KR900000578B1

KR900000578B1 - 효소 센서 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR900000578B1
Application number: KR1019870001087A
Authority: KR
Inventors: 요시아끼 가쓰베; 다쯔오 아라끼; 마사시 하라
Original assignee: 데루모 가부시끼가이샤; 도자와 미쓰오
Priority date: 1986-02-10
Filing date: 1987-02-10
Publication date: 1990-01-31
Also published as: EP0235024B1; EP0235024A3; DK64187A; EP0235024A2; KR870008189A; DE3750779T2; DE3750779D1; DK64187D0

Abstract

내용 없음.

Description

효소 센서 및 그 제조방법

제1도는 본 발명의 효소 센서의 1예의 구조도.

제2도는 본 발명의 효소 센서의 측정장치의 회로도.

제3도는 효소 고정화 막두께와 출력전압과의 관계를 나타낸 그래프도.

제4도는 효소 고정화 막두께와 응답시간과의 관계를 나타낸 그래프도.

제5도는 실시예 5의 우레아제(urease)센서의 출력전압의 시간변화를 나타낸 그래프도.

제6도는 실시예 5의 우레아제센서의 요소에 대한 검량선을 나타낸 그래프도.

제7도는 실시예 6의 글루코오스센서의 출력전압의 시간변화를 나타낸 그래프도.

제8도는 실시예 6의 글루코오스센서의 글루코오스에 대한 검량선을 나타낸 그래프도.

제9도는 본 발명의 사파이어기판의 구조의 1예를 표시한 도면.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1: p형 실리콘기판 2 : 이온 감응막

3 : 효소 고정화막 4 : 절연재

5 : 게이트 6 : 드레인

8,18 : 효소센서 9 : 차동 증폭기

10 : 리코오더 11 : 대조용 전극

12 : Ag/AgCl전극 13 : 보호막

20 : 사파이어기판 21 : 실리콘층

본 발명은 분리 게이트형 ISFET〔이온 셀렉티이브 피일드 이펙트 트랜지스터(Ion Selective Field Effect Transistor〕를 사용한 효소센서, 특히 사파이어 기판을 사용한 분리 게이트형 ISFET의 이온 감응막의 위에 직접 효소고정화막을 피착시킨 효소센서 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

그리고 본 발명에 있어서, 「분리 게이트형ISFET」란 이온감응막과 게이트부가 동일 기판상에 거리를 두고 형성된 구조의 FET를 말한다.

근래, 반도체기술 및 이 기술을 이용한 IC기술의 진보와 더불어 ISFET를 이용한 수소이온, 나트륨이온의 농도 측정용 센서가 피. 베르그베르트(P.Bergverd), 마쓰오(T.Matsuo), 케이.디.와이즈(K.D.Wise)에 의해서 보고되어 있다.

〔아이.이.이.이.트랜스 액션즈(I.E.E.E.Trans)BEM-19,342(1972) : 동, BEM-19,342(1972) ISFET는 일반적으로 기판, 베리어막 이온 감응막으로 구성되고 이온 감응막은 제이트부에 접속되어 있다. 그리하여 ISFET를 피검액에 침지하면, 이온 농도에 따라 이온 감응막의 표면전위가 변화하고 이 전위 변화를 예컨대 소오스와 드레인간의 전류변화로서 측정하고, 표준용액으로의 결과를 참조함으로써 이온 농도를 알 수가있다.

그리하여 상기 ISFET의 이온 감응막상에 측정 대상물을 분해하여, 수소이온을 발생시키는 효소를 고정화함으로써 효소센서로 된다. 이온 감응막상에서 효소의 고정화 방법으로서 종래부터 사용되고 있는 방법으로서 실란 결합제의 1종인 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTE)을 중류수에 혼합하고, 이 혼합용액중에 ISFET를 침지하여 반응시킨다. 이것에 의해 이온감응막중에 아미노기가 도입된다. 다음에 글루탈 알데히드를 주성분으로 하는 고정막 원액을 디프코우팅법등을 사용하여 이온 감응막위에 도포한다. 이에 의해 아미모기와 알데히드기가-CH=N-의 형의 결합을 한다. 또 얇은 글루탈알데히드 용액에 침지하고, 고정막에 알데히드기를 도입한루, 효소(예컨대 우레아제)용액을 도포하고 우레아제의 아미노기와 고정막 표면의 알데히드가와의 반응에 의해 우레아제를 고정막 위에 고정시키는 방법이 있다. (〔바이오 센서〕스즈끼 슈우이찌편, 고오단샤 사이언티픽).

그러나 상기 방법에 의해 얻어지는 효소 센서는 응답 속도가 느리고, 감도가 나쁘다는 문제점을 갖고 있었다. 그리고 그 원인은 이온 감응막상에 고정되는 효소 고정화막에 있다는 것을 본 발명자가 발견하여 본 발명에 이르게 된 것이다.

한편 MOS기판베이스의 MOSFET를 토대로 작성되는 종래의 효소 센서는 게이트부의 위에 직접 효소 고정화막을 피착한 구조이기 때문에 센서를 피검액속에 침지하면 게이트부분에 액이 스며들거나 게이트 부분이 빛에 감수되거나 하여 드리프트가 발생하기 쉬운 등의 문제점이 있었다. 또 종래의 료소 센서에 사용되고 있는 상기 게이트에서는 그위에 고정화 효소막을 피착시키는데는 기재표면에 실란 결합제 처리를 필요로 하기 때문에 센서의 제작공정이 복잡하다고 하는 결점이 있었다.

