DE3750779T2

DE3750779T2 - Enzym-Sensor und Verfahren zur Herstellung desselben.

Info

Publication number: DE3750779T2
Application number: DE3750779T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Araki; Masashi Hara; Teruaki Katsube
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1986-02-10
Filing date: 1987-02-10
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2007-02-11
Also published as: EP0235024A2; KR870008189A; KR900000578B1; DE3750779D1; EP0235024B1; DK64187A; EP0235024A3; DK64187D0

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung:
Diese Erfindung betrifft einen Enzymsensor, der einen ISFET (Ionenselektiven Feldeffekt-Transistor) mit isoliertem Gate verwendet. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Enzymsensor, der eine Membran mit fixiertem Enzym aufweist, die direkt auf der ionenempfindlichen Membran eines ISFET mit isoliertem Gate, das ein Saphirsubstrat verwendet, abgeschieden ist, und ein Verfahren zur Herstellung des Enzymsensors.
Der Begriff "ISFET mit isoliertem Gate", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, betrifft einen FET, der eine Struktur mit der ionenempfindlichen Membran und dem Gate aufweist, erzeugt in räumlicher Beziehung auf dem gleichen Substrat.
2. Beschreibung des Stands der Technik:
Große Fortschritte wurden kürzlich in der Halbleitertechnologie und darauf beruhenden IC-Techniken gemacht. Von einem Sensor, der einen ISFET zur Messung der Konzentration von Wasserstoff- und Natriumionen verwendet, wurde von P. Bergverd, T. Matsuo und K. D. Wise in I.E.E.E. Trans. Biomedical und Engeneering BEM-19, 342 (1972) und ibidem BEM- 21, 485 (1974) berichtet.
Im allgemeinen ist ein ISFET aus einem Substrat, einer Sperrmembran und einer ionenempfindlichen Membran zusammengesetzt, wobei die ionenempfindliche Membran mit einem Gate verbunden ist. Wenn der ISFET in eine flüssige Probe eingetaucht wird, ändert sich das Oberflächenpotential der ionenempfindlichen Membran in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration. Die Änderung des Potentials wird als Änderung des Stromes, beispielsweise zwischen der Source und dem Drain, gemessen, und die Ergebnisse werden mit den Ergebnissen einer ähnlichen Messung, die in einer Standardlösung vorgenommen wurde, verglichen, wodurch die Ionenkonzentration der Probe bestimmt werden kann.
Der vorstehend beschriebene ISFET wird durch Fixierung eines Enzyms auf dessen ionenempfindlicher Membran zum Abbau einer zu messenden Substanz und Erzeugung von Wasserstoffionen in einen Enzymsensor umwandelt. Ein herkömmliches Verfahren, das zum Fixieren eines Enzyms auf der ionenempfindlichen Membran verwendet wird, schließt die Schritte ein: Mischen von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTE), das einen Typ eines Silan-Kopplungsmittels darstellt, mit destilliertem Wasser und Eintauchen des ISFET in die Lösung des Gemisches, um eine Reaktion auszulösen, durch die Aminogruppen in die ionenempfindliche Membran eingeführt werden. Daran schließt sich das Beschichten der ionenempfindlichen Membran mit einer Fixierungsmembran-Stammlösung an, deren Hauptinhaltsstoff Glutardialdehyd ist, wobei etwa ein Verfahren wie Tauchbeschichtung angewendet wird. Die Folge ist, daß die Amino- und Aldehyd-Gruppen Bindungen des Typs -CH=N- bilden. Aufeinander folgende Schritte schließen ein: Eintauchen des vorstehend Erwähnten in eine verdünnte Glutardialdehydlösung, um die Aldehydgruppen auf der Fixierungsmembran einzuführen, sodann Beschichten des Ergebnisses mit einer Enzym- (z. B. Urease-) Lösung zur Fixierung der Urease auf der Fixierungsmembran durch eine Reaktion zwischen den Aminogruppen der Urease und den Aldehydgruppen auf der Oberfläche der fixierten Membran. (Siehe "Biosensors", herausgegeben von Shuichi Suzuki, Kodansha Scientific.)
Der Enzymsensor, der durch das vorstehende Verfahren erhalten wird, hat jedoch Nachteile wie etwa geringe Ansprechgeschwindigkeit und niedrige Empfindlichkeit. Die Erfinder haben herausgefunden, daß der Grund dafür darin besteht, daß die Membran mit dem fixierten Enzym auf der ionenempfindlichen Membran fixiert ist, und haben die vorliegende Erfindung auf der Grundlage dieser Erkenntnis perfektioniert.
Ein anderer herkömmlich erhältlicher Enzymsensor wird um einen MOSFET gebildet, der ein MOS-Substrat aufweist. Dieser Enzymsensor zeigt auch eine Reihe von Problemen wegen eines Aufbaus, bei dem eine Membran mit fixiertem Enzym direkt auf dem Gate-Bereich des MOSFET abgeschieden wird. Genau gesagt, sickert die Flüssigkeit in den Gate-Bereich, wenn der Sensor in eine flüssige Probe getaucht wird. Auch ist der Gate-Bereich lichtempfindlich, wodurch Drift auftreten kann. Außerdem ist es notwendig, die Materialoberfläche des Gate mit einem Silan-Kopplungsmittel zu behandeln, um die Membran mit dem fixierten Enzym auf dem bei diesem herkömmlichen Enzymsensor verwendeten Gate ab zuscheiden. Folglich ist der Herstellungsprozeß für den Sensor kompliziert.
Die Untersuchung von ISFETs mit isoliertem Gate wird fortgesetzt, um die vorstehend erwähnten Nachteile auszuschalten und das Ansprechen des ISFET zu stabilisieren. Bei einem ISFET mit isoliertem Gate braucht nur der ionenempfindliche Teil in die flüssige Probe eingetaucht zu werden und das Gate des FET wie auch die Sourcen- und Drain-Teile sind so gebaut, daß sie sowohl von Licht als auch äußeren Feldern abgeschirmt sind. Das soll das Ansprechen stabilisieren.
Solange jedoch ein Isolator als ionenempfindliche Membran verwendet wird wie bei dem herkömmlichen Gate-Material, ist die Bildung der Struktur des isolierten Gate schwierig. In Anbetracht dieser Umstände fanden die Erfinder kürzlich heraus, daß, wenn eine elektrisch leitende Iridiumoxid-Membran als ionenempfindliche Membran verwendet wird, das Iridiumoxid eine hervorragendes Haftvermögen bezüglich der Sperrmembran ausübt und das Iridiumoxid als hervorragender pH-Sensor mit guter pH-Empfindlichkeit zu funktionieren vermag. (T. Katsube; 1984 International Conference on Industrial Electronics, Control and Instrumentation; October 22-26, 1984).
