극을 예를 들면 센서에 응용했을 경우에는, 측정가능한 농도 범위의 높은 상한을 가진 센서를 제공할 수 있다. 또, 연료 전지에 응용했을 경우에는, 전류 밀도 및 그에 비례해서 향상된 출력 밀도가 높은 연료 전지를 제공할 수 있다.
2. 실시예들의 효소 전극에 의하면, 효소의 활성 중심으로부터의 전자 전달 속도를 증가시킬 수 있고, 효소 1분자당의 전류치를 증가시킬 수 있다. 즉, 보다 적은 효소량을 이용함으로써 필요로 하는 전류치를 얻을 수 있다. 따라서, 효소의 사용량을 저하시켜, 효소 전극의 제조에 필요한 자원 및 비용을 삭감할 수 있다.
3. 후술하는 바와 같이, 실시예들의 효소 전극에 의하면, 효소의 활성 중심으로부터의 전자 전달 속도를 증가시킬 수 있고, 효소 1분자당 전류치를 증가시킬 수 있다. 즉, 보다 적은 효소량을 이용함으로써 필요로 하는 전류치를 얻을 수 있다. 이 때문에, 효소 고정화 전극에 있어서, 종래의 전극에서와 동일한 고정화 효소의 밀도를 가진 경우, 일정한 출력 전류치 및 전하량을 유지한 채로 전극 면적을 저감할 수 있다. 이러한 이점을 전극 면적의 저감에 활용함으로써, 백그라운드 전류를 감소시킬 수 있어, 신호/잡음비를 증가시킬 수 있다. 또, 디바이스 크기를 감소시킬 수 있다. 따라서, 보다 적은 잡음을 가진 센서, 보다 소형의 센서 및 연료 전지를 제공할 수 있다.
제 1 실시형태:효소 전극
도 1은 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 효소 전극을 나타낸 개념도이다.
도 1을 참조하면, 효소 전극은 효소(1000), 효소(1000)가 고정화되어 있는 도전성 부재(1010), 상기 도전성 부재(1010)와 전기적으로 접속하고 있는 금속 착체(1020) 및 효소 내의 활성 사이트(1030)를 포함한다. (1040)은 효소 내의 활성 사이트에 혹은 그 근방에 배치되어 있는 아미노산을 나타낸다. (1005)는 효소를 구성하는 일부 변형된 단백질을 나타낸다.
본 제 1 실시형태에 있어서는, 효소 내의 활성 사이트에 혹은 그 근방에 매개체로서 기능하는 금속 착체와 결합하는 아미노산을 미리 배치시켜 둔다. 해당 아미노산과 해당 금속 착체는 서로 화학 결합한다. 결과적으로, 상기 활성 사이트에 대한 상기 매개체의 위치가 제어될 수 있다.
1) 아미노산 및 효소
우선, 효소 내의 활성 사이트에 혹은 그 근방에 배치되어 있는 아미노산에 대해 설명한다.
아미노산의 상기 배치는, 예를 들면 유전자 재조합균을 이용하는 효소 발현계에 있어서, 유전자 공학적 수법에 의해 상기 효소의 재조합 유전자에의 부위 특이적인 변이의 도입에 의해 실현된다.
여기서, "활성 사이트의 근방"이란 용어는, 산화환원 효소에 있어서, 원자가 산화 혹은 환원을 받는 효소의 기질, 보조 분자족(prosthetic group) 또는 보조 인 자를 구성하고, 산화환원에 가담하는 원자로부터의 거리가 1.6 ㎚ 이내, 바람직하지는 1.29 ㎚ 이내에 위치하는 것을 의미한다. 또, 활성 사이트의 위치는 X선 결정 해석 혹은 핵자기 공명 스펙트럼 해석에 의해 결정된다. 예를 들어, 효소가 글루코스 옥시다제인 경우에는, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드가 활성 사이트로서 기능한다. 효소가 서양 고추냉이의 퍼옥시다제인 경우에는, 헴이 활성 사이트로서 기능한다. 효소가 락카제인 경우에는 구리 원자가 활성 사이트로서 기능한다. "산화환원에 가담하는 원자"란 용어는, 특히 활성 사이트에서 위치된 산화환원을 담당하는 원자를 의미한다. 예를 들어, 활성 사이트가 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드인 경우에는, 플라빈 고리의 1번 위치 및 10번 위치에 있는 질소 원자가 상기 관련된 원자에 상당한다. 활성 사이트가 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드인 경우에는, 니코틴아마이드의 4번 위치에 있는 탄소가 상기 관련된 원자에 상당한다. 또, 활성 사이트가 피롤로퀴놀린 퀴논인 경우에는, 4번 위치 및 5번 위치에 있는 산소 원자가 상기 관련된 원자에 상당한다. 활성 사이트가 헴인 경우에는, 철 원자가 상기 관련된 원자에 상당한다. 1.6 ㎚, 바람직하게는 1.29 ㎚의 거리는 이하의 두가지 보고에 의거한 것이다. 한가지 보고는, 단백질의 활성 중심으로부터의 거리가 1.6 ㎚를 넘으면, 급격하게 전자 이동 속도가 저하된다고 서술하고 있다(문헌: Qijin Chi 외, "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 2005, Vol. 102, p.16203 참조). 다른 하나의 보고는 1.29 ㎚의 전자 이동 거리가 2개의 산화환원 중심 간의 생리적인 거리로서 결정되는 한 가장 긴 거리의 하나라고 서술하고 있다(문헌: Arthur Oubrie 외, "The Journal of Biological Chemistry", 2002, Vol. 277, p.3727).
아미노산의 일례로서는 히스티딘을 들 수 있다.
후술하는 실시예 1은, 효소로서 서양 고추냉이 퍼옥시다제를 이용하고 해당 서양 고추냉이 퍼옥시다제의 활성 사이트로서 기능하는 헴 근방에 히스티딘을 배치한 경우를 나타낸다.
후술하는 실시예 2는, 효소로서 글루코스 옥시다제를 이용하고 해당 글루코스 옥시다제의 활성 사이트인 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD) 근방에 히스티딘을 배치한 경우를 나타낸다.
본 제 1 실시형태에 있어서의 효소로서는, 상기 서양 고추냉이 퍼옥시다제나 글루코스 옥시다제 외에, 빌리루빈 옥시다제, 락카제, 티오레독신 리덕타제를 포함한 다른 산화환원 효소도 이용될 수 있다.
효소 내의 활성 사이트에 또는 근방에 배치된 아미노산으로서는, 금속 착체와 배위 결합에 의해 결합할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들어, 아미노산은 히스티딘이나 시스테인, 혹은, 금속 중심에 대해서 배위능을 가지는 비천연의 아미노산일 수 있다.
제 1 실시형태에서 사용된 "활성 사이트"란 용어는, 효소 내에서 전하를 전달하는 부위를 의미한다. 예를 들어, 활성 사이트는 산화환원 중심 혹은 그 산화환원 중심으로부터 전하를 받는 부위이다.
산화환원 중심으로서는 이하의 2개의 개념이 포함된다.
환원 중심의 하나의 유형은 글루코스 옥시다제의 FAD와 같이 효소 내에 유지 되고 있는 것이고, 다른 유형은 글루코스 데하이드로게나제의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)와 같이 기본적으로 효소 내에 유지되지 않는 것이다.
