JPS63241347A

JPS63241347A - 酵素電極

Info

Publication number: JPS63241347A
Application number: JP62075687A
Authority: JP
Inventors: Koichi Ono; 浩一小野; Toyoe Moriizumi; 森泉　豊栄
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1987-03-27
Filing date: 1987-03-27
Publication date: 1988-10-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は１例えば、血液・尿などの体液に含まれる生体
成分（グルコース、尿酸など）を定量するための酵素電
極、特に９分析精度に優れかつ複数の測定項目が同時に
分析され得る酵素電極に関する。

（従来の技術）血液・尿などの体液に含まれる生体成分９例えば、グル
コースや尿酸は、それぞれ糖尿病、痛風の指標となる。

糖尿病や痛風などの成人病を早期発見するために、グル
コースや尿酸の簡便かつ迅速な検出および定量方法が求
められている。

生体成分の検出方法には、過酸化水素電極、酸素電極な
どを用いるアンペロメトリックな方法と。

ガラス電極、　ｌ５ＦＥＴ　　（イオン感応膜電界効果
型トランジスター）などを用いるボテンシオメトリック
な方法がある。グルコースや尿酸の検出・定量には２通
常、過酸化水素電極を用いるアンペロメトリックな方法
が用いられる。

グルコース、尿酸は、それぞれグルコースオキシダーゼ
、ウリカーゼの存在下で酸素と反応して。

過酸化水素を発生する。そこで１発生した過酸化水素を
電気分解し、電流値を測定することにより。

グルコース量および尿酸量を定量することが行われてい
る。この方法では、電極上に固定化酵素膜を圧着した酵
素電極が用いられる。例えば、白金。

銀などのバルク状の金属を機械加工して電極を形成し、
この電極上に固定化酵素膜を圧着した酵素電極がある。

しかし、この酵素電極では、電極が機械加工により得ら
れるため、製造が困難である。

酵素膜の装着工程や取りはずし工程において、膜の破損
を防止するには少なくとも１μｍ以上の膜厚を要する。

そのために酵素電極の応答性が低下する。電極の小型化
も達成され得ない。しかも。

複数の測定項目を同時に分析し得ない。

このような欠点を解決するために、電極と酵素固定化層
とを一体化した酵素電極が提案されている。例えば、酵
素を分散させたポリビニルアルコールを電極上にスピン
コーティングした後、フォトリソグラフィーによりポリ
ビニルアルコールを光重合させて得られる酵素電極があ
る。この酵素電極によれば、電極の小型化が達成される
。しかし、この酵素電極を用いて過酸化水素を電気分解
する場合、血液や尿中に含まれるアスコルビン酸。

尿酸などの還元性物質も同時に電気分解され、電流を生
じる。これらは、過酸化水素の電気分解における妨害物
質となる。そのために、過酸化水素の電気分解による電
流値に誤差が生じ、グルコース量や尿酸量の分析精度が
低下する。これら問題点を解決するべ（、酵素電極とと
もに参照電極を形成し、酵素電極の電流値と参照電極の
電流値との差を算出することにより、上記還元性物質に
よる誤差を低減させる試みがなされている。しかし。

この方法でも、酵素電極および参照電極の電極形状、電
極面積５分極速度、劣化速度などを完全に一敗させるこ
とは困難であり、必ずしも所望の分析精度が得られない
。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的とするところは１分析端度に優れた酵素電極を提供
することにある。本発明の他の目的は、複数の測定項目
が同時に分析され得る酵素電極を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、小型にして簡便な酵素電極
を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、生
体成分の定量が簡便かつ迅速になされ得る酵素電極を提
供することにある。

（問題点を解決するための手段）本発明は、従来の酵素電極の電極層と酵素固定化層との
間に過酸化水素選択透過膜を設けることにより、電極層
で酵素反応により生じた過酸化水素のみが加水分解され
るため２分析端度が著しく向上し得る。との発明者らの
知見に基づいて完成された。

本発明の酵素電極は、絶縁基板上に導電性薄膜電極層を
形成した酵素電極であって、該導電性薄膜電極層上に過
酸化水素選択透過膜が形成されかつ該選択透過膜の表面
に酵素固定化層が設けられてなり、そのことにより上記
目的が達成される。