ISFETs vom bislang erhältlichen Typ werden jedoch gewöhnlich unter Verwendung eines Silizium-Substrats hergestellt. Wenn ein solcher ISFET in einem Enzymsensor verwendet wird, ist es notwendig, das Silizium-Substrat von der Lösung, in die der Sensor bei Gebrauch getaucht wird, zu isolieren. Zu diesem Zweck wird auf der Oberfläche des Silizium-Substrats durch Versehen des Silizium-Substrats mit Löchern und anschließender Oxidationsdurchführung eine oxidierte Membran erzeugt. Diese Methode zieht ein kompliziertes Herstellungsverfahren nach sich und die erzeugte Oxidmembran ist spröde und neigt zum Brechen. Folglich ist es schwierig, die Isolierungseigenschaft zu erhalten. Außerdem besitzt der ISFET, das das Silizium-Substrat verwendet, nicht genügend Festigkeit, so daß der Enzymsensor, der diesen ISFET verwendet, schwierig zu handhaben ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Enzymsensor mit hoher Ansprechgeschwindigkeit und hervorragender Empfindlichkeit zur Verfügung zu stellen, was durch Verbessern der Membran mit dem fixierten Enzym erreicht wird.
Der Enzymsensor entsprechend der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß er einen ISFET mit isoliertem Gate umfaßt, der eine ionenempfindliche Membran aufweist, die auf einem Isolator und abgesetzt von einem Gate- Bereich des ISFET und diesen überlappend erzeugt ist; wobei ein Teil des Isolators über dem Gate-Bereich abgetragen ist, um eine dünne Schicht davon zurückzulassen, und die ionenempfindliche Membran auf der dünnen Schicht des Isolators und auf dem Rest des Isolators, entfernt von der dünnen Schicht, erzeugt wird; die ionenempfindliche Membran ein elektrisches Potential entsprechend dem pH erzeugt und das Potential zum Gate-Bereich weiterleitet; und eine Membran mit fixiertem Enzym, die eine im wesentlichen einheitliche Dicke von 3 bis 100 um aufweist, die ionenempfindliche Membran direkt beschichtet.
Die ionenempfindliche Membran besteht vorzugsweise aus Iridiumoxid oder Palladiumoxid. Der ISFET mit isoliertem Gate ist vorzugsweise auf einem Saphirsubstrat erzeugt.
Die Membran mit dem fixierten Enzym enthält Urease als Enzym zur Messung der Harnstoffkonzentration und Glucoseoxidase zur Messung der Glucosekonzentration.
Da der Enzymsensor der Erfindung die Membran mit dem fixierten Enzym in einer Dicke von 3-100 um auf der ionenempfindlichen Membran des ISFETs aufweist, ist die Ansprechgeschwindigkeit hoch und hat der Sensor eine zufriedenstellende Empfindlichkeit. Das ermöglicht es, die Konzentration einer interessierenden Substanz in einer flüssigen Probe schnell und zuverlässig zu messen.
Da der ISFET zum Typ mit isolierenden Gate gehört, muß nur der Teil mit der ionenempfindlichen Membran in die flüssige Probe eingetaucht werden, und es ist unnötig, den Gate-, Drain- und Sourcen-Bereich des FET einzutauchen. Außerdem wird das Ansprechen stabilisiert, da diese Teile von Licht und äußeren Feldern abgeschirmt sind.
Außerdem kann in Übereinstimmung mit dem Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen Enzymsensors, das Erzeugung des ISFET und Abscheiden der Membran mit dem fixierten Enzym auf der ionenempfindlichen Membran des ISFET durch ein Drehbeschichtungsverfahren in einer Dicke von 3-100 um einschließt, die Dicke der Membran mit dem fixierten Enzym, die auf der ionenempfindlichen Membran erzeugt ist, genau kontrolliert werden. Das ermöglicht es, den Enzymsensor zuverlässig und leicht herzustellen.
Die Erfinder haben im Bemühen, die vorstehend erwähnten Unzulänglichkeiten des herkömmlichen Enzymsensors vom Typ mit dem gewöhnlichen ISFET auszuschalten, erschöpfende Forschung durchgeführt. Als Folge dieser Forschung haben die Erfinder herausgefunden, daß, wenn die ionenempfindliche Membran eines ISFET mit isoliertem Gate mit einer wäßrigen Lösung behandelt wird, wobei der ISFET ein Saphirsubstrat einschließt und eine Iridiumoxid- oder Palladiumoxidmembran als ionenempfindliche Membran verwendet, die Fixierung des Enzyms leicht ausgeführt werden kann, und der ISFET mit isoliertem Gate, der die Membran mit dem fixierten Enzym aufweist, hervorragende Sensoreigenschaften aufweist. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnis perfektioniert.
Da der Enzymsensor der der vorliegenden Erfindung den vorstehend beschriebenen Aufbau hat, können so hervorragende Eigenschaften wie die Stabilität des ISFET mit isoliertem Gate erhalten werden. Da der Sensor außerdem ein Enzym zu seinem Aufbau verwendet, kann die Konzentration eines Substrats mit ausgezeichneter Selektivität gemessen werden. Dank des Aufbaus des ISFET mit isoliertem Gate herrscht außerdem vergleichsweise große Freiheit hinsichtlich des Entwurfs des Bereichs, der Gestalt und Dicke der ionenempfindlichen Membran. Das hat wichtige praktische Vorteile. Da das Saphirsubstrat ausreichende Festigkeit hat, kann der Enzymsensor der Erfindung vorteilhafterweise ausreichend fest und daher leicht zu handhaben sein.
Es ist auch möglich, einen Vergleichs-FET zur Verfügung zu stellen, das heißt, einen FET, der als Kontrolle dient, bei dem kein Enzym an dem Saphirsubstrat fixiert ist oder bei dem ein inaktiviertes Enzym an dem Saphirsubstrat fixiert ist. Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird daher ein Enzymsensor bereitgestellt, der umfaßt:
- ein Paar von ISFETs mit isoliertem Gate, erzeugt auf einem Substrat, wobei jeder ISFET eine ionenempfindliche Membran aufweist, die auf einem Isolator und abgesetzt von einem Gate-Bereich jedes der ISFETs und diesen überlappend erzeugt ist; wobei ein Teil des Isolators über dem Gate-Bereich abgetragen ist, um eine dünne Schicht davon übrigzulassen, die ionenempfindliche Membran auf der dünnen Schicht des Isolators und auf dem Rest des Isolators-entfernt von der dünnen Schicht - erzeugt ist; die ionenempfindliche Membran ein elektrisches Potential entsprechend dem pH erzeugt und das Potential zum Gate-Bereich leitet;
- eine Membran, die ein darin fixiertes aktives Enzym und eine im wesentlichen einheitliche Dicke von 3 bis 100 um aufweist und die ionenempfindliche Membran eines der IS- FETs, der als Enzymsensor-Elektrode verwendet werden soll, direkt beschichtet; und
- eine Membran, die ein darin fixiertes inaktiviertes Enzym und eine im wesentlichen einheitliche Dicke von 3 bis 100 um aufweist und die ionenempfindliche Membran eines anderen der ISFETs , der als Vergleichselektrode verwendet werden soll, direkt beschichtet.
Die ionenempfindliche Membran besteht vorzugsweise aus Iridiumoxid oder Palladiumoxid.
