CN102636529A - 一种以电化学生物传感器实时检测酶中间体的方法 - Google Patents

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黄薇
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本发明公开了一种以电化学传感器实时检测酶催化反应中间体的工艺方法。所述的工艺方法是通过传感器电极上的还原电流对中间体相对量的持续测量来实现的。在固定化辣根过氧化物酶催化H2O2氧化还原反应体系中，反应过程中电子传递与酶中间体存在的数量具有定量的关系。通过考察底物、抑制剂，以及底物和抑制剂共同对酶活性的影响，证实此方法能够实时跟踪监测酶活性的变化和中间体的相对量。与传统的中间体检测方法相比，此方法具有灵敏度高，成本低的特点，可作为酶瞬态动力学检测的标准，在实验室、医学化验和工业中得到进一步的应用。

Description

一种以电化学生物传感器实时检测酶中间体的方法
技术领域
本发明涉及一种检测酶中间体的方法。具体涉及采用电化学生物传感器对酶-底物复合中间体的相对量，以及它们随底物浓度和抑制剂浓度的变化进行实时测量。
背景技术
酶活性检测是生物化学的基本技能，也是医学诊断、药物设计、食品工程、环境监测等领域的基础。传统的检测方法有液相色谱法、茚三酮显色法、Nessler定氨法等，这些检测是一种终态的测量，不能对反应进行中物质的变化进行连续跟踪。紫外光谱、动力学分析等方法虽然可以进行连续跟踪，而监测的对象要么是底物的消耗，要么是产物的累积，但难以对反应的中间体进行测定。
酶-底物复合中间体是酶动力学和酶机理研究最为直接的对象。然而，由于它们是瞬间存在的不稳定物质，所以对其进行观测和定量分析是十分困难的。传统的研究方法有终点法和连续法两种方式。终点法是在催化体系中加入化学淬灭剂以终止反应，然后用荧光光谱(Huang H，et al.，Analyst 2012，137，1481-1486)、质谱(Houston CT，et al.，Anal.Chem.2000，72，3311-3319)或色谱(Guasch A，et al.，J.Chromatogr.1989，473，281-286)进行测量。连续的方式是利用停流法或T-跃迁法进行实验，并用紫外光谱仪(Rowe GT，et al.，Inorg.Chem.2007，46，10594-10606)或荧光光谱仪(Gong P，et al.，Anal.Biochem.2009，391，45-55)进行检测。
酶生物传感器有着多方面的应用。例如，对糖尿病人的血糖监测(Han M，etal.，Biosens.Bioelectron.2012，31，151-156)。此类传感器是基于氧化还原反应中所产生的微电流与底物浓度之间存在着的线性关系，并以此从电流值来推算底物的浓度。传感器方法非常灵敏，能够侦测出纳米级浓度的底物。其实，与传感器电流直接存在着计量关系的并不是底物的浓度，而是反应中间体的生成或消耗速率。例如，消耗一个过氧化物酶-H2O2复合氧化中间体I和一个过氧化物酶-H2O2复合氧化中间体II各需要两个电子，共有4个电子进行传递[George P.Nature 1952，169，612-613]。因此电流与中间体的数量成正比。
目前，生物传感器已发展到第三代，即无电子媒介体的生物传感器，但此类传感器的应用尚不成熟。而电子媒介体的使用并不影响对酶活性的测量。因此，以辣根过氧化物酶和氢醌电子媒介体为代表的第二代生物传感器可作为酶活性测定较为理想的装置。
与以往生物传感器的使用目的不同，在这里传感器并不是用来检测底物浓度，而是用于对瞬间存在的酶中间体的相对量进行持续的测量，并且由此来分析底物和抑制剂对酶催化反应所产生的影响。此方法可进一步为酶动力学和酶机理的研究提供一种灵敏的和实时在线式的实验手段。
发明内容
本发明的目的之一是建立一种能够实时测量反应中间体相对量的方法。
本发明的目的之二是建立一种能够对固定酶活性和抑制进行检测的方法。
本发明的目的之三是进一步为酶动力学、抑制动力学和酶机理研究提供一种新的实验手段。
为了达到上述目的，本发明将辣根过氧化物酶(HRP)传感器引入到酶催化活性的检测中。在催化反应体系中，H2O2被HRP的还原成H2O，而HRP则被氧化成HRP氧化中间体I。HRP氧化中间体I能被对苯二酚(氢醌)还原成HRP氧化中间体II，随后再消耗一个氢醌分子进一步还原成初始的HRP。同时，2个分子的氢醌也被氧化成苯醌。每个苯醌分子在负电极上各得到2个电子重新还原为氢醌，那么电极共失去了4个电子来维持催化反应的一次循环。于是，在电极上可以检测到微电流。由于还原酶中间体I和II会在电极上转移4个电子。因此，反应体系内酶中间体的还原速率就与电极上电子传递的速率(电流)成正比。如果中间体的寿命恒定不变，那么中间体的消耗速率则又与中间体的存在量(浓度)成正比。由此推知，检测电流反映了中间体的存在量。即使不能确定绝对浓度，也可以电流的变化来反映酶中间体相对量的变化。
具体工艺如下：
电化学传感器采用酶传感器三电极系统：将玻碳电极作为工作电极，铂丝作为对电极，甘汞电极(SCE)作为参比电极。
将多壁碳纳米管沉积在玻碳电极表面上。