또, 인위적으로 아미노산이 도입되는 위치는, 아미노산이 효소를 구성하는 단백질을 통해 활성 사이트와 간접적으로 접촉하는 위치, 또는 아미노산이 근방에 위치한다면, 소정의 거리만큼 활성 사이트로부터 떨어져 있는 위치일 수 있다. 또, 필요하다면, 활성 사이트에 또는 그 근방에 배치된 아미노산과 결합된 금속 착체로부터, 전극에 전하를 수송하기 위한 중계(relay)로서 역할하는 다른 금속 착체와 결합하는 다른 아미노산을 효소 내에 도입하는 것도 가능하다.
2) 금속 착체
본 제 1 실시형태에 적용되는 금속 착체의 예로서는 이하의 것을 들 수 있다.
금속 착체의 금속 중심으로서는 예를 들어 철, 코발트, 루테늄, 오스뮴 또는 크롬을 들 수 있다. 금속 착체의 배위자로서는 예를 들어 바이피리딘, 터피리딘 또는 이미다졸 등의 복소환식 화합물, 사이클로펜타다이에닐 또는 이들의 유도체 등일 수 있다. 이 금속 착체는, 그 자체와 도전성 부재와의 사이에 고속의 전하의 전달을 실시할 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 요구를 충족시키기 위해서, 금속 착체는 예를 들어 배위자로서 π-컨쥬게이트 분자를 함유할 수 있다. 금속 착체의 중심 금속은 1개 또는 복수개일 수 있다. 중심 금속이 복수개인 경우, 당해 금속은 동일 또는 상이한 원소일 수 있다. 또, 금속 착체가 복수 종류의 원소를 함유 할 경우에는, 각각의 금속 중심 간의 전위 관계를 고려해서, 바람직한 방향으로 전자가 수송되도록 상기 원소를 배치하는 것이 중요하다.
또한, 금속 착체가 이탈기를 가질 경우, 상기 금속 착체는 히스티딘 등의 아미노산과 배위 결합하는 것이 가능하다. 이 이탈기의 예로서는, 할로겐, 4불화 붕소, 6불화 인을 들 수 있다.
금속 착체가 도전성 부재에 결합하고 있는 경우에는, 이 금속 착체의 분자길이를 변화시킴으로써 효소와 도전성 부재 간의 거리를 제어할 수 있다. 분자 길이의 이러한 제어에 의해, 이하의 2인자가 균형을 이룰 수 있다. 즉, (a) 분자길이를 단축시킴으로써, 효소의 활성 사이트로부터 도전성 부재에의 전하 수송 속도를 증가시킬 수 있다. (b) 분자길이를 증대시킴으로써 도전성 부재와의 상호작용으로 인해 효소의 활성이 저하하는 것을 막을 수 있다. 분자길이는 배위자의 분자 설계를 변경하는 방법, 또는 다핵 착체의 단계의 단계 수를 증가시키는 방법에 의해 실제로 변화시킬 수 있다.
3) 도전성 부재
도전성 부재는, 예를 들면, 금, 백금 등의 금속 전극이나 카본 전극, 인듐 주석 산화물 전극 등으로서 구성될 수 있다.
상기 금속 착체와 도전성 부재는 단지 서로 전기적으로 접속되어 있을 필요가 있다. 예를 들어, 금속 착체와 도전성 부재는 이들 사이에 어떠한 물질을 개재시켜 서로 전기적으로 접속될 수 있거나, 또는 어떠한 물질도 개재시키지 않고 직접 접속될 수 있다. 또, 이들은 필요에 따라서 물리적 및/또는 화학적으로 결합될 수 있다.
또, 효소가 도전성 부재에 고정화된 경우, 이 효소는 직접 도전성 부재에 접촉될 수 있고, 금속 착체를 개입시켜 도전성 부재에 고정화될 수도 있다. 대안적으로는, 폴리머나, 반응성 작용기를 가지는 가교제 등을 이용함으로써, 실질적으로 효소의 고정화를 실현하는 것도 가능하다.
종래에는 효소 내의 랜덤한 위치에만 매개체를 도입할 수 없었지만, 상기 설명한 제 1 실시형태에 따르면, 매개체 도입위치를 실질적으로 제어할 수 있다.
제 2 실시형태:효소 전극의 제조 방법
다음에, 본 제 2 실시형태에 따른 효소 전극의 제조 방법을, 도 2를 참조해서 설명한다.
우선, 금속 착체가 고정화되어 있는 도전성 부재를 준비한다(S1).
더욱 구체적으로는, 이 공정 S1에서는, 예를 들면 이하와 같이 도전성 부재가 준비된다.
우선, 도전성 부재를, 도전성 물질을 그대로 사용하는 방법이나, 예를 들어 유리나 폴리머의 절연성 물질 상에 도전성층을 형성하는 수법을 이용해서 제조된다. 이 도전성층의 형성 방법은 예를 들어 증착, 스퍼터링 또는 인쇄에 의해 실행될 수 있다.
다음에, 도전성 부재에 금속 착체를 고정한다. 금속 착체의 고정화는 이하의 2가지 방법 중 하나에 의해 실행될 수 있다.
[1]. 배위자의 작용기로서 도전성 부재에 혹은 해당 도전성 부재의 표면에 고정화된 물질에 결합할 수 있는 기를 가진 금속 착체의 용액과 도전성 부재를 접촉시키는 방법; 및
[2]. 도전성 부재에 혹은 해당 도전성 부재의 표면에 고정화된 물질에 결합할 수 있는 작용기를 가진 배위자의 용액을 도전성 부재와 접촉시켜, 이 배위자를 고정화시키고 나서, 이탈기를 가진 금속 착체의 중심 금속을 함유하는 화합물의 용액을 도전성 부재와 접촉시키는 방법.
다음에, 효소를 암호화하는 유전자를 유전자 공학적 조작에 의해 재조합하여, 해당 효소 내의 활성 사이트, 혹은 그 활성 사이트 근방의 다른 제어된 위치에 아미노산을 배치한다(S2).
보다 구체적으로는, 상기 효소를 암호화하는 유전자에 함유되고 상기 활성 사이트 근방에 위치된 아미노산에 대해서, 목적의 아미노산을 암호화하는 코돈을 치환하거나 혹은 삽입한다. 예를 들면, 제어된 위치에 히스티딘을 배치하기 위해서는, 히스티딘을 암호화하는 코돈인 CAT 혹은 CAC를 효소 내의 활성 사이트 근방에 위치된 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환하든지 또는 삽입한다. 이와 같이 인위적으로 치환된 혹은 삽입된 코돈의 위치를 제어하는 방식으로 아미노산을 배치함으로써, 최종적으로는, 금속 착체를 활성 사이트 근방에 배치할 수 있게 된다.
또한, 효소 내에 도입되는 아미노산의 위치를 제어하면서 해당 아미노산을 인위적으로 도입하는 조작에 관해서는, 상기 제 1 실시형태에서 설명한 기술적 사항이 본 제 2 실시형태에 대해서도 적용된다.
다음에, 아미노산을 금속 착체에 배위 결합시킨다(S3).
구체적으로는, 예를 들면, 상기 효소의 용액을 이탈기를 가지는 금속 착체가 고정화된 도전성 부재와 접촉시킴으로써 아미노산의 배위 결합을 수행한다.
이렇게 해서, 효소 전극이 얻어진다.
제 3 실시형태:센서
제 1 실시형태에 있어서 상기 설명한 효소 전극을 이용해서 구성된 센서에 대해서, 도 3을 참조해서 설명한다.
