JPS6275346A - 酵素センサ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素センサーに関する。更に詳しくは、絶縁
基板上に信頼性の高い過酸化水素電極を形成せしめるこ
とのできる酵素センサーに関する。

〔従来の技術〕

最近、酵素反応や免疫反応などの生体反応を利用した種
々のバイオセンサーが開発されており、特に臨床分野で
は、更に小型、高性能で低価格なものが求められるよう
になってきている。酵素センサーは、こうしたバイオセ
ンサーの一種であり、例えばグルコースオキシダーゼの
触媒作用を利用したグルコースセンサーは、血液や尿中
のグルコース濃度を測定するのに用いられ、実用的には
糖尿病患者に対する臨床検査用として重要である。

しかしながら、こういった＃素センサーで実用化され、
市販されているものの大半は、電極と酵素固定化膜とが
一体構造となっていないため、小型化の達成および大量
生産による低コスト化の妨げとなっている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

こうした市販酵素センサーの問題点に鑑み、最近では電
極上に直接酵素を固定化させる研究ｈｖｔａぬられ、そ
れに伴ってかなり小型化されたもの力１開発されるよう
になってきている。しかしながら、同一基板上に多数個
のセンサーを同時に形成させ、大量生産を可能とぜんと
する場合には１例えば外部電極との接続部を露出させ、
検出部のみに酵素を固定化するというように、電極基板
上の必要な部分のみに酵素を固定化させる必要がある。

本発明者らは、こうした課題を解決するために、光架橋
重合体を用いて酵素固定化膜を形成せしめることが有効
であることを見出し、絶縁基板上に形成させた金属薄膜
よりなるアノード電極およびカソード電極の少くとも前
者の電極に、光架橋重合体で固定化された酵素固定化膜
を設置した酵素センサーを先に提案している（特願昭６
０−１０３，６９９号）。

このように構成された酵素センサーは、同一基板上に多
数個の微小なセンサーを同時に形成させることができ、
大量生産を可能とさせるが、形成された１個の組合せ電
極が過酸化水素電極を構成する場合には、この電極が過
酸化水素以外の還元性妨害物質にも感応してしまうと１
１う問題のあることが新たし二児出された。

通常、こうした問題の対策としては、酵素固定化膜と電
極面との間に過酸化水素選択透過膜を設置する方法がと
られているが、上記酵素センサーの場合には、電極面上
に直接酵素が固定化されているため選択透過膜の設置は
不可能である。

そこで、本発明者らは、かかる課題の新たな解決方法を
求めて種々検討の結果、同一基板上しこ２組の組合せ電
極を形成させ、その内の１組（二つ０て、少くともアノ
ード電極上に固定化された酵素固定化膜を形成させるこ
とにより、上記課題力へ有効に解決されることを先に見
出した（特願昭６０−１７１．８５０号）。

ここに提案された酵素センサーは、同一絶縁基板上に形
成させた金属薄膜よりなるアノード電極およびカソード
電極の組合せ電極２ｆｆｌの内の１組について、少くと
もアノード電極上に固定化された酵素固定化膜を設置し
てなる。１組の組合せ電極上への酵素固定化膜の固定化
は、一般に光架橋重合体によって行われ、その光架橋重
合体で固定化される酵素固定化膜の形成は、先の提案と
同様に、光架橋性重合体と酵素との水性混合物にフォト
リングラフ法を適用することによって行われる。

また、酵素固定化膜を設置しない他の１組の組合せ電極
は、少くともアノード電極上が光架橋重合体膜によって
被覆されて用いられるが、この場合の光架橋重合体膜の
形成も、光架橋性重合体を含有する水溶液にフォトリソ
グラフ法を適用することによって行われる。

これら２．＠の組合せ電極において、各組錘にアノード
電極およびカソード電極を形成させてもよいが、カソー
ド電極を２組の組合せ電極について共通して用いられる
１個のカソード電極とし、それを各組合せ電極毎に切換
えて用いるようにすることもできる。

酵素センサーの作製に際しては、まずガラス板、塩化ビ
ニル樹脂、ポリイミド樹脂などの硬質樹脂板、５ｉｎ２
、Ｓｉ、Ｎ４などの絶縁被膜を表面に形成させたシリコ
ンウェハーなどの平らな絶縁基板上に。

アノード電極およびカソード電極の組合せ電極２組を形
成させることが行われる。、電極の形成は、金、白金（
以上アノード電極用）または銀、金、白金（以上カソー
ド電極用）などの金属材料を用し）。

