JPS63304150A - グルコース検定用酵素電極及びグルコース検定方法 - Google Patents

グルコース検定用酵素電極及びグルコース検定方法

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JPS63304150A
JPS63304150A JP63086239A JP8623988A JPS63304150A JP S63304150 A JPS63304150 A JP S63304150A JP 63086239 A JP63086239 A JP 63086239A JP 8623988 A JP8623988 A JP 8623988A JP S63304150 A JPS63304150 A JP S63304150A
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membrane
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JP63086239A
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チュン・チャン・ヤング
ケネス・ゲイリー
ハンダニ・ウィナータ
チン−チュン・チェン
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Nova Biomedical Corp
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は溶液中のグルコースを検定するための酵素ＭＬ
極集成体であって、積層膜を含む改良集成体に関し、ま
たグルコース溶液、殊に未稀釈または未処理の血液また
は血清の検定のための迅速検定法に関する。
従来の技術 グルコースの検定のために積層膜を有する酵素電極を用
いることは、従来から提案されてきており、例えば米国
特許第３５３９４５５号（クラーク）、同第３９７９２
７４号及び同第４０７３７１３号にューマン）、同第４
２２０５０３号、同第４３５６０７４号及び同第４４０
４０６６号（ジョンソン）ならびに特許出願公開昭６０
−１８５１５３号各明細曹に記載されている。これらの
グルコース酵素検定においては、下記反応式によるグル
コースの酵素触媒酸化反応の測定がなされる、グルコー
スオキシダーゼ グルコース＋０゜ グルコン酸＋Ｈ，Ｏ。
グルコースオキシダーゼ酵素は、二つの膜の間に挾持さ
れ固定化されている。それらの膜のうちの第１、すなわ
ち外側の膜は、被検定試料と接触し、グルコース及び酸
素が試料から酵素（グルコースオキシダーゼ）へ接近す
るのを許容するが、蛋白類、赤色血液細胞及びその他の
巨大分子の通過を抑止するものであり、また第２の膜は
センサー電極の表面と密接関係にあり、過酸化水素がそ
の電極に接近するのを許容するが、同時に約２５０以上
の分子量を有する妨害物質（例えばアスコルビン酸、尿
酸及びサリチル酸）の通過を排除するものである、 実用の際には、グルコース及び酸素の両方を含む被検定
試料は第１すなわち外側の膜の外表面と接融される。そ
の膜を介して試料が拡散し、固定酵素と接触すると、前
記の反応が起こり、その結果化じる過酸化水素が第２す
なわち内側の膜を介して拡散し、センサー電極と接触す
ると、電流が生じる。このｔ流は慣用手段により読み取
ることができ、かくして既知濃度のグルコースを含む標
準溶液について実施した同様な測定を基礎にした計算に
よりグルコースの濃度が測定可能となる。
膜被８！電極表面は、それを試料浴中に浸漬すること忙
より、あるいは第１すなわち外側膜の外表面上を試料が
流れるよ５に流動セルまたは流動室を設けることにより
、試料溶液と接触させることができる。しかし、先行技
術におけるように実施されるグルコース検定は、高グル
コース濃度を有する溶液（例えば未稀釈の未処理血液や