Das Paar von ISFETs mit isoliertem Gates ist vorzugsweise auf einem Saphirsubstrat erzeugt.
Das aktive Enzym kann Urease zur Messung der Harnstoffkonzentration, Glucoseoxidase zur Messung der Glucosekonzentration sein.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich werden, in denen gleiche Bezugszeichen die gleichen oder ähnliche Teile bei allen Figuren anzeigen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Schnittansicht, die ein Beispiel für den Aufbau eines Enzymsensors entsprechend der vorliegenden Erfindung erläutert;
Fig. 2 ist ein Schaltbild, das die Schaltung einer mit dem Enzymsensor der vorliegenden Erfindung verbundenen Meßvorrichtung zeigt;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Dicke der Membran mit dem fixierten Enzym und der Ausgangsspannung zeigt;
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Dicke der Membran mit dem fixierten Enzym und der Ansprechzeit zeigt;
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die die zeitliche Änderung der Ausgangsspannung eines Harnstoffsensors gemäß einer fünften Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Eichkurve eines Harnstoffsensors für Harnstoff gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die zeitliche Änderung der Ausgangsspannung eines Glucosesensors entsprechend einer sechsten Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die die Eichkurve eines Glucosesensors für Glucose gemäß der sechsten Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Fig. 9 ist eine Schnittansicht, die ein Beispiel für den Aufbau eines Saphirsubstrates entsprechend der vorliegenden Erfindung zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Eine der Erfindung entsprechende und in Fig. 1 dargestellte Ausführungsform eines Enzymsensors wird nun beschrieben.
Der Enzymsensor dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt ein p-Typ-Siliziumsubstrat 1 mit einem darauf erzeugten FET, einen Isolator 4 und eine ionenempfindliche Membran 2, geschaffen auf dem Isolator 4, ein, die eine Membran 3 mit fixiertem Enzym an einer wenig vom FET entfernten Stelle aufweist. Der FET hat einen Drain 6, eine Source 7 und ein Gate 5, das mit der ionenempfindlichen Membran 2 verbunden ist. Obwohl die in Fig. 1 gezeigte Anordnung das p-Typ-Siliziumsubstrat verwendet, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt, da auch ein Saphirsubstrat verwendet werden kann. Ein Saphirsubstrat hat größere Festigkeit und erhöht somit die Festigkeit des gebildeten Enzymsensors.
Gemäß der Erfindung wird die Anordnung des isolierten Gates übernommen. Der Grund ist, daß mit einem ISFET mit isoliertem Gate nur der Teil mit der ionenempfindlichen Membran in eine flüssige Probe getaucht werden muß und es unnötig ist, das FET-Gate und den Teil, der Source und Drain bildet, einzutauchen. Außerdem sind diese Teile von Licht und äußeren Feldern abgeschirmt, was zu einem stabileren Ansprechen führt.
Wie vorstehend erwähnt bezieht sich der Ausdruck "ISFET mit isoliertem Gate", wie er in der vorliegenden Erfindung gebraucht wird, auf einen FET mit einem Aufbau, bei dem das Substrat, eine Sperrmembran und ein Gate mit einer Source verbunden sind, wobei die ionenempfindliche Membran und das Gate auf dem gleichen Substrat in räumlicher Beziehung erzeugt sind.
Der FET wird auf dem p- (oder n-) Typ-Siliziumsubstrat 1 durch herkömmliche Verfahren hergestellt. Beispielweise kann der FET auf einem p- (oder n-) Typ-Siliziumsubstrat dadurch hergestellt werden, daß n- (oder p-) Typ-Silizium an den Teilen, die als Source und Drain dienen sollen, erzeugt wird - nach bekannten Verfahren wie etwa einem Photolackverfahren, einem Entladungsbehandlungsverfahren oder Thermodiffusionsverfahren oder einer Kombination davon.
Es ist bevorzugt, das die Stelle, wo der FET gebildet wird, nahe dem Endteil des p-Typ-Siliziumsubstrats liegt. Die ionenempfindliche Membran 2 sollte nahe dem anderen Ende des Substrats vom Gate des FET entfernt geschaffen werden. Ein solcher Aufbau ermöglicht, das p-Typ-Siliziumsubstrat in seiner Gänze wirksam zu nutzen und ist in Bezug auf die Isolierungstechnik von Vorteil.
Der Isolator 4 ist auf dem p-Typ-Siliziumsubstrat 1 angebracht, ein Teil des Isolators über dem Gate 5 wird entfernt, so daß eine dünne Schicht davon zurückbleibt, und die ionenempfindliche Membran 2 wird auf dieser dünnen Isolatorschicht und auf dem Rest des Isolators von diesem Teil entfernt erzeugt. Siliziumdioxid (SiO&sub2;) ist zur Verwendung als Isolatormaterial geeignet. Beispiele für das Material, das zur Bildung der ionenempfindlichen Membran 2 verwendet werden kann, sind Iridiumoxid (IrO&sub2;), Palladiumoxid (PdO&sub2;), Siliziumnitrid (Si&sub3;N&sub4;), Aluminiumoxid (Al&sub2;O&sub3;) und Tantaloxid (Ta&sub2;O&sub5;). Iridiumoxid und Palladiumoxid sind wegen ihrer hervorragenden pH-Empfindlichkeit besonders bevorzugt.
Vor allem ist Iridiumoxid deshalb bevorzugt, weil die daraus gebildete ionenempfindliche Membran eine Membran mit geringem Rauschen ist und als elektrischer Leiter wirkt. Die ionenempfindliche Membran 2 wird auf dem Isolator 4 auf dem p-Typ-Siliziumsubstrat 1 durch Abscheiden des vorstehend erwähnten Materials mittels eines Verfahrens des reaktiven Zerstäubens hergestellt.
Das Gate 5 des FET, das auf dem p-Typ-Siliziumsubstrat 1 erzeugt ist, und die ionenempfindliche Membran 2 sind über den ausgedünnten Teil des Isolators 4 verbunden, wie vorstehend bekanntgegeben. Das Interface-Potential der ionenempfindlichen Membran 2 kann somit zum Gate 5 weitergeleitet werden.
Die Membran 3 mit dem fixierten Enzym, die eine Dicke von 3-100 um hat, ist auf der ionenempfindliche Membran 2 an einer vom Gate 5 entfernten Stelle geschaffen. Eine Membran mit fixiertem Enzym von dieser Dicke zeigt eine hervorragende Ansprechgeschwindigkeit und eine hohe Empfindlichkeit. Die Membran 3 mit dem fixierten Enzym enthält ein Enzym dient als Träger dieses Enzyms auf der ionenempfindlichen Membran 2.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Enzym kann jedes sein, das die betreffende interessierende Substanz abbaut und Protonen erzeugt. Beispielee sind Urease (zum Messen von Harnstoff), Glucoseoxidase (zum Messen von Glucose), Penicillinase (zum Messen von Penicillin), Trypsin (zum Messen von Peptiden), Lipase (zum Messen von Fettsäuren) und Peptidase (zum Messen von Threonin).