図面の第１図に示されるようなリフトオフ法、基板上に
蒸着された金属薄膜をエツチング除去してパターニング
するフォトエツチング法、電極形状の窓が開いたマスク
を基板に重ね、マスクごしに電極形成物質を蒸着させる
マスク蒸着法、電極形成物質を導電材料とする導電性塗
料を電極形状に印刷するスクリーン印刷法あるいは上記
フォトエツチング法またはマスク蒸着法において蒸着の
代りに電極形成材料の無電解メッキを行なうメッキ法な
どによって行なうことができる。

第１図に示された態様では、リフトオフ法が用いられて
いる。まず、清浄された平らな絶縁基板、例えばガラス
板１上に電極部が基板露出面２の範囲内に形成されるよ
うに、ポジ型フォトレジスト３をパターニングする（工
程ａ）。次いで、真空蒸着法により、この基板上にクロ
ム薄膜４（厚さ約５００人）および金または白金薄膜５
（厚さ約０．２μｍ）を順次形成させる。ここで、クロ
ム薄膜は、電極を形成する金または白金薄膜とガラス板
基板との密着性を高めるために設けられている（工程ｂ
）。

その後、全体をアセトンなどのレジスト剥離液中に浸漬
してレジストを除去し、基板露出面２に残存する蒸着薄
膜５を電極面とした（工ｊｌ　ｃ　）。

このようにして絶縁基板上の所定の個所に、カソード電
極が１個共通して用いられる態様で、金属薄膜よりなる
アノード電極およびカソード電極となる３個の電極を形
成させたら、その内の少くともアノード電極となる１個
の電極に酵素固定化膜を設置させるが、その設置はフォ
トリソグラフ法を用いて、例えば第２図に示される如く
にして行なわれる。

まず、第１図に示された如くにして形成された絶縁基板
２上の電極面５に、光架橋性重合体と酵素との水性混合
物をスピンコード法、スプレー法などにより均一にコー
ティング６する（工程ｄ）。

光架橋性重合体としては、それが酵素水溶液と共に水性
混合物として分散されるため一般に水溶性重合体が用い
られ、例えば分子中に光架橋性基としてスチルバゾリウ
ム基、ジアゾ基などの感光性基、好ましくはスチルバゾ
リウム基を有するポリビニルアルコールなどが水溶液と
して用いられる。

水性混合物は、上記光架橋性重合体水溶液（濃度８．５
〜１２重量％）Ｉｇに対して、酵素３〜７２■を蒸留水
０．８ｍＱに溶解させた酵素水溶液が添加され、それを
数分間程度攪拌、混合してコーティングに用いられる。

コーテイング液を絶縁基板上の電極面上にコーティング
し、それが自然乾燥したら、そこをネガまたはポジの画
像を有するフォトマスク７で覆い、紫外線照射して光架
橋性重合体を光架橋させ、未架橋部分を純水で溶去して
、光架橋部分に光架橋重合体で固定化された酵素固定化
膜８を形成させる（工程ｅ）、これを再度紫外線照射し
てから乾燥させた。ここで使用されるフォトマスクは、
２組の組合せ電極の内の１組のアノード電極１１にのみ
酵素固定化膜８が形成されるような画像を有するものが
用いられる。

次に、還元性妨害物質に対する２組の組合せ電極の感応
特性を等しくするため、酵素固定化膜を設置しない他の
１組の組合せ電極のアノード電極１２に、第２図と同様
の手法により、光架橋性重合体を含有する水溶液にフォ
トリソグラフ法を適用し、そこに光架橋重合体膜９を被
覆させ、これを参照用電極とした（工程ｆ）。

これを再度紫外線照射してから乾燥し、各素子毎に分割
して、その電極露出面５．５’、５ｈにリード線１０．
１０”、１０ｋを取り付ける。このようにして作製され
た酵素センサーの御飯様が、平面図として第３図に示さ
れている。また、第４〜５図には、他の態様の酵素セン
サーの平面図が示されており、第４図の態様では、電極
面５′から２本のカソード電極１３，１３’を延長して
形成させ、各アノード−カソード間の電極間距離を短縮
させると共に、これらの各組合せ電極がそれぞれ酵素固
定化膜８および光架橋重合体膜９で覆われており、また
第５図の態様では、カソード電極１３の面積を電極１１
．１２の面積より広く設定することにより、アノードに
対するカソード電流を安定にし。

