JPS58208658A - 固定化ｎａｄ（ｐ）ｈ酸化酵素を用いた定量装置 - Google Patents
固定化ｎａｄ（ｐ）ｈ酸化酵素を用いた定量装置Info
- Publication number
- JPS58208658A JPS58208658A JP57091938A JP9193882A JPS58208658A JP S58208658 A JPS58208658 A JP S58208658A JP 57091938 A JP57091938 A JP 57091938A JP 9193882 A JP9193882 A JP 9193882A JP S58208658 A JPS58208658 A JP S58208658A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- oxidase
- immobilized
- nad
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はＮＡＤＨ−七酵素または＼ＡＤＰＨ酸化醇素
く以下ｒＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素分と記す）を固定化
した固定化酵素担体を用いて種々の生化学物質または酵
素活性の測定を行なうための、新規な定量装置に関する
。
く以下ｒＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素分と記す）を固定化
した固定化酵素担体を用いて種々の生化学物質または酵
素活性の測定を行なうための、新規な定量装置に関する
。
生体内の種々の生化学物質の定量は、その生体内の生化
学的情報を得る手段として極めて重要である。特に、臨
床検査の分野においては、病態を把握する上で、体液中
の生化学物質を定量することは不可欠である。診断治療
上重要な生体酸物は低分子成分から高分子成分に至るま
で、複雑多岐にわたっているので、特定成分のみを選択
的に測定するためには、高い基質特異性を有する酵素を
用いた酵素分析法が広く利用されている。
学的情報を得る手段として極めて重要である。特に、臨
床検査の分野においては、病態を把握する上で、体液中
の生化学物質を定量することは不可欠である。診断治療
上重要な生体酸物は低分子成分から高分子成分に至るま
で、複雑多岐にわたっているので、特定成分のみを選択
的に測定するためには、高い基質特異性を有する酵素を
用いた酵素分析法が広く利用されている。
酵素分析法において頻繁に測定対象となる物質の１つに
、補酵素ＮＡＤおよびＮＡＤ、Ｐの還元型であるＮＡＤ
ＨおよびＮＡＤＰＨ（以下ｒＮＡＤ（Ｐ）ＨＪと記す）
がある。これらは、その最大吸光波長として３４０ｎ１
ｍをもつことから、紫外部吸収測定により、ＮＡＤ（Ｐ
）Ｈの増減を求め、それによって基質あるいは酵素活性
の定量を行なっている。しかしながら、この方法におい
ては、試料に濁りあるいは紫外部のみならず可視部の吸
収がある場合は定量が困難である。そのため、場合によ
っては、脱色や遠心分離あるいは除たんばく等の前処理
が必要となる。
、補酵素ＮＡＤおよびＮＡＤ、Ｐの還元型であるＮＡＤ
ＨおよびＮＡＤＰＨ（以下ｒＮＡＤ（Ｐ）ＨＪと記す）
がある。これらは、その最大吸光波長として３４０ｎ１
ｍをもつことから、紫外部吸収測定により、ＮＡＤ（Ｐ
）Ｈの増減を求め、それによって基質あるいは酵素活性
の定量を行なっている。しかしながら、この方法におい
ては、試料に濁りあるいは紫外部のみならず可視部の吸
収がある場合は定量が困難である。そのため、場合によ
っては、脱色や遠心分離あるいは除たんばく等の前処理
が必要となる。
上述のような比色法の欠点を克服するために、最近では
固定化酵素を用いた酵素電極による電気的測定装置が提
案されている。しかしながら、現在実用化されている酵
素電極法は、比色法によって定量可能であった基質のす
べてをカバーするものではなく、基質や反応生成物が電
極活性物質となるような一部の酵素反応系でしか利用で
きなかった。その１〔めに、現在の酵素電極法による測
定項目は、高々３ないし４Ｆ！１類程度にすぎず、この
発明が意図しているような補酵素ＮＡＤあるいはＮＡＤ
Ｐを必要とする酵素反応系には全く利用されていなかっ
た。
固定化酵素を用いた酵素電極による電気的測定装置が提
案されている。しかしながら、現在実用化されている酵
素電極法は、比色法によって定量可能であった基質のす
べてをカバーするものではなく、基質や反応生成物が電
極活性物質となるような一部の酵素反応系でしか利用で
きなかった。その１〔めに、現在の酵素電極法による測
定項目は、高々３ないし４Ｆ！１類程度にすぎず、この
発明が意図しているような補酵素ＮＡＤあるいはＮＡＤ
Ｐを必要とする酵素反応系には全く利用されていなかっ
た。
そこで、本件発明者らは従来の上記の問題点を克服して
、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素を固定化した酵素固定化担
体を用いてＮＡＤ （Ｐ）Ｈや他の基質あるいは酵素活
性を迅速かつ正確に測定ないし定量する装置を提供せん
とするものである。
、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素を固定化した酵素固定化担
