JP2005069836A - 電極、タンパク測定装置及び酵素活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 補酵素と電極との間で、多段階の酸化還元反応を可能とし、補酵素の活性を阻害することのない適当な電子伝達場を設けるために、補酵素と電極との間にメディエータを設けるとともに、連続的な測定を可能とするために、補酵素のリサイクリングを実現し、すなわち、酸化型の補酵素を還元型に再生して酸化型の補酵素の除去を不要とし、ひいては、簡易、簡便かつ高感度に酵素活性を測定することができる電極、バイオリアクタ及びこれらを用いた酵素の活性測定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】導電体１１表面に、電子を授受し得るメディエータ１２を介して酵素層１３が積層され、酵素層１３に補酵素１４が接触して構成され、酵素層１３が、メディエータ１２の電子の授受及び補酵素１４の酸化還元反応に作用するものである補酵素依存型酵素の活性測定用電極。
【選択図】 図１

Description

本発明は、電極、タンパク測定装置及び酵素活性の測定方法に関し、より詳細には、導電体上にメディエータ、酵素及び補酵素が積層されてなる電極、該電極を有することにより、メディエータを介して、補酵素の間接的な電子授受を低い電位によって実現し得るバイオセンサを備えるタンパク測定装置及び酵素活性の測定方法に関する。

生体内に存在する物質は、通常、酵素反応によって代謝される。したがってこれらの物質は、酵素を用いることによって分析することができる。現に、種々の生体内物質の定量分析に酵素が利用されている。例えば、酸化還元酵素、特に脱水素酵素は、酸化還元酵素の中でも最も多く、４００種類以上のＮＡＤ（Ｐ）−依存型として存在している。
したがって、これらの酵素を用いることにより、バイオセンシングシステムを構築することができるとともに、このようなシステムは、医療分野及び食品分野等の分析に有用である。そして、このようなバイオセンシングシステムにおいて用いられる酵素活性を測定し、把握することができれば、より適切かつ精度のよいバイオセンシングを行うことが可能になる。

従来から、バッチ式のシステムにおいて、二種類の酸化還元酵素と補酵素とを組み合わせて、基質（例えば、生体内物質等）を高感度に定量する方法及び酵素活性を測定する方法が確立されている（例えば、非特許文献１）。
しかし、この定量法では、基質を酵素によって反応生成物に変換させるという主反応を停止した後、余分な酸化型補酵素を分解除去する必要がある。また、この方法では、補酵素のサイクリング反応を別途行う必要がある。このようなことから、連続的な測定ができないという課題がある。

一方、集電体と酸化還元酵素の補酵素とが混合されて構成された電極が提案されている（例えば、特許文献１）。この電極では、補酵素と集電体との接触を確実にすることによって、直接的に補酵素の酸化電流値の変化を集電体で捕らえることができ、迅速に、感度よく、酵素の基質濃度等を測定することができる。
しかし、この電極では、補酵素が集電体と一体的に構成されているために、補酵素リサイクルができず、やはり、連続的にバイオセンシングを行うことができない。

一般に、ＮＡＤ⁺及びＮＡＤＰ⁺の補酵素の酸化還元電位は非常に高く、電極との直接的な電子授受を行うと、補酵素のラジカルが生成し、補酵素自体が二量体化することにより活性を失わせるという課題がある。
生化学実験講座、第５巻、酵素研究法（東京化学同人）p121-129 特公昭５８−１６６９３号公報

つまり、連続測定が可能な電極型バイオセンサの構築にあたっては、酵素を固定化するだけでなく、補酵素も反応系内に取り込むことに加え、補酵素のリサイクリングを行う必要がある。
また、補酵素と電極との直接的な電子授受に起因する補酵素の二量体化及び補酵素の失活を防止するために、メディエータを介する間接的な電子授受によって、低い電位で、補酵素と電極とが確実に電子の授受を行うことができる電子伝達場を確保することが必要である。

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、補酵素と電極との間で、多段階の酸化還元反応を可能とし、補酵素の活性を阻害することのない適当な電子伝達場を設けるために、補酵素と電極との間にメディエータを設けるとともに、連続的な測定を可能とするために、補酵素のリサイクリングを実現し、すなわち、酸化型の補酵素を還元型に再生して酸化型の補酵素の除去を不要とし、ひいては、簡易、簡便かつ高感度に酵素活性を測定することができる電極、タンパク測定装置及びこれらを用いた酵素の活性測定方法を提供することを目的とする。