이와같은 문제점을 해결하고 ISFET의 응답의 안정화를 도모하는 방법으로서 최근 분리게이트형 ISFET의 검토가 진행되고 있다. 분리게이트형 ISFET에서는 이온 감응부만을 피검액에 침지하면되고 FET게이트부는 소오스, 드레인 구성부분과 동일하게 빛이나 외계로부터 차단된 구조이기 때문에 응답의 안정화가 도모된다고 생각되고 있다.

그런데, 이온 감응막으로서 종래의 게이트기재와 같이 절연물을 사용하고 있는한에 있어서 분리 게이트형 구조로 하는 것은 곤란하였다. 이러한 실상에 있어서 본 발명자는 앞서 이온 감응막으로서 전자 도전성의 산화이리듐막을 사용하면 분리게이트형 ISFET의 제작이 가능하다는 것, 산화 이리듐은 배리어막과의 길들임이 양호하다는 것, 그리하여 산화 이리듐 막은 pH감도가 좋고 뛰어난 pH센서로서 기능할 수 있다는 것을 발견하였다. 〔가쓰베(T.Ktsubr) : 1984 인터내셔널 컨퍼런스 온 인더스트리얼 일넥트로닉스, 콘트롤 앤드 인스트루멘테이션(International Conference on Industrial Electronics, Control and Instrumentation)(10월호)22-26, 1984〕.

그러나 지금까지의 ISFET는 일반적으로 실리콘기판을 사용하여 제작되고 있다. 그러나 효소 센서에 사용할 때 용액중에 침지되어서 사용되기 때문에 실리콘기판을 용액으로부터 절연할 필요가 있다. 이 때문에 실리콘기판에 구멍을 뚫은 후 산화시키고, 실리콘기판표면에 산화막을 형성하는 방법이 사용되고 있다. 이 방법은 제조공정이 복잡한 동시에 형성된 산화막이 무르기 때문에 파괴되기 쉽고, 절연성이 유지되기 어려운 것이었다. 또 실리콘기판을 사용한 것은 충분한 강도를 갖고 있지 않기 때문에 그것을 사용한 효소 센서는 취급이 곤란하다는 결점을 갖고 있었다.

본 발명의 목적은 효소 고정화막을 개량함으로써 응답 속도가 빠르고, 감도가 뛰어난 효소 센서 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 문제점을 해결하는 것은 ISFET와 이ISFET의 이온감응막위를 직접 피복하는 두께 3-100μm의 효소 고정화막을 구비하는 것을 특징으로 하는 효소센서이다.

또 ISFET는 분리게이트형 ISFET인 것이 바람직하다.

또 이온 감응막은 산화 이리듐이나 산화파라듐인 것이 바람직하다.

효소 고정화막은 효소로서 우레아제를 함유한 요소 농도를 센스하여 글루코오스 옥시다아제를 함유하고 글루코오스 농도를 센스한다.

또 상기 문제점을 해결한는 것은 ISFET를 만드는 공정과 이 ISFET의 이온 감응막상에 스핀코우트 법에 의해 효소를 고정화시킨 효소 고정화막을 3-100μm의 두께로 피착시키는 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 효소센서의 제조방법이다.

또 ISFET는 사파이어기판을 사용한 분리게이트형 ISFET인 것이 바람직하다.

효소 고정화막은 효소로서 우레아제를 함유하여 요소 농도를 센스하여 글루코오스 옥시다아제를 함유하고 글루코오스 농도를 센스한다.

본 발명의 효소센서는 ISFET의 이온 감응막의 위에 직접 두께 3-100μm의 효소 고정화막을 설치한 것이므로, 응답속도가 빠르고 또한 충분한 감도를 가지므로, 피검액중의 측정대상물질의 농도를 빠르게 또한 확실하게 측정할 수가 있다.

또 ISFET가 분리 게이트형 ISFET이므로 이온 감응막부만을 피검액에 침지하면 되고, FET게이트부 및 소오스, 드레인 구성부분을 침지할 필요가 없고 또 그들 부분은 빛이나 외계로부터 차단되어 있기 때문에 응답의 안정화가 도모할 수 있어 바람직하다.

또 ISFET를 만들고 이 ISFET의 이온감응막상에 효소를 고정화시킨 효소 고정화막을 스핀코우트법에 의해 3-100μm의 두께로 피착시키는 본 발명의 효소 센서의 제조방법에 의하면 이온 감응막상에 형성되는 효소 고정막 두께를 정확히 제어할 수 있기 때문에 상기 효소 센서를 확실하고 용이하게 제조할 수가 있다.

또 본 발명자들을 통상의 ISFET형의 효소 센서가 가지는 상기 결점을 극복하기 위하여 예의 검토한 결과, 사파이어기판을 사용하여 이온 감응막에 산화 이리듐 또는 산화 파라듐 막을 사용한 분리게이트형 ISFET의 이온 감응막은 수용액으로 처리하면 용이하게 효소의 고정화가 행할 수 있다는 것, 그리고 효소 고정화막을 갖는 상기 분리게이트형 ISFET가 뛰어난 센서 특성을 갖는다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 사파이어기판을 사용한 ISFET와 이ISFET의 이온감응막위를 직접 피복하는 효소 고정화막을 구비하는 것을 특징으로 하는 효소센서를 제공한다.