血液にしばしば見られるような）の場合には、精度が低
い。
従って、検定前にそのような高濃度試料を適当量の緩衝
液で稀釈することが行なわれてきた。この稀釈工程は時
間を消費するものであり、これ自体が誤差の一原因とな
る可能性がある。
ここに試料と接触する第１すなわち外側膜の厚さ及び細
孔寸法は、一定かつ正確な測定の達成のために重要であ
ること、殊に被検定試料が高グルコース濃度である場合
に重要であることが判明した。先行技術の膜は、一般に
、グルコースを非常に透過させ易いので（殊に高グルコ
ース濃度の試料の場合には）、固定化酵素と接触するに
至るグルコースのすｋが利用（反応）可能酸素の量を超
過してしまう程であった。従って、反応速度制限成分は
グルコース濃度ではなく酸素濃度であるので、グルコー
ス検定の精度が犠牲になる。同様に重要なものは、第２
すなわち内側膜の厚さ及び細孔寸法であり、第２の膜（
内側膜）は、：１Ｍ酸化水素が生成されるや否や可及的
に速かに電極表面へ向けて通過できるように充分な透過
性であるべきであるが、ｍ在的妨害物質の容易な通過を
許容してはならない。この膜による過酸化水素の保留（
すなわち過酸化水素が固定化酵素から電極表面へ迅速に
通過されない場合）は、反応の平衡を反転させて、誤差
を生じさせることになりうる、またそれは試料処理！（
速度）を低減させまた試薬使用量を増加させうる。
本発明は１〜２０μｍ１好ましくは５〜７μｍの厚さ及
び１０〜１２５オングストロームの細孔寸法を有し、か
くしてグルコース分子の拡散（通過）を制限する第１す
なわち外側膜を有する電極集成体を採用することにより
、固定化＃索と接触する充分な酸素の存在を確保するも
のである。さらには２〜４μｍ、好ましくは２〜６μｍ
の厚さの第２すなわち内側膜を設けることにより、本発
明は酵素から過酸化水素が迅速に除去されてセンサー電
極と接触し、平衡状態の迅速な達成がなされるようにす
る充分な透過性を与えろ。
グルコース検定のために本発明の電極ヲ使用する際に、
電極は反応が平衡に達するまで試料と接触状態に維持し
てもよい。その平衡後、電流値測定を行ないその測定値
を同一条件下で測定した標準溶液の測定値と比較する。
この操作には１０〜３０秒程度の時間を要する。第１の
股の外表面から残留試料を洗い出し、そしてセンサーを
接電流をその基底値まで復帰させるにはさらに追加時間
が必要であり、従って異なる試料の継続的検定のために
使用される電極の場合には、各個試料についての合計時
間は、グルコース濃度にもよるが、６０〜８０秒のオー
ダーである。
電極電流の測定前に平衡が達成されるのを侍って行なう
慣用操作法で本発明の電極を使用する場合に、一連の異
なる試料の検定のために必要とされる時間は、先行技術
の電極を用いる場合に必要とされる時間よりもいく分か
短い。しかし本発明の電極は、（殊に高グルコース！１
度の試料の場合に有利である）別異のさらに迅速な操作
法の使用を可能とすることが判明した。本発明の電極を
用いると、反応平衡に達する前に電流測定を行なうこと
により正確な再現性ある検定を行ないうろことが判明し
た。反応が平衡に達するのを待たずに、セル中の反応が
まだ平衡に近付こうとしている間の任意の標準的時点で
電流測定を行う。測定時間は、試料が第１すなわち外０
４ｌｌ膜とまず接触された後５秒より少なくないのが好
ましい。さらに好ましくは、最も再現性ある結果を得る
には、測定時間は、電流値が定常状態値の少なくとも９
０％に達して（・るように選択されるべきである。試料
と膜との接触は、その後は継続される必セはなく、好ま
しくは試料を可及的に速かに水または稜＠溶液で置き換
えて、電極ｔａをその基底値まで復帰させるようにする
。このようにすると為処理量（速度）が可能となり、本
発明センサーを含む分析器が別異のセンサーをも含んで
いる場合に殊にこれは有利である。さらには、そのよう
な早期の読取（測定）により、妨害物質の影響を制限で