本発明の補酵素依存型酵素の活性測定用電極は、導電体表面に、電子を授受し得るメディエータを介して酵素層が積層され、該酵素層に補酵素が接触するように構成されてなり、前記酵素層が、前記メディエータの電子の授受及び前記補酵素の酸化還元反応に作用するものであることを特徴とする。
また、本発明のタンパク測定装置は、上記電極を有し、さらに対電極と、これら電極及び対電極とが収容され、液体を充填し得る反応器とによって構成されるバイオセンサを備えることを特徴とする。
さらに、本発明の酵素活性の測定方法は、上記タンパク測定装置を用いて、補酵素依存型酵素の活性を測定することを特徴とする。

本発明によれば、多段階の酸化還元反応を行うことを可能とするメディエータを、補酵素と電極との間に設けることにより、補酵素と電極との間で、補酵素の活性を阻害することのない適当な電子伝達場を設けることができる。また、補酵素のリサイクリングを実現し、すなわち酸化型の補酵素を還元型に再生して酸化型の補酵素の除去を不要とすることにより、連続的な測定を可能とすることができる。したがって、簡易、簡便かつ高感度に、酵素活性、ＤＮＡ検出等を包含するタンパク測定が可能となる。

本発明の電極は、測定対象となる酵素（つまり、補酵素依存型酵素）の活性を測定するために用いることができるものであり、少なくとも、導電体上に、メディエータ、酵素層が積層されるとともに、酵素層には補酵素が接触されて構成される。

導電体としては、通常、電極として用いられるものであればどのような材料でも使用することができる。例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等；アルミニウム、銅、金、白金、銀等の金属又は合金、ＳｎＯ₂、Ｉｎ₂Ｏ₃、ＷＯ₃、ＴｉＯ₂等、導電性酸化物等種々の材料の単層又は２種以上の積層構造が挙げられる。電極の膜厚、大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用するメディエータ、酵素及び補酵素等の種類、得ようとするバイオセンサの性能等によって適宜調整することができる。例えば、厚み０．１〜５ｍｍ程度、１〜１００００ｍｍ²程度の面積の矩形形状であることが適当である。

メディエータとしては、電極と補酵素との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能するもので、酵素反応に悪影響を与えないものであれば、どのようなものでも使用することができる。例えば、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル置換体、エチル置換体、プロピル置換体等）、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン等の酸化還元性の有機又は無機化合物の１種あるいは２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、水や水溶性有機溶媒（低級アルコール等）に溶解し、取り扱いが容易であるもの、電子移動媒体としての機能が安定しているものが好ましく、例えば、フェロセン、フェリシアン化カリウム等が好適に用いられる。

導電体上に積層されるメディエータの膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、後述する酵素及び補酵素の種類及び量、測定対象である酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、メディエータを導電体上に積層する方法は、メディエータの種類によって、適当なものを適宜選択することができる。例えば、メディエータをその機能を阻害しない溶媒、例えば、水又は水溶性有機溶媒等に溶解させ、塗布、乾燥する方法、メディエータを適当な担体、例えば、樹脂、タンパク等の高分子化合物等に混合及び分散させ、担体を薄膜状に形成する方法、交互積層法（現代化学、１９９７年１月、ｐ２０〜２５参照）等、当該分野で公知の薄膜形成法のすべてを利用することができる。なかでも、後述する交互積層法が好ましい。

酵素層を構成する酵素は、メディエータの電子の授受を行い、つまり、メディエータと電極反応を触媒し、後に詳細に説明する補酵素層に含まれる補酵素の酸化還元反応に作用するものであることが必要である。酵素は、本発明の電極で用いられ、後述する補酵素及び測定対象の酵素（例えば、この補酵素の依存型酵素）の種類によって、適宜選択することができる。具体的には、グルタチオンリダクターゼ、ジアホラーゼ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ⁺リダクターゼ、リポアミド脱水素酵素等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。

酵素層は、導電体上に積層されたメディエータの上に積層されてもよいし、メディエータ及び酵素の種類等によっては、メディエータとともに導電体上に配置してもよい。酵素層の膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、後述する補酵素の種類及び量、測定対象である酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、酵素層を積層する方法としては、メディエータとともに、あるいはメディエータの上に、メディエータを積層するのと同様の方法が挙げられる。