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren zur Schaffung der Membran 3 mit dem fixierten Enzym auf der ionenempfindlichen Membran 2 ist ein Abhebeverfahren (lift-off method) unter Verwendung eines Photolacks. Ein Beispiel für dieses Verfahren schließt ein: Drehbeschichten der ionenempfindlichen Membran 2 des FET mit einem Photolack vom positiven Typ, Einwirkenlassen von Licht auf Teile außer dem, an dem die Membran 3 mit dem fixierten Enzym erzeugt werden soll, zur Auslösung der Entwicklung, und anschließendes Entfernen des Photolacks von dem Teil der ionenempfindlichen Membran, an dem die Membran 3 mit dem fixierten Enzym erzeugt ist. Es kann ein bekannter Photolack verwendet werden, wie der, den man erhält durch Zusatz von N-Methyl-P-formyl-stilpyridinium-meta-sulfat (offengelegte japanische Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 56- 5761), Polyethylenglycolmethacrylat (dem z. B. Benzoinethylether als Sensibilisator zugesetzt ist), Polyvinylalkohol (dem eine Diazid-Verbindung als Quervernetzer zugesetzt ist) und Polyvinylpropylen (dem eine Diazid- Verbindung als Quervernetzer zugesetzt ist).
Der exponierte Teil der ionenempfindlichen Membran 2 (der Teil, auf dem die Membran mit dem fixierten Enzym erzeugt werden soll) und der Teil der ionenempfindlichen Membran 2, auf dem der gehärtete Photolack erzeugt wurde, werden mit einer Lösung einer Silan-Kopplungslösung (z. B. 1 Gew.-% einer 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung) drehbeschichtet, und das Ergebnis wird erhitzt (z. B. 5 min lang auf 110ºC) zur Einführung der Aminogruppen auf der Oberfläche. Danach folgt Eintauchen in eine 5%ige Glutaraldehyd- Lösung (z. B. für etwa 15 min) und dann Waschen und Trocknen.
Das Ergebnis wird dann von oben mit einer Enzymlösung drehbeschichtet, die durch Mischen einer Rinderserumalbumin-Lösung (z. B. 300 mg/ml), einer Urease-Lösung (z. B. 50 mg/ml) und einer Glutaraldehyd-Lösung (z. B. 2 Gew.-%) mit einer Pufferlösung [z. B. PIPES-NaOH-Pufferlösung (0,1 M, pH 6,8), HEPES-Pufferlösung (0,1 M, pH 7,5) oder Tris-Hydrochloridlösung] erhalten wird.
Der Drehbeschichtungsprozeß kann unter Verwendung einer Drehvorrichtung, Modell IH-D2, das von Mikasa K. K. hergestellt wird, ausgeführt werden. Beispielsweise ermöglicht es die Ausführung der Drehbeschichtung 10 min lang bei 3000 UpM und 25ºC, daß die Membran 3 mit dem fixierten Enzym in einem einzigen Arbeitsvorgang in einer Dicke von etwa 1 m auf der ionenempfindlichen Membran 2 abgeschieden wird.
Somit kann die Membran 3 mit dem fixierten Enzym in jeder gewünschten Dicke erzeugt werden. Um eine Dicke von 3 - 100 um zu erreichen, wird der vorstehende Arbeitsvorgang unter Verwendung der Drehvorrichtung etwa 3 bis 100mal wiederholt. Die Dicke der Membran 3 mit dem fixierten Enzym, die bei einem einzigen Arbeitsvorgang abgeschieden wird, kann durch Variation der Viskosität der Enzymlösung verändert werden. Nach Anbringen der Enzymlösung durch Drehbeschichtung läßt man das Element stehen (z. B. für mindestens 30 min) und taucht es dann (vorzugsweise unter Anwendung von Ultraschallwellen) in ein Lösungsmittel (z. B. Aceton), das den gehärteten Photolack, aber nicht die Membran mit dem fixierten Enzym lösen wird, wobei es den Photolack entfernt. Demgemäß wird die Membran 3 mit dem fixierten Enzym wird auf einem Teil der ionenempfindlichen Membran 2 erzeugt.
Vorzugsweise werden Teile außer der Membran 3 mit dem fixierten Enzym und dem Isolator 4 zum Schutz des FET mit einem Schutzfilm 13 versehen.
Die Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens macht es möglich, die Dicke der Membran mit dem fixierten Enzym genau zu kontrollieren und die Membran 3 leicht und zuverlässig in einer Dicke von 3-100 um zu erzeugen.
Es ist wünschenswert, eine Vergleichselektrode auf dem p-Typ-Siliziumsubstrat 1 zu schaffen, die als Kontrolle dient, wobei die Elektrode den gleichen Aufbau hat wie der des vorstehend beschriebenen Enzymsensors, außer daß die Membran 3 mit dem fixierten Enzym fehlt. Obwohl die Elektrode auf einem getrennten Substrat geschaffen werden könnte, ist die Anbringung auf dem gleichen Substrat vorteilhaft, da nur ein einziger Sensor in eine flüssige Probe getaucht werden müßte, wenn eine Messung durchgeführt wird. Es ist auch insofern vorteilhaft, als dies die Erzeugung eines ziemlich homogenen FET ermöglichen wird. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß eine Membran mit einem Hitze-oder Säure-inaktivierten fixierten Enzym auf der ionenempfindlichen Membran der Vergleichselektrode bereitgestellt wird. Das wird es ermöglichen, den Einfluß von Drift oder ähnlichem zu ermitteln.
Man bezieht sich nunmehr auf Fig. 2, um eine Meßschaltung zu beschreiben, die den Enzymsensor der Erfindung verwendet, der bei Ziffer 8 in Fig. 2 gezeigt ist. Es sollte bemerkt werden, daß diese Schaltung auch eine Meßschaltung für die Vergleichselektrode 11 einschließt. Die Schaltung von Fig. 2 dient zur direkten Messung einer Veränderung im Schnittstellenpotential zwischen einer flüssigen Probe und der ionenempfindlichen Membran. Außerdem wird die Ansprechcharakteristik bezüglich der flüssigen Probe gemessen, basierend auf der Ausgangsdifferenz zwischen dem Enzymsensor 8 mit der Membran mit fixiertem Enzym und der Vergleichselektrode 11, die aus einem FET ohne eine Membran mit fixiertem Enzym oder mit einer Membran mit inaktiviertem fixiertem Enzym besteht.
Diese Meßschaltung wird nun kurz beschrieben.
Wegen der Wirkung von Rückkopplungsschaltungen, die Operationsverstärker umfassen, fließt ein konstanter Drainstrom in den Enzymsensor 8 und die Vergleichselektrode 11. Auch wird über Source und Drain dieser Elemente jederzeit eine konstante Spannung aufgeprägt. Das Potential der Lösung wird durch eine Ag/AgCl-Elektrode 12 konstant gehalten und an den Anschlüssen A und B erscheint eine Änderung im Schnittstellenpotential an der Schnittstelle der Lösung und der ionenempfindlichen Membran. Diese beiden Ausgänge werden einem Differentialverstärker 9 eingegeben, der eine Ausgangsdifferenz erzeugt, die von einem Recorder 10 in Bezug zur Änderung der Zeit aufgezeichnet wird.
Beispiele der Erfindung werden nun beschrieben.

