JPH01203959A - 酵素固定化ｆｅｔセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、臨床検査、食品加工等の分野において液体中
の生化学物質の濃度測定に有用な、電界効果型トランジ
スタを利用した分析器具に関する。

［従来技術とその欠点１ 電界効果型トランジスタ（以下、ＦＥＴと略記する）は
、半導体のソース領域とドレイン領域の間に流れる電流
が、ゲートの電位による電界効果により制御されること
を利用したトランジスタである。ゲートの電位として、
例えばイオン感応膜で生じた膜電位を与えることにより
、イオン活量を測定するのに利用することができる。

白金または金を感応面とするＦＥＴが酸化還元電位に応
答することを利用し、感応面に固定化した、酵素の作用
下に生成する過酸化水素による電位応答を測定して、試
料液中の基質を定量する酵素固定化ＦＥＴが、日本分析
化学会第３５年会要旨集第７５２頁演題３ＧＯ８（発表
者・上壁ら２１９８６年）で知られている。

上記酵素固定化ＦＥＴは、ゲート部に接続した白金線又
はゲート上に蒸着した金薄膜を感応面とし、その表面を
アミノシリル化し、血清アルブミンとゲルタールアルデ
ヒドにより、グリコースオキシダーゼ等の酸化酵素とペ
ルオキシダーゼを固定化したものである。

しかしこのＦＥＴで基質濃度を測定するには、試料液中
に一定濃度のへキサシアノ第一鉄塩を加える必要があっ
た。

［解決しようとする技術的課題］ 試料液のｐＨを確認又は１）整するだけで、そのまま試
料液中の基質を定量できる酵素固定化Ｆ［！Ｔを実現す
ることが本発明における技術的課題である。

［技術的課題の解決手段］ 上記課題は、酸化還元電位に応答し得る貴金属をゲート
の感応面とし、この感応面に酸化酵素および第一鉄錯塩
を固定化したＦＥＴにより達成された。

本発明において感応面に第一鉄錯塩、例えばフェロセン
を固定化するには、Ｊ、　Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ。

Ｃｈｅｗ、　　１）７巻、２３３−２４１ページ（著者
Ｊ　−Ｅ、　Ｄｕｂｏｉｓ　　ら、１９８１）に述べら
れた、反応性アミノ基を有するポリフェニレンオキシド
膜にフェロセン体をグラフトさせる方法を利用すること
ができる。

反応性アミノ基を有するポリフェニレンオキシド膜は、
ｐ−（２−アミノエチル）フェノール（通称チラミン）
、Ｎ−（θ−ヒドロキシベンジル）アニリン等のように
、アミノ基又はアニリノ基を有するフェノール類の電気
化学的酸化によって得られる。この膜は白金等の金属の
表面に強く付着し、フェロセンカルボキシアルデヒドの
アルデヒド基と反応性アミノ基との縮合によってフェロ
センをグラフトすることができる。チラミンの電気化学
的酸化によって得られたポリチラミン膜はフェロセンの
固定化に適している。ポリチラミン膜は白金等の金属の
面上に、電解重合によって形成することができる。チラ
ミンの電気化学的酸化およびポリチラミンへのフェロセ
ンの固定化の反応式は下記の通りである。

酸化酵素を固定化するには、上記のようにして第一鉄錯
塩を固定化た感応面に、天然又は合成高分子膜形成物質
の膜を形成し、これに架橋剤を用いて酸化酵素を固定化
すればよい。例えば、従来技術として述べたように、血
清アルブミン膜にゲルタールアルデヒドを架橋剤として
、グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）とペルオキシダー
ゼ（ＰＯＤ）を固定化することができる。

天然高分子としてアルブミンのほか、グロブリン、ゼラ
チン等も用いることができる。架橋剤としてゲルタール
アルデヒド以外に、活性ハロゲン、ビニルスルホニル基
、カルバジド基等の官能基を２個以上有する化合物を用
いることができる。かような化合物はハロゲン化銀写真
感光材料の業界においてゼラチンの硬膜剤として多く知
られている。