酵素層に接触する補酵素は、測定対象となる酵素の反応の発現に関与し得るものであり、先に説明した酵素層における酵素の種類、本発明の電極で用いられ、後述する補酵素依存型酵素の種類等によって、適宜選択することができる。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ⁺）、補酵素Ｉ、補酵素ＩＩ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、リポ酸、補酵素Ｑ等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ⁺）等のＮＡＤ系の補酵素が好ましい。

補酵素は、導電体上に積層された酵素層の上に、これと同様の形態で積層されてもよいし、補酵素、メディエータ及び上述した酵素の種類等によっては、メディエータ及び酵素とともに導電体上に、あるいは酵素とともに、メディエータ上に層状で配置してもよい。さらに、溶液等の液状で、酵素層と接触するように配置していてもよい。補酵素層とする場合には、膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、上述した酵素の種類及び量、後述する測定対象である酵素の種類及び量等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、補酵素層を積層する方法としては、メディエータ及び／又は酵素とともに、導電体、メディエータ又は酵素層の上に、メディエータを積層するのと同様の方法が挙げられる。また、液状の場合には、例えば、水、水溶性有機溶媒（メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド等）に０．１〜１０．０ｍｇ／ｍｌ程度の濃度の溶解、分散又は懸濁された状態であることが適当である。

本発明の電極では、上述したメディエータ、酵素層及び補酵素の少なくとも１種、好ましくは全てが、高分子担体とともに層状で積層されている。ここで用いることができる高分子担体としては、電荷を有すること、ポリマーであること及び水溶性であることのいずれか１種、好ましくは全ての性質を満足するものが適当である。電荷は正及び負のいずれでもよい。高分子担体は、例えば、各種タンパク質（例えば、酵素、抗体、レセプタータンパク等）、ポリペプチド（例えば、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等）、水溶性合成高分子化合物（例えば、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレンスルホン酸、ポリジメチルジアリルアンモニウムクロライド等）、天然高分子（アルギン酸及びその塩類、トラガントガム等）が挙げられる。

メディエータ等を高分子担体とともに積層する方法としては、特に限定されるものではなく、メディエータ等を高分子担体に分散、あるいは高分子担体とともに適当溶媒（水、緩衝液、水溶性有機溶媒等）に溶解又は分散し、塗布、乾燥する方法でもよいし、交互積層法を利用してもよい。

メディエータ、酵素層及び補酵素の少なくとも１種、好ましくはすべてを積層する交互積層法（ここでは、各層を順次積層する方法）は、例えば、以下のように行うことができる。
まず、導電体表面を活性化することにより、正又は負に帯電させる。次いで、メディエータを構成する分子、あるいはメディエータを分散／メディエータと結合した高分子担体を負又は正に帯電させ、これを導電体表面に接触させることにより、正と負との電荷の間の相互作用を通してメディエータを導電体表面に積層する。なお、このような１回の正負の相互作用によって、必要なメディエータ量を確保することができれば、上述のような積層は１層のみでよいが、さらに多量のメディエータを導電体表面に積層したい場合は、上述の相互作用を複数回行うことによって、メディエータ層を複数層、例えば、２〜２０層程度積層してもよい。この場合、積層されたメディエータ上に、これと反対の電荷を有する担体（例えば、上述した高分子担体）又はメディエータ等を積層し、再度、メディエータを構成する分子等を、この高分子担体等の上に積層するという一連の操作を繰り返すことによって、多数層のメディエータの積層を実現することができる。

酵素層及び補酵素も、メディエータと同様に単層又は積層層として、交互積層法によって形成することができる。なお、酵素層及び補酵素も、電荷が反対の２種以上のものを用いて、担体とともに又は担体を用いることなく、多数層を積層してもよい。

また、本発明の電極では、測定対象となる酵素の活性を測定するために、（１）さらに補酵素層の表面又は補酵素に接触するように、該補酵素の依存型酵素層、つまり活性の測定対象となる酵素が積層されていてもよいし、（２）本発明の電極に接触するように、この電極とは別個に測定対象となる酵素が配置されていてもよい。（１）の場合には、メディエータ等と同様の積層法を利用して積層することができ、同様に、交互積層法によって形成することが好ましい。なお、（１）の場合には、補酵素等とともに積層されていてもよい。このように、測定対象となる酵素が導電体上に積層されていることにより、例えば、酵素が基質とともに溶液によって供給されるのに比較して、測定対象の酵素の反応に起因して発生する電流値が十分に高い出力として得ることができ、より測定感度が良好となり、測定誤差を低減することが可能になるという利点がある。（２）の場合には、例えば、測定対象となる酵素を、好ましくは基質の存在下において、溶液状、懸濁又は分散された液状で、電極に接触させてもよい。なお、（２）の場合には、補酵素と測定対象となる酵素とが含有された液状であってもよい。測定対象となる酵素としては、特に限定されるものではないが、補酵素依存型又補因子依存型（本願明細書においては「補依存型」と総称する）酵素、例えば、デヒドロゲナーゼ、シトクロム、カタラーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、脂肪酸不飽和化酵素等の酸化還元酵素、特にＮＡＤ系依存型デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。

