WO2020262136A1 - メタン生成補酵素を用いた電気化学的バイオガス生産システム - Google Patents

メタン生成補酵素を用いた電気化学的バイオガス生産システム Download PDF

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雅紀 金子
清也 辻村
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Definitions

  • the present invention relates to a new biogas production system that does not require the use of microorganisms, which is different from the conventional production system of biogas generated from biomass, which is a kind of renewable energy.
  • the biomethane produced by this microorganism is the biosynthesis of methane by a methanogen, which is carried out via the methyl coenzyme M reductase.
  • Methan is produced in cells (in vivo) by a series of seven reactions, and the substrate for methanogenesis is not only carbon dioxide but also various C1 and C2 compounds such as methanol, methylamine, formic acid, and acetic acid. Can be.
  • the reaction of the last step of a series of reactions when using any of the substrates are common, it is a compound containing a methyl coenzyme M (CoM): Methyl from (CH 3 -S-CoM methyl SCOM)
  • CoM methyl coenzyme M
  • This is a reaction in which a group is eliminated to produce methane. It has already been clarified that the methyl coenzyme M reductase catalyzes this reaction, and the catalytic site of the enzyme is the methane-producing coenzyme F430 (see Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Non-Patent Document 1 describes CH 3 -S-, CH 3- O-, in vitro using an F430M derivative in which a methane-producing coenzyme F430 from a methanogen is activated by pentamethyl esterification modification. It was described that an experiment was conducted to see if methyl compounds such as CH 3 -halogen could be converted to methane. As a result, although some methyl compounds such as methane iodide were successfully methaneized, the original intracellular methyl coenzyme It has been reported that CH 3- S-CoM and dimethyl sulfide (DMS), which are substrates of M reductase, could not be methanized.
  • DMS dimethyl sulfide
  • Non-Patent Document 2 the electrode responsiveness of the pentamethyl esterified F430 was examined in an organic solvent
  • Non-Patent Document 3 the electrode responsiveness of the unmodified heat-extracted F430 in an organic solvent was investigated. Are reported respectively.
  • Non-Patent Document 4 Butane is produced from butyl SCoM by the methyl coenzyme M reductase, and it is suggested that the same is true for other short chain alkanes.
  • Biogas production using microorganisms has a problem that it is difficult to maintain the activity of methane bacteria.
  • An object to be solved by the present invention is to provide a method for producing biogas without using methane bacteria.
  • Another object of the present invention is to provide a regeneration method for electrochemically maintaining and controlling the active state of the methanogenic coenzyme F430 that catalyzes methanogenesis by an electrode reaction.
  • an object of the present invention is a sustainable reaction system that does not require a reducing agent by electrochemically maintaining and controlling the active state of the methanogenic coenzyme F430 in a biogas production method that does not use methanogens. It is to provide a biogas production system consisting of.
  • the present inventors When isolating the methanogenic coenzyme F430 from the methyl coenzyme M reductase, the present inventors isolated and stored the methanogenic coenzyme F430 under low temperature conditions to prevent oxidation without modification such as esterification. We succeeded in obtaining a stable native F430 sample. Then, by using the isolated unmodified F430, the original CH 3 -S-CoM other methyl compound is a substrate for the enzyme, yet is able to reduce the alkyl compound other than methyl as a substrate, methane The present invention has been completed by finding that a hydrocarbon gas containing the above can be produced.
  • the reduction reaction of the alkyl compound by the coenzyme F430 requires a reducing agent for reducing the coenzyme F430, but even if a reducing agent is not used, the central metal Ni (divalent) of F430 in the solution is required.
  • the central metal Ni (divalent) of F430 in the solution was found to be able to be electrochemically reduced to Ni (monovalent) by an electrode reaction.
  • the present invention has been completed by constructing a sustainable production system in hydrocarbon gas production.
  • the present invention relates to the following methods (1) to (4) for producing a hydrocarbon gas having 1 to 4 carbon atoms.
  • (2) The alkyl compound having 1 to 4 carbon atoms is RSA, ROA, or R-halogen, and R is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. ).
  • the method for producing a hydrocarbon gas is RSA, ROA, or R-halogen.
  • the present invention comprises the following methods (5) to (8) for reducing and activating the oxidized methanogenic coenzyme F430, or (9) the methanogenic coenzyme activity of the methanogenic coenzyme F430. Regarding how to maintain. (5) Oxidation by electrochemically reducing the central metal Ni (divalent) of unmodified methane-producing coenzyme F430 in the solution to Ni (monovalent) by an electrode reaction in the absence of a reducing agent. A method for reducing and activating the produced methane-producing coenzyme F430.
  • the oxidized electrochemical reactor according to (5) above which comprises a working electrode as a cathode and an anode as a counter electrode in the solution, and uses a closed electrochemical reactor in which the cathode and the anode are connected to a power supply source.
  • the present invention relates to the following (10) hydrocarbon gas production method or (11) hydrocarbon gas production apparatus.
  • (10) In the absence of a reducing agent, an unmodified methane-producing coenzyme F430 as a catalyst, an alkyl compound having 1 to 4 carbon atoms as a substrate, and an electrode are present in the solution to generate a methane-producing coenzyme.
  • the catalytic reaction vessel is provided with an action electrode and an anode which are cathodes connected to a power supply source, and the methane-producing coenzyme F430 after the catalytic reaction is electrochemically reduced and regenerated. Hydrocarbon gas production equipment.
  • the method for producing a hydrocarbon gas having 1 to 4 carbon atoms of the present invention maintenance of the equipment is not required because a large-scale facility using microorganisms and biomass by a methane fermenter in the conventional biogas production is not required.
  • the cost of management is low, and biogas can be produced at low cost.
  • an alkyl compound that cannot be used as a substrate by the in vivo methanogenic coenzyme F430 can be used as a substrate, hydrocarbons other than methane can be easily produced by a one-step catalytic reaction.
  • the methane-producing coenzyme F430 oxidized by the catalytic reaction can be electrochemically reduced, activated and regenerated by the electrode reaction without using a reducing agent, so that the substrate can be simply added to the catalytic reaction vessel. It provides an innovative biogas production system in a small facility consisting of a clean reaction system that does not require a reducing agent, which enables sustainable production of hydrocarbon gas.
