JPS6375655A - 酵素電極装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は多成分溶液中における特定成分の濃度測定に用
いる酵素電極装置の改良に関する。

（従来の技術） 酵素電極は、例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）
、ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＤ）、ウリカーゼ等の
酸化還元酵素を担体または電極上に固定化したもので、
多成分溶液中における特定成分の濃度測定に用いられて
いる。即ち、多成分溶液中に含まれる物質のうち、前記
酵素によって特異的に反応する基質のみが代謝され、電
極上では基質濃度に対応した電位差または電流を発生す
るから、その電位差または電流を測定することによって
基質濃度を知ることができる。このため、上記のような
酵素電極をトランスデユーサとしたセンサ装置は、所謂
バイオセンサとして医療分野、食品分野或いはＩＮ工業
分野への応用が図られている。また、近年ではこれらセ
ンサの微小化が進み、半導体イオン１橿、微小金電極に
酵素を固定化したタイプのもの等が開発されている。

ところで、上記の酵素電極装置の開発で最も問題とされ
る点の一つは、測定節回および測定結果の直線性である
。

例えば、グルコースオキシダーゼを用いた酵素電極の場
合、検出反応は次式で示され、この式で表される化学量
論的な酸素コを特徴とする特別な酸素供給手段を設けな
い場合、この必要な酸素は試料中の溶存酸素で賄われる
。

グルコース＋　１／２０２　＋８２０ →　グルコン酸＋８２０２ しかし、糖尿病患者のグルコース１度は１５　ｍＭｏ１
以上で、健常者のグルコース濃度が７．０ｍｊｙｊｏｌ
に比較して著しく高いのに対し、ａ素の溶存命は水の場
合でも１ｍＭ０ｌと少ないため、！ことえ試料溶液を稀
釈して測定する場合でも上記の化学両輪的酸素量を充足
できない。また、体液の溶存酸素量は０．１　ｍＭｏ１
と更に少ないため、試料を稀釈しないで測定を行なう場
合には検出反応に必要な酸素量が著しく不足する。従っ
て、糖尿病患者の血中グルコース濃度を測定する場合、
グルコース濃度に対して良好な直線性をもった応答性は
期待できない。

そこで、この問題を解決するために、酵素を固定化した
ゲルに空気中から直接酸素を補給するようにした酵素電
極装置が考案されている（Ｄａｖｉｄ、　Ａ、　Ｇｏｕ
ｇｈ　　ｅｔ、　ａｔ、　　：　Ａｎａｌ。

Ｃｈｅｗ、　５７，２３５１．１９８５　）　、この酵
素電極装置は、試料中のグルコース及び酸素を電極の軸
方向に拡散させると共に、空気中の酸素を電極の半径方
向に拡散させるものである。このため、試料液中のグル
コースがセンサーのゲル内に拡散して定常状態となるま
でに時間がかかり、応答が遅い欠点がある。また、生成
した過酸化水素の逆拡散が遅いため、次の測定が可能な
状態となるまでの時間が長くなる欠点がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記のように、試料中に高濃度を含まれる基質（例えば
糖尿病患者の血清中のグルコース）の１度を直接測定し
ようとする場合、酸素が不足となり、グルコース濃度に
対して良好な直線性をもった出力特性が得られない。即
ち、本発明の目的は、酵素が基質を代謝するに充分な酸
素を空気中より供給し、しかも基質の拡散が定常状態と
なるまでの時間を多く要さない構造の酵素電極装置を提
供し、これによって高濃度の基質を良好な直線性で且つ
迅速に測定することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明による酵素電極装置は、酸素透過膜上に形成され
た金属層と、該金属層電極上に固定化して形成された酵
素膜と、該酵素膜上を覆って形成された透析膜からなる
一体型アノードを具備し、前記酸素透過膜側が外気と接
し、且つ前記酵素膜が試料に接するように前記一体型ア
ノードが配置されていることを特徴とするもので、第１
図はこれを緊急的に示した説明図である。同図において
、１は酸素透過膜、２は金側Ｌ３は固定化酵素膜、４は
透析膜である。

本発明における酸素透過膜１としては、樹脂膜を用いる
ことができる。しかし、その上に金３層を被着形成する
必要から、物理的強度に優れ且つ耐化学性の優れたもの
を用いるのが望ましい。このような好ましい膜の一例と
しては、ポリテトラフルオロエチレン膜が上げられる。