体を用いてＮＡＤ （Ｐ）Ｈや他の基質あるいは酵素活
性を迅速かつ正確に測定ないし定量する装置を提供せん
とするものである。
この発明は、簡単に言うと、少なくともＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
酸化酵素を固定化した酵素固定化担体とＮへＤ （Ｐ）
Ｈを含む溶液を接触させ、その酵素反応に伴う酸素の減
少または過酸化水素の増加を１１％で測定することによ
り、化学量論的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量を行なうように
した足場装置である。
酸化酵素を固定化した酵素固定化担体とＮへＤ （Ｐ）
Ｈを含む溶液を接触させ、その酵素反応に伴う酸素の減
少または過酸化水素の増加を１１％で測定することによ
り、化学量論的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量を行なうように
した足場装置である。
この発明の池の実施例では、補酵素ＮＡＤ （Ｐ）を必
要とする酵素反応によってＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる
かあるいは、１つまたは？！数の酵素反応を共役させる
ことによってＮＡＤ （Ｐ）Ｈを生成し、生成されたＮ
ＡＤ （Ｐ）Ｈを電極を用いて測定することにより、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素以外の酵素反応に関与する生化学
物質あるいは酵素活性を測定ないし定量することができ
る。
要とする酵素反応によってＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる
かあるいは、１つまたは？！数の酵素反応を共役させる
ことによってＮＡＤ （Ｐ）Ｈを生成し、生成されたＮ
ＡＤ （Ｐ）Ｈを電極を用いて測定することにより、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素以外の酵素反応に関与する生化学
物質あるいは酵素活性を測定ないし定量することができ
る。
以下には、添付図面とともに、この発明の詳細な説明お
よびいくつかの実施例について詳細に説明する。
よびいくつかの実施例について詳細に説明する。
この発明に使用するＮ、ＡＤ（Ｐ））−１１！化瀞素は
、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈに酸素を供与してＮＡＤ （Ｐ）を
生成する酵素であり、次の２種類が知られている。
、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈに酸素を供与してＮＡＤ （Ｐ）を
生成する酵素であり、次の２種類が知られている。
１つは、次式（１）に示すような反応を呈する酵素であ
って、福井作蔵氏によってＬ ａｃｔｏｂａｃｉ ｌ
１ｕｓｐｌａｎｔａｒｌｊｌＩ Ｎｏ 、 １１に見
い出されている（アグリ力ルチャ・バイオロジカル・ケ
ミストリ第２５巻第１１号第８７０ないし８７８頁：１
９２ ＼ ＡＤ＜Ｐ＞ −←−２Ｈ２０・・・ （１
）他の１つはＲｕｄｉ Ｒｅｉｎａｒｄｓ氏らによッ
テ、Ａ ｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ：ａｉｄｌａｗａ
ｉｉに存在が知られているものである。これは、次式く
２）に示すように、酵素を与えてその結果ＮＡＤ （Ｐ
）と過酸化水素Ｈ２Ｏ２を生成するものである（ユアラ
ビアン・ジャーナル・バイオケミストり第１２０巻第３
２ＮＡＤ （Ｐ）＋Ｈ２Ｏ２−（２＞ この発明は、上記のＮＡＤ （Ｐ）Ｈｌｌ化酵素を、た
とえば酵素電極として電極に装着するための固定化酵素
膜、または試料流路に導入するための固定化酵素カラム
もしくは固定化酵素チューブ（コイル）などに固定化す
る。固定化酵素膜としては、アセチルセルロースやニト
ロセルロースなどのセルロース誘導体のような多孔性高
分子薄膜が一般的に用いられるが、この発明に用いられ
る固定化酵素膜としてはこれらの材料に限定されるもの
ではない。なお、膜厚は１００μ−以下特に２０μｍＱ
下が好ましい。他方、固定化酵素カラムの場合には、酵
素を固定化する担体としてガラスピーズまたはカラムゲ
ルに用いられる多糖類の粒子のセルロース誘導体もしく
は高分子微粒子が利用できる。固定化酵素チューブ（コ
イル）の場合には、担体としては、ナイロンが一般的に
用いられ得るが、これに限定されないことはもちろんで
ある。
って、福井作蔵氏によってＬ ａｃｔｏｂａｃｉ ｌ
１ｕｓｐｌａｎｔａｒｌｊｌＩ Ｎｏ 、 １１に見
い出されている（アグリ力ルチャ・バイオロジカル・ケ
ミストリ第２５巻第１１号第８７０ないし８７８頁：１
９２ ＼ ＡＤ＜Ｐ＞ −←−２Ｈ２０・・・ （１
）他の１つはＲｕｄｉ Ｒｅｉｎａｒｄｓ氏らによッ
テ、Ａ ｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ：ａｉｄｌａｗａ
ｉｉに存在が知られているものである。これは、次式く
２）に示すように、酵素を与えてその結果ＮＡＤ （Ｐ
）と過酸化水素Ｈ２Ｏ２を生成するものである（ユアラ
ビアン・ジャーナル・バイオケミストり第１２０巻第３
