JP5665070B2 - 酸化還元タンパク質固定化ナノ構造電極 - Google Patents
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(1) 導電性の微細突起が複数分布して形成される凹凸界面を有する電極と、該凹凸界面に固定された酸化還元タンパク質とを備え、該微細突起を、該凹凸界面に垂直な方向から、該凹凸界面に平行な仮想平面に投影したときの形状を内包する最小円の直径を1としたとき、該微細突起の高さが0.07〜1.00である、酸化還元タンパク質固定化電極。
(2) 前記直径が2〜200nmである、(1)の酸化還元タンパク質固定化電極。
スパッタリング法により作製された、凹凸界面を有する薄膜を備えた電極、或いは、
陽極酸化ポーラスアルミナ皮膜が表面に形成されたアルミニウム基材から、該被膜を除去して得られる、微細窪みが複数分布して形成される凹凸面を鋳型として作製された、凹凸界面を有する薄膜を備えた電極である、
(1)または(2)の酸化還元タンパク質固定化電極。
(4) スパッタリング法により作製された、導電性の微細突起が複数分布して形成される凹凸界面を有する薄膜を備えた電極と、該凹凸界面に固定された酸化還元タンパク質とを備える酸化還元タンパク質固定化電極。
(7) 前記酸化還元タンパク質がシトクロムP450である、(1)〜(6)のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極。
(8) 前記酸化還元タンパク質が、前記凹凸界面上に直接接触し固定化されている、(1)〜(7)のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極。
前記凹凸界面の表面に疎水性薄膜が形成されており、前記疎水性領域を有する酸化還元タンパク質が該薄膜の表面に接触し固定されている、(1)〜(7)のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極。
(11) (1)〜(9)のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極を備えるバイオリアクタ。
(12) (1)〜(9)のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極を備えるバイオ燃料電池。
本発明においてその界面に導電性微細突起が形成される電極の材料は、一般的に電気化学計測で使用できる導電性を有する材料であれば特に限定されない。例えば金、銀、銅、白金等の金属、炭素や、酸化インジウム、酸化チタン等の半導体等導電性を有する単体が例示できる。
前記電極の電極界面上には、導電性の微細突起が多数分布してなる凹凸界面が形成される。微細突起を構成する材料としては導電性材料であれば特に限定されず、例えば金、銀、銅、白金等の金属材料、炭素材料、酸化インジウム、酸化チタン (TiO2) 等の半導体材料等が挙げられる。
上記凹凸界面へ酸化還元タンパク質を固定化する方法としては、酸化還元タンパク質を直接電極上へ物理的に吸着固定する方法、電極表面を酵素と相互作用可能な分子(コーティング剤)でコーティングして酸化還元タンパク質を固定化する方法等が挙げられる。後者では、コーティング剤が電極と酸化還元タンパク質をつなぐバインダとなりその種類を選択することで共有結合、配位結合、静電相互作用、疏水作用、水素結合等の作用で酵素を固定化できる。コーティング剤としては、ピリジンチオールのような小有機分子からポリイオンのような高分子までを用いることができる。
で表される分子である。上記一般式(1)、(2-1)又は(2-2)で表される分子は、基−S−を介して電極界面に結合されることができる。一般式(1)、(2-1)又は(2-2)中の「アルキル基」とは、好ましくは炭素数1〜8、より好ましくは炭素数1〜6の直鎖状又は分岐鎖状の低級アルキル基である。一般式(1)、(2-1)又は(2-2)中の「ハロゲン原子」とは塩素、フッ素、臭素又はヨウ素を指す。一般式(1)、(2-1)又は(2-2)中の「ヘテロ原子含有有機基」とは、好ましくは、ヘテロ原子として窒素、酸素、硫黄を含む、総原子数が2〜5個である有機基であり、より好ましくは水酸基、アミド基、チオール基である。疎水性薄膜を構成する分子として最も好ましいものは、一般式(1)、(2-1)又は(2-2)において置換基が全て水素原子である、ベンゼンチオール(チオフェノール)、2-ナフタレンチオール又は1-ナフタレンチオールから誘導されたチオレートである。
