JPS58135949A - フロ−形酵素電極用固定化酵素膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はフロー形酵素電極用固定化跡素躾に関し、よ
り特定的には各種の生化学物質をコンティニュアス・フ
ロ一方式で測定するためのＩＩ阜電極に用いられる固定
化＊＊躾の改良に関する。

近年様々な分野において、生化学物質を選択的に測定す
るために、固定化Ｓ素膜と電極とを組合わせた酵素電極
が用いられるようになった。従来より生化学物質は、分
光光度計を用いた比色法によって測定されたいたが、Ｓ
＊電電極線、この比色法に比べて次のような利点を有し
ている。（１）測定時開および反応時開が短い。（２）
測定操作が藺便で測定が容易である。（３）固定化酵素
を利用するためコストが非常に廉価である。（４）試料
が少量でよい。（５）測定＠置が簡単かつ小形化できる
。（６）発色試薬等が不要である。

このような利点が理解され、臨床検査、鑵靜工業、良品
分析あるいは化学工業等の分野において注目され、実用
化され始めている。このように酵素電極を用いて被測定
物質を定量するための測定方法は、（１）ディスクリー
ト方式（ｄｉｓｃｒｅｔｅｔｙｐｅ＞と、（２）」シテ
ィニュアス・７０一方式（Ｃ０１ｌｔｉｎｕ０１１Ｓ　
　ｆｌｏｌｌｌ　、ｔｙｐｅりに大別できる。現状では
、ディスクリート方式が大部分であり、ｓＪｌ！電機を
用いるコンティニュアス・フロ一方式によるものは数少
ない。

ところが、生化学物質の測定には、連続した情報が求め
られることが非常に多い。たとえば臨床検査に６いＣ１
時々刻々変化する血液中の生化学物質の濃度変化を連続
的に測定し、監視することにより、動的な病態として把
握することが楊めて１１１１に′なってきている。とこ
ろが従来のディスクリート方式で、は１．離散的な情報
しか得られないので、コンティニュアス・フロ一方式の
導入が強く殻ｉされている。また、化学工業等の工１！
ｉ！！理においても、自動化のために、試料を連続的に
採取して各種の生化学物質の連続、測定が試みられてい
・− るが、現在のところ実用化されているものはほとんどな
い。

このように、コンティニュアス・フロ一方式が求められ
ているにもかかわらず、広く普及しない原因の１つは、
固定化＃ＩＪＪｌｌＩｓにある。すなわら。

現在のところ、ディスクリート６式で用いた固定化酵素
膜をそのままコンティニュアス・ノロ一方式に流用して
いるが、ディスクリート方式においては電極面に対応し
てその電極面とほぼ同面積にわたって固定化１ｌｓｌＩ
が形成され、そのような固定化酵素膜のほぼ全面積が被
測定試料と接するのに対し、コンティニュアス・フロ一
方式ｅは電機面の試料流路部分のみの固定化酵素膜がｌ
ｌ＃定試料と接触することになる。すなわち、固定化酵
素膜の試料と接触する有効面積は、後者の方がはるかに
小さいことになる。したがって電極面とばば同面積の固
定化酵素膜を２つの方式の酵素量−に用いる従来のやり
方では、コンティニュアス・フロ一方式では、電流変化
値が少なく安定した測定が困難で、特に微量な濃度変化
はほとんど定量不可能であった。また固定化酵素膜の一
部のみが常に試料と接触するようにｊれるのｅ、連続的
な使用に際して、そのような固定化酵素膜が破損し易い
という膜強度としての問題点をも有している。

そこで、この発明は、上述のような従来の固定化ＷＩＩ
県躾０問題点を解消し、特にコンティニュアス・フロ一
方式に好適する固定化Ｓ＊＊を提供することを目的とす
るものである。

この発明は、要約すれば、電極側の電極活性物質が選択
的に透過する＾分子薄膜と、溶液側の被測定物質が透過
する高分子膜との間に、電極面の試料流路部分に合致し
た固定化酵素を＾分子膜により電極面に密着させてなる
固定化酵素膜である。

以上には、図面を参照して、この発明およびその実施例
について詳細に説明する。

第１図はこの発明の一実施例を示すシステムダイアグラ
ムである。こ実施例は、酵素電極を用いてコンティニュ
アス・フロ一方式によって、血液中の生化学物質の濃度
を連続的に測定するためのものである。ダブルルーメン
カテーテル１を静脈（図示せず）中に留置し、マルチポ
ンプ２によって、チューブ３内八遍統採血する。このと
き、採血流速と同速度で、ヘパリンが混合されてなる緩
衝液−４をダブルルーメンカテーテル１内にボン１２で
送る。したかつ【、血液は２倍希釈され【チューブ３に
導入される。その債、−一部５によって適宜希釈された
後、混合＠１１１６によって血液と緩衝液とを充分に混
合し、さらに気泡抜きｌ１ｉｌ１７によって試料中の気
泡を除去する。このとき、気泡抜き装置７から、ボン７
２によって、液溜め８に廃液が流入される。次に、ＩＩ
東電極９に試料が導入され、この＃Ｉ東電電１１９経た
試料は最終的にＦ＆溜め１０に廃液として流入される。