또 ISFET는 분리게이트형 ISFET인 것이 바람직하다.

효소 고정화막은 효소로서 우레아제를 함유하여 요소 농도를 검지하고 글루코오스 옥시다아제를 함유하고 글루코오스 농도를 검지한다.

또 효소 고정화막의 두께는 3-100μm인 것이 바람직하다.

본 발명의 효소센서는 상기와 같이 구성된 것이기 때문에 분리게이트형 ISFET의 안정성 등의 뛰어난 특성을 보유하고, 동시에 효소를 사용한 센서이기 때문에 선택성이 좋게 기질의 농도를 측정할 수가 있다. 또 분리게이트 구조이기 때눈에 이온감응각의 면적이나 형태, 두께등에 비교적 자유도가 크고, 실용상 유리하게 사용할 수가 있다.

또 사파이어기판은 충분한 강도를 갖고 있기 때문에 본 발명의 효소 센서도 충분한 강도를 갖고 있으며, 취급이 용이하고 또 하나의 사파이어기판상에 효소를 고정시키지 않던가, 또 실활시킨 효소를 고정시킨 대조용의 FET를 설치할 수가 있다.

본 발명의 효소 센서을 제1도에 나타낸 실시예를 참조하여 설명한다.

본 발명의 효소 센서는, p형 실리콘기판(1)위에 FET가 형성되며, 이FET에서 조금 떨어진 위치에 효소 고정화막(3)을 갖는 이온 감응막(2)이 절연재(4)위에 설치되어 있으며, 다시금 FET는, 드레인 D(6)와 소오스 S(7)와 게이트G(5)를 가지고 있으며, 게이트는 이온 감응막(2)과 접속되어 있다. 제1도에 나타낸 것에서는, p형 실리콘기판을 사용하고 있지만 이에 한정되지 않으며, 사파이어기판을 사용한 것이더라도 좋다. 사파이어판은 강도가 높기 때문에, 형성되는 효소센서의 강도도 높아진다. 또, 제1도에 나타낸 것에서는, 분리 게이트형 ISFET를 사용하고 있지만, 이에 한정되지 않고 게이트의 위에 이온 감응막을 설치한 것이더라도 좋다. 바람직하기로는 분리게이트형이다. 분리게이트형 ISFET이라면, 이온 감응막부만을 피검액에 침지하면 좋고, FET게이트부 및 소오스, 드레인 구성부분을 침지할 필요가 없고, 다시금 그들 부분은 빛이나 외계로부터 차단되고 있기 때문에 응답의 안정화가 꾀하여지기 때문이다.

또한, 분리게이트형 ISFET란, 기판, 배리어막 및 게이트부가 소오스에 접속한 구조에 있어서, 이온 감응막과 게이트분리가 동일기판위에 거리를 두고 설치되어 있는 것을 말한다.

FET는, p형(혹은 N형) 실리콘기판(1)위에 통상의 방법에 의해 형성된다. 예컨대, p형(혹은 N형) 실리콘기판위에 n형(혹은 N형) 실리콘을, 소오스, 드레인으로 되는 부분에 포토 레스트법, 방전처리법, 열확산법등의 공지된 방법을 사용하고, 또 그들을 조합하여 FET를 형성시킨다.

FET의 위치는 p형 실리콘기판(1)위의 단부 부근에 형성하는 것이 바람직하다. 또, 이온 감응막(2)은, FET의 게이트와 떨어진 파단부 부근에 설치하는 것이 바람직하다. 이와같이하면, p형 실리콘기판의 전체를 유효하게 이용할 수 있으며 절연 기술상으로도 유리해지기 때문이다.

그리고, p형 실리콘기판(1)위에 절연제(4)를 올려놓고, 게이트(5)의 절연재를 얇게 깎고, 그 얇게 깎아진 절연재 및 그 부분에서 이간된 부분의 위에 이온 감응막(2)이 형성되어 있다. 절연재로서는, 산화규소(SiO₂)가 아주 알맞게 사용된다. 또, 이온 감응막으로서는, 산화이리듐(IrO₂), 산화파라듐(pdO₂), 질화규소(SiN₄), 산화 알루미늄(A1₂O₃), 산화탄탈(Ta₂O₅)등이 사용가능하다. 바람직하기로는, 산화 이리듐, 산화 파라듐이며, pH감도가 우수하기 때문이다.

특히 바람직하기로는 산화 이리듐이다. 산화 이리듐은 이온 감응막으로서 잡음이 적은막이며, 다시금 도전체로서도 작용한다. 이온 감응막(2)은, 상기 재료를 반응성 스팻터법을 사용하며, p형 실리콘기판(1)위의 절연제(4)위에 증착하므로서 형성된다.

그리고, p형 실리콘기판(1)위에 FET의 게이트(5)와 이온 감응막(2)이란, 상한 바와같이 얇게 깎여진 절연재를 개재하여 접속되어 있으며, 이온감응막(2)의 계면전위를 게이트(5)에 전달할 수 있도록 되어있다.

또한, 이온감응막(2)의 위에 있고, 게이트(5)에서 이간된 위치에, 두께 3-100μm의 효소 고정화막(3)이 설치되어 있으며, 이 두께의 효소 고정화막을 설치하므로서 우수한 응답속도와 높은 감도를 갖는 것이다. 효소 고정화막(3)은, 효소를 함유함과 동시에 그 효소를 이온 감응막(2)위에 지지하는 작용을 갖는다.