  • the results of chemical methanogenesis experiments from three different substrates by the unmodified methanogenic coenzyme F430 are shown.
  • a schematic diagram of the reaction mode of electrochemical methane production using the methanogenic coenzyme F430 is shown.
  • the results of the electrochemical methanogenesis experiment are shown.
  • the results of a chemical hydrocarbon gas production experiment from three different substrates having 2 to 4 carbon atoms are shown using an electrode-mediator-methanogenic coenzyme F430-substrate interaction system.
  • the present invention in the final stage of methane biosynthesis by methanogenic bacteria archaea, methyl coenzyme M (CoM) compounds containing: methane apart (CH 3 -S-CoM methyl SCOM) methyl group from the de From the methyl coenzyme M reductase that catalyzes the resulting reaction, the methane-producing coenzyme F430, which is the catalytic site of the enzyme, was developed and completed based on the fact that it could be isolated and purified while maintaining the chemical structure. is there.
  • the chemical structure of the methanogenic coenzyme F430 (hereinafter, also referred to as "coenzyme F430") is the nickel-containing modified tetrapyrrole represented by the formula (1), which is the most reduced tetrapyrrole having only five double bonds. Has a structure.
  • the reaction catalyzed by the coenzyme F430 in the methanogen is the methyl coenzyme M reduction reaction, which produces methane by the reaction of the following formula (2).
  • the present inventors simply prepared an unmodified coenzyme F430 standard product that maintained its chemical structure. It was able to be depurified.
  • the unmodified coenzyme F430 means a native coenzyme F430 whose terminal group is not modified.
  • the unmodified coenzyme F430 can be isolated and purified from all known methanogens.
  • the methanogen is ultrasonically crushed on an ice bath in an aqueous solution, and the extract is centrifuged to recover the supernatant. Pass the supernatant liquid through a Q-sepharose fast flow (GE healthcare) column, collect all the filtrate, and then pass this filtrate through a C18 solid-phase extraction column (manufactured by Sep-pack Water) to adsorb components. Is recovered with methanol to obtain a coenzyme F430 fraction. The coenzyme F430 fraction is evaporated to dryness until HPLC work and stored at ⁇ 20 ° C.
  • GE healthcare Q-sepharose fast flow
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the first stage HPLC is performed by gradient analysis using Chromolith SemiPrep RP-18e and the coenzyme F430 is isolated using a fraction collector.
  • the second stage HPLC is performed by gradient analysis using HYPERCARB 5 ⁇ m and the coenzyme F430 is isolated using a fraction collector.
  • the diluted isolated solution is passed through an HLB solid-phase extraction column, and the adsorbed component is recovered with methanol.
  • the recovered solution is dried by an evaporator to obtain a purified product of coenzyme F430.
  • the purified coenzyme F430 is stored at ⁇ 20 ° C.
  • coenzyme F430 purified product as a catalyst
  • F430, a substrate candidate, and a reducing agent were added to a buffer solution and reacted at room temperature to search for a substrate that could be reduced by coenzyme F430 to produce hydrocarbon gas.
  • an alkyl compound selected from RSA, ROA, or R-halogen which has a similar reduction site structure to this substrate, can be reduced.
  • the substituent R is an alkyl group having 6 or less carbon atoms, preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, which is reduced by the coenzyme F430 and corresponds to a hydrocarbon having 1 to 6 carbon atoms. Gas is produced.
  • Hydrocarbon gas can be produced by reacting with various substrates.
  • substituent A any group can be used as long as it is an inorganic or organic substituent that does not cause steric damage and the coenzyme F430 can act as a substrate, and metal, halogen, methyl coenzyme M (CoM), and carbon number of carbons can be used.
  • metal, halogen, methyl coenzyme M (CoM), and carbon number of carbons can be used.
  • Examples thereof include aromatic groups, benzoic acid groups, and sulfonium groups, such as 1 to 20 preferably 1 to 10 lower or higher chain alkyl groups and cyclic alkyl groups.
  • Halogen is fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • reaction with coenzyme F430 is carried out under anaerobic conditions.
  • "Aerobic" means a sealed reaction vessel having a liquid or gas maintained in an atmosphere with an oxygen concentration of less than about 1%, and the reaction solution is bubbled with an inert gas such as nitrogen or argon to dissolve oxygen. Is usually achieved by degassing and replacing the upper space of the reaction vessel with an inert gas.
  • an alkyl compound substrate, an equal amount of reducing agent and a coenzyme F430 were added to the buffer solution of the closed reaction vessel, the upper space of the vessel was replaced with an inert gas, and the temperature at room temperature was about 1 hour to 2 Hydrocarbon gas can be produced by daily reaction.
  • the reactivity is pH-dependent, requires alkaline conditions of pH 8 or higher, and reaches a maximum near pH 10.
  • a general-purpose buffer solution such as Tris, Tris / glycine, Ches, Caps and the like can be used.
  • a reducing agent for example, a general-purpose reducing agent such as titanium citrate or dithionate can be used.
  • CH 3- S-CoM is reduced by the action of coenzyme F430 to generate methane gas, and the biological reaction can be reproduced.
  • Methanogenesis using the coenzyme F430 in the presence of a reducing agent is referred to herein as chemical methanogenesis, as opposed to electrochemical methanogenesis below.
  • DMS in which A of RSA is an alkyl group and R-halogen in which halogen is I can be reduced, and not only methane gas can be produced, but also an ethyl compound in which R is an ethyl group is used as a substrate. Therefore, a new function of coenzyme F430 that can produce ethane gas was found.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the reaction mode of electrochemical methanogenesis using this coenzyme F430.
  • An electron carrier may be used as shown in FIG. 2, and for example, methyl viologen (MV), which is a viologen dye, is used.
  • MV methyl viologen
  • aquinone dye, triphenylmethane dye, phthalocyanines, methine dye, pyrrole dye, porphyrin derivative and the like can be used, but the viologen dyes methylviologen and benzylviologen are preferable.
  • the electrons e derived from the current source are transferred to the electron carrier MV, and the electron carrier gives the electrons to the oxidized coenzyme F430 to reduce the coenzyme F430.
  • the reduced coenzyme F430 reduces the substrate CH 3- S—CoM and the like, and thus electrochemically produces methane gas.
