JPH04132949A - 酵素固定化電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、グルコースその他の基質検出用のセンサ等
として利用され、酵素を固定化してなる電極、すなわち
酵素固定化電極に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、酵素固定化電極の製造方法として、ゼラチン、お
よび、架橋剤となるグルタルアルデヒドを含む酵素溶液
を白金電極に塗布して、電極本体の表面上で製膜を行う
とともに、酵素を共有結合的に固定化して、電極本体表
面に酵素固定化膜を形成する方法がある。ここで用いら
れる白金電極は、表面が平滑な白金板、あるいは、表面
が平滑なセラミック等の基板にスパッタ凛着で白金薄膜
を形成したもの等が用いられている。

なお、酵素固定化電極を用いて、各種の検出や測定を行
うには、酵素を固定化した酵素固定化電極すなわち測定
極と、酵素を固定化させない対極とを組み合わせ、両電
極間の電位差や電流を測定して、電気的な信号の形で検
出情報が得られるようにした酵素固定化電極装置が用い
られる。

ここで、ゼラチンは、酵素固定化膜のマトリックス成分
となるものであって、希薄な酵素溶液と、架橋剤として
のグルタルアルデヒドだけでは、架橋反応により得られ
る酵素固定化膜の強度力弱いので、膜強度を高めるため
に用いられる０例えば、酵素としてグルコースオキシダ
ーゼを用いる固定化膜の場合、酵素に対して５〜１０倍
程度のゼラチンを加えて、グルタルアルデヒドで架橋さ
せて製膜するようにしている。

このような酵素固定化電極を用いる際には、試料溶液中
に含まれる被測定物質以外の多種多様な成分による妨害
で、酵素を固定化した測定極による測定物質の検出が妨
害されないようにしてお（必要がある。そのため、測定
極の電極本体表面と酵素固定化膜の間、あるいは、酵素
固定化膜の表面等に、妨害物質の通過を防いだり除去す
る作用のある妨害物質除去膜（以下、「妨害除去膜」と
呼ぶ）を形成しておく、妨害不感型酵素固定化電極が提
案されている。

例えば、実開昭６２−８８９５３号公報には、酵素固定
化膜の上に電解重合膜を形成し、この電解重合膜を妨害
除去膜として利用する方法が開示されている。

また、本願発明者らも、電極本体と酵素固定化膜の間に
妨害除去膜を介在させる酵素固定化電極を開発し、特願
平１−１６４７９７号、特願平１−１２７３６１号等で
特許出願している。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところが、上記のような妨害不感型酵素固定化電極は、
その被検物質検出部分が、妨害除去膜、酵素固定化膜等
からなる多層構造になっているため、電極反応に関与す
る化学物質が有効に使われず、検出感度あるいは応答性
が良くないという問題があった。

例えば、グルコースオキシダーゼ固定化電極の場合、被
検液中にぶどう糖が存在すると、グルコースオキシダー
ゼの作用でグルコン酸と過酸化水素が発生し、この過酸
化水素が電気化学的に酸化され、そのときに流れる電流
を検出してグルコースの存在を検知する。ところが、酵
素固定化膜や妨害除去膜が分厚いと、過酸化水素の電極
本体への到達が遅れたり、到達出来なかったりすること
になり、その結果、電極反応の進行の遅れや検出電流値
の低下を招き、十分な検出性能が得られないのである。

そこで、この発明の課題は、前記したような酵素固定化
電極において、応答性が良好で検出感度の高い酵素固定
化電極を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題を解決する、この発明にかかる酵素固定化電極
は、電極本体の表面に酵素を固定してなる酵素固定化電
極において、電極本体の表面が微細な凹凸構造を有する
。

酵素固定化電極の基本的な構造は通常の酵素固定化電極
と同様であり、基板の表面等に測定極となる電極本体を
備え、電極本体の表面に、酵素を固定化してなる酵素固
定化膜を有している。電極本体が板状や棒状であれば基
板が無くてもよい。

酵素固定化電極装置は、上記のような測定極に隣接して
、酵素を固定化していない電極本体からなる対極を備え
ており、測定極と対極が外部の測定回路に接続されてい
て、検出情報を電気的な信号として取り出せるようにな
っている。

具体的には、まず、基板としては、セラミック、合成樹
脂、ガラスその他、通常の各種電子素子の基板材料と同
様のものが用いられる。電極本体の材料としては、白金
、銀その他、通常の酵素固定化電極装置における電極材
料が用いられる。