본 발명에 사용되는 효소로서는, 측정 대상물을 분해하여 프로톤을 발생시키는 것이라면 사용할 수 있고, 예컨대 우레아제(요소 검출용), 글쿠코오스 옥시다아제(글루코오스 검출용), 페니실리나아제(페니실린 검출용), 트립신(펩타이드 검출용), 리파아제(지방산 검출용), 펩티다아제(스레오닌 검출용)등을 들수 있다.

그리고, 본 발명에 있어서의 이온 감응막(2)에 효소 고정화막(3)을 설치하는 방법으로서는, 포토 레지스트를 사용한 리프트오프법에 의해 행하는 것이 바람직하며, 예컨대 포지티브형 포토레지스트를 FET의 이온 감응막(2)위에 스핀코우트하고, 효소 고정화막(3)이 형성되는 부분이외를 노광하고, 현상한후 이온 감응막의 효소 고정화막(3)이 형성되는 부분의 포토레지스트를 제거한다.

포토레지스트에는 공지된 것을 사용할수 있으며, 예컨대 폴리비닐 알코올의 수용액에 N-메틸-P-포르밀스틸 피리디늄 메토설페이트를 부가한것(특새소 56-5761호 공보) 폴리에틸렌 글릴콜 메타글리레이트(증감제로서 예컨대 벤조일 에틸에테르 가한 것), 폴리비닐알코올(가교제로서 디아지드 화합물을 혼합한 것), 폴리비닐 피롤리돈(가교제로서 디아지드 화합물을 혼합한 것)등이 있다.

그리고, 이온 감응막(2)이 노출된 부분(효소 고정화막이 형성되는 부분) 및 경화한 포토레지스트가 형성되어 있는 이온 감응막(2)에 실란 결합제의 용액(예컨대, 1중량%3-아미노프로필 트리에톡시 실란용액)을 스핀코우트하고, 가열(예컨대 110℃ 5분간)하여 표면에 아미노기를 도입하고, 다시금 이를 5중량% 정도의 글루탈 알데히드 용액에 침지(예컨대 15분간)한후, 수세· 건조한다.

그 위에서 왼충액〔예컨대,PIPES·NaOH 완충액(0.1 M, pH 6.8), HEPES 완충액 (0.1 M, pH7.5), 트리스-염산염완충액〕을 용액으로 하는 소혈청 알부민 용액(예컨대, 30mg/ml)과 우레아제 용액(예컨대, 50mg/ml)과 글루탈 알데히드 용액(예컨대, 2중량%)과를 혼합한 효소 용액을 스핀코우트 한다.

스핀코우트는, 예컨대 미까사 가부시끼가이샤제 스핀나-IH-D₂형을 사용하여 행할 수가 있으며, 예컨대 3000rpm로서 10분간 25℃로서 행하면, 1회의 조작으로 1μm의 효소 고정화막(3)을 이온 감응막(2)위에 피착할수 있다.

따라서, 임의의 두께의 효소 고정화막(3)을 형성할 수가 있고, 두께 3-100μm의 것을 형성하기 위해서는, 상기 조작을 약3-100회 반복하므로서 형성할 수가 있다. 또, 1회의 조작에 의해 피착되는 효소 고정화막(3)의 두께는, 효소용액의 점도를 변화시킴으로서 바꿀수가 있다. 그리고, 효소용액을 스핀코우트한 후, 방치(예컨대 30분 이상)하고, 경화한 포토레지스트를 용해하고, 또한 효소 고정화막을 용해하지 않는 용매(예컨대, 아세톤)에 침지하고(바람직하기로는 초음파를 부여한다)포토레지스트를제거한다. 이것에 의해 이온 감응막(2)위의 일부에 효소 고정화막(3)이 형성된다. 또한, FET를 보호하기 위하여 효소 고정화막(3), 절연재(4)를 제외한 부분에 보호막(13)을 설치하는 것이 바람직하다.

상기한 방법을 사용하므로서, 효소 고정화막(3)의 두께를 정확하게 제어할 수 있고, 두께 3-100μm의 것을 확실히 또한 용이하게 작성할 수가 있다.

그리고, p형 실리콘기판(1)위에 효소 고정화막(3)을 갖지않는이외는, 상기한 효소센서와 동일한 구성을 갖는 대조용 전극을 설치하는 것이 바람직하다. 대조용 전국은 다른기판에 설치하여도 좋지만, 동일기판위에 설치하는 편이 측정할 때 하나의 센서를 피검액에 침지하는 것만으로서 끝나며, 또한 형성되는 FET도 상당히 균질인 것을 형성할 수 있으므로 바람직하다. 그리고, 이 대조용 감응막위에, 열 또는 산등으로 실활시킨 효소의 고정화막을 설치하는 것이 바람직하다. 이와같이하면 더욱 드리프트 등의 영향을 파악할 수 있기 때문이다.