２ＮＡＤ （Ｐ）＋Ｈ２Ｏ２−（２＞ この発明は、上記のＮＡＤ （Ｐ）Ｈｌｌ化酵素を、た
とえば酵素電極として電極に装着するための固定化酵素
膜、または試料流路に導入するための固定化酵素カラム
もしくは固定化酵素チューブ（コイル）などに固定化す
る。固定化酵素膜としては、アセチルセルロースやニト
ロセルロースなどのセルロース誘導体のような多孔性高
分子薄膜が一般的に用いられるが、この発明に用いられ
る固定化酵素膜としてはこれらの材料に限定されるもの
ではない。なお、膜厚は１００μ−以下特に２０μｍＱ
下が好ましい。他方、固定化酵素カラムの場合には、酵
素を固定化する担体としてガラスピーズまたはカラムゲ
ルに用いられる多糖類の粒子のセルロース誘導体もしく
は高分子微粒子が利用できる。固定化酵素チューブ（コ
イル）の場合には、担体としては、ナイロンが一般的に
用いられ得るが、これに限定されないことはもちろんで
ある。
そして、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素の固定化は、公知の
いかなる方法すなわち化学的方法、（共肴結合法や架橋
結合法など）あるいは物理的方法（包括法や吸着性など
）によっても行なうことができるこの発明は前述の式（
１）または（２）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈｌｌ化酵素の反応に
よってＮＡＤ（’Ｐ）Ｈを定量するが、このＮＡＤ （
Ｐ）Ｈは、さらに、次のＮ索反応により生成されたもの
も含む。
いかなる方法すなわち化学的方法、（共肴結合法や架橋
結合法など）あるいは物理的方法（包括法や吸着性など
）によっても行なうことができるこの発明は前述の式（
１）または（２）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈｌｌ化酵素の反応に
よってＮＡＤ（’Ｐ）Ｈを定量するが、このＮＡＤ （
Ｐ）Ｈは、さらに、次のＮ索反応により生成されたもの
も含む。
（ｉ）ａ（基質） ＋ ＮＡ Ｄ （Ｐ ） −ＹＡ＆
ｉ屯酋−リ→ｂ （反応生成物？＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ （ｉｉ）Ｃ（基質）＋ｄ （基質ンー疼立二と１！４−
ｅ （基質）＝ｆ（反応生成物） ・、・！フ、ンー七２テ、−シ之１ ｅ （基質λ＋ＮＡＤ （Ｐ＞− − （反応生成物］＋ＮＡＤ （Ｐ）Ｈたとえばトリグ
ツごリドの定置については、以下の反応によって生成さ
れたＮＡＤ （Ｐ）Ｈを定ｌするここにより行なう。
ｉ屯酋−リ→ｂ （反応生成物？＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ （ｉｉ）Ｃ（基質）＋ｄ （基質ンー疼立二と１！４−
ｅ （基質）＝ｆ（反応生成物） ・、・！フ、ンー七２テ、−シ之１ ｅ （基質λ＋ＮＡＤ （Ｐ＞− − （反応生成物］＋ＮＡＤ （Ｐ）Ｈたとえばトリグ
ツごリドの定置については、以下の反応によって生成さ
れたＮＡＤ （Ｐ）Ｈを定ｌするここにより行なう。
１ご匂チ、−，・・、ｊ 、ニー。
ｉ〜・リグリセリ１ζτＨ２０
グリセロール＋脂肪酸イオン
グリセロール−ＮＡＤ（Ｐｉ’ニー・已−・４７−＋−
七篤イージヒドロ千シアセトンニＮＡｔ）（Ｐ） Ｈ以
下には、酵素電極を用いた実施例を例に挙げ、この発明
をざらに詳しく説明する。
七篤イージヒドロ千シアセトンニＮＡｔ）（Ｐ） Ｈ以
下には、酵素電極を用いた実施例を例に挙げ、この発明
をざらに詳しく説明する。
第１図はこの発明に用いられ得る酵素電極の一例を示す
断面図解図であり、第２図は固定化酵素膜の拡大断面図
である。酵素電極１はハウジング２を含み、このハウジ
ング２内には、作用電極３と関連の対照電極４が収納さ
れる。ハウジング２の上端には、たとえば螺合によって
蓋５が取付けられている。
断面図解図であり、第２図は固定化酵素膜の拡大断面図
である。酵素電極１はハウジング２を含み、このハウジ
ング２内には、作用電極３と関連の対照電極４が収納さ
れる。ハウジング２の上端には、たとえば螺合によって
蓋５が取付けられている。
作用電極３としは、電極活性物質としての酸素の減少を
測定する場合には、金、白金あるいはグラシカ−ボンな
どが用いられ、また対照電極４としては銀、鉛、塩化銀
あるいは飽和カロメル電極などが用いられ得る。作用電
極３は円柱状のものであり、対照電極４はそれを取巻く
環状のものとして構成される。これら２つの電極３およ
び４は、所定の間隔を隔てて、たとえばエポキシ樹脂の
ような樹脂１１６によってモールドされている。作用電
極３および４の端面はこの樹脂層６の下端においてそこ
から露出するように形成される。作用電極３および対照
電極４からは、樹脂層６および蓋５を通ってリード線が
引出され、このリード線は後述の電流検出器１１に接続
される。樹脂層６の下端面は、Ｏリング７によって装着
された固定化酵素膜８によって覆われる。したがって、
固定化酵素膜８と２つの電極３および４の端面とが接触
される。
測定する場合には、金、白金あるいはグラシカ−ボンな
どが用いられ、また対照電極４としては銀、鉛、塩化銀
あるいは飽和カロメル電極などが用いられ得る。作用電
極３は円柱状のものであり、対照電極４はそれを取巻く
環状のものとして構成される。これら２つの電極３およ