ゲート部に感応面を設けるためには、前述の上壁らの実
験のようにＦＥＴのゲート上に金薄膜を蒸着するか、金
、白金等の板又は線（少くとも金、白金等の表面を有す
る）をＦＥＴのゲートに接続すればよい。

ＦＥＴの感応面には、酸化酵素、第−鉄錯イオンととも
にペルオキシダーゼを固定化することが好ましい、固定
化には酸化酵素と同じ方法を用いることができる。

酸化酵素は、分析しようとする成分によって選択される
。例えば第１表に示す如き酸化酵素が用いられる。

第　　１　　表 ＦＥＴとしては市販のＦＥＴの適当なものを用いること
ができる。

例えば東芝製２３に２４１゜ 〔実施例〕 本発明の実施例を、第１図乃至第３図に基づいて以下に
説明する。

この実施例は、本発明の酵素固定化ＦＥＴセンサーをグ
ルコース濃度測定に適用したものであり、第２図は、こ
の実施例におけるＦＥＴセンサーの断面図である。

このＦＥＴセンサーは、ＦＥＴとして市販のＭＯＳＦＥ
Ｔ　（東芝製２３に２４１）を用い、ＦＥＴｌ５はゲー
トリードＮａ１３に白金板３（３Ｘ１２ＸＯ，５ｃｍ）
を接続し、ガラス管ｌＢ中に、ガラス管の底より白金ゲ
ート３の大部分がつき出るように装着、支持される。Ｆ
ＥＴのドレインリードｖＡ１７及びソースリード線１６
はガラス管１８の上端開口部より上方に引き出される。

さらに白金ゲート３上にポリチラミン膜４を電解重合で
形成するための電解重合用リード線１４が、ゲートリー
ド線１３に接続され、ガラス管１８の上端よりひき出さ
れる。

白金ゲート３のガラス管１８の底部より垂下する部分の
表面には、ポリチラミンＩＩｕ４が形成されている。こ
のポリチラミン膜には第一鉄錯塩として、フェロセンが
グラフトされている。ポリチラミン膜４の表面には、更
に血清アルブミン膜にゲルタールアルデヒドを架橋剤と
して、グルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）とペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）を固定化した酵素膜５が形成されてい
る。

次に、ポリチラミン膜４の形成方法並びにこのポリチラ
ミン膜にフェロセンを固定化する方法、及び酵素膜５の
形成方法を以下に説明する。

先ず、白金ゲート３の表面にポリチラミン１）４を電解
重合により形成する。この電解重合に使用される電解液
は、メタノール１）あたり０．１モルのチラミン及び０
．３モルの水酸化ナトリウムを溶解したものである。こ
の電解液中に作用電極として、白金ゲート３、対照電極
として塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｊり電極、さらに電解液を
零電位とするためのカウンタ電極として白金電極を、浸
漬する。そして、白金ゲート３と塩化銀電極間に電解重
合用リード線１４を通じ一定電流を流し定電流電解を行
ない、白金ゲート３表面にポリチラミン膜を形成する。

上記電解重合により形成されたポリチラミン膜４に、フ
ェロセンをチラミン分子との間に共有結合の形で固定化
する。フェロセンを固定化するには、エタノールＩｌｌ
中に０．１モルのフェロセンカルボキシアルデヒドを溶
解したフェロセン固定化液にＦＥＴセンサーの白金ゲー
ト３を室温で２日間浸漬する。さらに、フェロセンが固
定化されたポリチラミン膜４に酵素膜５を形成する。

酵素膜５の形成方法は、先ず、牛血清アルブミン８０■
、ゲルタールアルデヒド（ＣＯＤ）４０■、ペルオキシ
ダーゼ（ＰＯＤ）８０■を、それぞれ０．ＯＩＭ、ｐＨ
７，０のリン酸緩衝液１ｍｌに溶解する。別にゲルター
ルアルデヒドの８％水溶液を用意し、これら４種の溶液
を等量づつ混合した液にポリチラミン膜で被覆された白
金ゲート３を浸漬し、素早く引上げた後、冷暗所で１２
時間以上乾燥させて酵素膜５を形成する。