将HRP和牛血清白蛋白(BSA)覆盖在玻碳电极上，加入戊二醛使BSA交联成膜。酶修饰的工作电极与对电极和参比电极连接到电化学工作站，并浸入到含有氢醌的电解液中。加入微量H2O2，电化学工作站在-0.4～0.2V的电压范围内进行循环伏安扫描。同样，也将用无HRP修饰的传感器进行同样的扫描。将两者进行比较，如果在HRP存在的循环伏安图中出现了更加明显的还原电流峰，证明酶活性的存在，并且在电流-时间曲线的测定中施加这一峰值电压。
在峰值电压下，测定电流随时间的变化。在搅拌下每隔一定时间向体系加入微量的H2O2，电流则出现了阶跃式的上升(附图1的上升折线)，这说明酶中间体的相对量升高。以往，在一定的H2O2浓度范围内，可根据电流与H2O2浓度之间的线性关系从电流值推算体系中H2O2的浓度，这已作为酶传感器得到了广泛的应用。但根据上述电化学反应机制，该电流实际上反映的是酶中间体的瞬时含量。在较高的H2O2的浓度下，电流值对H2O2加入的敏感性下降，它们之间的线性关系被打破，这说明过高的底物浓度并不能继续产生酶中间体。
在恒定的H2O2浓度下，向体系间歇加入苯肼，电流则出现阶梯式下降(附图1中的下降折线)，说明酶中间体的相对量随抑制剂的加入呈下降趋势。
进而，交替加入H2O2和苯肼。酶中间体的相对量呈现出交替的上升和下降趋势(附图1)。这揭示了在底物和抑制剂共同作用下反应体系中酶的实时催化状态。苯肼抑制剂和H2O2底物相互竞争与酶分子结合，苯肼用量的增加相当于减少了底物，反之亦然。但是，附图1的曲线上，左侧的“台阶”要高于右侧。这说明随着催化体系中底物和抑制剂浓度的持续上升，电流所反映的酶中间体的相对量对这些底物和抑制剂的敏感性下降。电流并不与底物的浓度或抑制剂的浓度成正比，而是与中间体的相对量成正比。
电流-时间曲线实际上记录了每一时刻酶中间体相对量的变化，也直接反映了酶催化活性的实时变化。由此，可用于对酶的前稳态动力学或瞬态动力学进行分析研究。
本发明的优点在于：
1.本发明将传感器可用于酶活性检测，为酶活性实验，特别是为需要对酶活性进行精密的，不间断的监测的研究和应领域提供了一种新的方法。同时也为酶生物传感器提供了一种新的应用途径。
2.本发明所述的方法可用于酶中间体相对量的测量，为捕捉瞬间存在的不稳定中间体提供了简单的和低成本的实验手段。
3.本发明所述的方法可对酶动力学、酶抑制和酶催化机理的研究提供一种实验技术。
附图说明
图1描绘了能反映电催化峰值电流随H2O2底物浓度和苯肼抑制剂浓度的变化的计时安培曲线。在HRP传感器上，向含有1.0mmol/L的氢醌的磷酸盐缓冲液中间歇加入H2O2，使体系中H2O2的浓度依次为0.5、1.0和1.5mmol/L。随后间歇加入苯肼，使体系中苯肼的浓度依次为0.5、1.0和1.5mmol/L。重复上述过程，交替加入H2O2和苯肼，反复得到呈阶梯上升和下降趋势的计时安培曲线。所施加电压相对于SCE为-0.25V。
具体实施方式
实施例1：
在修饰前，用砂布上覆盖0.05mm的氧化铝糊浆对玻碳电极的表面进行打磨抛光，随后分别用丙酮、50％NaOH溶液、50％硝酸、双蒸水对玻碳电极进行超声清洗，室温干燥。
将1mg活化的多壁碳纳米管分散在10mL的N，N-二甲基甲酰胺中，超声振荡，得到黑色悬液。将10mL的悬液滴加在玻碳电极表面上，在红外灯下挥干溶剂，由此制备出HRP修饰的电极。
将2.5mg 300U/mL HRP和4mg BSA溶于0.2mL的KH2PO4-Na2HPO4磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值7.0)中形成混合液。然后将20μL的混合液滴加到碳纳米管修饰的玻碳电极表面。再将电极置于一个含有25％戊二醛蒸汽的封闭的容器内进行交联4h，室温干燥1h，在4℃下储藏待用。
实施例2：
用电化学工作站和一套常规的三电极系统进行循环伏安实验。其中，以修饰过的玻碳电极作为工作电极；铂丝作为对电极；饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极；PBS(0.05mol/L，pH值7.0)作为支持电解液。在测试前电解液用氮气脱气30min，实验期间电化学反应器用氮气保护。
循环伏安实验的电势扫描范围(相对于SCE)为-0.4～0.2V，扫描速率100mV/s。实验在室温下进行。
实施例3：
考察底物影响的实验在盛有20mL支持电解液的反应池中进行。在搅拌下，加入1mmol/L对苯二酚，在-0.25V电压下记录初始电流的基线。然后，每间隔约50s加入0.1mL 0.1mol/L H2O2溶液，得到呈阶跃上升的趋势的电流-时间曲线。
实施例4：
考察抑制剂影响的实验亦在盛有20mL支持电解液的反应池中进行。在搅拌下，加入1mmol/L氢醌和0.1mol/L H2O2溶液，在-0.25V电压下记录初始电流的基线。然后，每间隔约50s加入0.1mL 0.1mol/L苯肼溶液，得到呈阶梯下降趋势的电流-时间曲线。
实施例5：
考察底物和抑制剂对酶反应共同影响的电化学实验也在盛有20mL支持电解液的反应池中进行。在搅拌下，加入1mmol/L的氢醌，在-0.25V电压下记录初始电流的基线。每间隔50s加入0.1mL 0.1mol/L的H2O2溶液，得到呈阶跃上升的趋势的电流-时间曲线平台，再每间隔约50s加入0.1mL 0.1mol/L苯肼溶液，得到呈阶梯下降趋势的电流-时间曲线平台。然后，再重复上述交替加入底物和抑制剂的过程。此种交替加入底物和抑制剂的程序还可以进一步重复进行。