Beispiele 1-4

Der Enzymsensor 8, der einen ISFET mit dem in Fig. 1 gezeigten Aufbau verwendet, wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt:

(1) FET-Herstellung

Ein FET wurde unter Verwendung einer Kombination eines Photolackverfahrens und elektrischer Entladungsbehandlung in einem Teil eines p-Typ-Siliziumsubstrats erzeugt.

(2) ISFET-Herstellung

Als nächstes wurde der Isolator 4 (SiO&sub2;) von einer von dem Gate-Teil 5 entfernten Stelle des FET bis zu einem Teil über dem Gate geschaffen. Der Isolator 4 auf dem Gate 5 des FET wurde dann durch Abtragen dünner gemacht. Eine Iridiumoxid-Membran, die schließlich zur ionenempfindlichen Membran 2 wird, wurde auf dem Isolator 4 von einer Stelle über dem Gate 5 des FET und an einer vom Gate 5 entfernten Stelle erzeugt. Diese Membran wurde durch reaktive Zerstäubung unter einem Vakuum von 5 · 10&supmin;³ Torr in reinem Sauerstoff erzeugt. Die Dicke der Membran betrug 800 Å. Die Source 7 und Drain 6 des FET wurden jeweils mit Elektroden versehen.

(3) Enzymsensor-Herstellung

Die ionenempfindliche Membran 2 des FET wurde dann mit einem positiven Photolack drehbeschichtet, und Teile außer dem (150 · 500 um), an dem die Membran 3 mit dem fixierten Enzym erzeugt werden soll, wurden dem Licht ausgesetzt und entwickelt. Der Photolack wurde dann von dem Teil der ionenempfindlichen Membran 2 entfernt, an dem die Membran 3 mit dem fixierten Enzym erzeugt werden soll.
Als nächstes wurden der exponierte Teil der ionenempfindlichen Membran 2 (der Teil, auf dem die Membran mit dem fixierten Enzym erzeugt werden soll) und der Teil der ionenempfindlichen Membran 2 mit dem darauf erzeugten gehärteten Photolack mit einer Lösung einer Silan-Kopplungslösung (z. B. 1 Gew.-% einer 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung) drehbeschichtet, und das Ergebnis wurde bei 110ºC 5 min lang erhitzt, um die Aminogruppen auf der Oberfläche einzuführen. Danach folgte Eintauchen in eine 5%-Glutaraldehyd- Lösung für etwa 15 min und dann Waschen und Trocknen.
Das Ergebnis wurde dann von oben mit einer Enzymlösung drehbeschichtet, die durch Zusatz von 50 mg/ml einer Ureaselösung und 2 Gew.-% einer Glutaraldehydlösung zu 300 mg/ml einer Rinderserumalbuminlösung (eine 0,1 M HEPES-Pufferlösung von pH 7,5 oder Tris-Hydrochloridlösung) erhalten wurde, drehbeschichtet. Der Drehbeschichtungsprozeß wurde 10 Min lang bei 300 UpM und einer Temperatur von 25ºC durchgeführt. Dieser Vorgang wurde wiederholt, um eine Membran mit fixierter Urease herzustellen, die eine Dicke von 3 um (Beispiel 1), 5 um (Beispiel 2), 10 um (Beispiel 3) und 20 um (Beispiel 4) aufwies. Nach dem Anbringen der Enzymlösung durch Drehbeschichtung ließ man die Elemente mindestens 30 min lang stehen und tauchte sie dann unter Anwendung von Ultraschallwellen in Aceton, um den gehärteten Photolack zu entfernen. Zum Schutz des FET wurde der Schutzfilm 13 auf den Teilen außer der Membran 3 mit dem fixierten Enzym und dem Isolator 4 geschaffen. Enzymsensoren wurden derartig hergestellt.
Durch Verwendung des Drehbeschichtungsverfahrens war es möglich, die Dicke der Membran mit der fixierten Urease mit einer Genauigkeit von etwa 1 um zu regulieren. Die Haftung zwischen der exponierten Oberfläche der ionenempfindlichen Membran 2 und der Membran 3 mit dem fixierten Enzym war hervorragend.

(Vergleichsbeispiel 1)

Ein Harnstoffsensor mit einer Membran mit fixierter Urease von 1 um Dicke wurde unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1 hergestellt, mit Ausnahme der Tatsache, daß die Drehbeschichtung nicht wiederholt wurde.