다음에, 본 발명의 효소 센서(8)에 사용되는 측정회로를 설명한다. 측정회로는 제2도에 나타낸대로이며, 이는 상기한 대조용 전극(11)용의 측정회로를 포함함 것이다. 이 측정회로는 피검액과 이온 감응막간의 계면 전위의 변화를 직접 측정하기 위한 것이다. 또, 피검액에 대한 응답특성은, 효소 고정화막을 갖는 효소 센서(8)와, 대조용으로서 효소 고정화막을 갖지 않거나 실활시킨 효소의 고정화막을 갖는 FET로서 구성된 대조용 전극(11)용과의 차동 출력으로부터 측정한다.

측정회로를 간단히 설명한다.

연산 증폭기로서된 귀환 회로에 의해 효소 센서(8) 및 대조용 전극(11)에는 일정한 드레인 전류가 흐르며, 또, 소오스, 드레인 간에는 항상 일정한 전압이 가하여지고 있다. 용액의 전위는 Ag/AgC1전극(12)에 의해 일정하게 유지되며, 용액의 pH변화에 의해서 생기는 용액과 이온 감응막계면 전위변화가 A,B단자에 나타난다. 이 두 개의 출력을 차동 증폭기(9)에 입력하고, 그 차의 출력이 리코오더(10)에 시간 변화로서 기록된다.

다음에, 실시예를 들어 설명한다.

[실시예 1∼4]

하기 방법에 따라서, 제1도에 나타낸 구조의 ISFET를 사용한 효소 센서(8)를 작성하였다.

(1) FET의 작성

P형 실리콘기판(1)을 사용하고, 포코레지스트법, 방전처리법을 조합하여 기판의 일부에 FET를 성형하였다.

(2) ISFET의 작성

상기 FET가 형성된 구조물을 사용하여, FET의 게이트부(5)와는 거리를 둔 위치에서 FET의 게이트부(5)의 위에 걸쳐 절연재(4)(SiO₂)를 설치하였다. 다시금, FET의 게이트부(5)의 절연재를 얇게 깎았다. 그리고, FET의 게이트부(5)위 및 게이트(5)와는 거리를 둔 위치의 절연재(4)의 위에 이온 감응막(2)으로 되는 산화이리듐막을, 5×10^-3Torr진공화, 순효소중에서 반응성 스팻터법을 사용하여 형성하였다. 막두께는 800Å이었다.

또, FET의 소오스부(7)와 드레인부에는 각각 전극을 설치하였다.

(3) 효소 센서의 작성

그리고, 포지티브형 포토레지스트를 FET의 이온 감응막(2)위에 스핀코우트하고, 효소 고정화막(3)이 형성되는 부분(150×500μm)이외를 노광하여 현상한후, 이온 감응막(2)과 효소 고정화막(3)이 형성되는 부분의 포토레지스트를 제거하였다.

다음에, 이온 감응막이 노출한 부분(효소 고정화막이 형성되는 부분) 및 경화한 포토레지스트가 형성되고 있는 이온 감응막(2)에 실란 결합제의 용액 1중량%3-아미노프로필 트리에톡시 실란용액을 스핀코우트하고, 110℃로서 5분간 가열하여 표면에 아미노기를 도입하고, 다시금 이것을 5중량%의 글루탈알데히드 용액에 15분간 침지한후, 수세, 건조하였다.

그렇게한후, 300mg/ml 소혈청 알부민용액〔0.1 M, pH 7.5 HEPES 완충액〕에 50mg/gl의 우레아제 용액과 2중량% 글루탈 알데히드 용액을 혼합한 효소 용액을 스핀코우트 하였다. 스핀코우트는, 미까사 가부시끼가이샤제 스판니 IH-D₂형을 사용하여 3000rpm로서 10분간 25℃로서 행하고, 이 조작을 반복하므로서, 우레아제 고정화막두께 3μm(실시예1), 5㎛(실시예 2), 10μm(실시예3), 20μm(실시예4)의 것을 작성하였다.

그리고, 효소 용액을 스핀코우트한 후 30분이상 방치하고, 경화한 포토레지스트를 아세톤에 침지하여 초음파를 부여하여 제거하고, FET를 보호하기 위하여 효소 고정화막(3), 절연재(4)를 제외한 부분에 보호막(13)을 설치한 요소센서를 작성하였다.

스핀코우트법을 사용하므로서 우레아제 고정화막의 두께를 약 1μm의 정밀도를 제어할 수 있었다. 또, 이온감응막(2)노출면과 효소 고정화막(3)과의 밀착성은 양호하였다.

[비교예 1]

스핀코우트를 반복하지 않는 이외는, 실시예 1과 같은 방법을 사용하여, 우레아제 고정화막 두께1μm의 요소 센서를 작성하였다.

[비교예 2]

실시예 1에서 사용한 것과 같은 ISFET의 이온 감응막(2)위에, 0.2M트리스-염산염 완충액 (pH8.5)-15%소혈청 알부민 용액에 우레아제를 용해시킨 5μ1를 마이크로실린지로 채취하여 도포하고, 바람에 건조시킨 후 25용적%의 글루탈알데히드 용액 0.5μ1를 적하하고, 가교반응에 의해서 우레아제 고정화막을 성막하여 요소 센서를 작성하였다. 이 요소 센서의 우레아제 고정화막의 두께는 약 80μm였었다.

[시험예 1]

실시예 1∼4, 비교예 1,2의 요소센서의 출력 전압 및 응답 속도를 다음의 방법에 의해 측정하였다.