「酸化還元タンパク質」とは、活性中心として酸化還元(電子授受)応答を示す部位を有するタンパク質を指す。このような部位としては鉄等の金属イオン、フラビン等の有機分子が挙げられる。
本発明の酸化還元タンパク質固定化電極は、図1に模式的に示すように、複数の微細突起11の間の窪みに酸化還元タンパク質13が固定されることにより、タンパク質13と電極界面との接触面積が増大し、タンパク質-電極間の距離が短くなり、効果的な電子移動経路が生じ、電子授受が容易となると考えられる。本発明においてはタンパク質13を保持するためのマトリクスも不要であるため、タンパク質13の活性部位14への基質のアクセスも容易であると考えられる。
本発明の酸化還元タンパク質固定化電極は、バイオセンサにおける対象物質検出部位として用いることができる。この場合、酸化還元タンパク質による基質の酸化還元反応の進行により発生した電流または電圧を検出することで、基質の存在の有無またはその濃度、あるいは、酸化還元タンパク質による基質の処理速度を測定することができる。酸化還元タンパク質固定化電極における酸化還元反応による電気的信号を検出する手段は特に限定されない。バイオセンサの一実施形態を図5に示す。図5の実施形態では、本発明の酸化還元タンパク質固定化電極を作用電極51として用い、対極52および参照電極53を組み合わせて使用し、作用電極51、対極52および参照電極53を測定対象試料54に接触させる。作用電極51、対極52および参照電極53はポテンショスタット55に接続され、作用電極51に参照電極53を基準とした電位が印加され、酸化還元タンパク質56による酸化還元反応が、作用電極51と対極52との間の電流値として検知される。
本発明の酸化還元タンパク質固定化電極は、バイオリアクタにおける反応部位として用いることができる。酸化還元タンパク質固定化電極に電位を印加する手段は特に限定されない。図6に一実施形態を模式的に示す。本発明の酸化還元タンパク質固定化電極61と、対極62と、参照電極63とを反応基質を含有する反応液64中に配置し、酸化還元タンパク質固定化電極61と参照電極63間に電位差を印加して、酸化還元タンパク質66による反応基質の酸化還元反応を生じさせる。酸化還元タンパク質66の活性中心を還元することにより該タンパク質による反応を駆動する場合、酸化還元タンパク質固定化電極61に酸化還元タンパク質66の酸化還元電位よりも負な電位を印加し、酸化還元タンパク質66の活性中心へ電子を供与する。酸化還元タンパク質66の活性中心を酸化することにより該タンパク質による反応を駆動する場合、酸化還元タンパク質固定化電極61に酸化還元タンパク質66の酸化還元電位よりも正な電位を印加し、酸化還元タンパク質66の活性中心の電子を電極61に受容させる。例えば、酸化還元タンパク質としてシトクロムP450を用いる場合、シトクロムP450固定化電極に、標準水素参照電極に対して-0.3V程度の電圧を印加することで、酵素触媒反応(酸素添加反応)を進行させることができる。本発明のバイオリアクタによれば、還元剤又は酸化剤を投入する必要が無いため、反応液からの目的物質の精製が簡易となる。なお、図6では3電極式のバイオリアクタの実施形態を示すが、反応系によっては、2電極式のバイオリアクタとすることもできる。
本発明の酸化還元タンパク質固定化電極は、バイオ燃料電池における燃料極(負極)および/または酸素極(正極)として用いることができる。本発明のバイオ燃料電池の構成の一例を図7に模式的に示す。図7に示すように、燃料極71はグルコース等の基質(燃料)を酸化し、電子を受け取る。このときプロトンが生じる。電子は燃料極71から負荷を含む外部回路72を経由して酸素極73に達することにより、電流が生じる。燃料極71で生じたプロトンは、プロトン伝導性の電解質74を通り酸素極73まで移動する。酸素極73では、電子と、プロトンと、空気中の酸素とが反応して水が生成される。本発明の酸化還元タンパク質固定化電極を燃料極71として用いる場合、固定化される酸化還元タンパク質としては、グルコース等の燃料を酸化することができる酸化酵素(例えばグルコース酸化酵素、グルコース脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素、メタノール酸化酵素)を用いる。本発明の酸化還元タンパク質固定化電極を酸素極73として用いる場合、固定化される酸化還元タンパク質としては、酸素を還元することができる還元酵素(例えばラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、シトクロムc酸化酵素)を用いる。燃料極71および酸素極73の一方としては、燃料電池の電極触媒として一般に用いられる白金、白金合金触媒等が担持された電極を用いることもできる。燃料及び酸素をそれぞれ燃料極及び酸素極に供給する手段や、燃料極及び酸素極と電解質とを接触させる手段は特に限定されない。電解質の形態は特に限定されず、液状であっても固体状(例えば高分子電解質膜)であってもよい。