本発明における金属層２としては、金または白金を用い
るのが好ましい。この金１層を形成する方法としては、
例えば必要に応じて前記酸素透過ＭＡ１にマスキングし
ながら金または白金をスパッタリングすればよい。

この金属層上にＧＯＤやＬＯＤ等の所定の酵素膜３を形
成する場合、酵素をグルタルアルデヒド及びウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）と反応させることにより摸形成を容
易にすることができる。即ち、グルタルアルデヒド分子
両端のアルデヒド基と酵素および／またはＢＳＡのアミ
ノ基と縮合する−から、アミド結合により酸素および８
　Ｓ　Ａがグルタルアルデヒド残塁を介して数珠状に繋
り、更に高分子化する。このため樹脂に類似した性質が
付与され、膜を形成し易くなる。

本発明における透析膜４としては、ポリカーボネート膜
またはセルロースアセテート膜を用いるのが望ましい。

本発明の酵素電極装置では、酵素膜側が試料に接し、酵
素透過膜が空気に接するように一体型７ノード電極を配
置するが、これは例えば装置全体をフローセンサとする
ことで達成される。

〔作用〕

本発明の酵素電極装置では、上記のように固定化酸素が
試料溶液に接すると同時に、酸素透過膜を介して透過す
る酸素と接することが可能となる。

これによって高濃度の基質を代謝するための酸素不足が
補われ、従って直線応答域の広いセンサとすることがで
きる。

なお、透析膜４は試料溶液中の成分のうち、所定の酵素
反応を妨害する成分の拡散をｉ！１断するために形成す
るものである。

〔実施例〕

第２図〜第３図は、本発明の一実施例になる酵素電極装
置の説明図である。

第２図は、表面に金ｆｉ層１２を形成した酸素透過膜１
１を示す平面図である。該酸素透過ＩＩ！１１１として
は、厚さ１０−〜１００譚のポリテトラフルオロエチレ
ン膜が用いられている。前記金属層１２は、この酸素透
過！１１１上に白金または金をスパッタ蒸着することに
より網目状に形成されている。

また、該網目状部分から引出されたリード部１２′が形
成されている。

−上記第２図のアノード上に、更に酵素膜１３および透
析膜１４を積層することにより、第３図に示す一体型ア
ノード電極が構成されている。酵素！１１１３は、３５
０単位のＧＯＤ、２０ａｇの１０％ＢＳＡ。

１ｄの２５％グルタルアルデヒドを混合したものを塗布
して形成されており、膜厚は１０ＩＪ！ｎ〜１００ｐｒ
Ｌである。透析ｌｌ１１４としてはポリカーボネート膜
が用いられており、該透析膜は試料溶液中の妨害物質で
ある蛋白質をカットオフする。

この実施例では、上記のように構成した一体型アノード
電極を用い、第４図に示すフロータイブのバイオセンサ
が構成されている。同図において、２１は支持体である
。該支持体の軸方向には試料液の導入孔２２および排出
孔２３と、この間を連通ずる試料液通路が設けられてい
る。試料液通路の上壁および下壁には透孔が対向して穿
設され、土壁の透孔には第３図のアノード電極がその酸
素透過膜１１を外側に向けて配設されている。下壁の透
孔には、第２図と同じ構成のカソード電極２４が配設さ
れている。また、支持体壁を貫通して試料液通路内に突
出したＡａ　／ＡａＣＪ２の基準電極２５が設けられて
いる。

上記実施例の酵素電極装置を用い、試料溶液（例えば、
糖尿病患者の血清）中のグルコース濃度を測定する際は
、アノード１ｏには基準電極２５に対して＋０．７〜＋
ｉ、ｏ　ｖの電圧を印加する。

この状態で、第４図の酵素電極装置の導入孔２２から排
出孔２３に向けて試料溶液を流すと、試料液は各電極２
５，１０．２４に接して流れる。これにより、アノード
電極１０では試料液中のグルコースが酵素膜１３中に拡
散し、ＧＯＤによる下記の酵素反応を受けてグルコース
及び酸素が消費される。

グルコース＋１／２０２＋Ｈ２０ →　グルコン酸＋８２０２ この酵素反応で生成した＋２０２は、アノードの金属層
１２表面にまで拡散して下記のように陽極酸化反応を受
ける。