絶縁基板には２例えば、スライドガラス、プラスチック
フィルムなどが用いられる。この絶縁基板上に、蒸着ま
たはスパッタリングなどの薄膜形成技術により、金、白
金などの金属薄膜を形成し。

さらにスピンコーティングやフォトリソグラフィーによ
り所望形状の導電性薄膜電極層とされる。

金属薄膜の膜厚は、１００〜５０００人、好ましくは１
００〜１０００人、さらに好ましくは１００〜５００人
に調整される。

次いで、この導電性薄膜電極層上に過酸化水素選択透過
膜が設けられる。この過酸化水素選択透過ｉ　は、アセ
チルセルロース、エチルセルロース。

ポリウレタン、ヒドロキシエチルメタクリレートなどの
親水性高分子の有機溶媒溶液を導電性薄膜電極層上にス
ピンコーティングすることにより形成される。過酸化水
素選択透過膜の膜厚は、０．１〜１００μ−１好ましく
は０．１〜５０μｍ、さらに好ましくは０．１〜０．５
μ稲に設定される。電極層と過酸化水素選択透過膜が一
体構造となっているため。

電極層が支持台となり、０．１μ稲程の膜厚においても
機械的強度の面を考慮しなくてすむ。１００μｍを上ま
わると、過酸化水素選択透過膜中での過酸化水素の透過
に時間を要し、そのために酵素電極の応答性が低下する
。

この過酸化水素選択透過膜の表面には、さらに酵素固定
化層が形成される。酵素固定化層は９例えば、過酸化水
素を生成する所望の酵素を光重合性ポリマー、例えばポ
リビニルアルコールに分散させた後、この分散液を選択
透過膜上にスピンコーティングし２次いでフォトリソグ
ラフィーにより必要な部分にのみ光重合性ポリマーを光
重合させることにより、形成される。

酵素固定化層に含まれる酵素には２例えば、グルコース
定量の場合にはグルコースオキシダーゼ。

そして尿酸定量の場合にはウリカーゼがある。グルコー
スおよび尿酸は、それぞれグルコースオキシダーゼおよ
びウリカーゼの存在下で特異的に触媒作用を受け、以下
のように反応する。

グルコノラクトン十Ｈ２０□　　　（１）ウリカーゼ尿酸量〇□＋２Ｈ２０アラントイン＋ＣＯ□＋Ｈ，０□　　（２）各反応で生
成した過酸化水素は１例えば印加電圧約０．７Ｖの下、
過酸化水素電極上で次のように電気分解される。

（アノード上）　　ＨｚＯｚ−→２Ｈ”　　＋　（ｈ　
＋　２ｅ−（３）（カソード上）　　４８”　＋Ｏ＝＋
４ｅ−−−→２　Ｈ，０（４１この時の電子のやりとり
の量は過酸化水素濃度に比例し、また過酸化水素濃度は
それぞれの基質濃度に比例することにより、グルコース
濃度および尿酸濃度がアンペロメトリックに検出可能と
なる。

本発明の酵素電極は１例えば、第１図および第２図に示
すように、絶縁基板１上に導電性薄膜電極層２を形成し
てなり、この導電性薄膜電極層２上に過酸化水素選択透
過膜３が形成され、さらにこの選択透過膜３の表面に酵
素固定化層４が設けられてなる。導電性薄膜電極層２は
クロム蒸着膜２０および金蒸着膜２１を積層して構成さ
れる。この導電性薄膜電極層２には、グルコースセンサ
ー側アノード２２．尿酸センサー側アノード２３および
カソード２４がある。過酸化水素選択透過膜３は電極全
面に形成される。酵素固定化層４には、固定化した酵素
の種類により、グルコースオキシダーゼ固定化層４０と
ウリカーゼ固定化層４１がある。

このような構成の酵素電極を検体試料中に浸すと、試料
中のグルコースはグルコースオキシダーゼにより、そし
て尿酸はウリカーゼにより、それぞれ過酸化水素を発生
する。そこで、グルコースセンサー側アノード２２およ
び尿酸センサー側アノード２３と、カソード２４との間
に電圧を印加すれば。