도 3을 참조해서, 센서는 효소 전극(2000) 및 리드(2020)를 통해 외부 장치(2030)에 접속된 대향 전극(2010)을 포함한다. 효소 전극 및 대향 전극은 전해질(2040)에 배치되어 있다.
필요에 따라서, 참조 전극 및/또는 전해질을 유지하는 기구를 이용할 수도 있다.
상기 배치에 있어서 효소 전극을 통해 외부 장치(2030)에 의해 취득된 전기 신호를 측정함으로써, 전해질 중에 함유되어 검사대상으로 되는 물질의 유무 및 농도를 조사하는 것이 가능하다. 이와 같이 해서, 효소 전극을 이용한 센서가 실현된다. 또한, 전기신호는, 전류, 전하량, 전압, 전위 혹은 임피던스의 형태로 측정될 수 있다. 또, 외부 장치로부터 효소 전극에 전위 또는 전압을 인가해둘 수도 있다. 미리, 예를 들어 전기신호와 특정의 기질의 농도 간의 관계를 데이터베이스에 기억해 둠으로써, 취득되는 신호와 해당 데이터베이스 내에 기억되어 있던 정보를 비교하는 것도 가능하다.
제 4 실시형태:연료 전지
제 1 실시형태에서 상기 설명한 효소 전극을 이용함으로써 구성된 연료 전지에 대해서, 도 4를 참조해서 설명한다.
도 4를 참조하면, 연료 전지는 애노드(3000) 및 캐소드(3010)를 포함한다. 효소 전극은 애노드 및 캐소드의 적어도 하나로서 사용된다. 애노드 및 캐소드는 리드(3020)를 통해서 부하(3030)에 접속되어 있다.
애노드와 캐소드는 전해질(3040) 중에 배치되어 있다. 필요에 따라서, 전해질을 유지하는 기구도 이용될 수 있다. 전해질 중에 연료가 존재할 경우에, 애노드와 캐소드 사이에 전압이 발생되므로, 부하에 전류를 흘려 일을 행할 수 있다.
여기서 이용된 "부하"란 용어는, 예를 들어, 약제를 공급하기 위한 펌프 또는 전기신호를 발신하기 위한 발신기이다.
이하에, 실시예와 관련해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 효소 전극 제조 방법은 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(
실시예
1)
도 5는 실시예 1에서 제조된 효소 전극의 개념도를 나타낸다.
도 5를 참조해서, 유리 기판(5000) 및 금 전극(5010)은 도전성 부재를 구성한다. 코발트 착체(5020)는 상기 도전성 부재에 금/티올 결합을 통해 고정화되어 있다. 그리고, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(5040)의 분자에 도입된 히스티딘 잔기(5050)는 코발트 착체(5020)의 말단에서 코발트(5030)에 결합된다. 이 히스티딘 잔기(5050)는 서양 고추냉이 퍼옥시다제(5040)의 활성 사이트로서 작용하는 헴(5060)의 근방 영역(5070)에 도입되어 있다. 따라서, 효소 반응을 통해서 헴에 전달된 전자는 고속으로 코발트 착체를 통해서 도전성 부재로 이동하는 것이 가능해진다.
실시예 1에서는, 이 효소 전극의 조제예 및 과산화 수소 센서로서의 사용예를 이하의 각 항목으로 나누어 기술한다.
1. 전극에 고정화되는 금속 착체 배위자의 합성
2. 특정 위치에 히스티딘을 도입한 서양 고추냉이 퍼옥시다제의 조제
3. 효소 전극의 제조
4. 과산화 수소의 측정
1. 전극에 고정화되는 금속 착체 배위자의 합성
이하의 화학식(1)에 나타낸 착체 배위자의 합성법을 기술한다:
등몰의 2-아세틸피리딘 및 4-메틸티오벤즈알데하이드의 에탄올 용액에, 이 에탄올 용액의 절반 체적의 1.5M 수산화 나트륨 수용액을 가하여 반응시킨 후, 여 과, 물 및 메탄올에 의한 세정 및 건조 공정을 통해서 중간 생성물을 얻었다.
질소 분위기하, 칼륨-tert-부톡사이드의 테트라하이드로퓨란 용액에, 0.1 ㎖의 2-아세틸피리딘을 가하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하였다. 이 혼합물에 0.16 g의 상기 중간 생성물을 가해 실온에서 반응시킨 후에, 초산 암모늄 및 에탄올을 과잉량 첨가하고, 얻어진 용액을 환류시켰다. 그 후, 이 용액을 감압하 증류하였다. 얻어진 생성물을 수세하고, 메탄올을 이용해서 클로로포름으로부터 재침전시켰다. 이와 같이 해서 화학식(1)에 표시된 배위자를 얻었다.
2. 특정 위치에 히스티딘을 도입한 서양 고추냉이 퍼옥시다제의 조제
활성 사이트 근방에, 아미노산인 히스티딘을 특정의 위치에 도입해서, 그 도입된 히스티딘에 금속 착체를 배위 결합시킴으로써 효소 전극을 제조하는 방법에 대해 이하 설명한다.
서양 고추 냉이의 모종으로부터 상법에 따라 cDNA를 제조하였다.
제조된 cDNA를 주형으로서 이용해서 이하에 주어진 서열번호 1 및 2의 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 해서 PCR 증폭 반응을 수행하여, 약 920 염기쌍의 증폭 산물을 얻었다:
5'-AATAATGGATCCCAACTTACCCCTACCTTCTACGACAATTCA-3'(BamHI)[서열번호 1] 및
5'-AATAATCTCGAGAGAGTTGGAGTTCACCACCCTACAATTCAA-3'(XhoI)[서열번호 2].
증폭 산물의 DNA 염기서열을 해석함으로써, 이 PCR 증폭 산물[서열번호 3]은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가진 퍼옥시다제를 암호화하는 유전자(prxC1a)를 포함하는 것을 확인할 수 있었다.
이 DNA 증폭 산물을 제한 효소 BamHI 및 XhoI를 이용해서 소화에 의해 절단해서, 얻어진 약 920 염기쌍의 DNA 단편을 pGEX-6P-1(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제품)에 있어서의 제한 효소와 동일한 사이트에 삽입하였다. 이와 같이 함으로써, GST 융합 퍼옥시다제 발현 벡터 pGEX-prxC1a를 제작하였다.
정제한 pGEX-prxC1a에 대해서, 시판의 키트를 이용해서 부위 특이적 변이를 도입함으로써, 변이형 퍼옥시다제 발현 벡터 pGEX-mprxC1a를 제작하였다.
퍼옥시다제 유전자에 대해서 도입되는 부위 특이적 변이는, 이하의 모든 조건에 적합한 아미노산을 선택해서, 이러한 아미노산을 암호화하는 유전자를 각각, 히스티딘을 암호화하는 유전자로 치환함으로써 수행하였다.
(1). 퍼옥시다제 활성을 가진 아미노산 서열에 있어서, 아미노산은 전자를 전달하는 부위인 헴의 물리적 근방에 위치할 것.
(2). 아미노산은 효소 표면 근방에 위치할 것.
(3). 상기 아미노산의 히스티딘으로의 치환에 의해, 효소의 퍼옥시다제 활성을 저감시키지 않을 것.
(4). 치환된 히스티딘의 곁사슬을 구성하는 이미다졸기에 의해 효소 외부에 배치된 금속 착체에의 결합을 달성할 수 있을 것.