本発明においては、単に補酵素に１種又は２種以上のＤＮＡ断片が結合しているのみでもよい。また、補酵素とこれを構成する補酵素の依存型酵素との間に１種又は２種以上のＤＮＡ断片が介在していてもよい。ＤＮＡ断片としては、（１）ＤＮＡプローブ、ＤＮＡチップとも呼称されるような、ＤＮＡの相補性を利用して、検出及び／又は定量目的のＤＮＡ（以下「ターゲットＤＮＡ」と記す）と対合させるためのキャプチャープローブ、（２）ターゲットＤＮＡ、（３）ＤＮＡの相補性を利用して、ターゲットＤＮＡと対合して、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量するために、補酵素の依存型酵素が標識されたレポータプローブ等が挙げられる。なかでも、キャプチャープローブ、ターゲットＤＮＡ、レポータプローブがこの順に補酵素に結合されていることが好ましい。つまり、いわゆるターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを行わせ、これを本発明の電極に結合させて、メディエータを介する間接的な電子授受を、例えば、電流値として測定することによって、補酵素依存型酵素の酵素活性や、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。

なお、ＤＡＮ断片を用いる方法、つまりＤＮＡプローブ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション自体は当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。つまり、補酵素と補酵素依存型酵素との間にＤＮＡ断片を介在させる方法、補酵素にＤＮＡ断片を結合させる方法としては、上述したように導電体上にメディエータ、酵素層及び補酵素層が積層された電極上に、ＤＮＡ断片を結合させ、任意に補酵素依存型酵素層を結合させてもよいし、ＤＮＡ断片と補酵素依存型酵素とを結合させた後、これを電極上に積層させてもよい。また、補酵素が液状で酵素層に接触されている場合には、酵素層にＤＮＡ断片が結合していてもよい。この際に利用するＤＮＡ断片は、市販されているいずれを用いてもよい。例えば、サルモネラのプローブ（Rahn K., S. A. De Grandis, R. C. Clarke, S. A. McEwen, J. E. Galan, C. Ginocchio, R. Curtiss and C.L. Gyles, Mol. Cell. Probes, 6, 271-279 (1992)参照）、タカラバイオケミカルス、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）invE遺伝子検出用Primer Set INV-1& 2、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）ipaH遺伝子検出用Primer Set IPA-1& 2、コレラ毒素遺伝子検出用Primer Set VCT-1 & 2（いずれも（株）島津製作所製）等が挙げられる。なお、電極上にプローブを固定する方法としては、当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。例えば、電極上にストレプトアビジンを積層し、キャプチャープローブの５’末端をビオチン修飾し、アビジン−ビオチンの相互作用により固定する方法又はこれに準じた方法が挙げられる。

本発明の電極は、通常、対電極と、これらの電極及び対電極とを収容し、液体、好ましくは測定対象の酵素の基質を含有する溶液を収容することができる反応器内に配置され、さらにこの反応器内に、両電極がほぼ完全に浸漬する程度に溶液で充填されたバイオセンサにおいて、利用されることが適当である。このようなバイオセンサにおいては、サイクリックボルタンメトリを利用することによって、例えば、両電極に所定の電位差を有する定電位を与え、測定対象の酵素の反応に起因して発生する電流値を、例えば、限界酸化電流値として測定して、測定対象の酵素の活性を判定することができる。電流値の検出は、例えば、ポテンショスタット、電流計等の電流検出部によって行うことができる。

また、本発明のタンパク測定装置は、上述したようなバイオセンサを備えるものであり、酵素、基質等の種々のタンパクの定量及び／又は定性、さらには分析等、また、ペプチドや後述する実施例によるＤＮＡ、ＲＮＡ等の測定等、広範囲な対象物質の測定が可能であり、遺伝子検査にも利用することができる。