なお、このような一連の操作は１つのマルチポンプ２に
よって行なわれており、それぞれのチューブの内径を麦
えることによって希釈倍皐の調整を行なうことができる
。そして、酵素量１ｇ９から得られるｇ流変化はリード
糠１１を通して電流検出器１２によって読取られ、記録
計１３で記録される。

第２図は酵素電極の一例を詳細に示１１′語面図解図で
ある。酵素電極９は、ハウジングないし取付筒体９１を
含む。この取付筒体９１内に収納される躾支持台９６（
後述）には、試料流路すなわちチューブ３が貫通可能な
穴が形成されていて、したがってこの酵素電極９内に試
料流路ないしチューブ３が形成される。この試料流路３
に接する形で作用電＃Ａ９３および対照電１ｉ９４が配
置され、この２つの電極９３および９４はリード線１１
によって前述の電流検出器１２に接続される。この作用
電極９３と対照電極９４とは所定の開隔を隔てて、たと
えばエポキシ樹脂のような電極支持部材９５によって支
持される。ハウジングないし取付筒体９１内には躾支持
台９６が設けられ、固定化酵素膜９２はＯリング９７に
よってこの躾支持台９６に装着される。そして、躾支持
台９６は取付筒体９１の先端に１合される止め部材９８
によって固定される。なお、図示しないが、電極支持部
材９５は、ばねによって躾支持台９６の方向へ常に弾発
的に押されていて、したがって電極向と固定化酵素膜と
が充分に密−するように工夫されている。そして、固定
化ＷＩ素躾９２に固定化されている酵素による反応に伴
って生成される過酸化水素（Ｈ２０□）あるいは消費さ
れる１ｌｌｌｌＩ（０□）を作用電極９３および対照電
極９４を利用して検出することによって、被測定物質の
濃度を化学鏝論的に知ることができる。たとえば固定化
Ｉｎ膜９２に酵素グルコース・オキシダーゼ（ＧＯＬ）
）が固定化されていれば、血液中のグルコースがこの酵
素ＧＯＤによって次式（１）に示される反応を呈する。

（２００ グルコース＋０□−→グル」ン酸＋Ｈ２Ｏ２・・・（１
）作用電１１ｉ９３と対照電極９４との間にたとえば０
゜６ｖの電圧が印加され、作用電極９３の面でＨ２０□
が酸化され、その鹸化電流がリード線１１を通して検出
される。

第３図は第２図に示す酵素電極に形成される試料流路を
（固定化酵素膜９２を除去した状態で）平面的に見た図
である。この発明の１つの局面は、このような試料流路
部分にのみいかに多くのＳ素置を集中して固定化するか
という点である。第４図は第３図の線ＩＶ　−ＩＶに沿
った固定化酵素膜９２の断面図であり、第５図は１１１
３図の線ｖ−ｖにおけるＩ＃素電極の一部断面図である
。酵素電極９の固定化酵素膜９１は、電極側の電ｌｌ１
ｇ性物質透過性躾９２１と溶液ないし被測定試料側の被
測定物賀通過性躾９２２と、それらの２つの躾９２１お
よび９２２の闇に挟持される固定化１１１９２３とを含
む。電極活性物質透過性膜９２１は電極９３および９４
の端面に密着する。

電極側の電極活性物質透過性膜９２１としては、たとえ
ばＨ２０２を測定する場合は、ポリエチレンイミン、ポ
リアミド、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、イソ
シアヌル酸、セルロース誘導体あるいはポリカーボネー
トなどの単独腫合体または共重合体が利用可能である。

作成方法は公知の任意の方法でよい。また、たとえば前
述の式（１）において０２の減少を測定することによっ
てグルコースの定量も可能であるが、この場合は、躾９
２１として、テフロン（商品名）、ポリエチレン、ある
いはシリコン等の薄膜が利用される。

次に溶液側の被測定物質通過性膜９２２としては、透析
膜、ポリカーボネートあるいはセルロース誘導体等が利
用され得る。この躾９２２は、通常用いられる方法で作
成可能であり、また市販の躾を利用することもできる。