び４は、所定の間隔を隔てて、たとえばエポキシ樹脂の
ような樹脂１１６によってモールドされている。作用電
極３および４の端面はこの樹脂層６の下端においてそこ
から露出するように形成される。作用電極３および対照
電極４からは、樹脂層６および蓋５を通ってリード線が
引出され、このリード線は後述の電流検出器１１に接続
される。樹脂層６の下端面は、Ｏリング７によって装着
された固定化酵素膜８によって覆われる。したがって、
固定化酵素膜８と２つの電極３および４の端面とが接触
される。
固定化酵素膜８は、たとえば、酸素透過性のテフロン（
商品名）の膜８１と、セルロースフィルタにＮＡＤ （
Ｐ）Ｈ酸化酵素を吸着固定した固定化酵素膜、８２と、
試料中の高分子物質を透過させないための多孔性膜とし
てのポリカーボネート摸８３とを含む。
商品名）の膜８１と、セルロースフィルタにＮＡＤ （
Ｐ）Ｈ酸化酵素を吸着固定した固定化酵素膜、８２と、
試料中の高分子物質を透過させないための多孔性膜とし
てのポリカーボネート摸８３とを含む。
このような酵素電極１は、第３図のように反応槽１０に
浸漬され、この酵素電極１は電流検出器１１に接続され
る。すなわち、電流検出器１１によって、リード線を通
して、作用電極３および対照層１１４（７）ｆｆｉｌニ
、通常、−０，５Ｖないし−０゜７Ｍ程度の電圧が印加
され、この印加電圧はポーフログラフィにおける安定範
囲に設定される。そして、これら作用電極３および対照
電極４〈第１図）の間に流れる電流が、酵素反応によっ
て減少する酸素量に応じて変化し、その電流変化が電流
検出器１１によって検出される。電流検出器１１は、藺
録装置１２に接続され、この記録装置１２によって電流
変化の微分値が、検量線として記録される。なお、反応
槽１ｏ中には、マグネットスターラ（図示せず）が入れ
られていて、そこに溜められた緩衝液が常に攪拌されて
いる。
浸漬され、この酵素電極１は電流検出器１１に接続され
る。すなわち、電流検出器１１によって、リード線を通
して、作用電極３および対照層１１４（７）ｆｆｉｌニ
、通常、−０，５Ｖないし−０゜７Ｍ程度の電圧が印加
され、この印加電圧はポーフログラフィにおける安定範
囲に設定される。そして、これら作用電極３および対照
電極４〈第１図）の間に流れる電流が、酵素反応によっ
て減少する酸素量に応じて変化し、その電流変化が電流
検出器１１によって検出される。電流検出器１１は、藺
録装置１２に接続され、この記録装置１２によって電流
変化の微分値が、検量線として記録される。なお、反応
槽１ｏ中には、マグネットスターラ（図示せず）が入れ
られていて、そこに溜められた緩衝液が常に攪拌されて
いる。
実施例１
固定化酵素膜８にＮＡＤＨ酸化酵素を固定化する。そし
て、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）を反応槽１ｏ
に入れ、その後酵素電ｔｉｉ１を、固定化酸′１ｇ１１
８と緩衝液とが接するように、反応槽１０中に浸漬する
。りん酸緩衝液はマグネットスターラ（図示せず）によ
って常に攪拌されている。
て、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）を反応槽１ｏ
に入れ、その後酵素電ｔｉｉ１を、固定化酸′１ｇ１１
８と緩衝液とが接するように、反応槽１０中に浸漬する
。りん酸緩衝液はマグネットスターラ（図示せず）によ
って常に攪拌されている。
溶存酸素（の濃度）が安定した時点で、種々の濃度既知
のＮＡＤＨ溶液を反応槽１０中に加える。
のＮＡＤＨ溶液を反応槽１０中に加える。
酵素電極に固定化されたＮＡＤＨ酸化酵素とＮＡ［）Ｈ
との酵素反応の結果、前述の式〈１〉に従って、反応槽
１０中の酸素が減少し、この酸素の減少が電流検出器１
１によって検出されさらに記録装置１２によって記録さ
れる。この結果、第４図に示す検量線が得られた。
との酵素反応の結果、前述の式〈１〉に従って、反応槽
１０中の酸素が減少し、この酸素の減少が電流検出器１
１によって検出されさらに記録装置１２によって記録さ
れる。この結果、第４図に示す検量線が得られた。
次に、濃度未知のＮＡＤＨ含有試料を反応１１１１０中
へ注入して同様の操作により、電ｙｔ検出器１１によっ
て検出された電流変化論から、上述のような検Ｉｎを参
照して、この試料中のＮＡＤＨ濃度を求めた。
へ注入して同様の操作により、電ｙｔ検出器１１によっ
て検出された電流変化論から、上述のような検Ｉｎを参
照して、この試料中のＮＡＤＨ濃度を求めた。
第５図はこの発明の他の実施例を示すフローダイアグラ
ムである。この実施例は、特に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ１ｌｌ
化酵素の反応と補醪素ＮＡＤ （Ｐ）を必要とする酵素
反応またはその池のＷ＃票反応とを共役させてＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ酸化酵素の反応以外の酵゛素反応に関与する生
化学物質を定量するのに好適する実施例である。
ムである。この実施例は、特に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ１ｌｌ
化酵素の反応と補醪素ＮＡＤ （Ｐ）を必要とする酵素