이들 조건을 충족시키는 아미노산 세트로서는 예를 들어 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의, 31번째의 아르기닌, 73번째의 세린 및 176번째의 글루타민을 들 수 있다. 이와 같이 해서, 효소 내의 활성 사이트로서 작용하는 헴 근방의, 약 0.95 ㎚ 거리에 히스티딘이 배치되는 위치를 제어하면서 배치할 수 있 다.
이러한 아미노산의 히스티딘으로의 치환은, 시판 키트에 부착된 메뉴얼에 따라, 프라이머를 설계해서, 염기를 치환함으로써 실시하였다.
변이형 GST 융합 퍼옥시다제 발현 벡터 pGEX-mprxC1a를 E.coli BL21(DE3)로 상법에 따라 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체는 항생 물질인 암피실린에 대한 내성주로서 선별될 수 있다.
얻어진 형질 전환체를, 항생 물질인 암피실린을 첨가한 LB 배지에서 예비배양하였다. 다음에, 상기 형질 전환체의 일부를 LB-Amp 배지에 첨가해서 진탕 배양하였다. IPTG를 첨가하면서 배양을 계속한 후, 형질 전환체를 집균해서, PBS에 재현탁하였다. 이어서, 균체를 파쇄해서, 원심분리함으로써 조(crude) 효소 추출액을 취득하였다.
글루타티온 세파로스 비즈를 이용해서 조 효소 추출액으로부터 GST 융합 퍼옥시다제를 정제하였다. 더욱 구체적으로는, 미리 BSA를 흡착시킴으로써 비특이적 흡착을 억제하도록 글루타티온 세파로스를 전처리하고, 교반하에 상기 조 효소 추출액에 첨가함으로써, GST 융합 퍼옥시다제를 글루타티온 세파로스에 흡착시켰다.
흡착 후, 원심분리를 통해서 글루타티온 세파로스를 회수하고, PBS로 세정한 후, 글루타티온을 교반 하에 첨가함으로써, 흡착한 융합 단백질을 용출시켰다. 원심분리를 통해 상청액을 회수한 후, PBS에 대해서 투석을 실시하여 GST 융합 퍼옥시다제를 정제하였다. 이 정제된 GST 융합 퍼옥시다제를 GST 융합 프로테아제로 소화시켜, GST 부위를 절단하였다. 그 후, 이 절단한 GST 융합 퍼옥시다제를 글루 타티온 세파로스를 통과시켜 GST 융합 프로테아제와 GST를 제거하였다. 또한, 플로-쓰루(flow-through) 분획을 PBS를 이용해서 평형화한 세파덱스 G200 컬럼에 걸어서, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 변이형 퍼옥시다제의 최종 정제물을 얻었다.
퍼옥시다제 활성은 다음과 같이 해서 결정할 수 있었다. 예를 들어, 2,2'-아지노-다이-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트]다이암모늄염(ABTS)을 발색제로서 이용하였다. 다음에, 420 nm에 있어서의 흡광도 변화를 측정함으로써 퍼옥사다제 활성을 결정하였다.
3. 효소 전극의 제조
시판의 슬라이드 글라스를 아세톤 중에서 초음파 세정하고, 질소 기류하에서 건조하였다. 티탄/금을 20/200 ㎚의 두께로 상기 슬라이드 글라스 위에 증착하여, 도전성 기판을 제조하였다. 기판을 절단한 후, 이 절단한 기판을 과산화 수소수/진한 황산의 3/7 용액 중에 20분간 침지하고 나서, 수세하고, 질소 기류로 건조하였다.
(a) 이 기판을 화학식(1)의 배위자의 클로로포름 용액에 침지하였다. 그 후, 기판을 클로로포름으로 세정하고, 질소 기류 하 건조하였다.
(b) 다음에, 이 기판을 염화 코발트(II) 수용액에 침지하였다. 그 후, 기판을 수세하고, 질소 기류하 건조하였다.
(c) 이어서, 4',4""-(1,4-페닐렌)비스(2,2':6',2"-터피리딘)의 클로로포름 용액에 기판을 침지하였다. 그 후, 기판을 클로로포름으로 세정하고, 질소 기류하 에 건조하였다.
또, 상기 (b) 및 (c) 공정을, (b)-(c)-(b)-(c)-(b)의 순서로 반복함으로써, 도전성 기판에 고정화된 금속 착체를 얻었다.
상기 설명한 바와 같이 히스티딘을 도입한 서양 고추냉이 퍼옥시다제의 완충액을 준비하고, 이 고정화된 금속 착체를 포함하는 도전성 기판을 상기 완충액에 침지함으로써 상기 금속 착체에 효소를 고정화시켰다. 효소의 고정화량은, 예를 들어 수정 진동자 마이크로 밸런스법 등에 의해 추정할 수 있었다. 그 후, 상기 도전성 기판을 세정하여, 상기 금속 착체에 배위 결합되어 있지 않은 효소를 제거함으로써 효소 전극을 제조하였다.
이와 같이 해서, 효소 내의 활성 사이트 근방에 배치된 히스티딘과 금속 착체의 금속 중심으로서 작용하는 코발트 원자가 서로 배위 결합하고, 그 결과, 매개체로서 기능하는 금속 착체는 그의 위치를 활성 사이트에 대해서 제어하면서 배치할 수 있었다.
4. 과산화 수소 농도의 측정
상기 제조한 효소 전극이 작용 전극, 백금선이 대향 전극, 은/염화은 전극이 참조 전극으로 되도록 3전극 셀을 구성하였다. 이 3전극 셀을 포텐시오스탯(potentiostat)에 접속하고, 전해질로서 0.1M의 인산 완충액을 사용하였다. 측정 전에, 기지의 농도의 과산화 수소의 완충 용액을 이용하고 작용 전극에 500 mV 대 Ag/AgCl의 전위를 인가해서, 정상 전류(촉매 전류)를 관측하고, 검량선을 작성하였다. 이어서, 전해질에 미지 농도의 과산화 수소를 함유하는 물질을 첨가하 고, 동일한 전위를 인가해서, 정상 전류를 관측하여 첨가된 물질의 농도를 측정하였다.
(
실시예
2)
도 6는 실시예 2에서 제조한 효소 전극의 개념도를 나타낸다.
도 6을 참조하면, 실리콘 기판(6000) 및 금 전극(6010)은 도전성 부재를 구성하고 있다. 이 도전성 부재에 금/티올 결합을 통해 코발트 착체(6020)가 고정화되어 있다. 그리고, 코발트 착체(6020)의 말단에 있는 코발트(6030)에 글루코스 옥시다제(6040)의 분자에 도입된 히스티딘 잔기(6050)가 결합되어 있다. 또, 글루코스 옥시다제내에는, 금속 착체를 결합시키기 위한 다른 히스티딘이 도입되어 있다. (6060)은 코발트 착체가 결합된 다른 히스티딘을 나타낸다. 코발트 착체가 결합된 상기 히스티딘(6060)은 글루코스 옥시다제의 활성 사이트로서 작용하는 FAD(6070)의 근방(6080)에 도입된다. 이 때문에, 효소 반응을 통해서 FAD에 전달된 전자는, 고속으로 코발트 착체를 통해서 도전성 부재로 이동하는 것이 가능해진다.
실시예 2에서는, 이 효소 전극의 제조 및 글루코오스 센서 및 생물 연료 전지로서의 사용예를 이하의 각 항목에 대해 기술한다.
