JP4948327B2 - 酵素電極、酵素電極の製造方法、およびこれを用いたセンサ、燃料電池 - Google Patents
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Description
前記酵素は酸化還元酵素であり、
前記酸化還元酵素は、該酸化還元酵素の活性部位としての、酸化若しくは還元を受ける酵素の基質、酵素の補欠分子族または補因子を構成し酸化還元を担う原子、から1.6nm以内の距離に位置するアミノ酸を有し、
前記アミノ酸は、前記導電性部材に電気的に接続される金属錯体と配位結合しており、
前記金属錯体の中心金属は鉄、コバルト、ルテニウム、オスミウム、クロムのいずれかであることを特徴とする酵素電極提供する。
前記導電性部材に金属錯体を固定化する工程と、
前記酸化還元酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学により組替えることで、前記酸化還元酵素内の該酸化還元酵素の活性部位としての、酸化若しくは還元を受ける酵素の基質、酵素の補欠分子族または補因子を構成し酸化還元を担う原子、から1.6nm以内の距離にアミノ酸を設ける工程と、
前記アミノ酸と前記金属錯体とを配位結合させる工程と、を有することを特徴とする酵素電極の製造方法を提供する。
本発明に係る酵素電極の概念図を図1に示す。
まず、酵素内の活性サイトあるいはその近傍に配置されているアミノ酸について説明する。
本実施形態に適用される金属錯体としては、以下のものが挙げられる。
導電性部材は、例えば、金、白金などの金属電極やカーボン電極、インジウムスズ酸化物電極などを適用できる。
次に、本実施形態に係る酵素電極の製造方法について、図2を用いて説明する。
前述の第1の実施形態で説明した酵素電極を用いて構成されるセンサについて、図3を用いて説明する。
前述の第1の実施形態で説明した酵素電極を用いて構成される燃料電池について、図4を用いて説明する。
実施例1で形成される酵素電極の概念図を図5に示す。
1.電極上に固定化する金属錯体配位子の合成
2.特定位置にヒスチジンを導入した西洋ワサビペルオキシダーゼの調製
3.酵素電極の調製
4.過酸化水素の測定
以下の式(1)に示す錯体配位子の合成法を記述する。
活性サイトの近傍に、アミノ酸であるヒスチジンを特定の位置に導入し、そのヒスチジンと配位結合する金属錯体を用いた酵素電極について説明する。
cDNAを鋳型として用い、合成オリゴヌクレオチド
5’−AATAATGGATCCCAACTTACCCCTACCTTCTACGACAATTCA−3’(BamHI)[配列番号1]、および、
5’−AATAATCTCGAGAGAGTTGGAGTTCACCACCCTACAATTCAA−3’(XhoI)[配列番号2]、
をプライマーとして用い、PCR増幅反応を行い、約920塩基対の増幅産物を得る。
1.ペルオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列において、電荷の授受が行われる部位であるヘムの物理的近傍に位置するアミノ酸であること。
2.酵素表面近傍に位置するアミノ酸であること。
3.該アミノ酸のヒスチジンへの置換により、酵素のペルオキシダーゼ活性を低減させないもの。
4.置換されたヒスチジンの側鎖であるイミダゾール基により酵素外部に配置される金属錯体と結合させる目的に利用できること。
例えば2,2’−azino−di−[3−ethylbenzthiazoline−6−sulfonate]diammonium salt(ABTS)を発色剤として用いる。そして、420nmにおける吸光度変化を測定することにより決定する。
市販のスライドグラスをアセトン中で超音波洗浄、窒素気流下で乾燥した後、チタン/金を20/200nmの厚さで蒸着して、導電性基板を調製した。基板を切断後、過酸化水素水/濃硫酸の3/7溶液中に20分間浸漬し、水洗、窒素気流で乾燥した。