きるという利点がある。そのような妨害物質は、一般に
Ｈ２Ｏ，よりも内側膜内を移動するのに長時間を要する
ので、まだ膜を通り抜けようとしている状態のそれらの
物質からの局限された妨害のみで、良好なＨ！０．測定
（読取）値が得られる。
あるいは電極及びその積層膜は、第１の膜の表面へ試料
を供与するための限定された大きさの通過式試料室また
はセルと組合せることができる。
その場合、試料の容積または鎗及び流速（流量）は、外
側膜と接触する試料の標準的な短い滞留時間を与えるよ
うに選択することができる。この具体例において、試料
は一定の（固定的）標準容積（量）であり、ぜん動ポン
プによって膜の表面に沿って流過式室内を強制移動され
るのが好ましい、従って試料の通過波の室内には最少量
の試料が薄い表面フィルムの形で残留するにすぎない。
この残留試料フィルムは、迅速に消耗されまたその室内
に少量の緩衝液を流動させることにより急速に除去され
うるので、電流の基底値への迅速な復帰及び次の新しい
試料の検定のためのセンサーの迅速な準備完了がなされ
る。
本発明を図面により説明する。
第１図に示されるように本発明の電極は、電気絶縁性担
体１２（このものは長い円筒形のものでよい）の端部に
白金センサー電極（アノード）１４を付け、さらにこの
電極に活性露出表面１６及び導線１８を付けてなるもの
である。担体１２の下端部には、露出表面２２及び導線
２４を有する銀／塩化銀参照電極２０も設けられている
、導線１８及び２４は、電流計（図示せず）に連結され
ている。電極の露出表面には、第１すなわち外側膜２６
と第２すなわち内側膜２８とが、中間層３０によって接
着して一体固着されてなる積層膜が取付けられている。
中間Ｎｌ３０はグルコースオキシダーゼ酵素を含み、好
ましくはその酵素と交叉結合ないし結着剤（例えばグル
タルアルデヒド）との混合物からなる。積層膜は、０リ
ング３２または他の適宜な手段によって担体１２の下面
に対し【液密関係に密封されている。
外側膜２６はポリカーボネートであるのが好ましいが、
他の適当な、１〜２０μｍ、好ましくは５〜７μｍの厚
さ及び１０〜１２５オングストローム、好ましくは１０
〜１１０オングストロームの細孔寸法を有する固体の多
孔質または透過性材料から構成されてもよい。
内側膜２８はシリコーンゴム、メチルメタクリレート、
または他の適当な多孔質、透過性物質、例えばセルロー
ス酢酸酪酸エステルであってよいが、好ましくは酢酸セ
ルロースからなる。この膜２８は、好ましくは２〜４μ
ｍ、　さらに好ましくは２〜３μｍの厚さを有する、 図示した具体例においては、流動セル３４が外側膜２６
の下面に対して液密関係に取付けられている（シリコー
ンワッシャーまたはＯリング６２によってそれに密封さ
れている）。流動セル３４は、ポリスチレン、ポリメタ
クリレートまたは他の適宜な硬質の液体不透過性物質に
よって構成され【よく、膜２６の面に対面した室６６な
らびに入口６８及び出口４０を備えている。好ましい態
様においては、冨３６、入口３８及び出口４０を合せた
容積は約５〜１０μｌである。
操作中、外側膜２６が溶液試料と接触すると、試料中の
グルコース及び酸素はその膜内を通過し、層６０中の酵
素と接触する。この酵素はグルコースがグルコン酸−・
酸化する反応に対して触媒作用をなす。この酸化反応中
に生成した過酸化水素が膜２８内を通過して、センサー
電極１４の表面１６と接触する。センサー電極は、参照
電極２０との関係において−７００ｍＶで平衡が保たれ
る。
前述のように酢酸セルロース膜２８は、４μｍまたはそ
れ以下（一層好ましくは２〜３μ扉）の厚さを有する。
もし膜２８が４μｍよりも厚いと、その膜を介してのＨ
，Ｏ，の通過が妨害されまたは遅延される。もし膜２８
が２μｍよりも薄いと、その膜は十分な強度を有しない
であろう、、膜２８は過酸化水素の迅速な通過を許容す
るが、アノード１４によりなされる測定を妨害すること