反応またはその池のＷ＃票反応とを共役させてＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ酸化酵素の反応以外の酵゛素反応に関与する生
化学物質を定量するのに好適する実施例である。
この第５図実ｍ例において、許素電［ｉｌは、第１図お
よび第２図で示したものと同様である。酵素電極１の下
端には流路１３と連通するフローセルが一体的に取付け
られていて、それによって流路１３を流れる溶液が酵素
電極１の固定化酵素膜９（第１図）に接触するようにさ
れている。この流路１３の一方端には、ＩｉＩ液１１５
が連結される。試料槽１ｄが三方弁１７によってＩ［ｌ
Ｉｌ流路１３に連結される。この流路１３の下流側には
ポンプ１８が設けられ、流路１３の下流端には廃液槽１
９が連結されている。したがって、ポンプ１８によって
緩衝液流路１３が吸引され、三方弁１７を介して、緩衝
液槽１５内のｍ１ｌｌｉ液と試料槽１６内の試料溶液と
が流路１３を経て廃液槽１９内に流れ込む。試料１３の
酵素電極１の上流側には、固定化酵素カラム２０が介挿
されていて、この固定化酵素カラム２０には、たとえば
ガラスピーズのような固定化担体によって、周知の方法
で、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素の酵素反応と共役させる
べき反応を生ぜしめる酵素が固定化されている。なお、
酵素電極１は、電流検出器１１に接続され、そこから所
定の電圧が与えられるとともに、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ１化
酵素の酵素反応に伴う電橘活性物質たとえば酸素の減少
に応じたＮ流度化が読取られる。この電流検出器１１に
よって読取られた電流変化が、その微分１ｉ１（検量１
ｉｔ）として記録装置１２に記録される。
よび第２図で示したものと同様である。酵素電極１の下
端には流路１３と連通するフローセルが一体的に取付け
られていて、それによって流路１３を流れる溶液が酵素
電極１の固定化酵素膜９（第１図）に接触するようにさ
れている。この流路１３の一方端には、ＩｉＩ液１１５
が連結される。試料槽１ｄが三方弁１７によってＩ［ｌ
Ｉｌ流路１３に連結される。この流路１３の下流側には
ポンプ１８が設けられ、流路１３の下流端には廃液槽１
９が連結されている。したがって、ポンプ１８によって
緩衝液流路１３が吸引され、三方弁１７を介して、緩衝
液槽１５内のｍ１ｌｌｉ液と試料槽１６内の試料溶液と
が流路１３を経て廃液槽１９内に流れ込む。試料１３の
酵素電極１の上流側には、固定化酵素カラム２０が介挿
されていて、この固定化酵素カラム２０には、たとえば
ガラスピーズのような固定化担体によって、周知の方法
で、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ酸化酵素の酵素反応と共役させる
べき反応を生ぜしめる酵素が固定化されている。なお、
酵素電極１は、電流検出器１１に接続され、そこから所
定の電圧が与えられるとともに、ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ１化
酵素の酵素反応に伴う電橘活性物質たとえば酸素の減少
に応じたＮ流度化が読取られる。この電流検出器１１に
よって読取られた電流変化が、その微分１ｉ１（検量１
ｉｔ）として記録装置１２に記録される。
実施１＊２（乳酸の定り
酵素電極１の固定化酵素膜８（第２図）には、ＮＡＤＨ
酸化ＷＩ素を固定化する。固定化酵素カラム２０の酵素
担体には、乳酸脱水素酵素ＬＤＨが周知の方法で固定化
される。ｖｌ［ｒ液槽１５には、ＮＡＤ １１Ｇ／Ｉ
Ｑ、を含む０．１Ｍりん酸緩衝液（１））−１７，０）
を３０℃で貯えておく。これをポンプ１８によってｌｌ
１ｉ液流路１３に流し、固定化酵素カラム２０および酵
素電極１の固定化酵素膜に接触するようにしておく。ｌ
１ｌｉ液流路１３に三方弁１７によって乳酸を含む試料
を試料槽］６から注入する。注入された試料すなわち乳
酸は、固定化酵素カラム２０においてＬＤＨと反応を生
じ、ＮＡＤＨが生成される。このようにして生成された
ＮＡＤＨが流路１３を流れ酵素電極１の固定化酵素膜に
接触する。
酸化ＷＩ素を固定化する。固定化酵素カラム２０の酵素
担体には、乳酸脱水素酵素ＬＤＨが周知の方法で固定化
される。ｖｌ［ｒ液槽１５には、ＮＡＤ １１Ｇ／Ｉ
Ｑ、を含む０．１Ｍりん酸緩衝液（１））−１７，０）
を３０℃で貯えておく。これをポンプ１８によってｌｌ
１ｉ液流路１３に流し、固定化酵素カラム２０および酵
素電極１の固定化酵素膜に接触するようにしておく。ｌ
１ｌｉ液流路１３に三方弁１７によって乳酸を含む試料
を試料槽］６から注入する。注入された試料すなわち乳
酸は、固定化酵素カラム２０においてＬＤＨと反応を生
じ、ＮＡＤＨが生成される。このようにして生成された
ＮＡＤＨが流路１３を流れ酵素電極１の固定化酵素膜に
接触する。
試料として、種々の濃度既知の乳酸を含むものを用い、
上述と同様の操作を繰返して、第６図の検量線を得た。
上述と同様の操作を繰返して、第６図の検量線を得た。
次に、濃度未知の乳酸を含む試料を注入して、同様の操
作により、電流検出器１１によって検出されたＮ流度１
ヒ埴から、第６図のような検ｉｓを参照して、この試料
中の乳ＳａＷを求めた。
作により、電流検出器１１によって検出されたＮ流度１