第１図は、この実施零に係る酵素固定化ＦＥＴセンサー
１の使用例を説明する図である。

グルコース（Ｇｆｕ）を含む被検液８に浸漬された酵素
固定化ＦＥＴセンサー１には、ソースリード線１６とド
レインリード線１７を通し、ソース６、ドレイン７間に
５．Ｏｖの直流電圧が印加される。この時、白金ゲート
３上に形成された酵素膜５では、先ず、ＣＯＤの作用に
より、Ｇｌｕが次式で示される反応を起す。

・・・・・・ｉｌ＋ さらに（１）式の反応生成物Ｈｚ　Ｏ！により、ポリチ
ラミン膜４に固定化されたフェロセン（Ｃｐ、Ｆｅ）の
酸化反応が生ずる。この反応の速度はＰＯＤの作用によ
り高められる。

Ｈｚ　Ｏｘ　＋２Ｃｐｚ　Ｆｅ＋２Ｈ＋・・・・・・（
２） この酸化型Ｃｐ、Ｆｅ＋の濃度と還元型（反応前の型）
Ｃｐｚ　Ｆｅの濃度差に比例して、ポリチラミン膜４の
膜電位が変化し、ＦＥＴのソースドレイン間に流れる電
流を変化させる。この膜電位の変化は被検液８中に含ま
れるＧ　１　ｕ　９３度に比例している。

ポリチラミン膜４の膜電位変化に伴ない生ずるソースド
レイン電流の変化は、電流計１０又はソースホロア回路
と呼ばれる回路により、電圧に変換されて検出、記録さ
れる。なお、基準電極９は、被検液８の膜電位変化が、
１）電位に影響を及ぼすのを防ぐために用いる。この実
施例では、基準電極９ば塩化１）（Ａｇ／ＡｇＣ１電極
を使用しているが、これに限定されるものではなく、適
宜変更可能である。

第３図は、Ｏ，ＩＭ、ｐＨ７，０のリン酸緩衝液中に種
々の濃度でＧｌｕを溶解した液を被検液とし、リン酸緩
衝液中での膜電位に対する各々のＧ　１　ｕ　４度にお
ける膜電位の変化量をソースホロア回路で測定して得た
検量線を示している。この検Ｎ線を用いる事により未知
検体中のＧＡｕ濃度を求めることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素固定化ＦＥＴセンサーの使用例の
略図である。 第２図は本発明のセンサーの実施例の断面図である。 第３図は本発明の実施例で得られた検量線を示すグラフ
である。 記号の表わす意義は下記の通りである。 １７　　ドレインリード線 １８　　ガラス管 １６　　ソースリード線 １５　　　ＦＥＴ １４　　電解重合用リード線 １３　　ゲートリード線 １２　　接着剤 １）　　ハンダ付接続部分 ３　　白金ゲート ４　　ポリチラミン膜 ５　　酵素膜 特許出願人　富士写真フィルム株式会社第１回 第３図 ０．＋　　　　　　　　０．５　　　１　　　　　　　
　　５グ）レコー久濃＆　　（ｒｎＭ）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酸化還元電位に応答し得る貴金属をゲートの感応
   面とし、該感応面に酸化酵素および第一鉄錯塩を固定化
   した電界効果型トランジスタから成る、液体中の物質の
   分析に用いるセンサー。
2. （２）金又は白金をゲートの感応面とし、反応性アミノ
   基を有するポリフェニレンオキシド膜にフエロセンをグ
   ラフトすることにより感応面に固定化した、特許請求の
   範囲（１）のセンサー。
3. （３）感応面に酸化酵素、ペルオキシダーゼおよびフエ
   ロセンを固定化した特許請求の範囲（１）のセンサー。