があるその他の低分子−物質（例えはアスコルビン酸、
尿酸、サリチル酸）の通過に対しては、バリヤー（障害
）である。アスコルビン酸及び尿酸のような物質は、被
分析試料中に存在することが多く、ポリカーボネート膜
２６内を容易に通過しうるものである。
膜２６は、例えば、１〜２０μｍ（より好ましくは５〜
７μｍ）の厚さ及び６　Ｘ　１０”細孔／ｃｌＩｌの細
孔密度を有する１００オングストロームの細孔寸法の直
線孔ポリカーボネートフィルムである。このようなフィ
ルムは、例えば米国力リホルニャ州グリーザントンのヌ
クレボア（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）・フィルトレージョン
・プロダクツ社から販売されている。
その小さい気孔寸法は、試料中に存在しう石高分子量の
妨害及び汚染物質が酵素層へ向けて通過櫨るのを防止す
る。ここで重要なことは、１００オングストロームの細
孔寸法は酵素層へのグルコース分子の拡散を制限するの
に十分に小さな寸法であることである。もし、酵素へ向
けてのグルコース分子の拡散がそのように制限されない
とすれば、層２６内を拡散し終ったグルコース分子の全
部を酸化させるのに足る酸素が酵素層へ到達しえなくな
り、不正確なグルコース測定をもたらすことがある。拡
散制限細孔寸法は、試料が未稀釈の血液または血清（し
ばしば比較的高いグルコース濃度を有する）である場合
に、特に重畳である。１５０オングストロームの細孔寸
法は、未稀釈の血清、血漿、ホール血液または尿につい
て行なわれる（正確な）グルコース測定分析を可能とさ
せるように、グルコース分子の拡散を十分には制限しな
い。使用しうる細孔寸法の下限は、実質的な量のグルコ
ース分子を透過させないような寸法（約１０オングスト
ローム）である。
膜を介してのグルコースの拡散は、モル流束に関して定
量化できる。ある膜が、同じ細孔密度及び厚さを有する
が１５０オングストロームの細孔寸法を有する別の膜を
介してのグルコースのモル流束０６０％以下にまでグル
コースのモル流束を制限するような細孔寸法（直径）を
有するならば、その膜はグルコースの拡散を必要かつ十
分に制限することＫなろう。そのようなグルコース拡散
制限は、細孔寸法が１２５オングストローム以下である
ならば、達成できる。一層好ましくは、グルコースのモ
ル流束は、同じ細孔密度及び厚さを有するが１５０オン
グストロームの細孔寸法を有する膜におけるグルコース
のモル流束の４０係以下であるべきであり、そのような
制限は、細孔寸法が１１０オングストローム以下である
ならば、達成できる。
グルコースオキシダーゼ層３０は、グルコースオキシダ
ーゼとグルタルアルデヒドのような交叉結合剤との混合
物であるのが最も好ましい。
積層膜の調製方法は、米国特許第４０７３７１３号に−
ウマン）明細書に詳しく記載されている。
一般的には、積層膜の製造において、酢酸セルロースを
２３：１のシクロヘキサノン／インプロパツール混合物
中に溶解し、この溶液を水面上に注ぎ成層させる、これ
により酢酸セルロースのフィルムが形成するので、これ
をポリエチレンのキャリヤーシートによりすくい上げる
。酵素／グルタルアルデヒド液をこの酢酸セルロース層
上忙付着し、次いでポリカーボネートのフィルムを上記
酢酸セルロース層上の酵素調剤と接触させて積層体を形
成する。この積層体をローラー圧縮して合体を確保し、
厚さを可及的に小さくする。グルタルアルデヒドによる
交叉結合によって固定化酵素層が形成される、この積層
体を１．５時間またはそれ以上室温で空気中に放置して
乾燥させる。次いでキャリヤーシートを取り除いて、今
やポーラログラフセルの電極集成体中へ組み入れられる
状態の積層体を得ることができる。
典型的な検定においては、溶液の試料を入口３８に流入
し、流動室３６を満たす、グルコース及び酸素の拡散、
及びその結果としての過酸化水素の生成は、前述の通り