1. 효소 고정화용의 금속 착체(즉, (6060)을 구성하는 코발트 착체)의 합성
2. 특정 위치에 히스티딘을 도입한 글루코스 옥시다제의 제조
3. 효소 전극의 제조
4. 글루코오스 농도의 측정
5. 생물 연료 전지의 동작
1. 효소 고정화용의 금속착체의 합성
이하의 화학식(2)로 표시된 착체의 합성법을 이하에 기술한다:
등몰의 2,2':6',2"-터피리딘 및 염화 코발트(II)를 에틸렌글라이콜 용매 중, 질소 분위기하 환류를 수행함으로써 반응시켰다. 반응 용액을 공냉시킨 후, 이 냉각된 용액을 강력한 교반 하에 500 ㎖의 디에틸 에테르에 적하하였다. 얻어진 침전물을 물 및 다이에틸 에테르로 세정하고 건조시켰다. 이와 같이 해서, 화학식(2)로 표시되는 착체를 얻었다.
2. 특정 위치에 히스티딘을 도입한 글루코스 옥시다제의 제조
페니실륨 아마가사키엔스(Penicillium amagasakiense)(ATCC 28686)를 감자 및 글루코스를 함유하는 한천 판에 접종하고, 25℃에서 배양함으로써, 배양된 세포를 얻었다. 얻어진 배양된 세포를 인산 완충액에 현탁시킨 후, 이 세포를 원심분 리를 통해 회수하여 세정하였다. 이들 배양된 세포로부터 상법에 따라 cDNA를 조제하였다. 이 조제된 cDNA를 주형으로 사용하고, 이하의 서열번호 6 및 7의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-AATAATCATATGGCCTACCTGCCTGCCCAACAGATTGATGTCCAG-3'(NdeI)[서열번호 6] 및
5'-AATAATCGGCCGCTAGGCACTTTTGGCATAGTCATCCAAAAT-3'(EagI)[서열번호 7]
를 프라이머로 사용해서, PCR 증폭 반응을 실시하여, 약 1,700 염기쌍의 증폭 산물을 얻었다.
증폭 산물의 DNA 염기서열을 해석함으로써, 이 PCR 증폭 산물[서열번호 8]은, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가진 글루코스 옥시다제를 암호화하는 유전자를 함유하는 것을 확인할 수 있었다.
이 DNA 증폭 산물을 제한 효소 NdeI 및 EagI로 소화에 의해 절단하여, 얻어진 약 1,700 염기쌍의 DNA 단편을 pET-21a(+)(노바겐사(Novagen) 제품)에 있어서의 제한 효소와 동일한 사이트에 삽입하였다. 이렇게 함으로써, 글루코스 옥시다제 발현 벡터 pET21-GOX를 제작하였다.
정제한 pET21-GOX에 대해서, 시판의 키트를 이용해서 부위 특이적 변이를 도입함으로써, 변이형 글루코스 옥시다제 발현 벡터 pET-mGOX를 제작한다.
글루코스 옥시다제 유전자에 대해서 도입하는 부위 특이적 변이는, 다음과 같이 실시하였다.
즉, 이하의 조건 가운데, (1) 내지 (3), 또는 (2) 내지 (4)의 모든 조건을 충족시키는 아미노산을 선택해서, 이들 아미노산을 암호화하는 유전자를, 히스티딘을 암호화하는 유전자와 각각 치환하였다. 가능하다면, 그 자체로 이하의 조건 (1) 내지 (4)를 모두 충족시키는 하나의 아미노산도 선택될 수 있다.
(1). 글루코스 옥시다제 활성을 가지는 아미노산 서열에 있어서, 해당 아미노산은 전하가 전달되는 사이트인 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드의 물리적 근방에 위치할 것.
(2). 아미노산을 히스티딘으로 치환함으로써 글루코스 옥시다제 활성을 저감 시키지 않을 것.
(3). 아미노산이 치환된 히스티딘의 곁사슬을 구성하는 이미다졸기를 통해 금속 원자와 착체를 형성하는 것이 가능할 것.
(4). 효소 표면 근방에 위치하는 아미노산 중에서, 관련된 아미노산이 히스티딘으로 치환될 때 효소 외부에 배치된 금속 착체와 결합시킬 목적으로 이용할 수 있을 것.
상기 조건들을 충족시키는 아미노산 세트의 예로서 이하의 것을 들 수 있다.
그 세트의 예로는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의, 108번째의 트레오닌-231번째의 아스파라긴산-61번째의 세린-6번째의 글루타민을 들 수 있다. 다른 예로는 112번째의 글라이신-221번째의 아스파라긴-177번째의 세린-150번째의 알라닌이다. 또 다른 예로는 111번째의 아스파라긴-231번째의 아스파라긴산-61번째의 세린-6번째의 글루타민을 들 수 있다.
본 실시예 2에 있어서는, 108번째의 트레오닌-231번째의 아스파라긴산-61번 째의 세린-6번째의 글루타민의 4개의 아미노산을 치환한 예에 대해 설명한다.
이들 아미노산의 히스티딘으로의 치환은, 시판 키트에 부착된 메뉴얼에 따라, 프라이머를 설계해서, 염기를 치환함으로써 실시하였다.
변이형 글루코스 옥시다제 발현 벡터 pET-mGOX를 E.coli BL21(DE3)로 상법에 따라 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체는 항생 물질인 암피실린에 대한 내성주로서 선별될 수 있다.
얻어진 형질 전환체를, 항생 물질인 암피실린을 첨가한 LB 배지에서 예비배양하였다. 다음에, 상기 형질 전환체의 일부를 LB-Amp 배지에 첨가해서 진탕 배양하였다. IPTG를 첨가하면서 배양을 더욱 계속하였다. IPTG 유도한 형질 전환 균체를 집균해서, PBS에 재현탁하였다. 이어서, 이 균체를 동결 융해 및 초음파에 의해 파쇄해서, 원심분리함으로써, 봉입체를 함유하는 고형 협잡물을 취득하였다. 봉입체를 함유하는 고형 협잡물을, NaCl 및 EDTA를 함유하는 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 2회 세정한 후, 한층 더 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 세정하였다. 다음에, 요소 용액으로 세정해서 협잡 단백질을 제거함으로써, 봉입체를 정제하였다.
정제된 봉입체를 다이티오트레이톨을 함유하는 8M 요소 수용액에 현탁시키고, 빙욕에 정치시켜 가용화하였다.
가용화된 단백질을 투석 튜브에 넣어, 글루타티온, 글리세롤 및 FAD를 함유하는 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 대해서 투석함으로써, 리폴딩(refolding)시켰다.
리폴딩된 단백질 용액을 원심분리함으로써, 응집한 단백질을 제거하였다. 상청액에 함유된 단백질을, 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 겔 여과 컬럼에 통과시킴으로써 분획화를 실시하였다. 글루코스 옥시다제 활성 분획을 선별해서 취함으로써, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 변이형 글루코스 옥시다제의 정제품을 얻었다.
글루코스 옥시다제 활성은, 예를 들면 25℃의 효소 포화 조건하에, 아세트산 나트륨 완충액 중에서의 글루코스의 산화에 의해 생성된 과산화 수소량을 측정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면 2,2'-아지노-다이-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트]다이암모늄염(ABTS)을 발색제로서 이용해서 420 ㎚에 있어서의 흡광도 변화를 측정함으로써 결정하는 것이 가능하다.
3. 효소 전극의 조제
실리콘 기판상에 티탄/금을 20/200 ㎚의 두께로 증착하여, 도전성 기판을 제조하였다. 기판을 절단한 후, 이 절단한 기판을 과산화 수소수/진한 황산의 3/7 용액 중에 20분간 침지하고 나서, 수세하고, 질소 기류로 건조하였다.