(Vergleichsbeispiel 2)

Ein Harnstoffsensor wurde hergestellt durch: Beschichtung der ionenempfindlichen Membran 2 eines ISFET genauso wie das in Beispiel 1 verwendete mit 5 ul einer mit einer Mikrospritze aufgezogenen Lösung, die durch Lösen von Urease in einer Lösung erhalten wurde, die aus einer 0,2 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung (pH 8,5) und 15% Rinderserumalbumin bestand, Gebläsetrocknung des Elementes und anschließenden tropfenweisen Zusatz von 0,5 ul einer 25 Vol.-%-igen Glutaraldehydlösung zur Bildung einer Membran mit fixierter Urease durch einer Quervernetzungsreaktion. Die Dicke der Membran mit fixierter Urease des so erhaltenen Harnstoffsensors betrug etwa 80 um.

(Experiment 1)

Die Ausgangsspannungen und Ansprechgeschwindigkeiten der in den Beispielen 1-4 und den Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Harnstoffsensoren wurden nach folgendem Verfahren gemessen:
Die Messungen wurden in einer 20 mM HEPES-Pufferlösung pH 7,5 bei Harnstoffkonzentrationen von 10 mg/dl, 100 mg/dl und 1000 mg/dl vorgenommen. Die Gate-Vorspannung wurde mit einer Ag/AgCl-Elektrode eingestellt, und die Änderung des Gate-Oberflächenpotentials (Ausgangsspannung) und die Ansprechgeschwindigkeit zu dieser Zeit wurden gemessen.
Fig. 3 stellt die Ergebnisse bezüglich der Ausgangsspannung dar. Die Ausgangsspannung ist entlang der senkrechten Achse und die Dicke der Membran 3 mit dem fixierten Enzym ist entlang der waagerechten Achse aufgetragen.
Fig. 4 stellt die Ergebnisse bezüglich der Ansprechgeschwindigkeit dar. Die Ansprechzeit ist entlang der vertikalen Achse und die Dicke der Membran 3 mit dem fixierten Enzym entlang der waagerechten Achse aufgetragen.
Fig. 3 zeigt, daß die Ausgangsspannung mit Zunahme der Dicke der Membran mit dem fixierten Enzym von 1 um stark ansteigt, wobei die Ausgangsspannung bei etwa 10 um eine Sättigung erreicht und dann abfällt. Man fand, daß die Sensoren der Beispiele 1-4, bei denen die Membran mit dem fixierten Enzym Dicken von 3-20 um aufweist, zufriedenstellende Ausgangsspannungen entwickeln und eine hohe Empfindlichkeit zeigen.
Fig. 4 zeigt, daß die Ansprechgeschwindigkeit bei geringeren Dicken der Membran mit fixiertem Enzym ansteigt. Man fand, daß die Ansprechgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (Harnstoff) abhängt. Man stellte ebenfalls fest, daß die Sensoren der Beispiele 1-4, bei denen die die Membran mit dem fixierten Enzym Dicken von 3-20 um aufweist, eine zufriedenstellende Ansprechgeschwindigkeit zeigen und daß eine besonders bevorzugte Dicke der Membran mit dem fixierten Enzym 3-10 um beträgt.
Eine Ausführungsform, die die p-Typ-Siliziumschicht 21 in Fig. 9 auf dem Saphirsubstrat 20 angeordnet hat, wird nunmehr beschrieben.
Der Enzymsensor in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt ein Saphirsubstrat 20 mit einem darauf erzeugten FET und die ionenempfindliche Membran 2 ein, die auf dem Isolator 4 geschaffen ist und die die Membran 3 mit fixiertem Enzym an einer Stelle in kurzer Entfernung von dem FET daran befestigt hat. Der FET hat den Drain 6, die Source 7 und das Gate 5, das mit der ionenempfindlichen Membran 2 verbunden ist.
Das Saphirsubstrat 20 hat vorzugsweise eine Dicke von mindestens 0,30 um. Obwohl ein Enzymsensor unter Verwendung einer Dicke von weniger als 0,30 um erzeugt werden kann, hätte der Sensor zum Gebrauch nicht genügend Festigkeit. Andererseits macht eine Dicke von mehr als 1,0 um nicht nur das Schneiden schwierig, wenn das Substrat in Chips geschnitten wird, sondern erhöht auch die Materialkosten. Es ist bevorzugt, daß eine Siliziumschicht 21 (z. B. p-Typ-Silizium), die zur Erzeugung des ionenempfindliche Teils über dem Saphirsubstrat 20 liegt, eine Dicke von 0,53 um ± 0,05 um aufweist. In diesem Fall hätte das verwendete Silizium einen spezifischen Widerstand von 20 Ω·cm oder weniger.
Der FET kann nach einem herkömmlichen Verfahren auf dem Saphirsubstrat 20 erzeugt werden. Im allgemeinen ist es bevorzugt, einen FET zu verwenden, der eine auf dem Saphirsubstrat 20 durch epitaxiales Wachstum von n- oder p-Typ- Silizium geschaffene Siliziumschicht 21 aufweist. Wenn ein FET mit einer n-Typ-Siliziumschicht genommen wird, wird der FET durch Erzeugen von p-Typ-Silizium nach bekannten Verfahren, wie ein Photolackverfahren, ein Entladungsbehandungsverfahren oder Thermodiffusionsverfahren oder einer Kombination davon, an den Teilen gebildet, die als Source und Drain dienen.
Es ist bevorzugt, daß die Stelle, an der der FET erzeugt wird, in der Nähe des Endteils des Saphirsubstrats liegt. Die ionenempfindliche Membran 2 sollte nahe dem anderen Ende des Substrats vom Gate 5 des FET entfernt geschaffen werden. Solch ein Aufbau ermöglicht, das Saphir- Substrat in seiner Gänze wirksam zu nutzen und ist hinsichtlich der Isolierungstechnik vorteilhaft.
Die ionenempfindliche Membran 3 (2) wird nahe dem anderen Ende des Saphirsubstrats 20 erzeugt. Wenn ein SOS (Silicon-on-sapphire)-Aufbau verwendet wird, wird der Isolator 4 darauf angebracht, und auf dem Isolator wird die ionenempfindliche Membran 2 erzeugt. Siliziumdioxid ist zur Verwendung als Isolator 4 geeignet. Beispiele für das Material, das zur Erzeugung der ionenempfindlichen Membran 2 verwendet werden kann, sind Iridiumoxid und Palladiumoxid. Diese sind dank ihrer hervorragenden pH- Empfindlichkeit bevorzugt. Ein geeignetes Verfahren zur Schaffung der ionenempfindlichen Membran 2 ist, reaktives Palladium auf dem Saphirsubstrat 20 durch Dampfabscheidung zu erzeugen.
Das Gate 5 des FET und die ionenempfindliche Membran 2 werden durch ein elektrisch leitendes Material verbunden (Iridiumoxid, Palladiumoxid, usw.)
Die Membran 3 mit dem fixierten Enzym wird auf der ionenempfindlichen Membran 2 befestigt, enthält ein Enzym und dient als Träger dieses Enzyms auf der ionenempfindlichen Membran 2.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Enzym kann jedes sein, das die betreffende interessierende Substanz abbaut und Protonen erzeugt. Beispiele sind Urease (zum Messen von Harnstoff), Glucoseoxidase (zum Messen von Glucose), Penicillinase (zum Messen von Penicillin), Trypsin (zum Messen von Peptiden), Lipase (zum Messen von Fettsäuren, z. B. Phosphorylase (zum Messen von Acetylcholin)] und Peptidase (zum Messen von Threonin).
Ein herkömmliches Enzymfixierungsverfahren kann verwendet werden, um die Membran 3 mit dem fixierten Enzym auf der ionenempfindlichen Membran 2 aus Iridiumoxid oder Palladiumoxid abzuscheiden. Ein Beispiel für ein solches Verfahren schließt die Schritte ein: Lösen des Enzyms in einer Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung, der Rinderserumalbumin zugesetzt wurde, Beschichten der Oberseite der ionenempfindlichen Membran 2 mit der sich ergebenden Lösung und Trocknen derselben und anschließender tropfenweiser Zusatz einer Glutaraldehydlösung, um das Enzym durch eine Quervernetzungsreaktion zu fixieren. Die Haftung zwischen der auf diese Art erhaltenen Membran 3 mit fixiertem Enzym und einer Iridiumoxidmembran ist hervorragend. Obwohl der Membrandicke keine bestimmte Grenzen gesetzt ist, wird die Membran üblicherweise in einer Dicke von 400-1000 Å abgeschieden. Vorzugsweise wird die Dicke der Membran 3 mit dem fixierten Enzym auf 50-100 um angesetzt.
Es ist wünschenswert, eine Elektrode zu Vergleichszwecken auf dem Saphirsubstrat 20 bereitzustellen, wobei die Elektrode den gleichen Aufbau hat wie die des vorstehend beschriebenen Enzymsensors mit Ausnahme der Membran 3 mit dem fixierten Enzym. Die Vergleichselektrode ist zur Beobachtung der Drift des FET nützlich. Obwohl die Vergleichselektrode auf einem getrennten Substrat geschaffen werden könnte, ist das Anbringen auf dem gleichen Substrat günstig, insofern als nur ein Sensor in eine flüssige Probe eingetaucht werden müßte, wenn eine Messung durchgeführt wird. Es ist auch insofern günstig, als dies die Erzeugung eines ziemlich homogenen FET ermöglicht. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß eine Membran mit einem Hitze- oder Säureinaktivierten Enzym auf der ionenempfindlichen Membran der Vergleichselektrode geschaffen wird. Dies wird es ermöglichen, den Einfluß von Drift und ähnlichem zu ermitteln.
Die mit dem Enzymsensor dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verbundene Meßschaltung ist die in Fig. 2 gezeigte, vorstehend beschriebene.