  • a cathode as a working electrode and an anode as a counter electrode are inserted into the buffer solution.
  • a metal such as copper, iron, nickel, mercury, or steel, carbon, or graphite is used for the cathode, and platinum, graphite, or titanium is used for the anode.
  • the buffer as a control case of adding only the electronic carrier MV, the case of adding three parties CH 3 -S-CoM of MV and coenzyme F430 and substrate simultaneously select two parties of the tripartite Cyclic voltammetry was performed at a scan rate of 10 mV / s, and as a result, the reaction of FIG. 2 proceeded and a current flowed only when the three were added at the same time as shown in FIG. From this, it was shown that Ni of the oxidized coenzyme F430 can be activated by electrochemically reducing it by an electrode reaction.
  • the process of electrochemically reducing the central metal Ni (divalent) of the coenzyme F430 to Ni (monovalent) in the reaction vessel and the coenzyme A new electrochemical reactor system for hydrocarbon gas production was constructed by combining a hydrocarbon gas production reaction by reducing an alkyl compound with F430.
  • the coenzyme F430 and the substrate are added to the buffer solution in the closed container, and the inserted electrode is energized.
  • the pH of the solution is 6-12, preferably 8-11, more preferably pH 10.
  • the cathode voltage is -0.1 to -1.5 V with respect to the standard hydrogen electrode.
  • the C18 solid-phase extraction column (manufactured by Sep-pack Water) was washed with methanol, conditioned with 1% formic acid, the above-mentioned filtrate was passed through the solid-phase extraction column, the adsorbed component was recovered with methanol, and the coenzyme was collected. It was set to F430 fraction. The coenzyme F430 fraction was dried on an evaporator until HPLC work and stored at ⁇ 20 ° C.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a diluted isolated solution is passed through a C18 solid-phase extraction column that has been washed with methanol and conditioned with mobile phase A, and the adsorbed component is washed with 250 mL of ion-exchanged water and then recovered with methanol.
  • the recovered solution was dried on an evaporator and stored at ⁇ 20 ° C. until the second stage HPLC analysis.
  • the second stage HPLC was performed by gradient analysis using HYPERCARB 5 ⁇ m (100 mm ⁇ 9.5 mm).
  • Mobile phase A HClO 4 / H 2 O (pH 1)
  • mobile phase B acetonitrile
  • gradient conditions 1 mL / min, 0% B at 0 min, 30% B by 3 min, 53% B by 70 min.
  • Coenzyme F430 was isolated using a fraction collector. The isolated solution was diluted about 5-fold with mobile phase A and then desalted by the following method.
  • the diluted isolated solution was passed through an HLB solid-phase extraction column that had been washed with methanol and conditioned with mobile phase A, and the adsorbed component was washed with 250 mL of ion-exchanged water and then recovered with methanol.
  • the recovered solution was dried by an evaporator to obtain a purified product of coenzyme F430.
  • the purified coenzyme F430 was stored at ⁇ 20 ° C.
  • coenzyme F430 acts on all three substrates.
  • methanogens living organisms
  • coenzyme F430 which reduces methyl groups using a compound containing methyl coenzyme M (CoM) (CH 3- S-CoM: methyl SCoM) as a substrate, provides the original substrate in vitro. It was shown for the first time that it could be reduced. Furthermore, it was found that an alkyl compound having a structure similar to that of the original substrate can be used as the substrate.
  • the yield of methane gas was higher when a substrate other than the original substrate was used, and that ethylene was produced by oxidative polymerization of methane.
  • Table 1 shows each component added to the five types of solutions used in the measurement and their concentrations. After degassing the dissolved oxygen by bubbling argon gas in the reaction solution for 15 minutes, the starting potential is -0.3V (vs. Ag
  • Electrochemical methanogenesis was performed using a closed cell as follows. A working electrode was obtained by sewing a carbon cloth cut into a rectangle of 10 ⁇ 20 mm to the tip of a titanium wire. A platinum wire was used as the counter electrode, and an Ag
  • Mediator methyl viologen (MV), coenzyme F430, and substrate CH 3- S-CoM were added at final concentrations of 0.1 mM, 0.5 mM, and 500 mM, respectively, and subjected to argon bubbling for 15 minutes to dissolve. After degassing oxygen, a potential of ⁇ 1.3 V was applied to initiate the reaction. The reaction was carried out with stirring with a stirrer. From the start of the reaction, the produced gas in the headspace was collected with a gas syringe and analyzed by gas chromatography.
  • Example 4 ⁇ Electrochemical hydrocarbon gas production experiment 2 by coenzyme F430> As in Example 4, a new electrochemical hydrocarbon gas production system was used that combined the electrochemical reduction of coenzyme F430 and the hydrocarbon gas production reaction by reduction of the alkyl compound by coenzyme F430. Electrochemical methane production was performed using a closed cell in the same manner as in Example 4. A working electrode was obtained by sewing a carbon cloth cut into a rectangle of 10 ⁇ 20 mm to the tip of a titanium wire. A platinum wire was used as the counter electrode, and an Ag
  • CAPS buffer 0.5 M, pH 10.4
  • Mediator methyl viologen (MV), coenzyme F430, and three substrates with 2 to 4 carbon atoms, C 2 H 5- S-CoM, C 3 H 7- S-CoM, C 4 H 9- S-ComM Add the final concentrations of 0.1 mM, 0.5 mM, and 500 mM, 500 mM, and 500 mM, respectively, and perform argon bubbling for 15 minutes to degas the dissolved oxygen, and then apply a potential of -1.1 V. It was applied and the reaction was started. The reaction was carried out with stirring with a stirrer. From the start of the reaction, the produced gas in the headspace was collected with a gas syringe and analyzed by gas chromatography.
  • the electrochemical reactor system of the present invention in a biogas production system using a conventional methane fermenter, a large-scale facility using microorganisms and biomass is required, so that other equipment such as maintaining the activity of microorganisms is required. It is expected that maintenance and management will cost a lot of money, all the drawbacks of not being able to produce biogas at low cost will be eliminated, and it will become an innovative biogas production system in small facilities.