また電極間距離を一定にしたまま両電極間の対向幅を長
くすることにより、電極の応答特性の向上が図られてい
る。

この酵素センサーによって検出可能な基質とこの基質に
対して反応する触媒としての酵素との組合せの例は次の
如くであり、これらの場合両電極は過酸化水素電極とし
て作用する。

□酵 グルコース　　　　グルコースオキシダーゼガラクトー
ス　　　ガラクトースオキシダーゼし一アミノ酸　　　
　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼエタノール　　　　アルコ
ールオキシダーゼリン脂質　　　　　ホスホリパーゼ コリン　　　　　　コリンオキシダーゼグリセリン　　
　　グリセロキナーゼ このような酵素センサーをグルコースセンサーとして用
いた場合には、次のように作用する。まず、グルコース
センサーをグルコースを含まない緩衝液中に浸漬し、電
極面に、例えば金電極の場合０．８Ｖの電圧を印加して
おき、これにグルコースを添加すると、酵素が固定化さ
れた方の過酸化水素電極側で、グルコースがグルコース
オキシダーゼ酵素固定化膜に拡散し、固定化酵素の触媒
作用により次のように反応する。

この反応に伴って発生する過酸化水素は、アノード電極
上で次のように酸化され、発生した過酸化水素量に比例
した電流、即ちグルコース濃度に比例した電流が流れる
。

Ｈ２０□　　→　２８　＋Ｏ，＋２ｅ−このとき、参照
側電極には酵素が固定化されていないため、酵素反応に
よる電流は流れないので、酵素固定化側と参照側との差
動出力を検出しても、酵素固定化側の電流のみを検出す
ることができる。

この場合に、試料液中にＬ−アスコルビン酸などの還元
性妨害物質が含まれていても、妨害物質は固定化酵素の
有無によらず、両方の組合せ電極で等しく酸化されるの
で、このときにこれら両電極を流れる電流の差動出力を
検出すれば、妨害物質に起因する電流領分が相殺され、
酵素反応に起因する電流値のみを検出することができ、
例えばＬ−アスコルビン酸の場合、その濃度が０．５〜
４■／准の範囲内では、両電極で発生する妨害物質に起
因する電流を３％以下に軽減できることが確認された。

しかるに、酵素固定化膜と参照側となる光架橋重合体膜
とを光学顕微鏡でａ察すると、光架橋重合体膜が透明で
かつ均質な膜状体を形成しているのに対し、酵素固定化
膜の方は白色で、その表面に微小な凹凸が無数に形成さ
れていることが判明した。

そこで、これら両者の膜状体をなるべく同等なものとし
、これによって差動出力をより正確に検出する手段を求
めて更に検討した結果、参照側となる膜状体にも失活酵
素を固定化せしめる方法がきわめて有効であることを見
出した。

〔問題点を解決するための手段〕

従って１本発明は酵素センサーに係り、この酵素センサ
ーは、同一絶縁基板上に金属薄膜よりなるアノード電極
およびカソード電極の組合せ電極を２組形成させ、その
１組には少くともアノード電極上に固定化された酵素固
定化膜を、他の１組には少くともアノード電極上に固定
化された失活酵素固定化膜をそれぞれ設置してなる。

かかる酵素センサーの作製は、上記で図面の第１〜２図
を用いて説明した方法において、工程（ｄ）で用いられ
た光架橋性重合体含有酵素水溶液をオーブン中で酵素の
種類に応じて約８０〜１００℃で約５〜１０分間程度加
熱し、酵素を失活させた水溶液が工程（ｆ）で用いられ
る以外は、同様の方法によって行われる。そして、例え
ば第３〜５図に示される態様において、符号８側に酵素
固定化膜が、また符号９側に失活酵素固定化膜がそれぞ
れ固定化された酵素センサーが得られる。

〔作用〕および〔発明の効果〕 本発明に係る酵素センサーは、参照側にも失活酵素を固
定化させることにより、参照側電極の膜質を酵素側電極
の膜質と等しくさせ、これによって２組の組合せ電極間
の妨害物質に対する応答特性を等しくし、妨害物質信号
の差動除去特性が一層改善された。具体的には、Ｌ−７
スコルビン酸を用いた妨害物質信号の差動除去特性の測
定では、その濃度が１〜１００■／准の範囲内で１両電
極で発生する妨害物質に起因する電流を２％以下に軽減
することができ、この前の提案の０．５〜４■／准の範
囲内で３％以下という濃度範囲おび電流値と比較して、
妨害物質信号の差動除去特性のなお一層の改善が達成さ
れた。また、このような特性は、妨害物質がＬ−アスコ
ルビン酸の場合だけではなく、尿酸などの場合にも同様
に有効に発揮される。