以下に、本発明の電極、バイオリアクタ及び酵素活性測定方法の実施例を、図面に基づいて具体的に説明する。

（導電体）
まず、電極を構成する導電体として直径１．６ｍｍの円柱状のカーボン電極を準備した。
カーボン電極を、０．１Ｍ硫酸に１時間浸漬し、洗浄、１０％硝酸溶液中２．５％Ｋ₂Ｃｒ₂Ｏ₇に浸漬し、１０秒間、＋１．２Ｖの電位をかけて電解酸化した。これにより、カーボン電極表面の炭素を酸化するとともに、カルボキシル基を導入し、カーボン電極表面に負の電荷を導入した。

（メディエータ）
メディエータとしてＦｃ−ＣＯＯＨ（フェロセン−ＣＯＯＨ）８ｍｇ（３５μｍｏｌ）を５ｍｌのメタノールに溶解し、ペプチド合成試薬であるＣＤＩ（1,1'-Carbonyldiimidazole）１７ｍｇ（１０５μｍｏｌ）をこれに添加し、室温で１時間攪拌してＦｃ−ＣＯＯＨのカルボキシル基を活性化させた。これに、１０％（ｗ／Ｖ）に希釈したＰＥＩ（ポリエチレンイミン）１５ｍｌ（ｐＨ７．０）を添加した。１時間攪拌して反応させ、約１２時間蒸留水で透析することにより、未反応のＦｃ−ＣＯＯＨを除去した。
上述したようにして得られた、正の電荷をもったＰＥＩ−Ｆｃ水溶液１ｍｇ／ｍｌに、上述したようにして得られたカーボン電極を２０分間浸漬し、超純水で洗浄した。
その後、カーボン電極を、アルギン酸ナトリウム（Ａｌｇ−Ｎａ）水溶液５ｍｇ／ｍｌ中に浸漬した。
このように、浸漬及び洗浄を繰り返すことにより、カーボン電極表面に、（ＰＥＩ−Ｆｃ／Ａｌｇ−Ｎａ）層を２層積層した。

（酵素）
１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ及び１ｍｇ／ｍｌグルタチオンリダクターゼ（ＧＲ）を用いて、上述と同様の交互積層法により、得られたカーボン電極表面に、（ＰＥＩ／ＧＲ）層を１０層積層した。

（補酵素層：アルギン酸ナトリウム−ＮＡＤ層）
アルギン酸ナトリウム１８０ｍｇ（−ＣＯＯＨとして９２９．３３μｍｏｌ）を蒸留水に溶解し、これに、ペプチド合成試薬である水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide HCl）１７８ｍｇ（９２９．３３μｍｏｌ）を添加し、ｐＨ４．５〜４．７に調整して１時間攪拌することによりアルギン酸のカルボキシル基を活性化させた。約１２時間、室温にて、蒸留水で透析し、未反応のＥＤＣを除去した。その後、ＮＡＤＰ⁺を７７８ｍｇ（９２９．３３μｍｏｌ）添加し、１時間攪拌しながら反応させた。このとき、各試薬のモル比は、Ａｌｇ−Ｎａ（−ＣＯＯＨ）：ＥＤＣ：ＮＡＤＰ⁺＝１：１：１とした。
反応終了後、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ＭのＮａＣｌ水溶液、蒸留水で順次透析し、凍結乾燥を行った。これを用いて、上述と同様の交互積層法を行い、得られたカーボン電極表面に補酵素層を２層積層した。

（補酵素依存型酵素層）
まず、２％（ｗ／ｖ）に希釈したＰＥＩ水溶液（ｐＨ７．０）５ｍｌに、ＮＡＤＰ⁺８３ｍｇ（８５μｍｏｌ）を添加し、４℃で１時間攪拌し、２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析することにより、ＰＥＩ−ＮＡＤＰ⁺を得た。このＰＥＩ−ＮＡＤＰ⁺溶液３９００μｌに、０．２ｍｇ／ｍｌのＧ６ＰＤＨ（グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ）を１００μｌ添加し、攪拌し、４℃で一晩静置することにより、補酵素及びこの補酵素の依存型酵素の複合酵素溶液を得た。
このようにして得られた複合酵素溶液に、得られたカーボン電極を浸漬し、超純水で洗浄した。