である、図示の態様において、過酸化水素溶液がアノー
ド１４０表面１６と接触するときに、それは参照電極２
０の表面２２とも接触し、かくして二つの電極の間に導
電路を形成する。二つの電極の間に電流が発生し、その
値は過酸化水素の平衡濃度との関連において一定（定常
状態）値に向けて上昇する。
典型的な応答曲線は第２図に示されている。第２図の左
側部分においては、電流を時間（秒）に対してプロット
しである。時間は、試料サイクルの開始（試料が外側膜
２６と初めて接触する時間）からの経過時間である。こ
こには、それぞれ５０゜ＩＯｏ、２００，３００．４０
０及び５００■／ｄｉのグルコース濃度の試料Ａ−Ｆに
ついての電流値がプロットされている。図示されている
ように、電流出力は試料サイクルの開始直後に急激に上
昇する。
この上昇は、酵素層中で拡散し反応するグルコース分子
の増大する数に対応する。可成り迅速にグルコース供給
は平衡化し、かくして定常的なグルコース分子の供給及
び消耗（消費）がもたらされ、そして反応が進行して、
試料Ａ、Ｂ及びＣの場合にはそれぞれ約８秒、１２秒及
び２０秒後に平衡に達する（ＴｉＣ流が一定になってく
る）。定常状態において、を流は試料中のグルコース濃
度に直接（正）比例する。これは第２図の右側部分にお
ける検量線１に示されている。それぞれ３００．４００
及び５００■／ｄｌのグルコース濃度を有する試料Ｄ、
Ｅ及びＦの場合には、本発明の電極集成体を用いたとき
であってさえも、瞬間的に平衡が達成されるにすぎない
（たとえ平衡になったとしても）。
この理由は、グルコースオキシダーゼ／ｉ１３０　中へ
のグルコースの拡散速度が、利用（反応）可能酸も≦Ｍ
匹搗−相１対バ見−７〜Ｊ辷すＬゐか上−を烏ヱー、−
一その結果として、検量曲線１（すなわちこの操作によ
り検定されるときに未知試料を比較する標準）は、グル
コースの濃度が島いところではわずかく非線型となって
くる。これは未稀釈のホール血液または血漿で経験され
るのと同様である。従って精度が多少低減することにな
る。
第２図に示したように試料と膜２６の外表面との最初の
接触の後の一定の１５秒の時点での各試料についての電
流を測定することはより、別の検ｉ１２が得られる。こ
の検量曲線２は５００〜／ｄｉ以上の濃度に対して完全
に線型であり、平衡に達する前に測定を行なうにもかか
わらず高精度が確保される。
上記の操作は、外側膜２６の露出面を被検定試料溶液の
プール中に単に浸漬することにより、またはその膜の露
出面へ流動セル３４を密封付着して、試料を必要なとき
に室６６に流通させることにより、実施することができ
る。流動セルを使用する場合、試料溶液を膜２６と最初
に接触させて医　　　　　−ｒ　　Ｉ＋　　’−ｒ−Ｘ
　Ｌ　４＋ｙ　　瀉攻な緩衝液で室３６から残留試料を
洗い出すことにより、電極集成体が次の試料測定のため
の準備完了がなされる。各試料測定のための合計時間は
、そのような条件下では４５秒以内である。
流動セル３４を装着した場合に採用しうる別の方法は、
容積を制限した試料液（例えば室３６の全容積の２〜１
０倍の容積の試料液）を準備し、この試料をセル内に圧
送し、電極を通過させる。
膜３６上の残留フィルムはグルコース濃度に比例するピ
ーク電流値を生じさせる。このピークｘｉは、定常状態
が達成されたならば得られるであろう電流値よりも低い
。実際における室６６中の試料の滞留時間は６〜１０秒
のオーダーである。各場合（室容積１０μｌ）における
５秒の試料滞留時間でこれらの条件下で行なった同じ標
準溶液の応答曲線のプロットを第６図に示″１．図示さ
れるように、各場合に、初期接触後で平衡に達する前の
６〜８秒のところで電位がピークになる。また検量線に
よって示されるように、それらのピークはグルコース濃
度に対して正確に比例している。従って、最大電流を測
定するこの操作方法では線型検量線が得られ、また５ｏ
ｏｒ！ｖａｚ　　よりも高い濃度でも高精度の結果が得
