JP5709365B2 - 微生物酵素製剤およびその製造方法 - Google Patents
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Description
(I-1)下記(1)および(2)の特徴を有する、活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物:
(1)微生物の生存率が0〜91%、
(2)カテコールオキシダーゼ活性が1.7kU/g以上。
(I-2)カテコールオキシダーゼがチロシナーゼである、(I-1)記載の微生物組成物。
(I-4)微生物が酵母である、(I-1)または(I-2)に記載する微生物組成物。
(II-1)(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する微生物組成物を有効成分とする酵素製剤。
(III-1)不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことを特徴とする、(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する微生物組成物の製造方法。
(III-2)細胞障害処理が、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理からなる群から選択される少なくとも1つの処理である、(III-1)に記載する製造方法。
(III-3)上記界面活性剤が陽イオン系界面活性剤である(III-2)に記載する製造方法。
(III-4)上記陽イオン系界面活性剤が第4級アンモニウム塩である(III-3)に記載する製造方法。
(III-5)上記界面活性剤が陰イオン系界面活性剤である(III-2)に記載する製造方法。
(III-6)上記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である(III-2)に記載する製造方法。
(III-7)活性化処理が、不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を銅イオンと接触させる工程、および酸処理工程を有する処理である、(III-1)乃至(III-6)のいずれかに記載する製造方法。
(IV-1)カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことを特徴とする、微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼ活性を向上させる方法。
(IV-2)細胞障害処理が、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理からなる群から選択される少なくとも1つの処理である、(IV-1)に記載する方法。
(IV-3)上記界面活性剤処理に使用する界面活性剤が、陽イオン系界面活性剤である(IV-2)に記載する方法。
(IV-4)上記陽イオン系界面活性剤が第4級アンモニウム塩である(IV-3)に記載する方法。
(IV-5)活性化処理が、カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を銅イオンと接触させる工程、および酸処理工程を有する処理である、(IV-1)乃至(IV-4)のいずれかに記載する方法。
(V-1)(II-1)記載の酵素製剤の存在下で、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン(DOPA)及びその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むメラニン前駆体の製造方法。
本発明の微生物組成物は、活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物の集合体であって、下記(1)および(2)の特徴を備えるものである:
(1)微生物の生存率が0〜91%、
(2)カテコールオキシダーゼ活性が1.7kU/g以上。
(c-1) カテコールオキシダーゼ遺伝子を本来発現させているプロモーターよりも高活性のプロモーターの下でこの遺伝子を発現させている微生物。
(c-2) カテコールオキシダーゼ遺伝子を複数コピー有する微生物。
(c-3) カテコールオキシダーゼ遺伝子の変異体を有することにより高いカテコールオキシダーゼ活性を示す微生物。
本発明の微生物組成物は、不活性型カテコールオキシダーゼ、即ち補因子として銅を有しないアポ酵素型のカテコールオキシダーゼを含む微生物組成物に対して、細胞障害処理を施すことによって調製することができる。
ベタイン、ラウリルベタイン、塩化アルキルポリアミノエチルグリシンなどが挙げられる。
本発明の微生物組成物は、上記細胞障害処理の後、活性化処理を施すことによって調製される。
前述するように、銅を補因子とするカテコールオキシダーゼ、好ましくはチロシナーゼが活性を示すためには、触媒活性中心に2価銅イオンが配位することが必要である。特に形質転換等の遺伝子操作によりカテコールオキシダーゼの発現量を向上させた微生物においては、酵素の活性触媒中心に2価銅イオンが配位しておらず(不活性型カテコールオキシダーゼ)、十分なカテコールオキシダーゼ活性が得られない場合がある。このため、かかる不活性型カテコールオキシダーゼを有する微生物を、予め2価銅イオンで処理することにより、カテコールオキシダーゼの触媒活性中心に2価銅イオンを配位させることが好ましい。すなわち、上記(a)の処理は、微生物組成物中に含まれる不活性型カテコールオキシダーゼ、即ち活性触媒中心に2価銅イオンが配位していないアポ酵素型のカテコールオキシダーゼに2価銅イオンを配位させる処理である。
カテコールオキシダーゼの中でもチロシナーゼ、特にアスペルギルス・オリゼ由来のチロシナーゼは、pH2〜4程度の酸性溶液で処理することにより、成熟化し、活性化する。従って、微生物として、チロシナーゼ、特にアスペルギルス・オリゼ由来のチロシナーゼを有する微生物を用いる場合は、かかる酸処理を行うことで、酵素を成熟化させ、活性化させることが好ましい。