この発明では、上記のような電極本体の表面が平滑でな
く、微細な凹凸構造を有している。凹凸構造とは、一定
方向に沿って凹凸が交互に並ぶもの、縦横両方向に凹凸
が交互に配置されたもの等があり、個々の凹部または凸
部の形状も自由に設定できる。例えば、平坦な表面に円
形穴や角形穴等の凹部が多数配設された構造や、平坦な
表面に円柱や角柱状の凸部が多数配設された構造等があ
る。凹凸は、電極本体の全面に形成してお（のが好まし
いが、外部回路への接続部分等、必要のない個所であれ
ば、一部に凹凸のない部分があってもよい。

なお、電極本体の表面に微細な凹凸構造を形成するには
、平坦な基板の上に形成された電極本体の表面のみに凹
凸を形成してもよいが、通常は、基板の表面に凹凸を形
成しておき、その上に一定の厚みで電極本体を薄膜形成
することによって、基板の表面と同じ凹凸が電極表面に
も形成されるようにしたものが好ましい。

基板に微細な凹凸構造を形成するには、通常の半導体プ
ロセスにおける微細加工技術を利用すればよい。具体的
には、シリコンに対する異方性工ソチング技術を通用す
ることができる。こうようにして形成された基板の凹凸
構造の上に、電極材料をスパッタ蒸着すれば、基板の凹
凸構造に対応する凹凸を有する電極本体が形成できる。

電極本体に凹凸構造を形成する方法としては、上記のよ
うに基板に凹凸を形成しておく方法のほか、電極本体を
白金板等の金属板その他の比較的厚みのある材料で構成
し、この金属材料の表面を物理的加工で削り取ったり、
選択エツチングを行ったりして凹凸を形成することもで
きる。

凹凸構造の、凹凸の間隔や高さ等の寸法は自由に設定で
きる。具体的には、凹凸の間隔が狭くて密であるととも
に凸部の高さが高いほど、電極本体の実質的な表面積が
増えるので、応答性あるいは検出感度が向上するが、加
工条件や生産性等も考慮して設定すればよい。特に、凹
凸の間隔が数１０〜数１００ｎ程度の微細なものであれ
ば、電極本体の表面に形成する酵素固定化膜や妨害除去
膜等との密着性が良好になる。また、電極本体の凹凸構
造の上に酵素固定化膜その他の膜を形成したときに、酵
素固定化膜の表面には凹凸が残らず平滑になる程度に、
凹凸構造の寸法を設定しておくのが好ましい。但し、こ
れは、酵素固定化膜等の膜厚の設定によっても条件が変
わってくるが、通常の条件では、溶液塗布等の手段で酵
素固定化膜等の各構成膜を形成すれば、前記電極本体の
微細な凹凸構造を溶液で埋めて、表面を平滑にすること
は容易である。

酵素固定化膜の材料や作製方法は、通常の酵素固定化膜
と同様でよい。例えば、グルコースオキシダーゼ等の酵
素とゼラチンや架橋剤等を含む酵素溶液を、電極本体の
表面に塗布して、架橋反応を行わせることによって、ゼ
ラチンをマトリックス成分とする膜を形成させると同時
に、形成された膜に前記酵素を固定化させることができ
る。酵素の種類、ゼラチンや架橋剤等の添加剤の組み合
わせは、上記以外にも自由に変更できる。例えば、ゼラ
チン以外のマトリックス成分を用いてもよい。架橋剤と
しては、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド類の他、
ホルムアルデヒドやビスマレインイミド類、ジハロゲン
化アリール類、ジイソシアナート類等、通常の製膜に用
いられている各種架橋剤の中から適当なものを選択して
使用することができる。

酵素固定化膜としては、電極本体の表面に直接形成され
た場合には、底面は電極本体の凹凸構造に沿って凹凸が
出来てもよいが、測定使用時に試料溶液と接触する表面
については、平滑になるように形成してお（のが好まし
い。

測定極の電極本体と酵素固定化膜の間には、必要に応じ
て、妨害除去膜や下地膜を形成しておくことができる。

妨害除去膜は、測定極と酵素固定化膜の間に介在して、
妨害物質が測定極における検出を妨害するのを防ぐため
に用いる。具体的には、アルブミン等のタンパク質を含
む水溶性高分子、例えば、ポリアリルアミン水溶液にグ
ルタルアルデヒド等の架橋剤を添加したものを、電極本
体の表面に塗布し、架橋反応を行わせて膜を形成させれ
ばよい、膜形成のためのマトリックス成分となるアルブ
ミンに代えて、前記ゼラチン等を使用することもできる
。架橋剤としても、前記した酵素固定化膜の場合と同様
のものを用いることができる。