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Abstract

還元剤が不要な持続可能な反応系からなる、アルキル化合物を基質として炭化水素ガスを製造するための電気化学的リアクターシステムを提供する。 溶液中のメタン生成補酵素Ｆ４３０の活性状態を、電極反応により電気化学的に維持しながら、補酵素Ｆ４３０によりアルキル化合物基質を還元して炭化水素ガスを生産できる電気化学的リアクターシステムであり、補酵素ＦＤ４３０に基質を添加するだけで持続可能なバイオガスの製造を可能とする。

Description

メタン生成補酵素を用いた電気化学的バイオガス生産システム
　本発明は、再生可能エネルギーの一種であるバイオマスから発生するバイオガスの従来の生産システムとは異なる、微生物を用いる必要のない新たなバイオガス生産システムに関する。
　持続可能な社会の実現のためには、安全で安定的なエネルギーの供給が不可欠であることから、再生可能エネルギーの利用拡大が期待されている。再生可能エネルギーの一種としてのメタン発酵システムにより、バイオマスから発生するバイオガスの需要も拡大している。このバイオガスは、約６０％のメタンと約４０％の二酸化炭素、その他に硫化水素やシロキサン等の微量不純物を含む。
　メタン発酵槽を用いる従来のバイオガス生産システムでは、微生物とバイオマスを使用する大規模な施設が必要なために、微生物の活性維持等その他の設備の維持、管理には多大なコストがかかり、バイオガスを安価に生産できないという欠点がある。
　この微生物が生産するバイオメタンとは、メタン生成菌によるメタンの生合成であり、メチル補酵素Ｍ還元酵素を介して行われる。
　細胞の中（生体内）でメタンは７つの一連の反応によって生成され、メタン生成の基質は、二酸化炭素だけではなくメタノール、メチルアミン、ギ酸、酢酸など多様なＣ１、Ｃ２化合物がメタン生成の基質となり得る。そして、いずれの基質を用いる場合も一連の反応の最後のステップの反応は共通しており、それが、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）を含む化合物（ＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭ：メチルＳＣｏＭ）からメチル基が脱離してメタンが生じる反応である。この反応を触媒するのが、メチル補酵素Ｍ還元酵素であり、その酵素の触媒部位がメタン生成補酵素Ｆ４３０であることが既に解明されている（非特許文献１～３参照）。
　非特許文献１には、メタン生成菌からのメタン生成補酵素Ｆ４３０を、ペンタメチルエステル化修飾して活性化したＦ４３０Ｍ誘導体を用いて、生体外でＣＨ３－Ｓ－、ＣＨ３－Ｏ－、ＣＨ３－ハロゲン等のメチル化合物をメタンに変換できるか実験したことが記載され、その結果、ヨウ化メタン等幾つかのメチル化合物のメタン化に成功したものの、細胞内での本来のメチル補酵素Ｍ還元酵素の基質であるＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭやジメチルスルフィド（ＤＭＳ）を、メタン化できなかったことが報告されている。
　また、非特許文献２には、ペンタメチルエステル化Ｆ４３０の電極応答性を有機溶媒中で調べたことが、非特許文献３には、未修飾の熱抽出Ｆ４３０の有機溶媒中での電極応答性について、それぞれ報告されている。
　最近、嫌気性古細菌におけるブタン酸化の代謝経路の第１ステップで、メタンに特異的であるとされていたメチル補酵素Ｍ還元酵素がブタンに作用することが報告されており（非特許文献４）、メチル補酵素Ｍ還元酵素により、ブチルＳＣｏＭからブタンが生成されること、および他の短鎖アルカンでも同様であることが示唆されている。
J.CHEM.SOC.,CHEM.COMMUN.(1988)P.293-294 J.AM.CHEM.SOC.(2003) Vol.125, No.43, p.13120-13125 Inorganica Chimica Acta (1990) Vol.170, p.161-163 Nature (2016) Vol.539, p.396-401
　微生物を用いたバイオガス生産では、メタン菌の活性維持が困難であるという課題がある。本発明の解決しようとする課題は、メタン菌を用いないバイオガスの生産方法を提供することである。
　また、本発明の課題の一つは、メタン生成を触媒するメタン生成補酵素Ｆ４３０の活性状態を、電極反応により電気化学的に維持、コントロールする再生方法を提供することである。
　さらに、本発明の課題は、メタン菌を用いないバイオガスの生産方法において、メタン生成補酵素Ｆ４３０の活性状態を電気化学的に維持、コントロールすることにより、還元剤が不要で持続可能な反応系からなるバイオガス生産システムを提供することである。
　本発明者らは、メチル補酵素Ｍ還元酵素から、メタン生成補酵素Ｆ４３０を単離するに際し、酸化を防ぐために低温条件下で単離し保存することにより、エステル化等の修飾をすることなく、安定的なネイティブＦ４３０標本を得ることに成功した。そして、この単離された未修飾Ｆ４３０を用いることにより、酵素の本来の基質であるＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭ以外のメチル化合物、さらにはメチル以外のアルキル化合物を基質として還元することができ、メタンを含む炭化水素ガスを生産できることを見出し、本発明を完成した。
　また、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元反応には、補酵素Ｆ４３０を還元するための還元剤を必要とするが、還元剤を使わなくても、溶液中のＦ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）を、電極反応により電気化学的にＮｉ（１価）に還元できることを見出した。そして、この２価のＮｉを有する酸化された補酵素Ｆ４３０を、電気化学的に還元して活性化するプロセスと、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元触媒反応による炭化水素ガス生産反応を組み合わせることにより、炭化水素ガス生産における持続可能な生産システムの構築に至り、本発明を完成させた。
　本発明は、以下の（１）ないし（４）の炭素数１～４の炭化水素ガスを生産する方法に関する。
（１）溶液中で炭素数が１～４のアルキル化合物を基質として、触媒として未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０を作用させて、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガスを生産する方法。
（２）前記炭素数が１～４のアルキル化合物が、Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－Ａ、またはＲ－ハロゲンであり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基である、上記（１）に記載の炭化水素ガスを生産する方法。
（３）前記アルキル化合物Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－ＡのＡが、立体障害を起こさない無機または有機置換基である、上記（２）に記載の炭化水素ガスを生産する方法。
