JP5570160B2 - 反応槽容積を効率的に使用したメラニン前駆体の製造方法 - Google Patents
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(I-1)DOPA及びその類縁体からなる群から選択される少なくとも1種の基質化合物、及び酸化酵素またはこの酵素を含む微生物を含有する反応液に酸素、好ましくは純酸素を供給しながら、閉鎖系で酸化反応を行うことを特徴とする、メラニン前駆体の製造方法。
(I-2)上記酸化酵素がカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である、(I-1)記載の製造方法。
(I-3)上記カテコールオキシダーゼ活性を有する酵素がチロシナーゼである、(I-2)記載の製造方法。
(I-4)上記メラニン前駆体が、ドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドールカルボン酸、若しくは5,6-ジヒドロキシインドール、またはこれらの化合物を2種以上含む混合物である(I-1)乃至(I-3)に記載する製造方法。
(I-5)反応液中の溶存酸素量が常時1ppm以上になるように、言い換えると1ppmを下回らないように、酸素を供給することを特徴とする、(I-1)乃至(I-4)のいずれかに記載する製造方法。
(I-6)反応液を、反応容器にその容積70容量%以上の割合で収容し、酸化反応を行うことを特徴とする(I-1)乃至(I-5)のいずれかに記載する製造方法。
(I-7)反応液の発泡を抑制しながら基質化合物を酸化する方法である、(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する製造方法。
(I-8)下記(1)及び(2)の工程を有するメラニン前駆体の製造方法であって、
(1)反応液にアルカリまたは酸を供給して反応液のpHを5〜6に維持する工程、
(2)反応液のpHを連続して測定し、測定値の経時的変化をモニターする工程;
pHの経時的変化の傾向の切り替わりを反応終了の指標として、酸素の供給を停止することを特徴とする、
(I-1)乃至(I-7)のいずれかに記載する製造方法。
本発明の製造方法において、基質化合物としては、DOPA及びDOPA類縁体からなる群より選ばれる少なくとも1種の化合物を使用する。DOPA及びDOPA類縁体は、L体(3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-L-アラニン)(以下、「L-DOPA」とも称する)又はD体(3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-D-アラニン)のいずれであってもよい。DOPA類縁体としては、ドーパミン(Dopamine)や、DOPAの低級(炭素数1〜4)アルキルエステル、およびα−低級(炭素数1〜4)アルキルDOPA等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。中でも、天然型メラニン前駆体が得られる点で、L-DOPAを用いることが好ましく、酵素に対する親和性の点でもL-DOPAを用いることが好ましい。
本発明の製造方法に使用する酵素は、前述する基質化合物を酸化する作用を有するものであればよい。具体的には、酸化酵素を挙げることができる。中でも好ましくはカテコールオキシダーゼ活性を有する酵素である。
本発明の製造方法には、上記酵素に代えて上記酵素を産生する微生物を使用することもできる。
(c-1)「酸化酵素」遺伝子を本来発現させているプロモーターよりも高活性のプロモーターの下でこの遺伝子を発現させている微生物。
(c-2)「酸化酵素」遺伝子を複数コピー有する微生物。
(c-3)「酸化酵素」遺伝子の変異体を有することにより高い酵素活性(好ましくはカテコールオキシダーゼ活性、より好ましくはチロシナーゼ活性)を示す微生物。
(1)微生物を常法により液体培養した後、培養液を遠心分離して培地を除去する。
(2)この微生物を水に懸濁して遠心分離し、上清を除去する。
(3)(2)の工程を繰り返すことにより、微生物を洗浄する。
(4)(3)で得られた微生物を水に懸濁したものを微生物懸濁液とする。
なお、酸化酵素、特にチロシナーゼが活性を示すためには、触媒活性中心に2価銅イオンが配位することが必要である。このため、酵素酸化反応に、酸化酵素、または当該酵素を産生する微生物のいずれを用いる場合でも、これらの酵素又は微生物を、予め2価銅イオンで処理することにより、酸化酵素の触媒活性中心に2価銅イオンを配位させることが好ましい。かかる方法として、具体的には、酸化酵素又は微生物を0.1〜2mM程度の硫酸銅溶液等に懸濁し、30〜40℃程度で0.5〜2時間程度静置する方法を挙げることができる。
本発明において酸化反応は、前述する基質化合物と酸化酵素または当該酵素を産生する微生物を含有する反応液に酸素を供給しながら、閉鎖系で行うことを特徴とする。
