JP2002221508A

JP2002221508A - バイオセンサ

Info

Publication number: JP2002221508A
Application number: JP2001019601A
Authority: JP
Inventors: Takashi Shimamura; 隆嶋村; Fumihiko Hoshino; 文彦星野; Osamu Asami; 修浅見
Original assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2002-08-09

Abstract

(57)【要約】【課題】少量の検体試料液でも容易に測定操作のでき
るバイオセンサを提供する。【解決手段】酵素と酵素基質との反応量を、当該反応
により直接に増大又は減少する物質の濃度に依存する電
極の電流変化値として検出するバイオセンサにおいて、
電極表面に酵素又は酵素基質のいずれか一方を含む親水
性高分子膜を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素と酵素基質と
の反応量を電極の電流値変化として検出し、これによっ
て酵素又は酵素基質を測定するバイオセンサに関する。
本発明は、例えば、抗原抗体反応等を利用して酵素で標
識された検出目的物や、検出目的物自体である酵素基質
を高感度に測定するのに好適である。

【０００２】

【従来の技術】近年、バイオセンサは臨床医療、環境計
測、食品工業等の幅広い分野で応用されており、小型で
低コストなバイオセンサの提供が望まれている。例えば
臨床医療分野では、血中のグルコースを定量するための
バイオセンサであるグルコースセンサの開発が、糖尿病
検査等への利用を目的として盛んに行われている。

【０００３】このグルコースセンサを例にとって説明す
ると、試料中の検出目的物であるグルコースを、これを
基質とするグルコース酸化酵素と反応させてδ−グルコ
ノラクトンに変換する。この変換の際、酸素が電子受容
体となって過酸化水素が発生するので、上記の酸素の減
少量を酸素電極で測定したり、上記の過酸化水素の増加
量を過酸化水素電極で測定したりすることで、試料中の
グルコース濃度を正確に測定することができる。

【０００４】上記の酸素電極や過酸化水素電極はクラー
ク型電極を指し、一般に、作用極と対極とが電解液でつ
ながるように電解液の液だめ又はゲル状電解質を形成
し、その上に透過膜を形成した構造からなる。

【０００５】又、上記の酵素反応によって生じた電子と
電極の仲介をする物質であるフェリシアン化カリウム等
の電子メディエータ（以下、単に「メディエータ」と言
う）を利用することも行われている。メディエータを利
用する場合、試料中に混在する各種の電流検出妨害因子
の影響を抑制したり、高濃度のグルコース検定において
溶存酸素の影響を小さくする、等の一定の有用性が認め
られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、バイオ
センサの検体試料は例えば血液、尿、唾液等のように水
を溶媒とする溶液であることが多い。一方、バイオセン
サの電極表面は例えばポリエチレンテレフタレート（Ｐ
ＥＴ）等の疎水性材料からなり、又は電極表面がテフロ
ン（登録商標）（テトラフルオロエチレン重合体）等の
疎水性材料膜で被覆されている場合が多い。このため電
極表面と検体試料液とのなじみ（電極表面に対する検体
試料液のヌレ性）が悪く、微量の検体試料液を測定する
ことが困難であると言う不具合があった。

【０００７】このような不具合に対し、本願発明者は、
疎水性材料からなり又は疎水性材料膜で被覆された電極
表面に親水性高分子膜を形成し、酵素反応に関与する酵
素又は酵素基質をこの高分子膜中に含ませることを着想
した。

【０００８】ところで、例えば特開２０００−４６７８
２号公報には、電極表面に酸化還元酵素及び酵素反応検
知試薬（メディエータ）を配合した蛋白質等の高分子膜
を形成したバイオセンサが開示されている。この高分子
膜は、メディエータを高濃度に使用した場合に電極表面
に生じる隆起及び凸凹化を抑制したり、酵素及びメディ
エータの電極表面からの剥離／脱落を防止することを目
的としている。

【０００９】しかし本願発明者の研究によれば、高分子
膜にメディエータを配合すると、メディエータが元々高
濃度である場合はもちろんであるが、元々低濃度である
場合でも高分子膜を乾燥させる際に高濃度化したメディ
エータが、（ａ）酵素又は基質の溶解性を低下させる、
（ｂ）酵素の安定性を低下させる、（ｃ）酵素反応を阻
害する、等の不具合を生じさせることが判明した。従っ
て、本願発明者の着想を、メディエータを利用する方式
のバイオセンサに適用することは、好ましくない。