（４）還元剤の存在下で行う、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の炭化水素ガスを製造する方法。
　また、本発明は、以下の（５）ないし（８）の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法、または（９）のメタン生成補酵素Ｆ４３０のメタン生成補酵素活性を維持する方法に関する。
（５）還元剤の非存在下、溶液中の未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）を、電極反応により電気化学的にＮｉ（１価）に還元することにより、酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（６）溶液中に陰極である作用電極と対電極である陽極とを備え、陰極および陽極を電力供給源に接続した密閉した電気化学的リアクターを用いる、上記（５）に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（７）前記酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０が触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０である、上記（５）または（６）に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（８）さらに電子運搬体を用いる、上記（５）または（６）に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（９）触媒反応後の酸化された不活性なメタン生成補酵素Ｆ４３０を、基質を含む触媒反応系中で電気化学的に還元して再生することを特徴とする、メタン生成補酵素Ｆ４３０のメタン生成補酵素活性を維持する方法。
　さらに、本発明は、以下の（１０）の炭化水素ガス製造方法、または（１１）の炭化水素ガス製造装置に関する。
（１０）還元剤の非存在下、溶液中に触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と、基質である炭素数が１～４のアルキル化合物と、電極とを存在させ、メタン生成補酵素Ｆ４３０の活性を電極反応により電気化学的に維持しながら触媒反応を行うことを特徴とする、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガス製造方法。
（１１）密閉した触媒反応容器内の溶液中に、触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と基質である炭素数が１～４のアルキル化合物を反応させて、炭化水素ガスを製造する装置において、前記触媒反応容器内に、電力供給源に接続した陰極である作用電極と陽極とを備えて、触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０を電気化学的に還元して再生することを特徴とする、炭化水素ガス製造装置。
　本発明の炭素数１～４の炭化水素ガスを製造する方法によれば、従来のバイオガス生産におけるメタン発酵槽による微生物とバイオマスを使用する大規模な施設が不要なために、設備の維持、管理にかかるコストが少なく、バイオガスを安価に生産することができる。
　また、生体内のメタン生成補酵素Ｆ４３０が基質にできないアルキル化合物を基質とできるため、メタン以外の炭化水素を、一段階の触媒反応により簡単に製造することができる。
　さらに、触媒反応により酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を、還元剤を用いることなく、電極反応により電気化学的に還元して活性化して再生できるため、触媒反応容器中に基質を添加するだけで、持続可能に炭化水素ガスを製造することができるという、還元剤が不要なクリーンな反応系からなる小規模施設での革新的なバイオガス生産システムを提供する。
未修飾メタン生成補酵素Ｆ４３０による、３種類の異なる基質からの化学的メタン生成実験結果を示す。 メタン生成補酵素Ｆ４３０を用いた電気化学的メタン生成の反応様式の概略図を示す。 電極－メディエーター－メタン生成補酵素Ｆ４３０－基質相互作用を示すサイクリックボルタンメトリーの結果。 電気化学的メタン生成実験結果を示す。 電極－メディエーター－メタン生成補酵素Ｆ４３０－基質相互作用の系を用いて、３種類の異なる炭素数２～４の基質からの化学的炭化水素ガス生成実験結果を示す。
　本発明は、古細菌のメタン生成菌によるメタンの生合成の最終段階において、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）を含む化合物（ＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭ：メチルＳＣｏＭ）からメチル基が脱離してメタンが生じる反応を触媒するメチル補酵素Ｍ還元酵素から、その酵素の触媒部位であるメタン生成補酵素Ｆ４３０を、化学構造を維持した状態で単離精製できたことに基づき、発展、完成させたものである。
　メタン生成補酵素Ｆ４３０（以下、「補酵素Ｆ４３０」ともいう。）の化学構造は、式（１）に示すニッケル含有修飾テトラピロールであり、二重結合が５つしかない最も還元されたテトラピロール構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　メタン生成菌中で補酵素Ｆ４３０が触媒する反応は、メチル補酵素Ｍ還元反応であり、下記式（２）の反応によりメタンを生成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明者らにより、メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｂａｒｋｅｒｉ由来のメチル補酵素Ｍ還元酵素から、補酵素Ｆ４３０を低温条件で単離し保存することにより、化学構造を維持した未修飾の補酵素Ｆ４３０標品を単離精製することができた。
　本明細書において未修飾の補酵素Ｆ４３０とは、末端の基が修飾されていないネイティブな補酵素Ｆ４３０を意味する。また、未修飾の補酵素Ｆ４３０は、既知の全てのメタン生成菌から単離精製することが可能である。
　未修飾の補酵素Ｆ４３０の単離精製は、まず、メタン生成菌を水溶液中氷浴上で超音波破砕を行い、抽出液を遠心分離して上澄み液を回収する。Ｑ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈ　ｃａｒｅ）カラムに上澄み液を通液し、濾液を全て回収し、次にこの濾液を、Ｃ１８固相抽出カラム（Ｓｅｐ－ｐａｃｋ　Ｗａｔｅｒ社製）に通液し、吸着成分をメタノールで回収し、補酵素Ｆ４３０画分とする。補酵素Ｆ４３０画分は、ＨＰＬＣ作業までエバポレーターで乾固し、－２０℃で保存する。
　補酵素Ｆ４３０画分からの補酵素Ｆ４３０の精製は、２段階の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行う。
　１段階目のＨＰＬＣは、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ　ＳｅｍｉＰｒｅｐ　ＲＰ－１８ｅを用いてグラジエント分析にて行い、補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離する。２段階目のＨＰＬＣは、ＨＹＰＥＲＣＡＲＢ　５μｍを用いてグラジエント分析にて行い、補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離する。