発生した過酸化水素が電気分解されて電流が流れる。ア
スコルビン酸や尿酸などの妨害物質は過酸化水素選択透
過膜を透過できず、電気分解され得ない。それゆえ、こ
の電流値を測定することにより、グルコース量や尿酸量
がより正確に定量される。測定に際し、既知濃度のグル
コースおよび尿酸と電流値との関係を求めて、あらかじ
め検量線が作製される。本発明の酵素電極は尿酸、グル
コースに限らず、コレステロール、タレアチニン。

ポリアミンなどの生体成分をも測定することができる。

また１つの酵素電極にて複数の項目を分析できる。

（作用）本発明の酵素電極によれば、このように、過酸化水素選
択透過膜により過酸化水素のみが選択的に透過されるた
め、アスコルビン酸や尿酸などの還元性物質゛は電極と
接触し得ない。それゆえ、これら還元性物質が妨害物質
となって、過酸化水素の電気分解による電流値に誤差を
生じることがない、その結果、生体成分の分析精度が著
しく向上する。

（実施例）以下に本発明を実施例について説明する。

実施■土第１図および第２図において、スライドガラスでなる絶
縁基板１上全面に、クロムおよび金を蒸着法により飛ば
し、クロム蒸着膜（膜厚３００人）／金蒸着膜（膜厚３
０００人）を形成した。ここで、クロム蒸着膜は、金蒸
着膜とスライドガラスとの密着性を高める作用がある。

この金／クロム薄膜上にて、ポジ型のフォトレジスト（
ＯＦＰＲ８００、東京応化社製）を用いて、第１図に示
すフォトレジストパターンを形成した後、ヨウ化カリウ
ム（Ｌｏｇ）：ヨウ素（Ｌｏｇ）：水（１００ｄ）の混
合液でなる金エツチング液を用いて金をエツチングし、
その後。

硝酸第２セリウムアンモン（２５ｇ）：過塩素酸（６，
５ｍｆ）　　：界面活性剤（数■）：水（１００＋＋＋
ｆｆ１）の混合液でなるクロムエツチング液によりクロ
ムを　　゛取り除いた。次いで、アセトンなどの有機溶
剤によりレジストを剥離して、導電性薄膜電極層２　（
２つのアノード２２．２３および１つのカソード２４と
なりうる３つの電極層）を形成した。

このように絶縁基板１上に導電性薄膜電極層２が形成さ
れた電極全面上に、アセチルセルロースのアセトン／シ
クロヘキサノン混合溶媒溶液（１％アセチルセルロース
溶液）をスピンコーティングした後、溶媒を完全に揮発
させて、過酸化水素選択透過膜３　（膜厚約０．５μｍ
）を形成した。

この過酸化水素選択透過膜３の表面に、さらに。

グルコースオキシダーゼ３０■、純水０．４−およびポ
リビニルアルコール５００■の溶液をスピンコーティン
グした。約１時間風乾後、クロムマスクを使って光照射
することにより、第１図のようにグルコースオキシダー
ゼ固定化層４０を形成した。他のコーティング部分は水
洗により取り除いた。次いで、ウリカーゼ７１”ｇ＋純
水０．６−およびポリビニルアルコール５００■の溶液
を用いて、上記と同様の方法によりウリカーゼ固定化層
４１を形成した。

その後、純水、リン酸緩衝液（ｐＨ７，０，ＯＩＭ　）
により洗浄した。過酸化水素選択透過膜３を部分的に剥
離してアノード２２．２３およびカソード２４を露出さ
せた。アノード２２とカソード２４がグルコースセンサ
ーとなり、アノード２３とカソード２４が尿酸センサー
となる。