(a)この基板を式(1)の配位子のクロロホルム溶液に浸漬、クロロホルムで洗浄、窒素気流下乾燥する。
(b)次に、この基板を塩化コバルト(II)水溶液に浸漬、水洗、窒素気流下乾燥をおこなう。
(c)次に4’,4’’’’−(1、4−Phenylene)bis(2,2’:6’,2’’−terpyridine)のクロロホルム溶液に浸漬を行い、クロロホルムで洗浄、窒素気流下で乾燥する。
調製した酵素電極を作用電極とし、白金線を対電極、銀/塩化銀電極を参照電極として3電極セルを構成し、ポテンショスタットに接続、電解液として0.1Mのリン酸緩衝液を使用する。測定前に、既知濃度の過酸化水素の緩衝溶液を用い、作用電極に500mV vs Ag/AgClの電位を印加して定常電流(触媒電流)を観測、検量線を作成する。その上で、電解液に未知濃度の過酸化水素を含む物質を添加し、同様の電位を印加して定常電流を観測することで濃度を測定する。
実施例2で形成される酵素電極の概念図を図6に示す。
1.酵素固定化用金属錯体の合成(6060を構成するコバルト錯体)
2.特定位置へヒスチジンを導入したグルコースオキシダーゼの調製
3.酵素電極の調製
4.グルコース濃度の測定
5.生物燃料電池の動作
以下の式(2)に示す錯体の合成法を記述する。
Penicillium amagasakiense(ATCC 28686)を、ジャガイモ、グルコースを含む寒天プレートに接種し、25℃で培養することにより、培養細胞を得る。得られた培養細胞をリン酸緩衝液に懸濁した後、遠心分離して回収することにより洗浄する。この培養細胞より常法に従いcDNAを調製する。このcDNAを鋳型として、合成オリゴヌクレオチド
5’− AATAATCATATGGCCTACCTGCCTGCCCAACAGATTGATGTCCAG −3’ (NdeI) [配列番号6]、および、
5’− AATAATCGGCCGCTAGGCACTTTTGGCATAGTCATCCAAAAT −3’(EagI)[配列番号7]、
をプライマーとして、PCR増幅反応を行い、約1,700塩基対の増幅産物を得る。
すなわち、以下の条件のうち、1から3、または2から4のそれぞれ全ての条件に適合するアミノ酸を選択し、これらのアミノ酸をコードする遺伝子を、ヒスチジンをコードする遺伝子に置換することによって行う。また、可能であれば、一つのアミノ酸で1から4の全ての条件に適合していても良い。
2.ヒスチジンへの置換によりグルコースオキシダーゼ活性を低減させないこと。
3.置換されたヒスチジンの側鎖であるイミダゾール基により金属原子と錯体を形成することが可能であること。
4.酵素表面近傍に位置するアミノ酸の中から、ヒスチジンへの置換により酵素外部に配置される金属錯体と結合させる目的に利用できること。
シリコン基板上にチタン/金を20/200nmの厚さで蒸着して、導電性基板を調製した。基板を切断後、過酸化水素水/濃硫酸の3/7溶液中に20分間浸漬し、水洗、窒素気流で乾燥した。
(a)この基板を式(1)の配位子のクロロホルム溶液に浸漬、クロロホルムで洗浄、窒素気流下乾燥する。
(b)次に、この基板を塩化コバルト(II)水溶液に浸漬、水洗、窒素気流下乾燥をおこなう。
(c)次に4’,4’’’’−(1、4−Phenylene)bis(2,2’:6’,2’’−terpyridine)のクロロホルム溶液に浸漬を行い、クロロホルムで洗浄、窒素気流下で乾燥する。
調製した酵素電極を作用電極とし、白金線を対電極、銀/塩化銀電極を参照電極として3電極セルを構成し、ポテンショスタットに接続、電解液として0.1Mのリン酸緩衝液を使用する。必要な場合は、不活性ガスをバブリングすることで、溶液から酸素を除去する。測定前に、既知濃度のグルコースの緩衝溶液を用い、作用電極に500mV vs Ag/AgClの電位を印加して定常電流(触媒電流)を観測、検量線を作成する。その上で、電解液に未知濃度のグルコースを含む物質を添加し、同様の電位を印加して定常電流を観測することで濃度を測定する。