　脱塩のため、希釈した単離溶液をＨＬＢ固相抽出カラムに通液し、吸着成分をメタノールで回収する。回収した溶液はエバポレーターで乾固し、補酵素Ｆ４３０精製物とする。精製した補酵素Ｆ４３０は－２０℃で保存する。
　この補酵素Ｆ４３０精製物を触媒として使用し、緩衝液にＦ４３０と基質候補と還元剤を添加して室温で反応させ、補酵素Ｆ４３０により還元されて炭化水素ガスを生産できる基質を探索した結果、本来の基質であるＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭの他にも、この基質と還元部位の構造が類似するＲ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－Ａ、またはＲ－ハロゲンから選ばれるアルキル化合物を還元できることがわかった。ここで、置換基Ｒは、炭素数が６以下のアルキル基であり、好ましくは炭素数１～４のアルキル基であり、補酵素Ｆ４３０により還元され、対応する炭素数が１～６の炭化水素ガスが生産される。様々な基質と反応させて炭化水素ガスを生産できる。
　置換基Ａは、立体障害を起こさない無機または有機置換基であって補酵素Ｆ４３０が基質として作用可能であれば任意の基が使用でき、金属、ハロゲン、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）、炭素数が１～２０好ましくは１～１０の低級または高級鎖状アルキル基、環状アルキル基等、芳香族基、安息香酸基、スルホニウム基が例示される。
　ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素である。
　補酵素Ｆ４３０による反応は、嫌気性条件下で行われる。「嫌気性」とは、酸素の濃度が約１％未満の雰囲気に維持された液体または気体を有する密封反応容器を意味し、反応溶液を窒素やアルゴンなどの不活性ガスでバブリングして溶存酸素を脱気し、反応容器の上部空間を不活性ガスで置換することにより、通常達成される。
　この嫌気条件下、密閉反応容器の緩衝液中に、アルキル化合物基質と等量の還元剤と補酵素Ｆ４３０を加え、容器の上部空間を不活性ガスで置換して、室温で約１時間から２日反応させることにより、炭化水素ガスを生産することができる。反応性についてはｐＨ依存性があり、ｐＨ８以上のアルカリ条件が必要であり、ｐＨ１０付近で最大となる。
　緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ、Ｔｒｉｓ／ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｃｈｅｓ、Ｃａｐｓ等の汎用の緩衝液を用いることができる。
　アルキル化合物の還元反応を触媒すると、補酵素Ｆ４３０に含まれるＮｉが、１価から２価に酸化されて補酵素Ｆ４３０が不活性になるため、触媒反応系には還元剤の添加が必要となる。還元剤としては、例えば、クエン酸チタン、ジチオナイト等の汎用の還元剤を用いることができる。還元剤の存在下、補酵素Ｆ４３０の作用によりＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭが還元されてメタンガスが生成し、生体反応を再現することができる。還元剤の存在下で補酵素Ｆ４３０を用いるメタン生成を、下記の電気化学的メタン生成と対照的に、本明細書において化学的メタン生成という。
　さらに、Ｒ－Ｓ－ＡのＡがアルキル基であるＤＭＳや、ハロゲンがＩであるＲ－ハロゲンを還元することもでき、メタンガスを生産できるだけでなく、Ｒがエチル基であるエチル化合物を基質にして、エタンガスを生産できるという新たな補酵素Ｆ４３０の機能が見出された。
　次に、還元剤を用いることなく、酸化された補酵素Ｆ４３０の２価のＮｉを、電極反応により電気化学的に１価に還元して活性化できるか試みた。この補酵素Ｆ４３０を用いる電気化学的メタン生成の反応様式の概略図を図２に示す。
　図２のように電子運搬体を用いてもよく、例えば、ビオロゲン色素であるメチルビオロゲン（ＭＶ）等を用いる。ビオロゲン色素以外にも、アキノン色素、トリフエニルメタン色素、フタロシアニン類、メチン色素、ピロール色素、ポルフイリン誘導体等を用いることができるが、ビオロゲン色素のメチルビオロゲン、ベンジルビオロゲンが好ましい。
　概略図では、電流源に由来する電子ｅが電子運搬体ＭＶに移され、この電子運搬体がその電子を酸化された補酵素Ｆ４３０に与え、補酵素Ｆ４３０を還元する。還元された補酵素Ｆ４３０は、基質であるＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭ等を還元し、このようにして電気化学的にメタンガスが生成される。
　酸素を遮断して反応容器内で電気化学的に補酵素Ｆ４３０を還元する電気化学的還元において、緩衝液中に作用電極としての陰極と対電極としての陽極を挿入する。陰極には、金属、例えば、銅、鉄、ニッケル、水銀、または鋼や、炭素、グラファイトを用い、陽極には、白金、グラファイト、またはチタンを用いる。
　緩衝液に、電子運搬体ＭＶのみを添加した場合をコントロールとして、ＭＶと補酵素Ｆ４３０と基質のＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭの三者を同時に添加した場合と、三者のうち二者を選択して同時に添加した場合で、スキャンレート１０ｍＶ／ｓでのサイクリックボルタンメトリーを行い、その結果、図３に示すように三者を同時に添加した場合のみ、図２の反応が進行して電流が流れたことから、酸化された補酵素Ｆ４３０のＮｉを、電極反応により電気化学的に還元して活性化できることが示された。
　補酵素Ｆ４３０が電気化学的に再生できることが確認されたことから、反応容器内で補酵素Ｆ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）をＮｉ（１価）に電気化学的に還元するプロセスと、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元による炭化水素ガス生産反応を組み合わせた、炭化水素ガス製造のための新たな電気化学リアクターシステムを構築した。
　図４に結果を示した実験では、密閉容器中の緩衝液に、補酵素Ｆ４３０と基質を添加して、挿入した電極に通電する。溶液のｐＨは６～１２、好ましくは８～１１、より好ましくはｐＨ１０で実施する。陰極電圧は、標準水素電極に対し－０．１～－１．５Ｖである。
　反応開始から経時的に生成物をガスクロマトグラフィーで解析した結果から、反応開始後約１時間でメタンおよびエチレンの生成が確認され、時間の経過に伴い生成物の量が線形的に増加することから、本発明の炭化水素ガス製造のための電気化学リアクターシステムが作動することが確認させた。
　以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
＜補酵素Ｆ４３０の単離精製＞
　メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｂａｒｋｅｒｉＤＳＭ　８００Ｔ株を１％（約ｐＨ２）ギ酸水溶液中氷浴上で超音波破砕を行った。抽出液を遠心分離（１３０００ｇ×３０分）により固液分離して、上澄み液を回収した。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１晩平衡化したＱ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈ　ｃａｒｅ）をカラムに充填後、イオン交換水でコンディショニングを行い、カラムに上澄み液を通液し、濾液を全て回収した。Ｃ１８固相抽出カラム（Ｓｅｐ－ｐａｃｋ　Ｗａｔｅｒ社製）をメタノールで洗浄し、１％ギ酸でコンディショニングを行い、上述の濾液を固相抽出カラムに通液し、吸着成分をメタノールで回収し、補酵素Ｆ４３０画分とした。補酵素Ｆ４３０画分は、ＨＰＬＣ作業までエバポレーターで乾固し、－２０℃で保存した。
　補酵素Ｆ４３０画分からの補酵素Ｆ４３０の精製は、２段階の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。
　１段階目のＨＰＬＣは、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ　ＳｅｍｉＰｒｅｐ　ＲＰ－１８ｅ（１００ｍｍ×１０ｍｍ)を用いてグラジエント分析にて行った。移動相Ａ：１００ｍＭ　ＮａＣｌＯ４　ｉｎ　ＨＣｌＯ４／Ｈ２Ｏ（ｐＨ２．３）,移動相Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，グラジエント条件：１ｍＬ／ｍｉｎ,０％　Ｂ　ａｔ　０ｍｉｎ，２ｍｉｎまでに２０％　Ｂ，２０ｍｉｎまでに２６％Ｂ。
　補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離した。単離溶液は移動相Ａにて５倍程度に希釈後、以下の方法で脱塩した。
　メタノール洗浄および移動相Ａでコンディショニングを行ったＣ１８固相抽出カラムに、希釈単離溶液を通液し、吸着成分を２５０ｍＬのイオン交換水で洗浄後、メタノールで回収する。回収した溶液はエバポレーターで乾固し、２段階目のＨＰＬＣ分析まで－２０℃で保存した。
　２段階目のＨＰＬＣは、ＨＹＰＥＲＣＡＲＢ　５μｍ（１００ｍｍ×９．５ｍｍ）を用いてグラジエント分析にて行った。移動相Ａ：ＨＣｌＯ４／Ｈ２Ｏ（ｐＨ１）,移動相Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，グラジエント条件：１ｍＬ／ｍｉｎ,０％　Ｂ　ａｔ　０ｍｉｎ，３ｍｉｎまでに３０％　Ｂ，７０ｍｉｎまでに５３％Ｂ。
　補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離した。単離溶液は移動相Ａにて５倍程度に希釈後、以下の方法で脱塩した。
　メタノール洗浄および移動相Ａでコンディショニングを行ったＨＬＢ固相抽出カラムに、希釈単離溶液を通液し、吸着成分を２５０ｍＬのイオン交換水で洗浄後、メタノールで回収した。回収した溶液はエバポレーターで乾固し、補酵素Ｆ４３０精製物とした。精製した補酵素Ｆ４３０は－２０℃で保存した。
＜補酵素Ｆ４３０の基質＞
　実施例１で精製した未修飾の補酵素Ｆ４３０を用いて、補酵素Ｆ４３０が基質とできるアルキル化合物を探索した。
　補酵素Ｆ４３０　１μｍｏｌ、固体の基質ＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭ　１００μｍｏｌをバイアル瓶内に計りとり、Ｎ－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＣＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。還元剤であるクエン酸チタン　１００μｍｏｌを添加後、水溶液をアルゴンバブリングにより脱気し、ブチルゴム栓およびアルミキャップを用いて密栓して、室温にて反応開始させた。
　同様に、補酵素Ｆ４３０　１μｍｏｌを添加したバイアル瓶内のＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．４）に、室温で液体のアルキル化合物　ＣＨ３－Ｓ－ＣＨ３（ｄｉｍｅｔｙｈｙｌｓｕｌｆｉｄｅ）またはＣＨ３－Ｉ（ｉｏｄｅｍｅｔｈａｎｅ）各１００μｍｏｌと、還元剤であるクエン酸チタン　１００μｍｏｌを添加後、水溶液をアルゴンバブリングにより脱気し、ブチルゴム栓およびアルミキャップを用いて密栓して、室温にて反応開始させた。
　経時的に気相を採取して、ガスクロマトグラフィーにより炭化水素成分の定量を行った。結果を図１に示し、補酵素Ｆ４３０は、３つのいずれの基質にも作用すること解明された。
　メタン生成菌（生体）内では、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）を含む化合物（ＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭ：メチルＳＣｏＭ）を基質としてメチル基を還元する補酵素Ｆ４３０が、生体外で本来の基質を還元できることが初めて示された。さらに、本来の基質と作用部分の構造が類似したアルキル化合物を基質とできることがわかった。
　しかも、補酵素Ｆ４３０の生体外反応では、本来の基質でない基質を用いた方がメタンガスの収率が高いことや、メタンが酸化重合したエチレンが生成することも観察された。
＜補酵素Ｆ４３０の電気化学的活性化＞
　還元剤を用いる代わりに、還元反応後の補酵素Ｆ４３０の酸化された２価のＮｉを、電極反応により電気化学的に１価に還元して補酵素Ｆ４３０を活性化できるか試みた。
　図２に反応様式の概略図を示した電極－メディエーター－補酵素Ｆ４３０－基質相互作用確認実験として、電気化学セルを用いて以下のようなサイクリックボルタンメトリーを行った。
　Ｔｉメッシュの集電体に触れたカーボンクロスを作用極とし、対極には白金線、作用極にはＡｇ|ＡｇＣｌ電極を用いた。ＣＡＰＳ緩衝液（０．５Ｍ）０．２０ｍＬを反応容器に加えた。下記表１に、測定に用いた５種類の溶液に加えた各成分とその濃度を示す。
　反応液に、１５分間アルゴンガスをバブリングして溶存酸素を脱気した後に、開始電位を－０．３Ｖ（ｖｓ．Ａｇ|ＡｇＣｌ）、折り返し電位を－１．２５Ｖとし、掃引速度１０ｍＶ／ｓでサイクリックボルタンメトリーを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　サイクリックボルタンメトリーの結果を図３に示す。
　補酵素Ｆ４３０、メディエーターであるＭＶ（メチルビオロゲン）、および基質ＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭの３つを溶液に加えた場合にのみ、これらの相互作用により図２の反応が進行して電流が流れることが確認された。これにより、還元反応後の酸化された補酵素Ｆ４３０Ｎｉ（II）が、電気化学的に還元され、補酵素Ｆ４３０Ｎｉ（I）となり再生され、また反応を触媒できることがわかる。
＜補酵素Ｆ４３０による電気化学的炭化水素ガス生成実験１＞
　補酵素Ｆ４３０の電気化学的還元と、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元による炭化水素ガス生産反応を組み合わせた、新たな電気化学的炭化水素ガス生成のシステムを構築した。