その後、カーボン電極を、アルギン酸ナトリウム（Ａｌｇ−Ｎａ）水溶液５ｍｇ／ｍｌ中に浸漬した。
このように、浸漬及び洗浄を繰り返すことにより、カーボン電極表面に、（複合酵素／アルギン酸ナトリウム）を、交互積層法にて、２層積層した。

このようにして得られた電極は、図１に示したように、補酵素依存型酵素１６であるＧ６ＰＤＨが基質であるグルコース６リン酸１５と反応して６ＰＧ（６-ホスホグルコン酸）１７を生成する際に酸化型補酵素１４であるＮＡＤＰ⁺が水素を受け取ることで還元型酵素ＮＡＤＰＨに変換される。このＮＡＤＰＨが、酵素１３であるＧＲの酵素反応によって水素を移動させて、これによって生じた電子の授受をメディエータ１２を介してカーボン電極１１に伝達させることができる。

この電極を用いて、図２に示すように、バイオセンサ８を備えるタンパク測定装置（図示せず）を構成した。
このバイオセンサ８は、反応器５内に、リード１ａに接続された電極１と、同じくリード４ａに接続された対電極４と、参照電極としてリード２ａに接続された電極２とを収容するとともに、電解液３として、Ｇ６ＰＤＨの基質であるＧ６Ｐ（グルコース６リン酸）を４１６ｍｇ／ｍｌ含有したトリス緩衝液３．０ｍｌを収容し、さらに、その電極１と対電極４との間にセパレータ６を装備して構成される。また、リード１ａには、電極１において発生した電流値を測定するための電流検出部として電流計７が接続されている。

このようなバイオセンサ８の電極１に、電極２を基準として+５００ｍＶの電位を印加することにより、電解液５中の基質と酵素及び補酵素等が反応し、メディエータを介して電子の授受が行われ、電極１に流れる電流を限界酸化電流として、電流計７によって測定することができる。

上記タンパク測定装置において、基質としてＧ６Ｐを０〜０．１６ｍＭ添加し、電位を印加して得られた結果を図３に示す。
図３によれば、基質濃度の増加とともに直線的に電極に流れる電流が増大しており、補酵素が失活することなく、酵素反応が良好に行われていることがわかる。これにより、酵素活性を精度よく、高感度に測定できることが確認できた。

実施例１と同様に、図４に示すように、カーボン電極１１上にメディエータ１２を介して酵素１３としてジアホラーゼ（ＤＩ）を層状に積層した。この酵素１３の表面に、ターゲットＤＮＡ２８ｂと相補的にハイブリダイズするキャプチャープローブ２８ａを固定した。

ＴＥバッファ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に、ターゲットＤＮＡ２８ｂ（サルモネラのプローブ：Rahn K., S. A. De Grandis, R. C. Clarke, S. A. McEwen, J. E. Galan, C. Ginocchio, R. Curtiss and C.L. Gyles, Mol. Cell. Probes, 6, 271-279 (1992)参照）を添加し、サーマルサイクラーにて９６℃、３０秒間で、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させた。このターゲットＤＮＡ２８ｂを、補酵素依存型酵素１６であるＧ６ＰＤＨの耐熱温度である７２℃まで冷却し、キャプチャープローブ２８ａを固定した電極を挿入し、さらに、ここに、レポータプローブ２８ｃを添加した。なお、レポータプローブ２８ｃには、補酵素依存型酵素２６であるＧ６ＰＤＨが結合しているものを用いた。
これを、５６℃まで冷却し、３０秒間温度を保持しながら、キャプチャープローブ２８ａ、一本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃをアニールさせることにより、本発明の電極を得た。なお、得られた電極には、ターゲットＤＮＡ２８ｂが９．０５×１０^-12モル、キャプチャープローブ２８ａが０．６０×１０^-9モル、レポータプローブ２８ｃが０．８３×１０^-9モルで結合している。

このような電極を用いて、上述した図２に示すバイオセンサを含むタンパク測定装置を構成し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)溶液中、０．４ｍＭのＮＡＤ⁺と０．６ｍＭのＧ６Ｐとを含有する溶液を反応器中に充填した。