そして、固定化１１８９２３は、たとえば、ガラス・ビ
ーズあるいはカラム・ゲルに用いられる多糖類の粒子た
とえばセファ０−ス（商品名）、セファデックス（商品
名）、デキシトラン（商品名）、セルロースおよびＤＥ
ＡＥ−セルロースあるいはＣＭ−セルロース等のセルロ
ース誘導体もしくは＾分子の微粒子たとえばポリスチレ
ンあるいはポリエチレン等などからなる担体に固定化さ
れている。これらの担体は、単位あたり極めて多量の酵
素が固定化できる。また、固定化酵素９２３としては、
ＷＩＩｊｌｌ！蛋白を架橋剤で処理したものあるいは不
活性蛋白たとえばアルブミン等とともに架橋させたもの
であってもよい。なお、担体への酵素の固定化法は、既
によく知られているところであり、任意の方法を採用す
ることができる。

上述のようにして酵素が固定化された担体あるいは架橋
処理された酵素蛋白からなる固定化酵素９２３を、たと
えば第３図あるいは第５図に示すような試料流路３の形
態に合せて、上述の２枚の躾９２１および９２２の間に
挾み込み、試料流路３に合致するように、このように一
体化された固定化鋳素躾９２が躾支持台９６にたとえば
０リング９７で装着される。その債、止め部材９８によ
って、この躾支持台９６を取付筒体９１にねじ止めする
ことにより、固定化酵素膜９２を電極面に密着させる。

なお、このとき、第５図に示すように、作用電極９３の
端面は必ず固定化１素膜すなわち試料流路３の部分に位
１的に一致しなければならない。このように、この実施
例では試料流路３が酵素電極の一部を通って長手に形成
されていて、固定化Ｓ素９２３はその試料流路３に沿っ
てその形態に合致するように形成される。したがって、
従来のディスクリート方式に用いられているように電極
全面にわたって固定化Ｓ＊を設ける必要がない。そのた
めに、必要な＊＊の最が大幅に、□コ 節減され得る。

なお、このようなＳ素電極に利用できるＳ素としては、
主として０２の消費あるいはＨ２０□の生成が見られる
オキシダーゼ類であり、たとえば、グルコース・オキシ
ダーゼ、ウリカーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コレステ
ロール・オキシダーゼ。

乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、アルコー
ル・オキシダーゼ、キサンチン・オキシダーゼ、グルセ
ロール・オキシダーゼあるいはごリルピン・オキシダー
ゼなどが挙げられる。また、次式（２）および（３）の
ように、いくつかの解素反応を共役させることにより、
オキシダーゼ類以外の酵素でも利用可能である。

醋ｌ 被測定物質（基質）→Ａ（生成物）・・・（２）オキシ
？−１ Ａ＋０２　　　→　　Ｂ＋Ｈ２Ｏ２・・・　（３）この
ような例としては、インベルターゼ、ムタロターゼ、コ
レステロール・エステラーゼ、ベータ・ガラクトシダー
ゼ、リパーゼあるいはりボフロティンリバーゼなどが挙
げられる。さらに、上述の実施例では、、、、、、、、
４楊活性物質として０２あるいはＨ２Ｏ２を例に説明し
たが、この発明の固定化酵素膜は、アンモニア電極、炭
蒙ガス電楡あるいはガラス電極などにも適用可能であり
、したがって利用し得るＷＩＩ素は上述したものに限定
されるものではないことは言うまでもない。

次に、実施例について説明する。

１１１ セルロースフィルタたとえばミリボア（商品名）フィル
タＴＨタイプを約５０℃の１．０Ｍ（モル）のメタ過よ
う素酸ナトリウム溶液中に３時間浸漬し、鹸化開裂させ
る。反応後純水で洗浄する。次に、３０％ヒドラジン・
ヒトラード溶液に約１時間浸漬し、洗浄後、１０％グル
タルアルデヒド溶液（０，１Ｍりん酸緩衝液ｐＨ６，４
＞に３０分開成応させる。次に、０．１Ｍりん酸緩衝液
ｐＨ６，４で洗浄する。

この躾をグルコース・オキシダーゼＩＩ（２０ｍｉｌｌ
／ＩＩＩＬ）中に１！１夜冷蔵庫中で浸漬する。りん酸
緩衝液で洗浄した後電極面部分の試料流路の形状に合せ
て切り取る。

このようにして得られた躾切片を、アセチル・セルロー
スの薄膜とポリカーボネート躾たとえばニュクリボア（
商品名）メンブレンとの−に挾み、セルロースフィルタ
の膜と試料流路が一致するように躾支持台に０リングで
装着する。このとき、アセチル・セルロース膜を上側に
する。これを止め部材で電極面と一致させながら取付筒
体に取付け、第２図に示すような酵素電極を得る。その
ような酵素電極を用いて第１図に示すシステムにおいて
グルコースの連続定量を行なった。その結果を比較例（
従来例）とともに表１に示す。