　密閉系セルを用いて以下のように電気化学メタン生成を行った。チタン線の先端に１０×２０ｍｍの長方形に切り取られたカーボンクロスを縫い付けたものを作用電極とした。対極には白金線、作用極にはＡｇ|ＡｇＣｌ電極を用いた。セル内にＣＡＰＳ緩衝液(０．５Ｍ，ｐＨ１０．４)３ｍＬを加えた。メディエーターメチルビオロゲン（ＭＶ）、補酵素Ｆ４３０、および基質ＣＨ３－Ｓ－ＣｏＭを、それぞれの終濃度が０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、および５００ｍＭとなるように加え、１５分間アルゴンバブリングを行い、溶存酸素を脱気してから、－１．３Ｖの電位を印加し、反応を開始した。反応はスターラーで撹拌しながら行った。反応開始から定期的にヘッドスペースの生成気体をガスシリンジにて回収し、ガスクロマトグラフィーにて分析した。
　ガスクロマトグラフィー分析によるメタンガスとエチレガスの定量結果を、図４に示す。
　反応開始後、メタンとエチレンは、時間当たり同じ位の生成量で同程度生成される。炭化水素ガスが線形的に生成されることから、補酵素Ｆ４３０による還元反応が一定速度で行われることが確認された。
　一方、反応開始後８時間後にプロトン供与体であるトリエチルアミンを添加すると、直後から急激にメタンとエチレンの生成量が増加した。このことは、補酵素Ｆ４３０により生成されたメチルラジカルが、メタンとエチレンに変化したことを示すものであり、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元作用が確認された。
＜補酵素Ｆ４３０による電気化学的炭化水素ガス生成実験２＞
実施例４と同じく、補酵素Ｆ４３０の電気化学的還元と、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元による炭化水素ガス生産反応を組み合わせた、新たな電気化学的炭化水素ガス生成のシステムを用いた。
　実施例４と同様に密閉系セルを用いて電気化学メタン生成を行った。チタン線の先端に１０×２０ｍｍの長方形に切り取られたカーボンクロスを縫い付けたものを作用電極とした。対極には白金線、作用極にはＡｇ|ＡｇＣｌ電極を用いた。セル内にＣＡＰＳ緩衝液(０．５Ｍ，ｐＨ１０．４)４．５ｍＬを加えた。メディエーターメチルビオロゲン（ＭＶ）、補酵素Ｆ４３０、および炭素数２～４の３種類の基質、Ｃ２Ｈ5－Ｓ－ＣｏＭ、Ｃ３Ｈ7－Ｓ－ＣｏＭ、Ｃ４Ｈ９－Ｓ－ＣｏＭを、それぞれの終濃度が０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、および５００ｍＭ、５００ｍＭ、５００ｍＭ、となるように加え、１５分間アルゴンバブリングを行い、溶存酸素を脱気してから、－１．1Ｖの電位を印加し、反応を開始した。反応はスターラーで撹拌しながら行った。反応開始から定期的にヘッドスペースの生成気体をガスシリンジにて回収し、ガスクロマトグラフィーにて分析した。
　ガスクロマトグラフィー分析による炭素数２～４の炭化水素ガスの定量結果を、図５に示す。
　反応開始後、基質のアルキル基に対応するエタン、プロパン、ブタンおよびエチレン、プロペン、ブテンが生成された。炭化水素ガスの生成量は、２から４へと炭素数が増えるにしたがい減少する傾向があった。
　本発明の電気化学的リアクターシステムによれば、従来のメタン発酵槽を用いるバイオガス生産システムにおける、微生物とバイオマスを使用する大規模な施設が必要なために、微生物の活性維持等その他の設備の維持、管理には多大なコストがかかり、バイオガスを安価に生産できないという欠点が全て解消され、小規模施設での革新的なバイオガス生産システムとなることが期待される。
 
 

Claims (11)

  1. 　溶液中で炭素数が１～４のアルキル化合物を基質として、触媒として未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０を作用させて、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガスを生産する方法。
  2. 　前記炭素数が１～４のアルキル化合物が、Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－Ａ、またはＲ－ハロゲンであり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基である、請求項１に記載の炭化水素ガスを生産する方法。
  3. 　前記アルキル化合物Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－ＡのＡが、立体障害を起こさない無機または有機置換基である、請求項２に記載の炭化水素ガスを生産する方法。
  4. 　還元剤の存在下で行う、請求項１ないし３のいずれかに記載の炭化水素ガスを生産する方法。
  5. 　還元剤の非存在下、溶液中の未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）を、電極反応により電気化学的にＮｉ（１価）に還元することにより、酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
  6. 　溶液中に陰極である作用電極と対電極である陽極とを備え、陰極および陽極を電力供給源に接続した密閉した電気化学的リアクターを用いる、請求項５に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
  7. 　前記酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０が触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０である、請求項５または６に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
  8. 　さらに電子運搬体を用いる、請求項５または６に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
  9. 　触媒反応後の酸化された不活性なメタン生成補酵素Ｆ４３０を、基質を含む触媒反応系中で電気化学的に還元して再生することを特徴とする、メタン生成補酵素Ｆ４３０のメタン生成補酵素活性を維持する方法。
  10. 　還元剤の非存在下、溶液中に触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と、基質である炭素数が１～４のアルキル化合物と、電極とを存在させ、メタン生成補酵素Ｆ４３０の活性を電極反応により電気化学的に維持しながら触媒反応を行うことを特徴とする、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガス製造方法。
  11. 　密閉した触媒反応容器内の溶液中で、触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と基質である炭素数が１～４のアルキル化合物を反応させて、炭化水素ガスを製造する装置において、前記触媒反応容器内に、電力供給源に接続した陰極である作用電極と陽極とを備え、触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０を電気化学的に還元して再生することを特徴とする、炭化水素ガス製造装置。

     
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