られる。試料の直後に空気が入りまた非常にわずかな未
反応試料が残留するにすぎないので、次の試料測定に対
して備えるための緩衝液での洗浄はほとんど必要とされ
ず、また各試料の測定のための合計時間は３ｏ秒または
それ以下のオーダーである。
各電極集成体について上記のように検ｉｔ線を作ると、
同じ操作方法で実施した未知試料の検定のための比較標
準として通常の方式で使用できる。、
【図面の簡単な説明】
第１図は、流動室を備えた本発明の電極集成体第２図は
、種々のグルコース濃度の試料について反応を平衡Ｋま
で進行させた場合のｔ光応答曲線を示すグラフ（左側部
分）及び検量線（右側部分）である。 第６図は、制限された址の試料を流動させたときの応答
曲線（第２図と同様）である。 センサー電極（アノード）１４

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）溶液中のグルコースの検定のためのポーラログラ
    フセル中で使用するための電極集成体であって、参照電
    極と、溶液接触表面を積層膜で被覆されたセンサー電極
    とからなり： その積層膜が、 （ａ）１０〜１２５オングストロームの細孔寸法を有す
    る厚さ１〜２０μｍの外側溶液接触膜、（ｂ）センサー
    電極の表面に隣接する厚さ２〜４μｍの内側膜、及び （ｃ）上記両膜の間にあつてそれらの膜を一緒に保持し
    ている接着性のグルコースオキシダーゼ層、 からなり、かつその内側層がグルコースオキシダーゼ層
    からセンサー電極表面への過酸化水素の通過を確保する
    のに十分大きな透過性を有することを特徴とする上記電
    極集成体。
  2. （２）外側膜がポリカーボネートからなる特許請求の範
    囲第１項に記載の電極集成体。
  3. （３）内側膜が酢酸セルロースからなる特許請求の範囲
    第１または２項に記載の電極集成体。
  4. （４）外側膜の外部露出表面に接して通り過ぎるように
    溶液試料を導くための流動セルをさらに備えており；そ
    のセルが該露出表面に対し密封され、そして露出表面に
    面した室とその室の入口及び出口とを有し；かつその室
    とその室の入口及び出口とが一定の容積を有することを
    特徴とする特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載
    の電極集成体。
  5. （５）特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の電
    極集成体の外側膜に溶液試料を接触させ、初期接触後少
    なくとも５秒と、電流が一定になるのに必要とされる時
    間よりも実質的に短い時間と、の間の一時点で両電極間
    の電流値を測定し、その測定電流値を、既知グルコース
    濃度の標準溶液の同一条件下で測定された電流値と比較
    する、ことからなる溶液中のグルコースの検定方法。
  6. （６）特許請求の範囲第４項に記載の電極集成体の流動
    セル内に溶液試料を流通させ、 初期接触後少なくとも５秒と、電流が一定になるのに必
    要とされる時間よりも実質的に短い時間と、の間の一時
    点で両電極間の最大電流値を測定し、 その測定された最大電流値を、既知グルコース濃度の標
    準溶液の同一条件下で測定された最高電流値と比較する
    、 ことからなり、試料が流動セルの室及び入口の容積より
    も大きな一定の容積を有し；かつ試料の流動速度を、測
    定電流値が一定の値になってしまう前に残留液膜を除く
    すべての試料が該室を通過するような試料流動速度とす
    ることを特徴とする溶液中のグルコースの検定方法。
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