調製した酵素電極をアノードとし、白金線をカソードとして生物燃料電池を構成する。アノード、カソードから取り出したリード線に、負荷、例えば、液晶表示装置を接続する。燃料であるグルコース、酸素を含んだ電解液をアノード、カソード間に導入することで、起電力を発生し、液晶表示装置を駆動させる。
本発明の酵素電極においては、分子生物学的手法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼの活性サイトであるヘム、グルコースオキシダーゼ活性サイトであるのFADの近傍に金属錯体に配位可能なヒスチジンを導入する。このヒスチジンに対し、脱離基として塩素を分子内に有するコバルト錯体を結合させることで、活性サイトの近傍にメディエータとして機能するコバルト錯体を固定化する。
2.この電極は、酵素の活性中心からの電子の取出を高速化することで、酵素1分子あたりの電流値を高くすることができる。すなわち、少ない酵素量で必要とされる電流値を与えることができるため、酵素の使用量を低下させ、電極の製造に必要な資源、コストの削減に寄与する。
3.この電極は、酵素の活性中心からの電子の取出を高速化することで、酵素1分子あたりの電流値を高くすることができる。すなわち、少ない酵素量で必要とされる電流値を与えることができる。このため、酵素固定化電極において、従来の電極と、同じ固定化密度の電極の場合には、一定の出力電流値、電荷量を維持したまま電極面積を低減することができる。これを利用して、電極面積を低減することで、バックグラウンド電流を減少させ、シグナル/ノイズ比を向上させることができる。また、デバイスを小型化することができる。これによって、低ノイズのセンサや小型のセンサ、燃料電池を提供することができる。
1010 導電性基板
1020 金属錯体
1030 活性サイト
1040 アミノ酸
1005 酵素を構成する、一部改変された部位をもつタンパク質
Claims (6)
- 酵素と導電性部材とを有する酵素電極であって、
前記酵素は酸化還元酵素であり、
前記酸化還元酵素は、該酸化還元酵素の活性部位としての、酸化若しくは還元を受ける酵素の基質、酵素の補欠分子族または補因子を構成し酸化還元を担う原子、から1.6nm以内の距離に位置するアミノ酸を有し、
前記アミノ酸は、前記導電性部材に電気的に接続される金属錯体と配位結合しており、
前記金属錯体の中心金属は鉄、コバルト、ルテニウム、オスミウム、クロムのいずれかであることを特徴とする酵素電極。 - 遺伝子工学的に前記酸化還元酵素をコードする遺伝子を組替えて、前記酸化還元酵素内の活性部位またはその近傍に前記アミノ酸が人為的に導入されていることを特徴とする請求項1に記載の酵素電極。
- 前記アミノ酸がヒスチジンであることを特徴とする請求項1乃至2に記載の酵素電極。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載の酵素電極と、前記酵素電極が有する前記導電性部材に電圧を印加するための手段を有することを特徴とする酵素センサ。
- 請求項1乃至4のいずれかに記載の酵素電極と、前記酵素電極に対向する対向電極と、前記酵素電極および前記対向電極の間に配置された電解質を収容するための空間と、を有することを特徴とする燃料電池。
- 酸化還元酵素と導電性部材を有する酵素電極の製造方法であって、
前記導電性部材に金属錯体を固定化する工程と、
前記酸化還元酵素をコードする遺伝子を遺伝子工学により組替えることで、前記酸化還元酵素内の該酸化還元酵素の活性部位としての、酸化若しくは還元を受ける酵素の基質、酵素の補欠分子族または補因子を構成し酸化還元を担う原子、から1.6nm以内の距離にアミノ酸を設ける工程と、
前記アミノ酸と前記金属錯体とを配位結合させる工程と、を有することを特徴とする酵素電極の製造方法。
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