(1) 20nmの金微粒子が高密度で集積したナノ凹凸界面を有する電極の作製
清浄なガラス基板上に、バインダとしてチタン薄膜をスパッタリング法により形成した。次いで、チタン薄膜上に金薄膜をスパッタリング法により形成した。スパッタリングは、直流スパッタリング方式によりターゲット印加電圧:0.6kV, イオン電流:11mA,不活性ガスイオン:アルゴンイオン(99.99%以上)、圧力0.7 Torr、基板温度24℃の条件下で15分間行った。形成されたチタンおよび金薄膜の膜厚はいずれも50nm程度となった。作製した金薄膜界面のAFM(原子間力顕微鏡)観察を行ったところ、直径が約20nmであり、高さが1〜5nm程度(10個の微細突起を観察した場合の上限と下限)、即ち、直径を1としたとき高さが約0.05〜0.25 (平均値:0.09) である、金微粒子が集積化したナノサイズの微細突起からなる凹凸が観測された(図2a)。
上記(1)で作製した電極を、1 mMのナフタレンチオールのエタノール溶液に1時間程度浸漬して、ナフタレンチオレートの単分子膜を各電極界面上に形成させた。その後、エタノール、水で洗浄し、単離精製したヒトシトクロムP450(CYP3A4)酵素を電極界面上に垂らして室温で10分程度静置し固定化を行った。酵素の固定化は高感度反射赤外分光法により確認した。ヒトシトクロムP450は膜結合型の酵素であり、電極界面上に構築した疎水性のナフタレンチオレート膜と疎水的な作用により固定化されたと考えられる。
上記(2)で作製した、ヒトシトクロムP450固定化電極の電気化学計測をサイクリックボルタンメトリー法により行った。
(a) 基質非存在下での応答
脱酸素した緩衝溶液中で測定したシトクロムP450固定化電極の電気化学応答を図3に示した。図3aはナノ凹凸を有する電極界面上(図2a)に固定化したP450の電極応答であり、-0.2 V vs. SHE付近に酸化(正の電流)および還元(負の電流)ピークを示した。これはP450のヘム鉄イオンの酸化還元応答に帰属され、電極-P450間に電子移動が起こっていることが示された。一方、平滑な電極界面(図2b)にP450を固定化した場合、図3bにように酸化還元に由来するピーク応答は観測されなかった。このことから、直径1に対して高さが0.07よりも大きい微細突起からなる凹凸界面がP450-電極間の直接電子授受に重要であることが明らかとなった。
基質薬物(テストステロン)および適度な酸素を含む緩衝溶液中で測定したシトクロムP450-3A4(大腸菌由来ミクロソーム)固定化電極の電気化学応答を図4に示した。
0.1M リン酸緩衝溶液中(pH7.4)で、0.1 V/sの掃引速度で測定。
(a) 基質および阻害剤非存在下。
(b) 30 μM テストステロン。
(c) 130 μM テストステロン。
(d) 500 μM ケトコナゾール。
(e) 500 μM ケトコナゾール + 30 μM テストステロン。
(f) 500 μM ケトコナゾール + 130 μM テストステロン。
特定の条件において作製される陽極酸化ポーラスアルミナ(PA)は、規則的に整列した直径10nm前後から数100nmの細孔を有しており、このPAに鋳造技術を適用して微細な突起を有する金材質の電極を作製した。
(a)鋳型の作製
アルミニウム基材(0.5mm厚, 99.999%)を、陽極酸化(電解質:シュウ酸0.3M、電解質温度:16℃、電圧:40V、時間:60min)し、アルミニウム基材100の表面に、ハニカム状に並んだ縦型の細孔101(直径約100nm、深さ50μm)が形成された、陽極酸化ポーラスアルミナ皮膜102を有するPA基板を作製した(図10a)。アルミニウム基材100の、陽極酸化ポーラスアルミナ皮膜102と接する界面には、複数の微細窪み103 (直径約130nm、深さ約30nm)が形成される。次にPA基板をクロム酸(1.8wt%)と過塩素酸(6wt%)の水溶液(60℃)に浸漬し、陽極酸化ポーラスアルミナ皮膜102を溶解除去することにより、直径約130nm、深さ約30nmの微細窪み103が複数並んだアルミニウム基材100を作製した(図10b)。こうして得られたアルミニウム基材100を鋳型として使用した。