また、カテコールオキシダーゼは、トリプシン等の特定のペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼのようなプロテアーゼで処理することによっても活性化することができる。これは、プロテアーゼ処理することにより、酵素のN末端及び/又はC末端側の配列が取り除かれることによる。従って、カテコールオキシダーゼを有する微生物をプロテアーゼで処理することで、カテコールオキシダーゼ活性を向上させることが好ましい。
前述する本発明の微生物組成物は、そのままの状態で酵素製剤とすることができる。この場合、微生物組成物の形態は、特に制限されず、例えば、水等の極性溶媒またはこれらの混合液に懸濁させた状態であってもよいし、冷凍状態でもよい。また乾燥固体状態に調製したものであってもよいし、粉末状態でもよい。また、担体結合法、包括法、架橋法、光架橋法等の公知の方法で、任意の担体に固定化させた状態のものであってもよい。
本発明はまた微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼの活性を向上させる方法を提供する。
本発明はまた(II)で説明する本発明の酵素製剤を用いてメラニン前駆体を製造する方法を提供する。当該方法は、少なくとも下記の2工程を含む方法によって実施することができる。
本発明の酵素製剤の存在下で、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン(DOPA)及びその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する工程、
(b)回収工程
(a)で得られた反応液からメラニン前駆体を回収する工程。
(a)工程において、基質化合物としては、前述するようにDOPA及びDOPA類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の化合物を使用する。DOPA及びDOPA類縁体は、L体又はD体のいずれであってもよい。DOPA類縁体としては、ドーパミン(Dopamine)や、DOPAメチルエステル、DOPAエチルエステルおよびα−メチルDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点で、L-DOPAを用いることが好ましく、酵素に対する親和性の点でもL-DOPAを用いることが好ましい。なお、基質化合物は1種を単独で使用してもよいし、2種以上を任意に組み合わせて用いてもよい。
(a)工程において、酸化反応は、上記基質化合物を水に溶解した状態で行ってもよいし、また水に完全に溶解させることなく非溶解状態で行ってもよい。
斯くして調製されたメラニン前駆体を含む反応液(メラニン前駆体含有溶液)には、メラニン前駆体のほかに、使用した酵素又は微生物、更には通気及び撹拌により細胞が破損して生じたタンパク質又は細胞から流出したタンパク質や、メラニン前駆体が重合したメラニンも含まれる。従って、必要に応じて、反応液からメラニン前駆体以外の成分を除去してもよい。例えば酵素や微生物細胞の除去は、限外ろ過等のろ過、遠心分離等の手段により行うことができる。また、タンパク質やメラニンの除去は、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等の手段により行うことができる。
カテコールオキシダーゼとしてチロシナーゼ(melB)、微生物として酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて、カテコールオキシダーゼ産生微生物を調製した。なお、チロシナーゼ(melB)は麹菌Aspergillus oryzaeから単離された酵素である(特許第3903125号公報)。そのアミノ酸配列、並びにそれをコードするmelB遺伝子のクローニング方法およびその塩基配列も、上記特許第3903125号公報に記載されている。
特許第3903125号公報の記載に従って、麹菌Aspergillus oryzaeからmelB遺伝子をクローニングした。具体的には、麹菌「Aspergillus oryzae OSI-1013」株(受託番号FERM P-16528、平成9年11月20日に日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター(旧:工業技術院生命工学工業技術研究所・特許微生物寄託センター)に寄託)を蒸米に接種し、製麹した麹を1.5g秤量し、液体窒素中で完全に破砕した。日本ジーン社製ISOGENを用いて、これから240μgの全RNAを抽出した。120μgの全RNAからタカラバイオ株式会社製Oligotex-dT30<Super>を用いて、1μgのmRNAを精製した。このmRNAを、Clontech社製SMART cDNA Library Construction KitによりcDNAライブラリーを作成し、PCRによりmelB cDNAのみを増幅した。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動で、目的の約1.8Kbpのバンドのみが増幅されていることを確認した。また、塩基配列解析の結果、正常にイントロン配列が取り除かれていることも確認した。なお、特許第3903125号公報の配列番号2に記載されているmelB遺伝子の塩基配列のうち、1〜1436番目の塩基配列はプロモーター領域、3636〜4174番目の塩基配列はターミネーター領域に相当し、1437〜3635番目の塩基配列は、melB cDNAに相当するコーティング領域に相当する。
上記(1)で得られたmelB cDNAを、酵母Saccharomyces cerevisiae用発現ベクター(特開2003-265177号公報)に発現可能な状態で接続した。具体的には、特開2003-265177号公報の記載に準じて、SED1プロモーターとADH1ターミネーターを持つ上記発現ベクターのプロモーター直下のSmaI部位に、上記(a)で取得したmelB cDNAを挿入した。URA3マーカー内部に存在するStuI部位で切断することにより得られるmelB cDNAを含む断片を導入用カセットとして精製した。