(a) 이 기판을 화학식(1)로 표시되는 배위자의 클로로포름 용액에 침지하였다. 그 후, 기판을 클로로포름으로 세정하고, 질소 기류 하 건조하였다.
(b) 다음에, 이 기판을 염화 코발트(II) 수용액에 침지하였다. 그 후, 기판을 수세하고, 질소 기류하 건조하였다.
(c) 이어서, 4',4""-(1,4-페닐렌)비스(2,2':6',2"-터피리딘)의 클로로포름 용액에 기판을 침지하였다. 그 후, 기판을 클로로포름으로 세정하고, 질소 기류하 에 건조하였다.
또, 상기 (b) 및 (c) 공정을, (b)-(c)-(b)의 순서로 반복함으로써, 도전성 기판에 고정화된 금속 착체를 얻었다.
상기 설명한 바와 같이 히스티딘을 도입한 글루코스 옥시다제의 완충액을 준비하고, 이 고정화된 금속 착체를 포함하는 도전성 기판을 상기 완충액에 침지함으로써, 상기 금속 착체에 효소를 고정화시켰다. 효소의 고정화량은, 예를 들어 수정 진동자 마이크로 밸런스법 등에 의해 추정할 수 있었다. 그 후, 상기 도전성 기판을 완충액으로 세정하여, 상기 금속 착체에 배위 결합되어 있지 않은 효소를 제거하였다. 또한, 상기 도전성 기판을 상기 화합물(2)의 0.1M 인산 완충액 중에 침지함으로써 효소 전극을 제조하였다.
이와 같이 해서, 효소 내의 활성 사이트 근방에 배치된 히스티딘과 금속 착체의 금속 중심으로서 작용하는 코발트 원자가 서로 배위 결합하고, 그 결과, 매개체로서 기능하는 금속 착체는 상기 활성 사이트에 대해서 그의 위치를 제어하면서 배치될 수 있다.
4. 글루코오스 농도의 측정
상기 제조한 효소 전극이 작용 전극, 백금선이 대향 전극, 은/염화은 전극이 참조 전극으로 되도록 3전극 셀을 구성하였다. 이 3전극 셀을 포텐시오스탯에 접속하고, 전해질로서 0.1M의 인산 완충액을 사용하였다. 필요한 경우, 불활성 가스를 버블링시킴으로써, 상기 용액으로부터 산소를 제거하였다. 측정 전에, 기지의 농도의 글루코스 완충 용액을 이용하고 작용 전극에 500 mV 대 Ag/AgCl의 전위를 인가해서, 정상 전류(촉매 전류)를 관측하고, 검량선을 작성하였다. 이어서, 전해질에 미지 농도의 글루코스를 함유하는 물질을 첨가하고, 동일한 전위를 인가해서, 정상 전류를 관측하여 첨가된 물질의 농도를 측정하였다.
5. 생물 연료 전지의 동작
상기 제조한 효소 전극 애노드로서 이용하고 , 백금선을 캐소드로 이용해서 생물 연료 전지를 구성하였다. 애노드 및 캐소드로부터 인출한 리드 선에 부하, 예를 들어, 액정표시장치를 접속하였다. 연료로서 작용하는 글루코스와, 효소를 함유하는 전해액을 애노드 및 캐소드 사이에 채우면, 기전력을 발생해서, 액정표시장치를 구동시켰다.
이상, 본 발명을 예시적인 실시형태를 참조해서 설명하였으나, 본 발명은 개시된 예시적인 실시형태로 제한되는 것이 아님을 이해할 필요가 있다. 이하의 청구범위의 범주는 모든 변형, 등가 구성 및 기능을 망라하도록 최광의의 해석에 따르는 것으로 간주된다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 효소 전극을 설명하기 위한 도면;
도 2는 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 효소 전극을 제조하는 공정을 설명하기 위한 순서도;
도 3은 본 발명의 제 3 실시형태에 따른 센서를 설명하기 위한 모식도;
도 4는 본 발명의 제 4 실시형태에 따른 연료 전지를 설명하기 위한 도면;.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 효소 전극을 설명하기 위한 도면;
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따른 효소 전극을 설명하기 위한 도면.
<도면의 주요부분에 대한 설명>
1000: 효소 1005: 일부 변형된 단백질
1010: 도전성 부재 1020: 금속 착체
1030: 활성 사이트 1040: 아미노산
2000: 효소 전극 2010: 대향 전극
2020: 리드 2030: 외부 장치
2040: 전해질 3000: 애노드
3010: 캐소드 3020: 리드
3030: 부하 3040: 전해질
5000: 유리 기판 5010: 금 전극
5020: 코발트 착체 5040: 서양 고추냉이 퍼옥시다제
5050: 히스티딘 잔기 5060: 헴
5070: 헴의 근방 영역 6000: 실리콘 기판
6010: 금 전극 6020: 코발트 착체
6030: 코발트 6040: 글루코스 옥시다제
6050: 히스티딘 잔기
6060: 코발트 착체가 결합된 다른 히스티딘
6070: FAD(flavin adenine dinucleotide)
6080; FAD의 근방
<110> CANON INC.
<120> ENZYME ELECTRODES, PRODUCTION METHODS OF THE ENZYME ELECTRODES,
AND SENSOR OR FUEL CELL USING THE ENZYME ELECTRODES
<150> JP2006-226699
<151> 2006-08-23
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
aataatggat cccaacttac ccctaccttc tacgacaatt ca 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
aataatctcg agagagttgg agttcaccac cctacaattc aa 42
<210> 3
<211> 948
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 3
aataatggat cccaacttac ccctaccttc tacgacaatt catgtcctaa tgtctctaac 60
atcgtacggg atactattgt caatgagcta agatcagacc ctcgtattgc cgcgagcatc 120
cttcgtcttc acttccacga ctgctttgtt aatggttgtg acgcatcgat cttgttagac 180
aacacaacat catttcgaac agagaaagat gcgtttggaa acgcaaactc ggcaagagga 240
tttccagtga ttgatagaat gaaagccgcg gtggagagtg catgcccaag aaccgtttca 300
tgcgcagatt tgctcaccat tgcagctcaa caatctgtca ctttggcggg aggtccttct 360
tggagagttc ctttgggcag aagagatagc ttacaagcat ttctggatct tgctaatgca 420
aatcttccag ctccattctt cacacttcca caacttaaag acagctttag aaatgttggc 480
ctcaaccgtt cttctgatct cgttgcactg tccgggggcc acacatttgg taaaaatcag 540
tgtcggttta ttatggacag attatacaac ttcagcaaca ccggtttacc cgatcctact 600
ctcaacacta cttatctcca aactcttcgt ggactatgtc ccctcaatgg taatctaagc 660
gctttggtgg attttgatct acgtacgcca acgatttttg acaacaaata ctatgtgaat 720
ctcgaagagg aaaaaggact tatccaaagc gaccaagagt tgttctctag ccccaatgcc 780
actgacacaa tccctttggt gagatcattt gctaatagca cacaaacatt cttcaatgca 840
tttgtggagg cgatggatag gatgggaaac attacacctc ttacaggaac tcaaggacag 900
atcaggttga attgtagggt ggtgaactcc aactctctcg agattatt 948
<210> 4
<211> 308
<212> PRT
<213> Armoracia rusticana
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(308)
<223> Horseradish peroxidase
<400> 4
Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn
1 5 10 15
Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Ile
20 25 30
Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly
35 40 45
Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu
50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val Ile
65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser
85 90 95
Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu Ala
100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gln
115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr
130 135 140
Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser
145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gln
165 170 175
Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu
180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly Leu
195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg
210 215 220
Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Glu
225 230 235 240
Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala
245 250 255
Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr
260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile Thr
275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val Val
290 295 300
Asn Ser Asn Ser
305
<210> 5
<211> 308
<212> PRT
<213> Armoracia rusticana
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(308)
<223> Horseradish peroxidase mutant
<400> 5
Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn
1 5 10 15
Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro His Ile
20 25 30
Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly
35 40 45
Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu
50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn His Ala Arg Gly Phe Pro Val Ile
65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser
85 90 95
Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu Ala
100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gln
115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr
130 135 140
Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser
145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn His
165 170 175
Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu
180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly Leu
195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg
210 215 220
Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Glu
225 230 235 240
Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala
245 250 255
Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr
260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile Thr
275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val Val
290 295 300
Asn Ser Asn Ser
305
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
aataatcata tggcctacct gcctgcccaa cagattgatg tccag 45
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 7
aataatcggc cgctaggcac ttttggcata gtcatccaaa at 42
<210> 8
<211> 1791
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR product
<400> 8
aataatcata tggcctacct gcctgcccaa cagattgatg tccagtctag tcttctcagt 60
gaccctagca aggttgcagg aaagacctat gattacatca ttgctggtgg tggtttgact 120
ggccttactg ttgctgccaa attgacagaa aaccccaaga tcaaagtcct ggtcattgaa 180
aagggcttct atgagtccaa cgatggagcc atcatcgagg atccaaatgc ttatggacaa 240
atctttggca ccactgttga ccagaactac ctcaccgttc ccctgatcaa caaccgcacg 300
aacaatatca aggccggtaa aggtcttgga ggatcaacct tgataaacgg tgactcctgg 360
actcgcccag acaaagtcca gattgattct tgggagaagg tctttggcat ggaaggttgg 420
aattgggaca acatgttcga gtacatgaag aaggccgagg ctgcacgtac ccctactgct 480
gctcagcttg ctgctggcca ctccttcaat gctacctgcc atggaaccaa cggtactgtt 540
caatccggag cccgtgacaa cggccagcct tggtctccta ttatgaaggc ccttatgaac 600
accgtctcgg cccttggtgt ccccgtacag caagactttc tctgtggtca tcctcgaggt 660
gtctctatga tcatgaacaa tctcgacgaa aaccaagttc gtgttgatgc tgcccgtgca 720
tggctgcttc ccaactacca gcgctcgaat ttggagatcc ttactggtca gatggttgga 780
aaggttctgt ttaaacagac cgcatccggt ccccaggctg ttggtgtgaa cttcggtact 840
aataaggccg tcaactttga cgtctttgct aagcatgagg tccttttggc tgctggctca 900
gctatctctc cgctgatctt ggaatattct ggcataggct tgaagtctgt tcttgatcaa 960
gccaatgtca ctcagcttct tgatcttcct gttggtatca atatgcaaga tcagaccaca 1020
accactgtca gttcccgtgc tagttccgct ggtgctggtc agggtcaggc cgtcttcttc 1080
gccaatttca ctgagacctt cggtgactac gccccccagg ccagggactt actcaacacc 1140
aagctcgacc aatgggccga ggagaccgtt gcgcgcggtg gtttccataa tgtaactgct 1200
ctcaaagtac aatacgaaaa ctatcgtaac tggctccttg acgaagacgt cgccttcgcc 1260
gagcttttca tggacaccga gggcaagatc aacttcgatt tatgggatct catccctttc 1320
actcgtggtt ccgtccatat cctcagtagc gatccttacc tatggcaatt cgccaacgac 1380
cccaaattct tcctgaacga gtttgacctc cttggtcaag ctgccgcttc caagcttgct 1440
cgtgatctca ctagccaagg cgctatgaag gagtacttcg ccggggagac tcttccagga 1500
tacaacttgg tccagaatgc tactctttcc cagtggtcgg attatgtctt acagaacttc 1560
cgtcccaact ggcatgctgt gagcagctgc tctatgatgt ctagagagct tggtggtgtc 1620
gttgatgcta ctgccaaggt gtacggtacc caaggcctac gtgtcattga cgggtctatt 1680
cctccgactc aggtgtcttc ccatgtcatg accattttct acggaatggc tttgaaggtt 1740
gctgatgcca ttttggatga ctatgccaaa agtgcctagc ggccgattat t 1791
<210> 9
<211> 587
<212> PRT
<213> Penicillium amagasakiense
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(587)
<223> glucose oxidase
<400> 9
Tyr Leu Pro Ala Gln Gln Ile Asp Val Gln Ser Ser Leu Leu Ser Asp
1 5 10 15
Pro Ser Lys Val Ala Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ala Lys Leu Thr Glu Asn Pro Lys
35 40 45
Ile Lys Val Leu Val Ile Glu Lys Gly Phe Tyr Glu Ser Asn Asp Gly
50 55 60
Ala Ile Ile Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Thr Thr
65 70 75 80
Val Asp Gln Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu Ile Asn Asn Arg Thr Asn
85 90 95
Asn Ile Lys Ala Gly Lys Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly
100 105 110
Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gln Ile Asp Ser Trp Glu Lys
115 120 125
Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Met Phe Glu Tyr Met
130 135 140
Lys Lys Ala Glu Ala Ala Arg Thr Pro Thr Ala Ala Gln Leu Ala Ala
145 150 155 160
Gly His Ser Phe Asn Ala Thr Cys His Gly Thr Asn Gly Thr Val Gln
165 170 175
Ser Gly Ala Arg Asp Asn Gly Gln Pro Trp Ser Pro Ile Met Lys Ala
180 185 190
Leu Met Asn Thr Val Ser Ala Leu Gly Val Pro Val Gln Gln Asp Phe
195 200 205
Leu Cys Gly His Pro Arg Gly Val Ser Met Ile Met Asn Asn Leu Asp
210 215 220
Glu Asn Gln Val Arg Val Asp Ala Ala Arg Ala Trp Leu Leu Pro Asn
225 230 235 240
Tyr Gln Arg Ser Asn Leu Glu Ile Leu Thr Gly Gln Met Val Gly Lys
245 250 255
Val Leu Phe Lys Gln Thr Ala Ser Gly Pro Gln Ala Val Gly Val Asn
260 265 270
Phe Gly Thr Asn Lys Ala Val Asn Phe Asp Val Phe Ala Lys His Glu
275 280 285
Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Pro Leu Ile Leu Glu Tyr
290 295 300
Ser Gly Ile Gly Leu Lys Ser Val Leu Asp Gln Ala Asn Val Thr Gln
305 310 315 320
Leu Leu Asp Leu Pro Val Gly Ile Asn Met Gln Asp Gln Thr Thr Thr
325 330 335
Thr Val Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala
340 345 350
Val Phe Phe Ala Asn Phe Thr Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Pro Gln
355 360 365
Ala Arg Asp Leu Leu Asn Thr Lys Leu Asp Gln Trp Ala Glu Glu Thr
370 375 380
Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Val Gln Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asp Glu Asp Val Ala Phe Ala Glu
405 410 415
Leu Phe Met Asp Thr Glu Gly Lys Ile Asn Phe Asp Leu Trp Asp Leu