実施例１と同様に電極に電圧を印加することにより、反応１０分後のＣＶ特性を測定した。その結果を、図５における曲線Ａに示す。なお、図５においては、比較例として、補酵素と基質とを含有しないトリス塩酸緩衝溶液を用いてＣＶ特性を測定した結果を併せて示す（曲線Ｂ参照）。
図５によれば、電解質溶液のみを用い、酵素反応が起こらない場合であっても、ベースとなる電流が発生するのに対して、上記実施例の電極においては、酵素反応が起こった場合の酸化還元反応の電子の移動を、ベース電流に比較してより大きな値として測定することができる。よって、より高感度で、精度よく、ＤＮＡの検出を行うことが確認できた。

このように、酵素反応に基づく酵素−電極間の電子伝達をモニタする、つまり、Ｇ６ＰＤＨから始まる一連の電子移動を電流として捕らえることにより、ターゲットＤＮＡの有無又は濃度を検知することができる。遺伝子工学的手法と電気化学的手法とを組み合わせた新規なＤＮＡバイオセンシングシステムを実現することができる。

言い換えると、ターゲットＤＮＡを捕捉するキャプチャープローブ及びキャプチャーしたターゲットＤＮＡにさらに結合し、信号を得るためのレポータプローブを用いるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて、レポータプローブに予め脱水素酵素を結合させておくことにより、本発明の酵素活性の測定方法を利用したＤＮＡプローブアッセイが可能となる。

本発明の電極、バイオセンサを備えるタンパク測定装置及び酵素活性の測定方法は、医療分野及び食品分野のほか、環境計測用などの幅広い分野で、溶液及び気体等の種々の測定対象試料に対して利用することができる。

本発明の電極の実施の形態を示す概略模式図である。 本発明の電極を用いたバイオセンサを示す概略断面図である。 本発明の電極を用いて電子の授受を測定したグラフである。 本発明の電極をＤＮＡの検出に用いる実施の形態を示す概略模式図である。 本発明の電極を用いてＤＮＡ断片を介して電子の授受を測定したグラフである。

符号の説明

１ 電極（導電体）
１ａ、２ａ、４ａ リード
２ 電極
３ 電解液
４ 対電極
５ 反応器
６ セパレータ
７ 電流計
８ バイオセンサ
１１ カーボン電極（導電体）
１２ メディエータ
１３ 酵素
１４ 補酵素
１５ Ｇ６Ｐ
１６、２６ 補酵素依存型酵素
１７ ６ＰＧ
２８ａ キャプチャープローブ
２８ｂ ターゲットＤＮＡ２８ｂ
２８ｃ レポータプローブ２８ｃ

Claims (11)

1. 導電体表面に、電子を授受し得るメディエータを介して酵素層が積層され、該酵素層に補酵素が接触するように構成されてなり、前記酵素層が、前記メディエータの電子の授受及び前記補酵素の酸化還元反応に作用するものであることを特徴とする補酵素依存型酵素の活性測定用電極。
2. さらに、補酵素の依存型酵素が、前記補酵素に接触するように配置されてなる請求項１に記載の電極。
3. メディエータ、酵素層、補酵素及び／又は補酵素の依存型酵素が、高分子担体とともに積層されてなる請求項１又は２に記載の電極。
4. メディエータ、酵素層、補酵素及び／又は補酵素の依存型酵素が、交互積層法によって積層されてなる請求項１〜３のいずれか１つに記載の電極。
5. 補酵素に、１種又は２種以上のＤＮＡ断片が結合してなる請求項１〜４のいずれか１つに記載の電極。
6. 補酵素に、該補酵素の依存型酵素が接触されてなり、前記補酵素と該補酵素の依存型酵素との間に１種又は２種以上のＤＮＡ断片が介在してなる請求項１、３〜５のいずれか１つに記載の電極。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の電極を有し、さらに対電極と、これら電極及び対電極とが収容され、液体を充填し得る反応器とによって構成されるバイオセンサを備えるタンパク測定装置。
8. さらに、バイオセンサから発せられる電流値を検出するための電流検出部を備えてなる請求項７に記載のタンパク測定装置。
9. 請求項５に記載の電極に、ＤＮＡ断片に結合するターゲットＤＮＡ、さらに該ターゲットＤＮＡに結合し得る、補酵素依存型酵素が標識されたＤＮＡ断片を反応させ、前記電極によって、バイオセンサから発せられる電流値を検出することを特徴とする酵素活性の測定方法。
10. 請求項７又は８に記載されたタンパク測定装置を用いて、補酵素依存型酵素の活性を測定することからなる酵素活性の測定方法。
11. ＤＮＡの検出及び／又は定量に用いる請求項９に記載の酵素活性の測定方法。
    
    
    

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