斯くして調製されたメラニン前駆体を含む反応液には、メラニン前駆体のほかに、使用した酸化酵素又は微生物、更には通気及び撹拌により細胞が破損して生じたタンパク質又は細胞から流出したタンパク質や、メラニン前駆体が重合したメラニンも含まれる。従って、必要に応じて、反応液からメラニン前駆体以外の成分を除去してもよい。例えば酸化酵素や微生物細胞の除去は、限外ろ過等のろ過、遠心分離等の手段により行うことができる。また、タンパク質やメラニンの除去は、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等の手段により行うことができる。
(1)カテコールオキシダーゼ産生微生物(melB産生酵母)の調製
カテコールオキシダーゼとしてチロシナーゼ(melB)、微生物として酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて、カテコールオキシダーゼ産生微生物を調製した。なお、チロシナーゼ(melB)は麹菌Aspergillus oryzaeから単離された酵素である(特許第3903125号公報)。そのアミノ酸配列、並びにそれをコードするmelB遺伝子のクローニング方法およびその塩基配列も、上記特許第3903125号公報に記載されている。
特許第3903125号公報の記載に従って、麹菌Aspergillus oryzaeからmelB遺伝子をクローニングした。具体的には、麹菌Aspergillus oryzae OSI-1013株(受託番号FERM P-16528、平成9年11月20日に日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第6に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター(旧:工業技術院生命工学工業技術研究所・特許微生物寄託センター)に寄託)を蒸米に接種し、製麹した麹を1.5g秤量し、液体窒素中で完全に破砕した。日本ジーン社製ISOGENを用いて、これから240μgの全RNAを抽出した。120μgの全RNAからタカラバイオ株式会社製Oligotex-dT30<Super>を用いて、1μgのmRNAを精製した。このmRNAを、Clontech社製SMART cDNA Library Construction KitによりcDNAライブラリーを作成し、PCRによりmelB cDNAのみを増幅した。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動で、目的の約1.8Kbpのバンドのみが増幅されていることを確認した。また、塩基配列解析の結果、正常にイントロン配列が取り除かれていることも確認した。なお、特許第3903125号公報の配列番号2に記載されているmelB遺伝子の塩基配列のうち、1〜1436番目の塩基配列はプロモーター領域、3636〜4174番目の塩基配列はターミネーター領域に相当し、1437〜3635番目の塩基配列は、melB cDNAに相当するコーティング領域に相当する。
上記(a)で得られたmelB cDNAを、酵母Saccharomyces cerevisiae用発現ベクター(特開2003-265177号公報)に発現可能な状態で接続した。具体的には、特開2003-265177号公報の記載に準じて、SED1プロモーターとADH1ターミネーターを持つ上記発現ベクターのプロモーター直下のSmaI部位に、上記(a)で取得したmelB cDNAを挿入した。URA3マーカー内部に存在するStuI部位で切断することにより得られるmelB cDNAを含む断片を導入用カセットとして精製した。
上記で得られたmelB産生酵母(組換え酵母)を常法に従って培養し、遠心分離によって菌体を回収し、蒸留水で洗浄した。次いで、菌体(湿重量約100mg)に0.1mMの硫酸銅を含む水溶液1mLを加え、40℃で20分間保持した。その後、遠心分離により菌体を回収し、これを50mMの酢酸緩衝液(NaOAc-HCl)(pH3.0)1mLに懸濁し、室温で10分間静置した。その後、遠心分離により菌体を回収し、過剰な銅イオンを除去するため、20mMのEDTA溶液(KOHを使用してpH5に調整)で洗浄し、遠心分離して菌体を回収した。斯くして活性化処理された菌体を水1mLに懸濁して、これを微生物懸濁液とした。
(1)試験液の処理
測定する試験液の遠心上清0.5mlと3%(w/v)アスコルビン酸ナトリウム水溶液0.5mlを混和する。本溶液を65℃で15分間加熱後、0.1%(w/v)りん酸水溶液9.0mlを添加してよく混ぜる。かかる処理により、試験液中に含まれているドーパクロムは全量5,6―ジヒドロキシインドールに変換され定量することができる。
斯くして調製した試験液の遠心上清を下記条件のHPLCに供し、標準化合物(L-DOPA:和光純薬社製、5,6―ジヒドロキシインドール:BIO SYNTH社製)で作成した検量線から、反応液中のL-DOPAおよびドーパクロムの濃度を測定する。
HPLC装置:Waters社製HPLC Alliance2695-2996
カラム:Waters社製SunfireC18(4.6×150mm)
移動相:A液−1.5%(w/v)リン酸溶液、B液−99.9%メタノール(B液が初発0%、5分後に50%となるようにグラジエントを設定)
試験液注入量:10μl
流速:1.0ml/min
検出:極大吸収波長である280nmにおける吸光度でモニター。
以下、図2に示す反応システムの概略図を参考にして説明する。