〔実施例〕

次に、実施例について本発明を説明する。

実施例１ 光架橋性ポリビニルアルコール（光架橋性スチルバゾリ
ウム基含有量１．４モル％、けん化度８８％、重合度１
４００）の１１．７重量％水溶液０．５　ｇに、グルコ
ースオキシダーゼ酵素３０ｍｇを溶解させた蒸留水０．
４ｍＱを添加し、数分間程度攪拌、混合してコーテイン
グ液を調製する。このコーテイング液を、ガラス板上に
形成させた２組の過酸化水素電極の上に、　４０００ｒ
ｐｍ、２０秒間の条件下でスピンコードする。コーテイ
ング液が自然乾燥したら、２組の過酸化水素電極の内、
一方の組のアノード電極部分のみを紫外線照射できるよ
うなネガの画像を有するフォトマスクで覆い、紫外線照
射（出力２５０　Ｗ　）を１５秒間行ない、その後純水
による洗浄によって現像し、再び紫外線照射した。

次に、上記コーテイング液を、オーブン中で９５℃に６
分間加熱した後、上記と同様の手法により、酵素を固定
化させていない方の過酸化水素電極のアノード電極上に
適用し、そこに失活酵素固定化膜を被覆させた。

このようにして製造された酵素センサーを用い、還元性
アスコルビン酸について、妨害物質信号の差動除去特性
をｐＨ７，０，温度３７℃で測定すると、第６図に示さ
れる如く、０で示される点（し−アスコルビン酸濃度と
固定化酵素側電極を流れる電流値との関係を示している
）と×で示される点（し−アスコルビン酸濃度と参照固
定化失活酵素側電極を流れる電流値との関係を示してい
る）との差を表わすΔで示される点（Ｌ−アスコルビン
酸濃度とこれら両電極を流れる電流値の差動出力値との
関係を示している）の結果から、妨害物質濃度１〜１１
００１ａ／　ａの範囲内では、両電極で発生する妨害物
質に起因する電流を２％以下に軽減できることが確認さ
れた。

実施例２ 実施例１において、妨害物質として尿酸を用い、妨害物
質信号の差動除去特性をｐＨ７，７５、温度３７℃で測
定すると、第７図に示される如く、０、×およびΔ（第
６図の場合と同様の関係を示している）の結果から、妨
害物質濃度０．５〜４ｍｇ／　ｄＱの範囲内では、両電
極で発生する妨害物質に起因する電流を３％以下に軽減
できることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、絶縁基板上に電極を形成させる工程を順次示
した断面図である。第２図は、絶縁基板上に形成させた
２個のアノード電極の上に、それぞれ光架橋重合体で固
定化された酵素固定化膜および光架橋重合体膜（または
失活酵素固定化膜）を設置させる工程を順次示した断面
図であり、第３図はこのようにして作製された酵素セン
サーの御飯様の平面図である。第４〜５図は、本発明に
係る酵素センサーの他の態様の平面図である。また、第
６〜７図は、それぞれ妨害物質としてＬ−アスコルビン
酸または尿酸を存在させたときの差動出力特性を示すグ
ラフである。 （符号の説明） １・・・・・絶縁基板 ２・・・・・基板露出面 ５・・・・・電極 ６・・・・・光架橋性重合体含有酵素水溶液７・・・・
・画像を有するフォトマスク８・・・・・酵素固定化膜 ９・・・・・光架橋重合体膜 （または失活酵素固定化膜） １１・・・・・酵素固定化膜側アノード電極１２・・・
・・参照側アノード電極 １３・・・・・カソード電極

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、同一絶縁基板上に金属薄膜よりなるアノード電極お
   よびカソード電極の組合せ電極を２組形成させ、その１
   組には少くともアノード電極上に固定化された酵素固定
   化膜を、他の１組には少くともアノード電極上に固定化
   された失活酵素固定化膜をそれぞれ設置してなる酵素セ
   ンサー。 ２、失活酵素として熱処理された酵素が用いられた特許
   請求の範囲第１項記載の酵素センサー。 ３、固定化が光架橋重合体によつて行われた特許請求の
   範囲第１項記載の酵素センサー。 ４、カソード電極１個が２組の組合せ電極に共通して用
   いられている特許請求の範囲第１項記載の酵素センサー
   。 ５、組合せ電極が過酸化水素電極を構成している特許請
   求の範囲第１項記載の酵素センサー。