ヒ埴から、第６図のような検ｉｓを参照して、この試料
中の乳ＳａＷを求めた。
なお、上述の実施例では、１！楊活性珈貢として酸素の
減少を測定した。しかしながら、これは鹸述の式（２）
に従って過酸化水素の増加を測定するようにしてもよい
。
減少を測定した。しかしながら、これは鹸述の式（２）
に従って過酸化水素の増加を測定するようにしてもよい
。
また、＼Ａｍ）（Ｐ）ＨＷＩ化醇素の酵素反応（よって
、試料中に含まれるＮＡＤ （Ｐ）Ｈをまたは生成され
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定するに際して、酵素電極を用い
ないで、固定化酵素カラムと電極の組合わせあるいは固
定１ヒ醪素コイルないしチューブと電極の組合わせを用
いることもできる。
、試料中に含まれるＮＡＤ （Ｐ）Ｈをまたは生成され
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定するに際して、酵素電極を用い
ないで、固定化酵素カラムと電極の組合わせあるいは固
定１ヒ醪素コイルないしチューブと電極の組合わせを用
いることもできる。
なお、ＮＡＤ ＜Ｐ）Ｈ酸化酵素の酵素反応と共役さぜ
るべき酵素反応のための酵素とは、上述のように個別の
担体に固定化してもよく、また同一の担体たとえば固定
化酵素膜に固定化してらよいつ以上のように、この発明
によれば、ＮＡＤ （Ｐ＞Ｈ酸化酵素を固定化してなる
酵素固定化担体と電極どの組合わせによって、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを定量することができ、単独であるいは池の酵
素反応と共役させることによって、種々の生化学物質ま
たは酵素活性を定ｌすることができる。
るべき酵素反応のための酵素とは、上述のように個別の
担体に固定化してもよく、また同一の担体たとえば固定
化酵素膜に固定化してらよいつ以上のように、この発明
によれば、ＮＡＤ （Ｐ＞Ｈ酸化酵素を固定化してなる
酵素固定化担体と電極どの組合わせによって、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを定量することができ、単独であるいは池の酵
素反応と共役させることによって、種々の生化学物質ま
たは酵素活性を定ｌすることができる。
第１図はこの発明に用いられ得る酵素電極の一例を示す
断面図解図である。第２図は固定化酵素膜の一例を示す
拡大断面図である。第３図はこの発明の一実施例を示す
フローダイアグラムである。 第４図は第３図実施例に従って作成したＮＡＤ（Ｐ）
！−（の検量線の一例を示すグラフである。第５図はこ
の発明の他の実ｍ例を示すフローダイアグラムである。 第６図は第５図実施例に従って得た乳酸の検量線の一例
を示すグラフである。 図において、］は酵素電極、３は作用電極、４は対照電
極、８は固定化酵素膜、１１は電流検出器、２０は固定
化酵素カラムを示す。 特許出願人 立石電機株式会社 代 理 人 弁理士 深 見 久 部（
ほか２名）
断面図解図である。第２図は固定化酵素膜の一例を示す
拡大断面図である。第３図はこの発明の一実施例を示す
フローダイアグラムである。 第４図は第３図実施例に従って作成したＮＡＤ（Ｐ）
！−（の検量線の一例を示すグラフである。第５図はこ
の発明の他の実ｍ例を示すフローダイアグラムである。 第６図は第５図実施例に従って得た乳酸の検量線の一例
を示すグラフである。 図において、］は酵素電極、３は作用電極、４は対照電
極、８は固定化酵素膜、１１は電流検出器、２０は固定
化酵素カラムを示す。 特許出願人 立石電機株式会社 代 理 人 弁理士 深 見 久 部（
ほか２名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ｌ’、ｌ Ａ Ｄ Ｈ蓑化酵素またはＮＡＤ
ＰＨＩＩ化醇索を固定化してなる固定化酵素担体を備え
、前記固定化酵素担体に固定化されたＮＡＤＨ酸化１９
素また。よＮＡＤＯＨ酸化酵素とＮ Ａ Ｄ Ｈまたは
＼、へＤＰＨを含有する溶液とによって酵素反応を生亡
しの、 前記酵素反応に伴う酸素の減少または過酸化水素フ〕増
加を測定するための電極を備える、固定化ｔＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ酸化酵素を用いた定量装置。 （２） 前記固定化酵素担体は固定化酵素膜を含み、前
記固定化酵素膜は前記電極表面に装着され、それによっ
て譬素電ｔが形成され、前記薯素電慟が前記Ｎ Ａ Ｄ
ＨまたはＮＡＤＰＨを富有する１庸に浸漬された、特
許請求の範囲第１項記載の定１１＊置。 （３） 前記固定化酵素担体は固定化酵素カラムを含む
、特許請求の範囲第１項記載の定量装置。 ！’ｌ Ｆｉ記固定化酢素担体は固定化酵素チューブ
を含む、特許請求の範囲第１項記載の定量装置。 （５） 補酵素ＮＡＤまたはＮＡＤＰを必要とする酵素
を前記固定化Ｎ素担体と同一の担体に固定化し、 前記Ｎ Ａ、 ＤまたはＮ Ａ Ｄ Ｐを必要とする酵
素反応とＮＡＤＨ酸化酵素またはＮ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ酸
化酵素の反応とを共役させて生成されるＮＡＤＨまたは
ＮＡＤＰＨを前記電極を用いて定量し、それによって １’ｉ Ａ Ｄ ＨＩＩ化酵素または＼Ａ、 Ｄ Ｐ