420 425 430
Ile Pro Phe Thr Arg Gly Ser Val His Ile Leu Ser Ser Asp Pro Tyr
435 440 445
Leu Trp Gln Phe Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Leu Asn Glu Phe Asp
450 455 460
Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Ser Lys Leu Ala Arg Asp Leu Thr Ser
465 470 475 480
Gln Gly Ala Met Lys Glu Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Leu Pro Gly Tyr
485 490 495
Asn Leu Val Gln Asn Ala Thr Leu Ser Gln Trp Ser Asp Tyr Val Leu
500 505 510
Gln Asn Phe Arg Pro Asn Trp His Ala Val Ser Ser Cys Ser Met Met
515 520 525
Ser Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Thr Ala Lys Val Tyr Gly
530 535 540
Thr Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Val
545 550 555 560
Ser Ser His Val Met Thr Ile Phe Tyr Gly Met Ala Leu Lys Val Ala
565 570 575
Asp Ala Ile Leu Asp Asp Tyr Ala Lys Ser Ala
580 585
<210> 10
<211> 587
<212> PRT
<213> Penicillium amagasakiense
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(587)
<223> glucose oxidase mutant
<400> 10
Tyr Leu Pro Ala Gln His Ile Asp Val Gln Ser Ser Leu Leu Ser Asp
1 5 10 15
Pro Ser Lys Val Ala Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ala Lys Leu Thr Glu Asn Pro Lys
35 40 45
Ile Lys Val Leu Val Ile Glu Lys Gly Phe Tyr Glu His Asn Asp Gly
50 55 60
Ala Ile Ile Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Thr Thr
65 70 75 80
Val Asp Gln Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu Ile Asn Asn Arg Thr Asn
85 90 95
Asn Ile Lys Ala Gly Lys Gly Leu Gly Gly Ser His Leu Ile Asn Gly
100 105 110
Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gln Ile Asp Ser Trp Glu Lys
115 120 125
Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Met Phe Glu Tyr Met
130 135 140
Lys Lys Ala Glu Ala Ala Arg Thr Pro Thr Ala Ala Gln Leu Ala Ala
145 150 155 160
Gly His Ser Phe Asn Ala Thr Cys His Gly Thr Asn Gly Thr Val Gln
165 170 175
Ser Gly Ala Arg Asp Asn Gly Gln Pro Trp Ser Pro Ile Met Lys Ala
180 185 190
Leu Met Asn Thr Val Ser Ala Leu Gly Val Pro Val Gln Gln Asp Phe
195 200 205
Leu Cys Gly His Pro Arg Gly Val Ser Met Ile Met Asn Asn Leu Asp
210 215 220
Glu Asn Gln Val Arg Val His Ala Ala Arg Ala Trp Leu Leu Pro Asn
225 230 235 240
Tyr Gln Arg Ser Asn Leu Glu Ile Leu Thr Gly Gln Met Val Gly Lys
245 250 255
Val Leu Phe Lys Gln Thr Ala Ser Gly Pro Gln Ala Val Gly Val Asn
260 265 270
Phe Gly Thr Asn Lys Ala Val Asn Phe Asp Val Phe Ala Lys His Glu
275 280 285
Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Pro Leu Ile Leu Glu Tyr
290 295 300
Ser Gly Ile Gly Leu Lys Ser Val Leu Asp Gln Ala Asn Val Thr Gln
305 310 315 320
Leu Leu Asp Leu Pro Val Gly Ile Asn Met Gln Asp Gln Thr Thr Thr
325 330 335
Thr Val Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala
340 345 350
Val Phe Phe Ala Asn Phe Thr Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Pro Gln
355 360 365
Ala Arg Asp Leu Leu Asn Thr Lys Leu Asp Gln Trp Ala Glu Glu Thr
370 375 380
Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Val Gln Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asp Glu Asp Val Ala Phe Ala Glu
405 410 415
Leu Phe Met Asp Thr Glu Gly Lys Ile Asn Phe Asp Leu Trp Asp Leu
420 425 430
Ile Pro Phe Thr Arg Gly Ser Val His Ile Leu Ser Ser Asp Pro Tyr
435 440 445
Leu Trp Gln Phe Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Leu Asn Glu Phe Asp
450 455 460
Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Ser Lys Leu Ala Arg Asp Leu Thr Ser
465 470 475 480
Gln Gly Ala Met Lys Glu Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Leu Pro Gly Tyr
485 490 495
Asn Leu Val Gln Asn Ala Thr Leu Ser Gln Trp Ser Asp Tyr Val Leu
500 505 510
Gln Asn Phe Arg Pro Asn Trp His Ala Val Ser Ser Cys Ser Met Met
515 520 525
Ser Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Thr Ala Lys Val Tyr Gly
530 535 540
Thr Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Val
545 550 555 560
Ser Ser His Val Met Thr Ile Phe Tyr Gly Met Ala Leu Lys Val Ala
565 570 575
Asp Ala Ile Leu Asp Asp Tyr Ala Lys Ser Ala
580 585
Claims (8)
- 효소(1000; 5040; 6040);상기 효소가 고정화되어 있는 도전성 부재(1010; 5000, 5010; 6000, 6010);상기 도전성 부재에 전기적으로 접속된 금속 착체(1020; 5020; 6020); 및상기 효소 내의 활성 사이트(1030; 5060; 6070)에 혹은 상기 활성 사이트 근방의 제어된 위치에 배열된 아미노산(1040; 5050; 6050)을 포함하되,상기 아미노산은 상기 금속 착체와 배위 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 효소 전극.
- 제 1항에 있어서, 상기 효소를 암호화하는 유전자는 유전자 공학적 조작에 의해 재조합되고, 상기 아미노산은 상기 효소 내의 활성 사이트에 혹은 그 근방에 인위적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 효소 전극.
- 제 1항에 있어서, 상기 아미노산이 히스티딘인 것을 특징으로 하는 효소 전극.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 효소 전극(2000) 및 이 효소 전극에 전압 혹은 전위를 인가하기 위해 배치된 수단(2010, 2020, 2030)을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 센서.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 효소 전극(3000 또는 3010), 대향 전극(3010 또는 3000) 및 상기 효소 전극과 상기 대향 전극 사이에 배열된 전해질(3040)을 포함하는 것을 특징으로 하는 연료 전지.
- 금속 착체(1020; 5020; 6020)가 고정화되어 있는 도전성 부재(1010; 5000, 5010; 6000, 6010)를 준비하는 단계;효소(1000; 5040; 6040)를 암호화하는 유전자를 유전자 공학적 조작에 의해 재조합해서, 상기 효소 내의 활성 사이트(1030; 5060; 6070)에 혹은 그 활성 사이트 근방의 제어된 위치에 아미노산(1040; 5050; 6050)을 배열시키는 단계; 및상기 아미노산과 상기 금속 착체를 서로 배위 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 전극의 제조 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 도전성 부재에 혹은 해당 도전성 부재의 표면에 고정화된 물질에 결합할 수 있는 작용기를 가진 상기 금속 착체의 용액을 상기 도전성 부재와 접촉시킴으로써 상기 금속 착체를 상기 도전성 부재에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 효소전극의 제조 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 도전성 부재에 혹은 해당 도전성 부재의 표면에 고정된 물질에 결합할 수 있는 작용기를 가진 리간드의 용액을 상기 도전성 부재에 접촉시키고 나서, 이탈기를 가진 상기 금속 착체의 중심 금속을 함유하는 화합물의 용액을 상기 도전성 부재와 접촉시킴으로써 상기 금속 착체를 상기 도전성 부재에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 효소전극의 제조 방법.
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