当該反応システム1は、反応液3を収容した反応槽2、反応液にアルカリを供給するアルカリ供給部4、反応液3に酸を供給する酸供給部5、反応液3のpHをモニターするpH測定部6、酸素供給部11、反応槽2からの排気を制御する排気バルブ14を少なくとも備えている。ここでアルカリ供給部4と酸供給部5はpH測定部6と連動しており、反応液3のpHが常に5〜6、好ましくはpH5.3付近に維持されるように、制御部17によりオンラインでコントロールされている。すなわち、反応液3のpHが5より低くなる場合はアルカリ供給部4からアルカリ水溶液が自動添加されて反応液3のpHが5.3付近になるように調整され、逆に反応液3のpHが6より高くなる場合は酸供給部5から酸水溶液が自動添加されて反応液3のpHが5.3付近になるように調整される。なお、ここでは、アルカリ水溶液として6Nの水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液を、酸水溶液として3Nの硫酸水溶液を使用した。
pH測定部6を備えた10L容量の反応槽2に、イオン交換水2.7L、L-DOPA48gを仕込み、アルカリ供給部4から6NのNaOH水溶液を添加して、反応液のpHを5.3付近になるように調整した。これに参考例1に記載する方法で調製した微生物懸濁液0.3L(酵素活性1,080kU)を添加して、反応を開始した(反応液3の総量3L)。反応は、反応液3の温度を25℃前後に調整し、酸素供給部11から純酸素を1L/minの割合で供給しながら、撹拌下(400rpm)で行った。また排気バルブ14は開放し、排気口を通じて反応槽2と空気が連通する状態で反応を行った(開放系反応)。なお、前述するように、反応は、反応液3のpHが5.3付近になるように、アルカリ供給部4から6NのNaOH水溶液の添加が、また酸供給部5から3NのH2SO4水溶液の添加が、自動制御されている。
図4に示す反応システムの概略図を参考にして説明する。
(1)反応システムの説明
当該反応システム1は、反応液3を収容した反応槽2、反応液にアルカリを供給するアルカリ供給部4、反応液に酸を供給する酸供給部5、反応液のpHをモニターするpH測定部6、反応液の溶存酸素を測定する溶存酸素測定部7、撹拌部8、酸素供給部11、反応液への酸素供給量を測定する流量計15および反応槽2からの排気を制御する排気バルブ14を少なくとも備えている。
pH測定部6および溶存酸素測定部7を備えた10L容量の反応槽2に、イオン交換水2.7L、L-DOPA48gを仕込み、アルカリ供給部4から6NのNaOH水溶液を添加して、反応液のpHを5.3付近になるように調整した。これに参考例1に記載する方法で調製した微生物懸濁液0.3L(酵素活性1,080kU)を添加して、反応を開始した(反応液3の総量3L)。反応は、反応液3の温度を25℃前後に調整し、また反応液3の溶存酸素濃度が1ppmを下回らないように、酸素供給部11からの酸素供給速度および撹拌部8の撹拌速度を調整しながら行った。また排気バルブ14は開放し、排気口を通じて反応槽2と空気が連通する状態で反応を行った(開放系反応)。なお、前述するように、反応は、反応液のpHが5.3付近になるように、アルカリ供給部4から6NのNaOH水溶液の添加が、また酸供給部5から3NのH2SO4水溶液の添加が、自動制御されている。
実験例2で使用した図4に示す反応システムと同様の反応システムを用いて、酸素反応を行った。
図2に示す反応システムの概略図を参考にして説明する。
2.反応槽
3.反応液
4.アルカリ供給部
5.酸供給部
6.pH測定部
7.酸素溶存量測定部(DO測定部)
8.撹拌部
11.酸素供給部
12.圧力調整部
13.ニードルバルブ
14.排気バルブ
15.流量計
16.圧力計
17.制御部
Claims (5)
- 3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)アラニン(DOPA)、ドーパミン、DOPAの低級アルキルエステル及びα−低級アルキルDOPAからなる群から選択される少なくとも1種の基質化合物、及びチロシナーゼまたはこの酵素を含む微生物を含有する反応液に純酸素を供給しながら閉鎖系で酸化反応を行うことを特徴とする、メラニン前駆体の製造方法。
- 反応液中の溶存酸素量が常時1ppm以上になるように純酸素を供給することを特徴とする、請求項1に記載する製造方法。
- 反応液を、反応容器に、その容積70容量%以上の割合で収容し、酸化反応を行うことを特徴とする請求項1又は2に記載する製造方法。
- 反応液の発泡を抑制しながら基質化合物を酸化する方法である、請求項1乃至3のいずれかに記載する製造方法。
- 下記(1)及び(2)の工程を有するメラニン前駆体の製造方法であって、
(1)反応液にアルカリまたは酸を供給して反応液のpHを5〜6に維持する工程、
(2)反応液のpHを連続して測定し、測定値の経時的変化をモニターする工程;
反応液のpH低下が上昇に転じ、反応液へのアルカリ供給から酸の供給に切り替わることを反応終了の指標として、酸素の供給を停止することを特徴とする、
請求項1乃至4のいずれかに記載する製造方法。
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