Beispiel 5

Der Enzymsensor 18, der einen ISFET mit isoliertem Gate mit dem in Fig. 9 gezeigten Aufbau verwendet, wurde gemäß folgendem Verfahren hergestellt:

(1) FET-Herstellung

Ein SOS-Aufbau wurde durch Schaffung (mittels epitaxialem Wachstum) einer Siliziumschicht 21 mit einer Breite von 0,5 um, einer Länge von 6 um und einer Dicke von 60 um auf der Oberfläche des Saphirsubstrates 20 erzeugt, das eine Dicke von 350 um aufwies. Ein FET wurde in einem Teil des Substrates auf der vorstehend erwähnten Siliziumschicht 21 unter Verwendung eines Photolackverfahrens und elektrischer Entladungsbehandlung in Kombination erzeugt.

(2) Herstellung des ISFET mit isoliertem Gate

Als nächstes wurde der Isolator 4 (SiO&sub2;) an einer vom Gate-Teil 5 des FET entfernten Stelle auf der Saphiroberfläche mit der darauf erzeugten Siliziumschicht 21 geschaffen und so angeordnet, daß er sich über dem Gate 5 des FET und darüber hinaus erstreckt. Eine Iridiumoxidmembran, die schließlich zur ionenempfindlichen Membran 2 wird, wurde durch reaktive Zerstäubung unter einem Vakuum von 5 · 10&supmin;³ Torr in reinem Sauerstoff auf dem Isolator 4 erzeugt. Die Dicke der Membran betrug 800 Å. Danach wurden das Gate 5 des FET und die ionenempfindliche Membran 2 durch einen kurzen Leiter verbunden, und die Source 7 und der Drain 6 wurden jeweils mit Elektroden versehen. Darauffolgte die Isolierung des FET, des Leiters und der ionenempfindlichen Membran 2 mit einem Isolator 13 (Siliziumnitrid), wobei die Elektroden völlig unverhüllt blieben. Ein Teil des Isolators 13 wurde dann entfernt, um die ionenempfindliche Membran 2 mit einer exponierten Oberfläche zu versehen, die einen Oberflächenbereich von 150 · 500 um aufweist. Die Membran 3 mit dem fixierten Enzym wurde auf dieser exponierten Oberfläche nach folgendem Verfahren erzeugt:

(3) Herstellung des Enzymsensors

Ein Harnstoffsensor wurde durch Beschichten der ionenempfindlichen Membran 2 mit 5 ul einer mit einer Mikrospritze aufgezogenen Lösung hergestellt, die erhalten wurde durch: Lösen von Urease (hergestellt von Toyo Boseki K. K.) in einer Lösung, die aus einer 0,5 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung (pH 8,5) und 15% Rinderserumalbumin (hergestellt von Nakarai Chemicals, Ltd.) bestand, Gebläsetrocknen des Elementes und anschließendem tropfenweisen Zusatz von 0,5 ul einer 25 Vol.-%-igen Glutaraldehydlösung, um durch eine Quervernetzungsreaktion eine Membran mit fixierter Urease zu bilden.
Die Haftung zwischen der derartig erhaltenen Membran 3 mit dem fixierten Urease-Enzym und der Iridiumoxid-Membran war hervorragend. Die Ergebnisse eines Haltbarkeitstest, in dem Messungen über einen Zeitraum von drei Wochen wiederholt wurden, zeigten, daß es zu keiner Verschlechterung und keinem Nachlassen der Sensoreigenschaften kam.