＋２０２　　→　２Ｈ”　＋０２　＋２ｅ−これに対し
、カソード２４では下記のＮ極反応が生じる。

２Ｈ”　＋０２　＋２８−　−＋　　１−１２０２これ
ら両電極における電極反応の結果、アノード／カソード
間にはグルコース濃度に応じた応答電流が流れる。

上記実施例の酵素電極装置では、ＧＯＤにょる酵素反応
に必要な酸素が試料溶液中の溶存酸素から供給されるだ
けでなく、酸素透過膜１１を介して空気中からも供給さ
れる。このため、試料中のグルコース濃度が高い場合で
も反応に要する酸素量は不足することなく充分に供給さ
れ、前記の酵素反応で発生する＋２０２の市はグルコー
ス濃度に対して良好な直線性を示すようになる。従って
、上記電橋反応による応答電流も試料中のグルコースＳ
度に対して良好な直線性を示し、広い濃度範囲において
高精度の測定が可能となる。

次に、上記実施例の酵素電極装置を用いたグルコース濃
度の測定試験について説明する。

この測定試験では、第５図に示す三極のポテンショスタ
ット回路を用いた。この回路はフィードバックループＡ
と、電流電圧変換部Ｂとからなっている。同図において
、１０′はアノードコネクタ、２４′はカソードコネク
タ、２５′は基準電極コネクタであり、夫々酵素１慢装
置の対応する電極１０．２４．２５が接続される。また
、２６は電極電位ＥＳの入力端子である。旦述のように
、試料溶液中のグルコース濃度に応じてアノード１０／
カソード２４間に電流ｉが流れると、電流電圧変換部Ｂ
によりｉの値に比例した出力電圧ｖｏｕｔが発生する。

即ち、ｖｏｕｔはグルコース濃度に比例する。従って、
このＶＯｕｔを直接グルコース濃度に対応させることも
できるが、この試験例ではｖｏｕｔを電流１［ｉに換算
して行なった。

なお、この実施例では電極電位入力端子１７にグランド
に対して負の電位（−０，７〜−１，ＯＶ）を印加する
ことにより、アノード１０には基準電極２５に対して＋
０．７〜＋１．Ｏｖの電位を印加して測定を行なった。

基準電極２５はオペレーションアンプの正入力で受けて
いるので電流は流れない。また、フィードバックループ
の一部であるから、電流ｉの値が変化してもＥＳの値は
常に一定に補償されている。

上記の方法により、グルコース濃度既知の試料を用いて
測定試験を行なった結果、第６図に示すように高濃度領
域においても良好な直線性が得られた。比較のために、
特別な酸素供給手段を設けていない従来の酵素電極を用
い、同じ方法で同一の試料に対して行なった測定試験の
結果を第６図に併記する。図示のように、従来例では酸
素供給量が充分でないため、高濃度領域において良好な
直線性が得られない。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明による酵素電極装置は基質
濃度の高い試料でも、試料を稀釈することなく基質濃度
に対して良好な直線応答を示す領域で測定でき、高濃度
領域において精度の高い測定が可能である等、顕著な効
果を秦するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による酵素電極を概念的に示す断面図、
第２図〜第４図は本発明の一実施例になる酵素電極装置
の説明図、第５図は酵素電極装置による測定に用いるポ
テンショスタット回路の一例を示す回路図、第６図は本
発明の実施例になる酵素電極装置を用いた場合の測定時
性を従来例と比較して示す線図である。 １・・・酸素透過膜、２・・・金属層、３・・・酵素膜
、４・・・透析膜 出願人代理人　弁理士　坪井　淳 （７ト乳） （１氏材） 第１図 第２図 ＋　　　　　　　　１１”１ 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　酸素透過膜上に形成された金属層と、該金属層電極
   上に固定化して形成された酵素膜と、該酵素膜上を覆っ
   て形成された透析膜からなる一体型アノードを具備し、
   前記酸素透過膜側が外気と接し、且つ前記酵素膜が試料
   に接するように前記一体型アノードが配置されているこ
   とを特徴とする酵素電極装置。 ２　全体が一体型のフローセンサとなっていることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素電極装置。 ３、前記透析膜がポリカーボネート膜またはセルロース
   アセテート膜であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の酵素電極装置。 ４　前記金属層が金または白金できていることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の
   酵素電極装置。