下地膜は、上記妨害除去膜と測定極の電極本体との間に
介在して、妨害除去膜と電極本体との密着性等を改善す
るために用いる。例えば、ゼラチン等の高分子水溶液に
、グルタルアルデヒド等の架橋剤を添加して、電極本体
の表面に塗布し、架橋反応を行わせて膜を形成させれば
よい。下地膜の材料および作製方法も、通常の酵素固定
化電極の場合と同様でよい。例えば、架橋剤は、前記し
た酵素固定化膜の場合と同様のものに変更することもで
きる。

この発明においては、上記下地膜および妨害除去膜につ
いては、なくても構わない。また、酵素固定化膜の表面
に、前記妨害除去膜や適宜保護膜等を形成する場合もあ
る。

酵素固定化電極装置において、対極の材料や作製方法お
よび具体的形状については、通常の酵素固定化電極装置
の場合と同じでよく、前記した測電極の電極本体と同様
の材料および作製方法からなるものが用いられる。対極
の表面に、妨害除去膜や下地膜を形成しておくこともで
きる。

〔作　　用〕

酵素固定化電極を構成する電極本体の表面に、微細な凹
凸構造を有していれば、電極本体の平面的な面積は同じ
でも、測定極としての電極反応に関与する電極の表面積
を実質的に増大させることができる。その結果、得られ
る出力すなわち検出感度は、凹凸構造を有しない従来の
電極に比べて、格段に向上することになる。

すなわち、酵素反応の結果生じた電極反応に関与する物
質が測定極の電極表面に到達したときに、電流が流れる
電極界面と溶液の界面部分が大幅に増加する。その結果
、酵素固定化膜で生成された前記反応物質が、電極表面
と接触する機会が増大し、反応物質が電極反応に有効に
使われることになり、大きな検出電流が流れて検出感度
が向上することになるのである。また、反応物質が電極
表面で迅速に反応を起こして電流が流れるので、応答性
も良好になる。

検出感度が向上する割合は、具体的な電極の凹凸構造に
よっても異なるが、凹凸のない従来の電極構造に比べて
、数１０倍の感度向上も可能である。

つぎに、電極本体の表面に、酵素固定化膜あるいは妨害
除去膜等の膜を形成するときに、膜を形成する溶液が電
極本体の微細な凹凸に入り込んだ状態で膜形成されるの
で、電極本体とその上に形成される膜との密着性が向上
する。その結果、前記した反応物質の電極表面への到達
が良好に行われるようになるだけでなく、酵素固定化電
極全体の機械的強度や耐久性が向上することになる。

なお、電極本体の凹凸構造を、下地膜や妨害除去膜ある
いは酵素固定化膜で埋めてしまい、酵素固定化電極の最
上面に露出する表面には凹凸が出来ずに平滑になるよう
にしておけば、酵素固定化電極を測定に使用した後、試
料溶液の除去が容易に行われる。これは、酵素固定化電
極の表面に凹凸があると、この凹凸に試料溶液が入り込
んだままで残ってしまうが、表面が平滑であれば、この
ような問題は生じないからである。

酵素固定化膜等の形成を膜作製溶液の塗布により行えば
、電極本体の凹凸構造内部まで膜作製溶液が入り込み、
しかも、膜が形成されるときには表面張力等で膜表面が
平滑に′なるので、前記のような作用が簡単に発揮でき
る。

〔実　施　例〕

ついで、この発明の実施例について、図面を参照しなが
ら以下に説明する。

第１図および第２図（８１（ｂ）は、酵素固定化電極装
置の概略構造を示している。

第１図に示すように、シリコン等からなる基板１の上に
、酵素固定化電極からなる測定極２と、酵素を固定して
いない対極３が、所定のパターンで設けられている。

第２図（ａｌ　（ｂ）に示すように、測定極２および対
極３は、何れも、基板１の表面に白金や銀等をスパッタ
蒸着してパターン形成された電極本体２０および３０を
有する。但し、対極３の電極本体３０は、基板１の平滑
な表面に形成されているが、測定極２の電極本体２０は
、基板１に形成された微細な凹凸構造１０の表面に沿っ
て設けられており、電極本体２０の表面にも微細な凹凸
構造が構成されている。基板１の凹凸構造１０は、シリ
コンの異方性エツチング等の加工手段で形成され、その
上に凹凸構造１０の凹凸を埋めてしまわない程度の薄く
−様な厚みの電極本体２０が形成されている。