Beispiel 6

Ein Glucosesensor wurde auf die gleiche Art hergestellt wie der, der die vorstehend erwähnte Membran mit fixierter Urease aufweist, mit Ausnahme der Tatsache, daß Urease durch Glucoseoxidase (hergestellt von Nagase Seikagaku Kogyo K. K.) ersetzt wurde. Die Haftung zwischen der abgeschiedenen Membran 3 mit fixiertem Glucoseoxidase-Enzym und der Iridiumoxidmembran war ebenso wie in Beispiel 5 hervorragend.
Die folgenden Experimente wurden unter Verwendung des Enzymsensors durchgeführt, der, wie vorstehend ausgeführt, hergestellt wurde:

(Experiment 2)

Die Ausgangs-Ansprech-Charakteristik des Harnstoffsensors, der gemäß Beispiel 5 hergestellt wurde, wurde auf folgende Art untersucht: es wurde die Änderung der Ausgangsspannung mit der Zeit untersucht, wenn einer 0,01 M Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung (pH 7,0) Harnstoff bis zu Harnstoffkonzentrationen von 20 mg/dl und 50 mg/dl zugesetzt wurde. Das Potential wurde bezogen auf eine Ag/AgCl-Elektrode bei einer Temperatur von 30ºC gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
Eine starke, wenn auch allmähliche Änderung der Ausgangsspannung wurde beobachtet, wie in Fig. 5 angezeigt. Die Ansprechgeschwindigkeit lag in der gleichen Größenordnung wie die eines herkömmlichen ISFET.

(Experiment 3)

Eine Eichkurve für Harnstoff wurde für den gemäß Beispiel 5 hergestellten Harnstoffsensor angefertigt. Dieses Experiment wurde auf die gleiche Art wie Experiment 2 ausgeführt, bis auf die Tatsache, daß die Harnstoffkonzentration über einen Bereich von 5-1000 mg/dl variiert wurde. Fig. 6 zeigt eine Eichkurve, die auf der Grundlage der Ausgangsspannung angefertigt wurde, nachdem, folgend auf den Harnstoffzusatz, 5 min verstrichen waren.
Die Ausgangsspannung zeigte eine Änderung von etwa 15 mV innerhalb eines Harnstoffkonzentrationsbereichs von 10-100 mg/dl, wie Fig. 6 andeutet. Aufgrund dieser Tatsache ist der Harnstoffsensor der Erfindung für den praktischen Gebrauch geeignet.

(Experiment 4)

Die Ausgangs-Ansprech-Charakteristik des gemäß Beispiel 6 hergestellten Glucosesensors wurde wie in Beispiel 2 untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.

(Experiment 5)

Eine Eichkurve für Glucose wurde für den Glucosesensor, der gemäß Beispiel 5 hergestellt wurde, angefertigt. Fig. 8 zeigt die Ergebnisse. Die Ausgangsspannung zeigte eine Änderung von etwa 11 mV innerhalb eines Glucosekonzentrationsbereichs (Harnstoffkonzentrationsbereichs) von 10 - 100 mg/dl, wie Fig. 8 zeigt. Aufgrund dieser Tatsache ist der Glucosesensor der Erfindung, ebenso wie der vorstehend erwähnte Harnstoffsensor, zum praktischen Gebrauch geeignet.

Claims

1. Enzymsensor, der umfaßt:

- einen ISFET mit isoliertem Gate, der eine ionenempfindliche Membran (2) aufweist, die auf einem Isolator (4) und abgesetzt von einem Gate-Bereich (5) des ISFET und diesen überlappend erzeugt ist; wobei über dem Gate-Bereich (5) ein Teil des Isolators (4) abgetragen ist und eine dünne Schicht davon zurückbleibt, die ionenempfindliche Membran (2) auf der dünnen Schicht des Isolators (4) und auf dem Rest des Isolators (4) - entfernt von der dünnen Schicht - erzeugt ist; die ionenempfindliche Membran (2) ein elektrisches Potential entsprechend dem pH erzeugt und das Potential zum Gate-Bereich (5) leitet; und

- eine Membran (3) mit fixiertem Enzym, die eine im wesentlichen einheitliche Dicke von 3 bis 100 um aufweist und die ionenempfindliche Membran (2) direkt beschichtet.

2. Enzymsensor nach Anspruch 1, wobei der ISFET mit isoliertem Gate auf einem Saphirsubstrat (20) erzeugt ist.

3. Enzymsensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ionenempfindliche Membran (2) aus Iridiumoxid besteht.

4. Enzymsensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ionenempfindliche Membran (2) aus Palladiumoxid besteht.

5. Enzymsensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Membran (3) mit dem fixierten Enzym Urease als Enzym zur Messung der Harnstoffkonzentration enthält.

6. Enzymsensor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Membran (3) mit dem fixierten Enzym Glucoseoxidase als Enzym zur Messung der Glucosekonzentration enthält.

7. Enzymsensor, der umfaßt:

- ein Paar von ISFETs mit isoliertem Gate, die auf einem Substrat erzeugt sind, wobei jeder ISFET eine ionenempfindliche Membran aufweist, die auf einem Isolator und abgesetzt von einem Gate-Bereich jedes der ISFETs und diesen überlappend erzeugt ist; wobei über dem Gate-Bereich ein Teil des Isolators abgetragen ist und eine dünne Schicht davon zurückbleibt, die ionenempfindliche Membran auf der dünnen Schicht des Isolators und auf dem Rest des Isolators - entfernt von der dünnen Schicht - erzeugt ist; die ionenempfindliche Membran ein elektrisches Potential entsprechend dem pH erzeugt und das Potential zum Gate-Bereich leitet; und

- eine Membran mit einem darin fixierten aktiven Enzym, die eine im wesentlichen einheitliche Dicke von 3 bis 100 um aufweist und die ionenempfindliche Membran eines der ISFETs, der als Enzymsensorelektrode (8) dienen soll, direkt beschichtet; und

- eine Membran mit einem darin fixierten inaktiven Enzym, die eine im wesentlichen einheitliche Dicke von 3 bis 100 um aufweist und die ionenempfindliche Membran eines anderen der ISFETs, der als Vergleichselektrode (11) dienen soll, direkt beschichtet.

8. Enzymsensor nach Anspruch 7, wobei das Paar der ISFETs mit isoliertem Gate auf einem Saphirsubstrat erzeugt ist.

9. Enzymsensor nach Anspruch 7 oder 8, wobei die ionenempfindliche Membran aus Iridiumoxid besteht.

10. Enzymsensor nach Anspruch 7 oder 8, wobei die ionenempfindliche Membran aus Palladiumoxid besteht.

11. Enzymsensor nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Enzym zur Messung der Harnstoffkonzentration Urease ist.

12. Enzymsensor nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Enzym zur Messung der Glucosekonzentration Glucoseoxidase ist.