得られた酵素電極のグルコースセンサー、尿酸センサー
のアノード、カソード間にそれぞれ０．７Ｖの電圧を印
加し、グルコース４０■／ｄ！の濃度の溶液（ｐＨ７，
５，リン酸緩衝液）に浸した時の電流値（μＡ）の経時
変化を第３図に示す。また、尿酸３■／ｄｉの濃度の溶
液（ｐＨ７，５，ＩＪン酸緩衝液）に浸した時の電流値
（μＡ）の経時変化を第４図に示す。これらの結果から
、この酵素電極は、各センサーについて、グルコースお
よび尿酸に対して高い選択性を有することがわかる。こ
の酵素電極を用いて、グルコース濃度および尿酸濃度の
異なる溶液（ｐＨ７，５，リン酸緩衝液）により、グル
コース濃度（■）および尿酸濃度（■）と電流値（μＡ
）との検量線を作製した。これらの結果を第５図および
第６図に示す。第５図および第６図から、グルコースに
おいては、０〜５０■／ｄ！、尿酸においては０〜１０
■／ｄ１の範囲内で濃度と電流値との間に直線性が得ら
れた。正常な人間の血中正常値はグルコース約１００■
／ｄ！、尿酸約５■／ａなので１本発明により作製した
酵素電極は、検体を約１０倍程度に希釈することにより
、実用化可能と考えられる。また本発明で作製した酵素
電極は、１００回連続測定において出力低下２％程度で
あった。グルコース濃度１０■／ｄ１で１日に３回連続
測定を行い、その経時変化においても６０日間で出力低
下は２％程度であった。

実施皿ｌスライドガラスでなる絶縁基板１上に、スパッタリング
法により白金膜（膜厚５００人）を形成したこと以外は
、実施例１と同様の方法により、酵素電極を得た。ただ
し、過酸化水素選択透過膜３の膜厚は０．３μ蒙、酵素
固定化層４０．４１におけるグルコースオキシダーゼ量
は２０■、そしてウリカーゼ量は１０■とした。

得られた酵素電極を用いて、実施例１と同様の方法によ
り、グルコース濃度および尿酸濃度と電流値との検量線
を作製したところ、濃度と電流値との間には実施例１と
同程度の直線性が認められた。

（発明の効果）本発明の酵素電極は、このように、電極層と酵素膜との
間に過酸化水素選択透過膜が設けられているため、酵素
反応により生じた過酸化水素のみが選択的に透過され、
電極層で加水分解される。

それにより、酵素電極の分析精度が著しく向上する。過
酸化水素選択透過膜の表面に異なる酵素固定化層を形成
すれば、複数の測定項目（例えば。

グルコースおよび尿酸）が同時に分析され得る。

しかも、この酵素電極は小型にして機械的強度に優れて
いるため、簡便かつ迅速に生体成分の定量がなされ得る
。その結果２本発明の酵素電極は。

グルコースや尿酸などの生体成分の検出および定量に有
効に利用され得る。

４、　゛　　の　　゛な普゛口第１図および第２図は、それぞれ本発明の酵素電極の一
実施例を示す平面図および側面図である。

第３図は１本発明の酵素電極を、グルコース４０■／ａ
を含む溶液に浸したときの、グルコースセンサーおよび
尿酸センサーでの電流値の経時変化を示すグラフである
。第４図は本発明の酵素電極を尿酸３■／ｄ１を含む溶
液に浸したときの、尿酸センサーおよびグルコースセン
サーでの電流値の経時変化を示すグラフである。第５図
および第６図は。

それぞれ２本発明の酵素電極において測定したグルコー
ス濃度および尿酸濃度と電流値との関係を示すグラフ（
検量線）である。

１・・・絶縁基板、２・・・導電性薄膜電極層、３・・
・過酸化水素選択透過膜、４・・・酵素固定化層、２０
・・・クロム蒸着膜、２１・・・金蒸着膜、２２・・・
グルコースセンサー側アノード、２３・・・尿酸センサ
ー側アノード。

２４・・・カソード、４０・・・グルコースオキシダー
ゼ固定化層、４１・・・ウリカーゼ固定化層。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、絶縁基板上に導電性薄膜電極層を形成した酵素電極
であって、該導電性薄膜電極層上に過酸化水素選択透過膜が形成さ
れかつ該選択透過膜の表面に酵素固定化層が設けられた
酵素電極。