Claims (4)

1.一种检测酶催化反应中间体的工艺方法，其特征在于：所述的工艺方法是采用电化学生物传感器通过实时测量酶中间体的相对量来监测酶催化活性。
2.根据权利要求1所述的检测酶催化反应中间体的工艺方法，其特征在于：能够通过电流-时间曲线持续测量酶中间体的相对量随底物浓度的变化，从而对前稳态酶动力学进行分析。
3.根据权利要求1所述的检测酶催化反应中间体的工艺方法，其特征在于：能够通过电流-时间曲线持续测量酶中间体的相对量随抑制剂浓度的变化，从而对前稳态抑制动力学进行分析。
4.根据权利要求1所述的检测酶催化反应中间体的工艺方法，其特征在于：电化学传感器采用三电极系统，其中工作电极的修饰是以戊二醛交联的牛血清白蛋白将辣根过氧化物酶和多壁碳纳米管固定在玻碳电极上；底物为过氧化氢和氢醌，抑制剂为苯肼。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106248767A (zh) * 2016-07-15 2016-12-21 济南大学 一种用于检测癌细胞中h2s的三维纸分析器件的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005069836A (ja) * 2003-08-22 2005-03-17 Daikin Ind Ltd 電極、タンパク測定装置及び酵素活性の測定方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005069836A (ja) * 2003-08-22 2005-03-17 Daikin Ind Ltd 電極、タンパク測定装置及び酵素活性の測定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU-SHENG YANG ET AL.: "An Amperometric Horseradish Peroxidase Inhibition Biosensor for the Determination of Phenylhydrazine", 《ANALYTICAL SCIENCES》, vol. 24, 31 December 2008 (2008-12-31) *
蔡汝秀等: "动力学分析方法检测酶反应活性中间体的研究", 《高等学校化学学报》, vol. 18, no. 3, 31 March 1997 (1997-03-31) *
黄应平等: "一种基于检测酶反应中间体而测定漆酶活性的动力学分析法", 《分析化学》, vol. 30, no. 10, 31 October 2002 (2002-10-31) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106248767A (zh) * 2016-07-15 2016-12-21 济南大学 一种用于检测癌细胞中h2s的三维纸分析器件的制备方法

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