측정은, 20mM 의 pH 7.5 HEPES 완충액중에서 요소농도 10mg/d1, 100mg/d1, 1000mg/d1에 대해서 행하고, Ag/AgC1전극에 의해 게이트 바이어스를 조정하여 게이트 표면전위(출력전압)의 변화 및 그때의 응답속도를 측정하였다.

제3도는 출력전압에 대해서의 결과를 나타낸 것이며, 종축이 출력전압이며, 횡축은 효소 고정화막(3)의 두께이다.

제4도는 응답속도에 대해서의 결과를 나타낸 것이며, 종축이 응답시간이며, 횡축은 효소 고정화막(3)의 두께이다.

제3도에서는, 효소 고정화막 두께가 1μm로부터 두꺼워짐에 따라서 출력전압은 급속하게 상승하고, 10μm정도로서 포화에 도달하고, 그후는 감소하는 경향이 있다는 것이 나타내어지고 있다. 그리고, 효소 고정화막 두께 3-20μm인 실시예 1∼4의 것은, 충분한 출력전압을 가지며 감도가 높다는 것을 알았다.

제4도에는, 효소 고정화막(3)이 얇을수록 응답속도가 빠르다는 것이 나타내어지고 있다. 또 응답속도에는 기질(요소)의 농도 의존성이 보였다. 그리고, 효소 고정화막 두께 3-20μm인 실시예1∼4의 것은, 충분한 응답속도를 갖는 것이라는 것을 알았다. 특히 바람직하기로서는, 효소 고정화막 두께 3-10μm이라는 것도 알 수 있었다.

다음에, 제9도에 나타낸 P형 실리콘층(21)을 사파이어기판(20)위에 태운 예를 설명한다.

본 발명의 효소 센서는, 사파이어기판(20)위에 FET와 이 FET에서 조금 떨어진 위치에 효소 고정화막(3)을 고정한 이온 감응막(2)이 절연재(4)의 위에 설치되어 있으며, 또한 FET는, 드레인D(6)과 소오스(7)와 게이트G(5)를 기지고 있으며, 게이트는 이온 감응박(2)와 접속되어 있다.

사파이어기판(20)으로서는, 막두께 0.30mm이상의 것이 바람직하게 사용된다. 막두께가 0.30mm미만에서는 효소 센서로서 형성된 것의 사용시의 강도에 견딜 수 없는 우려가 있기 때문이며, 또 1.0mm이상에서는, 칩형으로 가공할 때 절단이 곤란하며, 재료비용도 높아지기 때문이다. 이 사파이어기판(20)의 위에 태우는 이온 감응부로 되는 실리콘층(21)(예 P형 실리콘)의 막두께는 0.53 ±0.05정도가 바람직하다. 이런 경우, 비저항 20Ω.cm 정도 이하의 것을 사용한다.

FET는, 사파이어기판(20)위에 통상이 방법에 의해 형성되지만, 일반적으로 사파이어기판(20)위에 n형 또는 p형 실리콘을 에픽택셜 성장시켜 설치한 실리콘층(21)을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, m형 실리콘층을 갖는 것에 있어서는, 소오스, 드래인으로 되는 부분에 p형 실리콘을 호트레지스트(hot-resist)법, 방전처리법, 열확산법 등 공지의 방법을 사용하며, 또 그들을 조합하여 FET를 형성시킨다.

FET의 위치는 사파이어기판(20)위의 단부부근에 설치하는 것이 바람직하다. 또, 이온감응막(2)은 FET의 게이트(5)와 떨어진 다른 단부부근에 설치하는 것이 바람직하다. 그와 같이하면, 사파이어기판(20)의 전체를 유효하게 이요할 수 있으며, 더구나 절연 기술상으로도 유리하게 되기 때문이다.

그리고, 사파이어기판(20)의 다른 단부에 이온 감응막(3)이 형성되어 있다. SOS구조의 것을 사용한 경우, 이 위에 절연재(4)를 태우고, 그 위에 이온 감응막(3)을 형성한다. 절연제(40로서는 SiO₂가 잘 알맞게 사용된다. 이온 감응막(2)으로서는, 산화 이리듐 또는 산화파라듐이 아용된다. 이들의 것을 사용한 모든 것은 pH강도가 우수하기 때문이다. 이온 감응막(2)을 설치하는 방법으로서는, 반응성 파라듐을 사파이어기판(20)위에 증착하는 방법이 잘알맞게 사용된다.

FET의 게이트(5)와 이온 감응막(2)은 도전성재료(산화 이리듐, 산화파라듐 등)로서 접속되어 있다. 그리고 , 이온 감응막(2)위에는, 효소 고정화막(3)이 고정되어 있다. 효소 고정화막(3)은, 효소를 함유함과 함께 그 효소를 이온 감응막(2)위에 지지하는 작용을 갖는다.

본 발명에 사용되는 효소로서는, 기질을 분해하여 프로톤을 발생시키는 것이라면 사용할 수 있고, 예컨대 우레아제(요소검출용), 글루코오스 옥시다아제(글루코오스 검출용), 페니실리나아제(페니실린 검출용), 트립신(펩타이드 검출용), 리파아제(지방산 검출용), 예컨대 포스포리파아제(아세틸콜린 검출용), 펩티다아제(스레오닌 검출용)등을 들수가 있다.