Ｈ酸化訂素の反応以外の酵素反応に関与する生化学物質
または酵素活性を特徴する特許請求の範囲第１項ないし
第４項のいずれかに記載の定量装＠４（６） 前記ＮＡ
ＤＨ酸化醪素またはＮ Ａ Ｄ ＰＨ酸化酵素の固定化
酵素担体とは異なる別の担体に補酵ＪＩＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを特徴とする特許を固定化し、 前記ＮＡＤまたはＮＡＤＰを必要とする酵素反応とＮＡ
Ｄ）−１酸化酵素またはＮＡＤＰＨＩＩ化酵素の反応と
を共役させて生成されるＮＡＤＨまたはＮＡＯＰＩ−１
を前記電極を用いて定量し、それによって ＮＡＤＨｉｌｌ化酵素またはＮＡＤＰＨ酸化醪素の反応
以外の酵素反応に関与する生化学物質または酵素活性を
特徴する特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか
に記載の定量装置。 （７） 前記ＮＡＤ）−Ｉｌｌ化酵素またはＮＡＤＰＨ
酸化酵素の固定化酵素担体と同一の担体に、１つまたは
複数の酵素反応のための酵素を固定化し、前記１つまた
は複数の酵素反応を共役させてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈを生成し、 前記１つまたは複数の酵素反応とＮＡＤＨＭ化酵素また
はＮＡＤＰＨ酸化酵′素の反応とを共役させて前記生成
されたＮＡＤＩ−（またはＮＡＤＰＨを前記電極を用い
て定量し、それによって前記１つまたは複数の酵素反応
に関与する生化学物質または酵素活性を特徴する特許請
求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の定ｌ装
置。 （８） 前記ＮＡＤＨ酸化酵素またはＮＡＤＰＨ酸化酵
素の固定化酵素担体とは異なる担体に１つまたは複数の
酵素反応のための酵素を固定化し、前記１つまたは複数
の酵素反応を共役させてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生
成し、 前記１つまたは複数の酵素反応とＮＡＤＩ−１酸化酵素
またはＮＡＤＰＨ酸化酵素の反応とを共役させて前記生
成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを前記電極を用いて
定ｌし、それによって前記１つまたは複数の酵素反応に
関与する生化学物質または酵素活性を特徴する特許請求
の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の定量装置
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57091938A JPS58208658A (ja) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | 固定化ｎａｄ（ｐ）ｈ酸化酵素を用いた定量装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57091938A JPS58208658A (ja) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | 固定化ｎａｄ（ｐ）ｈ酸化酵素を用いた定量装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58208658A true JPS58208658A (ja) | 1983-12-05 |
| JPH0365490B2 JPH0365490B2 (ja) | 1991-10-14 |
Family
ID=14040529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57091938A Granted JPS58208658A (ja) | 1982-05-28 | 1982-05-28 | 固定化ｎａｄ（ｐ）ｈ酸化酵素を用いた定量装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58208658A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6428555A (en) * | 1987-07-24 | 1989-01-31 | Terumo Corp | Enzyme sensor |
| JPH01257499A (ja) * | 1988-04-07 | 1989-10-13 | Sekisui Chem Co Ltd | Ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダーゼを用いたｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 |
-
1982
- 1982-05-28 JP JP57091938A patent/JPS58208658A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6428555A (en) * | 1987-07-24 | 1989-01-31 | Terumo Corp | Enzyme sensor |