グルコース・オキシダーゼ溶液（２０ｍｇ、−′ｓ鈍）
２０μ庭、牛血清アルブミン溶液（２２％）２０μ庭お
よび０．５％グルタル・アルデヒド溶液１０μ監をアセ
チル・セルロースの薄膜上でよく混合させる。その上に
ポリカーボネート躾を被せて密着させる。この躾を上記
実施例１と同様にして電極に装着し、第１図のシステム
でグルコースの連続定量を行なった。その結果を次表に
示す。

の数は、上記実施例１の場合は２０枚であったのに刺し
比較例すなわち従来例では１０枚しか作れなかった。そ
して、上記表かられかるように、実施例１は同じグルコ
ース濃度すなわち１０ｓ　ａ　／ｄｌｌであっても、比
較例に対して非常に大きな電流唆化値が得られている。

このことによって、徴最の讃廣変化を安定かつ正確に検
出することができた。

！ アルキル・アミン・ガラス（・コントロール・ボアー・
ガラス；ＰＩＥＲＣＥ社）２００＋ｏを２゜５％グルタ
ル・アルデヒド溶液中で反応させ、水洗いした後、グル
コース・オキシダーゼ溶液（２０−ａ／ｍＪｌ）１■庭
中に浸漬し１１４夜に応させ。

その後りん酸緩衝液で洗浄する。また、躾支持台にポリ
カーボネート躾を密着させ、試料流路部分に相当する位
置を上から押えてくぼみを形成させ、このくぼみ部分に
上記Ｓ票を固定化したフルキル・アミン・ガラスを入れ
、さらに、７セチル・セルロース躾を密着させた。これ
を実１１と同様にして装着した。

この実施例２によっても、先の実施例１と同様に従来に
比べてかなり大きな電流変化値が得られた。

なお、試料流路３は、第６図および第７図に示すように
、比較的短い部分が固定化酵県躾９２に接触するように
してもよい。この場合、第４図に示す固定化酵素の長さ
が一層短くされるであろう。

したがって、必要な酵素の量もまた節減することができ
る。

以上のように、この発明によれば、コンティニュアス・
フロ一方式の酵素電極として最適の形状ですなわち試料
流路に合致した形状で固定化酵素を設４ノだので、従来
のディスクリート方式のものを流用する場合に比べて、
被測定試料との接触面楡が増大され、微曇な１Ｉｒ１１
変化であってもより大きい電流変化値として得られ、極
めて精度良く定量することができる。また、試料流路に
合致する形状で固定化酵素を配置しているためすなわち
必要な部分にのみ固定化ｓｌＩがあるため、周辺の余分
なＨ素反応の影響をほとんど受けることがなく、安定性
および再現性に優れ、したがって用いる試料も少量でよ
い。また、必要な部分にのみ固定化酵素を形成するため
、１つの酵素電極あたりに必要な酵素の最も従来のもの
に比べて大幅に節減することができる。

【図面の簡単な説明】

１１図はこの発明の一実施例を示すシステムダイアグラ
ムである。第２図は酵素電極の一例を示す断面図解図で
ある。第３図は試料流路の形状を平面的に示す平面図解
図である。第４図は１３図の輪ＩＶ−ＩＶに沿って切断
した固定化酵素膜の断面図解図である。第５図は第３図
の翰ｖ−■に泊って切断した酵素電極の一部断面図であ
る。第６図および第７図は試料流路の別の形状を示す図
であり、第６図が断面図解図、第７図がその平面図解図
を示す。 図において、３はチューブないし試料流路、９はｗＩ！
Ｒ電極、９２は同定化酵素膜、９３は作用電極、９４は
対照電極、９６は躾支持台、９２１は電極活性物質透過
性膜、９２２は被測定物質通過性膜、９２３は固定化酵
素を示す。 第２図　　　　　、ｌ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　電極面に＠着された固定化ＷＩＩｊｌｌＩを被
   測定試料が流入する試料流路内に設け、連続的に被測定
   物質を定量するフロー形酔素電極の固定化＊＊躾であっ
   て、 電機活性−賀を選択的に透過させる＾分子ｉｓｍと、 被測定物質が透過する＾分子膜と、 前記＾分子薄膜と前記＾分子膜との間に設けられる固定
   化酵素とを慟え、 前記固定化酵素を電極面の前記試料流路に合致する部分
   にのみ設けたことを特徴とする、フロー形酵素電極用固
   定化ｓｕｍ。
2. （２）　前記試料流路は電極面の一部を通って長手に形
   成され、前記固定化Ｓ＊は前記試料流路に沿って設けら
   れている、特許請求の範囲第１項記載のフロー形酵素電
   極用固定化酵素躾。