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母(組換え酵母)を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体(湿重量約100mg)に0.1mMの硫酸銅を含む水溶液1mLを加え、40℃で20分間保持した。その後、遠心分離により菌体を回収し、これに50mMの酢酸緩衝液(NaOAc-HCl)(pH3.0)1mLに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、過剰な銅イオンを除去するため20mMのEDTA溶液(KOHを使用してpH5に調整)で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母(組換え酵母)を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体(湿重量約100mg)を−20℃冷凍庫内で冷凍し4ヶ月間保存した。
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母(組換え酵母)を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体(湿重量約100mg)をシャーレに薄く広げ、60℃の通風乾燥機に入れ、3時間通風することにより乾燥させた。
調製例に記載する方法で得られたmelB産生酵母(組換え酵母)を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し、次いで蒸留水で洗浄した。次いで、菌体(湿重量約100mg)を、表1に記載する各種濃度(0.1、0.4、0.8および2.0重量%)に調製した界面活性剤(塩化ベンザルコニウム)の水溶液(15℃)に、0.5時間浸漬した。
比較例および実施例1〜3でそれぞれ調製した活性化処理菌体について、菌体の生存率(%)および菌体のチロシナーゼ活性を測定した。
酵母の死滅細胞はメチレンブルーによって青く染色する。そこでメチレンブルー染色法を用いて(「清酒醸造技術」1979年3月30日、p.169、財団法人日本醸造協会発行)、顕微鏡下で酵母細胞のメチレンブルー染色率を求め、それから酵母細胞全体に占める生菌の割合(酵母生存率)(%)を算出した。メチレンブルーによる菌体の染色は、細胞障害処理後の溶液を100倍希釈し、希釈溶液100μLと0.01%メチレンブルー溶液900μLを懸濁し、5分以内に顕微鏡で観察することで行った。
菌体のチロシナーゼ活性の測定は、基質としてL-DOPAを用いて、次のようにして行った。
実施例1〜3で調製した菌体、および比較例で調製した菌体について測定した生存率(%)とチロシナーゼ活性(1kU/g)を表1に示す。
実験例1で、塩化ベンザルコニウムを用いた界面活性剤処理が、活性化処理の前処理として有効であることが判明したので、ここでは実施例3で使用した塩化ベンザルコニウム0.1〜2重量%に代えて、表2に示す種々の第4級アンモニウム塩(0.5重量%)を用いて、実施例3に記載する方法で活性化処理菌体を調製し、実験例1と同様にして菌体の生存率(%)と菌体のチロシナーゼ活性(kU/g)を測定した。結果を表2に示す。
実験例2で、陽イオン系界面活性剤(第4級アンモニウム塩)を用いた界面活性剤処理が、活性化処理の前処理として有効であることが判明したので、ここでは実施例3で使用した塩化ベンザルコニウム0.1〜2重量%に代えて、表3に示す種々の界面活性剤(0.3重量%)をアルカリ性条件下で用いて、実施例3に記載する方法で活性化処理菌体を調製し、実験例1と同様にして菌体の生存率(%)と菌体のチロシナーゼ活性(kU/g)を測定した。
Claims (8)
- 不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理からなる群から選択される少なくとも1つの細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことを特徴とする、下記の特徴を有する、活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物の製造方法:
(1)微生物の生存率が0〜91%、
(2)カテコールオキシダーゼ活性が1.7kU/g以上。 - カテコールオキシダーゼがチロシナーゼである、請求項1に記載する製造方法。
- 微生物が酵母である、請求項1または2に記載する製造方法。
- 上記界面活性剤が陽イオン系界面活性剤であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載する製造方法。
- 活性化処理が、不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を銅イオンと接触させる工程、および酸処理工程を有する処理である、請求項1乃至4のいずれかに記載する製造方法。
- カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を、冷凍処理、乾燥処理および界面活性剤処理からなる群から選択される少なくとも1つの細胞障害処理した後に、活性化処理を行うことを特徴とする、微生物組成物におけるカテコールオキシダーゼ活性の向上方法。
- 活性化処理が、不活性型カテコールオキシダーゼを含有する微生物組成物を銅イオンと接触させる工程、および酸処理工程を有する処理である、請求項6に記載する方法。
- 請求項1乃至5のいずれかに記載する製造方法により得られる微生物組成物を有効成分とする酵素製剤の存在下で、3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン(DOPA)及びその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の基質化合物を酸化してメラニン前駆体に変換する酸化工程と、反応液からメラニン前駆体を回収する回収工程とを含むメラニン前駆体の製造方法。
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