測定極２の電極本体２０の上には、下地膜２２、妨害除
去膜２４、酵素固定化膜２６が、順次形成されている。

下地膜２２は、電極本体２０の凹凸構造に入り込んで埋
めているとともに、下地膜２２の表面は平坦になってい
る。下地膜２２の上に形成される妨害除去膜２４および
酵素固定化膜２６も平坦であり、酵素固定化膜２６の表
面は平滑になっている。

上記のような構造を有する酵素固定化電極を作製し、そ
の性能を測定した結果について説明するまず、第１図お
よび第２図（ａｌ　（ｂｌに示す酵素固定化電極装置を
作製した。

異方性エツチングで基板１の表面に微細な凹凸構造１０
を形成した後、基板１の上に、測定極２には白金からな
る電極本体２０を、対極３には銀からなる電極本体３０
を形成した。測定極２の電極本体２０の表面には、下地
膜作製液、妨害除去膜作製液、酵素固定化膜作製液を順
次用い、それぞれ０．５μｌづつ塗布して架橋反応を行
わせて各構成膜２２．２４．２６を製膜した。塗布部分
の大きさ、すなわち平面的な見掛けの面積は１×１−で
あった。また、各作製液の組成は、第１表に示すとおり
であった。

第１表 単位は重量％ なお、実施例１〜３として、電極本体２０の表面に形成
された凹凸の寸法が異なるものを作製するとともに、比
較例として、第３図に示すように、電極本体２０に凹凸
構造を有していない酵素固定化電極装置を作製した。

一酵素固定化電極装置の性能比較− 上記実施例１〜３および比較例の各酵素固定化電極装置
について、同じ測定条件における検出電流値すなわち検
出感度を測定して比較した。

感度の測定は、酵素固定化電極装置を、ポーラログラフ
イックアナライザ等の測定装置に接続し、電圧０．６Ｖ
（測定極２と対極３の電位差）を印加し、２０μｌの試
料溶液に対して測定を行った。試料溶液には、１５０ｍ
ｇ／ｄｉのグルコース標準液を用いた。第２表に測定結
果を示している。

以上の結果をみれば、実施例１〜３は比較例に比べて、
はるかに大きな電流値すなわち検出感度が得られており
、電極本体２０の表面に微細な凹凸構造を設けておくこ
との効果が実証された。また、実施例１と実施例２を比
べると、凹凸の幅を狭くすることによって検出感度が向
上することが判り、実施例２と実施例３を比べると、凸
部の高さを高くすることによって検出感度が向上するこ
とが判る。

なお、実施例１〜３および比較例において、下地Ｉｌ！
Ｊ２２を設けないものを作製して、電極本体２０と妨害
除去膜２４の密着性を試験したところ、この発明の実施
例の場合は比較例の場合に比べて、はるかに密着性が向
上していた。したがって、この発明では、下地膜２２を
省いても、妨害除去膜２４と電極本体２０の密着性が低
下しないことが判った。

〔発明の効果〕

以上に述べた、この発明にかかる酵素固定化電極によれ
ば、電極本体の表面に微細な凹凸構造を有することによ
って、検出電流を増大させ、検出感度や応答性を格段に
向上させることができる。

しかも、酵素固定化電極もしくは酵素固定膜自体の平面
的な面積を全く増やすことなく、前記のような性能向上
が図れるので、酵素固定化電極の小型化、高性能化に太
き（貢献できることになる。

また、電極本体の凹凸構造と、その上に形成される構成
膜が互いに噛み合った状態になるので、電極本体と上記
構成膜との密着性が高まり、より性能が向上するととも
に、使用時の機械的強度や耐久性も向上する。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明にかかる酵素固定化電極の実施例を示
す概略平面図、第２図（ａ）　（ｂｌは要部の拡大断面
を示し、第２図（ａｌは測定極部分の断面図、第３図は
対極部分の断面図、第３図は比較例の測定極部分の断面
図である。 １・・・基板　２・・・測定極（酵素固定化電極）　　
２０・・・電極本体　２６・・・酵素固定化膜　３・・
・対極代理人　弁理士　　松　本　武　彦 第 第 図 図 手続補正書 酵素固定化電極 （自り９ 平成 ３年 １月２ｑ日 ６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 ■　明細書第３頁第１０行に「実開昭６２−８８９５３
号」とあるを、「特開昭８２−８８９５３号」と訂正す
る。 住　　所　　　大阪府１頗忙（閉慎１０４８番地名　称
（５８３）松下電工株式会社 代表者　情緻三好俊夫 ４、代理人

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　電極本体の表面に酵素を固定してなる酵素固定化電
   極において、電極本体の表面が微細な凹凸構造を有する
   ことを特徴とする酵素固定化電極