또, 효소 고정화박(3)을 산화 이리듐 또는 산화파라듐 이온 감응막(2)위에 피착하자면, 총사의 효소고정화법을 사용할 수 있으며, 예컨대 소의 혈청 알부민을 가한 트리스-염산완충액에 효소를 녹여, 이것을 이온 감응막(2)위에 도포하여 건조시킨후, 글루탈 알데히드 용액을 적하하여 가교반응에 의해 고정화하는 방법을 들 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 효소 고정화막(3)과 산화 이리듐막과의 밀착성은 매우 양호하다. 막두께는 특별한 제한은 없지만, 통상 400∼1000Å로 되도록 피착된다. 또, 효소 고정화막(3)의 두께로서는 50∼100μm정도로 설정하는 것이 바람직하다.

그리고, 사파이어기판(20)위에, 효소 고정화막(3)을 갖지않은 이외는, 상기한 효소 센서와 동일한 구성을 갖는 대조용 전극을 설치하는 것이 바람직하다. 대조용 전극은, FET의 드리프트 등을 보기위한 것이다. 대조용 전극은 다른 기판위에 설치하여도 좋지만, 동일한 기판위에 설치하는편이, 측정에 있어서도 하나의 센서를 피검액에 침지하는 것만으로소 끝나며, 다시금 형성되는 FET로 상당히 균질한 것을 형성할 수 있어서 바람직하다. 그리고, 이 대조용 전극은, 상술한 바와같이 기본 구성은 상기한 센서에도 있는 구성과 같지만, 효소 고정화막이 설치되어 있지 않는점이 상위한 것이다. 보다 바람직하기로는 열 또는 산 등으로 실활시킨 효소의 효소 고정화막을 설치하는 것이다. 이렇게하는 편이 보다 드리프트 등의 영향을 파악할 수 있기 때문이다.

다음에, 본 발명 효소 센서에 사용되는 측정회로는, 상술한 제2도에 나타낸 바와 같다.

[실시예 5]

하기 방법애 따라서, 제9도에 나타낸 구조의 분리게이트형 ISFET를 사용한 효소 센서(8)를 작제하였다.

(1) FET의 작성

판두께 350μm의 사파이어기판(20)의 한쪽의 면상에, 실리콘층(21) 폭0.5, 길이6mm, 두께0.60μm(에피택셜 성장한것)을 설치하고, SOS(실리콘 온 사파이어 : Sillicon on Sapphire)구조물을 형성하였다. 그리고, 상기 실리콘층(21)위에, 호트레지스트법, 방전처리법을 조합하여 기판의 일부에 FET를 형성시켰다.

(2) 분리게이트형 ISFET의 작성

상기 FET가 형성된 SOS구조물을 사용하여, FET의 게이트부(5)와는 거리를 둔 위치이며, 실리콘층(21)이 형성되어 있는 사파이어 면상이며, 또한, FET의 게이트부(5) 및 그것을 넘어가도록 절연재(4)(SiO₂)를 설치하고, 그위에 이온 감응막(2)으로 되는 산화이리듐감응막, 5×10^-3Torr진공하에서 순산 소중에 반응성 스팻터법을 사용하여 형성시켰다. 막두께는 800Å이었다. 그후, 상기 FET의 게이트부(5)와 이온 감응막(2)을 짧은 도선에 의해 결합하였다. 또 FET의 소오수부(7)과 드레인부(6)에는 각각 전극을 설치하였다. 그후, 전극을 완전히 싸여지게 하지 않도록 FET, 도선 이온 감응막(2)을 절연체(4)(질화규소)로서 절연하였다. 다시금, 절연물의 일부를 제거하여 150×500μm의 이온 감응막(2)의 노출면을 설치하였다. 이 노출면에 하기 방법에 의하여 효소 고정화막(3)을 성막하였다.

(3) 효소센서의 작제

0.5M트리스-염산완충제(pH8.5)-15%소의 혈청 알부민용액〔나까바이가가꾸야꾸힝 가부시끼가이샤제〕에 우레아제〔도오요보오세끼 가부시끼가이샤체〕를 용해시킨 액 5μl을 마이크로 실린지로서 채취하고, 이온 감응막 노출면의 위에 도포하여 바람에 의해 건조시킨 다음, 25용적%의 글루탈 알데히드 용액 0.5μl 적하하고, 가교반응에 의해서 우레아제 고정화막을 성막하여 요소센서를 작제하였다.

이와같이하여 피착한 우레아제의 효소 고정화막(3)과 산화 이리듐막과의 밀착성은 양호하였고, 3주간 정도의 측정을 반복한 내구성 시험의 결과에 있어서는, 열화나 센서 특성의 저하는 보이지 않았다.

[실시예 6]

우레아제의 대신에 글루코오스 옥시다아제〔나가세 세이까가꾸 고오교 가부시끼가이샤제〕를 사용한 이외는, 상기 우레아제 고정화막의 경우와 마찬가지로 하여 글루코오스 센서를 작제하였다. 피착한 글루코오스 옥시다아제이 효소 고정화막(3)과 산화 이리듐막과의 밀착성은 실시예(5)와 마찬가지로 양호하였다.

이상과 같이하여 작제한 효소 센서를 사용하여 이하의 시험을 행하였다.

[시험예 2]

실시예 5에서 작제한 요소센서의 출력응답 특성을 다음의 방법에 의해 조사하였다. 즉 0.01M트리스-염산완충제(pH7.0)중에 요소를 20mg/d1 또는 50mg/d1로 되도록 첨가했을때의 출력 전압의 시간변화를 조사하였다. 더구나 측정은 30℃로서 행하였으며, 전위는 Ag/AgC1전극에 대하여 측정하였다.