| JPH01257499A (ja) * | 1988-04-07 | 1989-10-13 | Sekisui Chem Co Ltd | Ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダーゼを用いたｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0365490B2 (ja) | 1991-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lowe | Biosensors | |
| Guilbault et al. | Enzyme electrodes based on the use of a carbon dioxide sensor. Urea and L-tyrosine electrodes | |
| CA1177735A (en) | Method of polarographic analysis of lactic acid and lactate | |
| US3857771A (en) | Rate sensing batch analyzer | |
| JP2838484B2 (ja) | ガス測定用バイオセンサー及びその製造方法 | |
| AU605111B2 (en) | Enzyme-electrode sensor | |
| Keedy et al. | Determination of urate in undiluted whole blood by enzyme electrode | |
| Palleschi et al. | Ideal hydrogen peroxide-based glucose sensor | |
| JPS61128152A (ja) | 生物化学センサ | |
| Morelis et al. | Sensitive biosensor for choline and acetylcholine involving fast immobilization of a bienzyme system on a disposable membrane | |
| Milardović et al. | Glucose determination in blood samples using flow injection analysis and an amperometric biosensor based on glucose oxidase immobilized on hexacyanoferrate modified nickel electrode | |
| Hale et al. | Enzyme-modified tetrathiafulvalene tetracyanoquinodimethane microelectrodes: direct amperometric detection of acetylcholine and choline | |
| US4317879A (en) | Glucose analyzer membrane containing immobilized glucose oxidase | |
| Kissinger | Biomedical applications of liquid chromatography-electrochemistry | |
| WO1994002842A1 (en) | Analytical method for the detection and measurement of paracetamol | |
| JP3499767B2 (ja) | ヒスタミン計測用微小電極およびヒスタミン計測用センサ | |
| WO1995021934A1 (en) | Hexacyanoferrate modified electrodes | |
| US5306413A (en) | Assay apparatus and assay method | |
| Winartasaputra et al. | Amperometric enzymic determination of triglycerides in serum | |
| US4045296A (en) | Rate sensing batch analysis method and enzyme used therein | |
| Compagnone et al. | Amperometric glutathione electrodes | |
| JPS58208658A (ja) | 固定化ｎａｄ（ｐ）ｈ酸化酵素を用いた定量装置 | |
| Palleschi et al. | Amperometric probe for 3-hydroxybutyrate with immobilized 3-hydroxybutyrate dehydrogenase | |
| JPH043500B2 (ja) | ||
| Sittampalam et al. | Amperometric determination of glucose at parts per million levels with immobilized glucose oxidase: An undergraduate experiment |