スパッタリング装置(JEOL製JFC1100、Ar雰囲気中、600V、11mA)を用いて上記アルミニウム基材の鋳型100の表面に、平均80nm厚の金蒸着薄膜110を蒸着し、加熱処理(200℃、60min)を行い、次に電解メッキ法(エヌ・イー ケムキャット株式会社製金メッキ液:ECF-88K、印加電流:3mA/cm2)を適用して厚さ400nmの金メッキ薄膜111を追加し、引き続き電解メッキ法(普通ニッケルメッキ浴(硫酸ニッケル7水塩:15g、塩化アンモニウム:1.5g、ホウ酸:1.5g、水:100mL)、印加電圧:1.5V)を適用して厚さ30μmのニッケルメッキ薄膜112を形成した(図11a)。更に、水酸化ナトリウム溶液(30wt%)に浸漬してアルミニウム基材の鋳型100を溶解除去し、ニッケル材によって補強された金電極113を作製した(図11b)。金電極113の電極界面には、鋳型100の複数の微細窪み103の反転形状である複数の微細突起114からなる凹凸界面が形成された。電極表面のAFM像(図9)によると、微細突起の直径は約130nm、直径を1としたとき高さは約0.07〜0.50 (10個の微細突起を観察した場合の上限と下限, 平均値:0.23) である。
上記(2)の方法でヒトシトクロムP450試料の固定化を行い、電気化学測定を行ったところ、上記(3)と同様な結果が得られた。
11・・・微細突起
12・・・電極
13・・・酸化還元タンパク質(酵素)
14・・・活性部位
50・・・バイオセンサ
51・・・酸化還元タンパク質固定化電極(作用電極)
52・・・対極
53・・・参照電極
54・・・測定対象試料
55・・・ポテンショスタット
56・・・酸化還元タンパク質
57, 58, 59・・・リード
60・・・バイオリアクタ
61・・・酸化還元タンパク質固定化電極(作用電極)
62・・・対極
63・・・参照電極
64・・・反応液
65・・・ポテンショスタット
66・・・酸化還元タンパク質
67, 68, 69・・・リード
70・・・バイオ燃料電池
71・・・燃料極
72・・・外部回路
73・・・酸素極
74・・・電解質
80・・・凹凸界面に平行な仮想平面
81, 82, 83・・・微細突起
84, 85, 86・・・投影像
100・・・アルミニウム基材(鋳型)
101・・・細孔
102・・・陽極酸化ポーラスアルミナ皮膜
103・・・微細窪み
110・・・金蒸着薄膜
111・・・金メッキ薄膜
112・・・ニッケルメッキ薄膜
113・・・ニッケル材によって補強された金電極
114・・・微細突起
Claims (6)
- 導電性の微細突起が複数分布して形成される凹凸界面を有する電極と、該凹凸界面に固定された酸化還元タンパク質としてのシトクロムP450とを備え、
微細突起が、凹凸界面を平滑な界面とみなしたときの表面積あたり5×109〜1×1013個/cm2の密度で分布しており、
少なくとも10個の微細突起について観察した際、該微細突起を、該凹凸界面に垂直な方向から、該凹凸界面に平行な仮想平面に投影したときの形状を内包する最小円の直径の平均値が2〜200nmであり、該直径の平均値を1としたとき、該微細突起の高さの平均値が0.08〜0.50であり、
前記凹凸界面を有する電極が、
金をターゲット物質とするスパッタリング法により作製された、凹凸界面を有する薄膜を備えた電極、或いは、
陽極酸化ポーラスアルミナ皮膜が表面に形成されたアルミニウム基材から、該被膜を除去して得られる、微細窪みが複数分布して形成される凹凸面を鋳型として作製された、凹凸界面を有する薄膜を備えた電極である、酸化還元タンパク質固定化電極。 - 少なくとも10個の微細突起について観察した際、微細突起の、最低地点の高さ位置から頂点の高さ位置に至る途中の50%の高さ位置より頂点側の部分が上凸状に反った曲面により形成されている、請求項1の酸化還元タンパク質固定化電極。
- シトクロムP450が、前記凹凸界面上に直接接触し固定化されている、請求項1または2の酸化還元タンパク質固定化電極。
- 前記凹凸界面の表面に疎水性薄膜が形成されており、シトクロムP450が該薄膜の表面に接触し固定されている、請求項1または2の酸化還元タンパク質固定化電極。
- 請求項1〜4のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極を備えるバイオセンサ。
- 請求項1〜4のいずれかの酸化還元タンパク質固定化電極を備えるバイオリアクタ。
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