결과를 제5도에 나타낸다.

제5도에 나타낸 바와 같이, 출력전압에는 느슨하기는 했으나 커다란 변화가 보였다. 또, 응답속도는 통상의 ISFET와 같은 정도였었다.

[시험예 3]

실시예 5에서 작제한 요소센서의 요소에 대한 검량선을 작성하였다. 시험은, 요소농도를 5-1000ng/d1의 범위로 바꾼이외는 시험예 2와 마찬가지로 하여 행하였다. 요소첨가후 5분후의 출력전압을 기본으로하여 작성한 검량선을 제6도에 나타낸다.

제6도에 나타낸 바와 같이, 요소농도 10-100mg/d1의 범위에서 출력전압에 약 15mV의 변화가 보였다. 이것으로 해서, 본 발명의 요소 센서가 실용으로 제공할수 있는 것이라는 것을 알았다.

[시험예 4]

실시예 (6)에서 작제한 글루코오스센서의 출력응답 특성을 시험예2와 마찬가지로 하여 조사하였다. 결과를 제7도에 나타낸다.

[시험예 5]

실시예에서 작제한 글루코오스센서의 글루코오스에 대한 검량선을 작성하였다. 결과를 제8도에 나타낸다.

제8도에 나타낸 바와 같이, 글루코오스 농도 10-100mg/d1의 범위에서 출력전압에 약 11mVNO 변화가 보였다. 따라서 본 발명의 글루코오스 센서도 요소 센서와 마찬가지로 실용에 제공할수 있는 것이라는 것을 알수 있었다.

더구나, 본 실시예에서는, 효소 센서로서 요소 센서와 글루코오스 센서에 대하여 설명하였으나, 다른 효소센서 다시금 일반적으로는 모든 바이오 센서에도 적용된다.

Claims

ISFET의 이온 감응막을 효소 고정화막으로 피복하는 효소 센서로서, ISFET의 게이트부에서 떨어진 위치에, pH에 감응하고 또한 도전체인 이온 감응막을 갖는 분리게이트형 ISFET와, 스핀 코우트법에 의해 제어되어 형성된, 이 이온 감응막상을 직접 밀착하여 피복하는 3μm내지 100μm의 일정한 두께로 균질한 효소 고정화막을 구비하는 것을 특징으로 하는 효소센서.
제1항에 있어서, 이온 감응막은 산화이리듐인 것을 특징으로 하는 효소센서.
제1항에 있어서, 이온 감응막은 산화파라듐인 것을 특징으로 하는 효소센서.
제1항에 있어서, 이온 효소 고정화막은 효소로서 우레아제를 함유하여 요소농도를 센스하는 것을 특징으로 하는 효소센서.
제1항에 있어서, 이온 효소 고정화막은 효소로서 글루코오스 옥시다제를 함유하여 글루코오스농도를 센스하는 것을 특징으로 하는 효소센서.
ISFET의 이온 감응막을 효소 고정화막으로 피복하는 효소 센서로서, 사파이어 기판과, 이 사파이어 기판상에 형성된, ISFET의 게이트부에서 떨어진 위치에, 이온 감응막을 갖는 분리게이트형 ISFET와, 스핀 코우트법에 의해 제어되어 형성된, 이 이온 감응막상을 직접 밀착하여 피복하는 일정한 두께로 균질한 효소 고정화막을 구비하는 것을 특징으로 하는 효소센서.
제6항에 있어서, 이온 감응막은 산화이리듐인 것을 특징으로 하는 효소센서.
제6항에 있어서, 이온 감응막은 산화파라듐인 것을 특징으로 하는 효소센서.
제1항에 있어서, 효소 고정화막은 효소로서 우레아제를 함유하여 요소농도를 센스하는 것을 특징으로 하는 효소센서.
제1항에 있어서, 효소 고정화막은 효소로서 글루코오스 옥시다제를 함유하여 글루코오스농도를 센스하는 것을 특징으로 하는 효소센서.
제6항에 있어서, 효소 고정화막의 두께는 3μm∼ 100μm인 것을 특징으로 하는 효소센서.
ISFET의 이온 감응막에 효소 고정화막을 피복하는 효소 센서의 제조방법으로서, 게이트부에서 떨어진 위치에, 이온 감응막을 갖는 분리게이트형 ISFET를 작성하는 공정과, 스핀 코우트법에 의한 피복을 반복하여 이 이온 감응막상에 3μm내지 100μm의 일정한 두께로 효소를 균일하게 고정화한 효소 고정화막을 형성하는 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소 센서의 제조방법.
제12항에 있어서, ISFET는 사파이어기판을 사용하는 것을 특징으로 하는 효소 센서의 제조방법.
제12항에 있어서, 이온 감응막은 산화이리듐인 것을 특징으로 하는 효소 센서의 제조방법.
제12항에 있어서, 이온 감응막은 산화파라듐인 것을 특징으로 하는 효소 센서의 제조방법.
제12항에 있어서, 효소 고정화막은 효소로서 우레아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 효소 센서의 제조방법.
제12항에 있어서, 효소 고정화막은 효소로서 글루코오스 옥시다아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 효소 센서의 제조방법.