【００１０】そこで本発明は、以上の着想及び知見に基
づき、酵素反応に基づき微量の検体試料液を容易に測定
することができるバイオセンサを提供することを、解決
すべき課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】（第１発明の構成）上記
課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の
発明）の構成は、酵素と酵素基質との反応量を、当該反
応により直接に増大又は減少する物質の濃度に依存する
電極の電流値変化として検出するバイオセンサにおい
て、疎水性材料からなり、又は疎水性材料膜で被覆され
た電極表面に、前記酵素又は酵素基質のいずれか一方を
含む親水性高分子膜を成膜した、バイオセンサである。

【００１２】（第２発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、
前記第１発明に係る親水性高分子膜を構成する親水性高
分子が、生体高分子、合成高分子又はこれらの誘導体で
ある、バイオセンサである。

【００１３】（第３発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、
前記第２発明に係る親水性高分子がゼラチン、アガロー
ス、コラーゲン、ポリビニルアルコール又はこれらのい
ずれかの誘導体である、バイオセンサである。

【００１４】（第４発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、
前記第１発明〜第３発明に係る親水性高分子膜が酵素を
含む場合において、該酵素は、試料中の検出目的物であ
る酵素基質と反応させるためのものである、バイオセン
サである。

【００１５】（第５発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、
前記第１発明〜第３発明に係る親水性高分子膜が酵素基
質を含む場合において、該酵素基質は、試料中の検出目
的物と結合した酵素と反応させるためのものである、バ
イオセンサである。

【００１６】（第６発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、
前記第１発明〜第５発明に係る酵素が酸化還元酵素であ
る、バイオセンサである。

【００１７】

【発明の作用・効果】（第１発明の作用・効果）第１発
明のバイオセンサにおいては、疎水性材料からなり又は
疎水性材料膜で被覆された電極表面に酵素又は酵素基質
のいずれか一方を含む親水性高分子膜を成膜したので、
電極表面と検体試料液とのなじみが良くなり、微量の検
体試料液であっても容易に測定することができる。

【００１８】又、第１発明のバイオセンサは、酵素と酵
素基質との反応量を当該反応により直接に増大又は減少
する物質の濃度に依存する電極の電流値変化として検出
する方式であり、前記特開２０００−４６７８２号公報
に開示されたようなメディエータを利用する方式のバイ
オセンサではないので、電極表面の高分子膜に起因する
前記（ａ）〜（ｃ）のような不具合を伴わない。

【００１９】（第２発明の作用・効果）親水性高分子膜
を構成する親水性高分子としては、例えば第２発明のよ
うに、生体高分子、合成高分子又はこれらの誘導体を用
いることができる。

【００２０】（第３発明の作用・効果）親水性高分子膜
を構成する親水性高分子の代表的なものとして、例えば
第３発明のように、生体高分子たる蛋白質であるゼラチ
ン、アガロース、コラーゲン、合成高分子であるポリビ
ニルアルコール、又はこれらのいずれかの誘導体を好ま
しく例示することができる。これらの高分子は、親水性
であると共に乾燥時の吸水性（水に対する膨潤性）が高
い点で、特に好ましい。

【００２１】（第４発明の作用・効果）バイオセンサ
は、例えばグルコースセンサのように、試料中の検出目
的物である酵素基質（グルコース）と反応させるための
酵素（グルコースオキシダーゼ）を親水性高分子膜に含
ませておく形式とすることができる。

【００２２】（第５発明の作用・効果）バイオセンサ
は、例えば免疫クロマトグラフィーと組合わせたセンサ
のように、試料中の検出目的物（例えば唾液中のコルチ
ゾール）を予め抗原抗体反応を利用して特定の酵素で標
識しておき、この酵素と反応させるための特定の酵素基
質を親水性高分子膜に含ませておく形式とすることがで
きる。

【００２３】（第６発明の作用・効果）バイオセンサに
おいて利用する酵素反応に係る酵素としては、特に酸化
還元酵素が好ましい。

【００２４】

【発明の実施の形態】次に、第１発明〜第６発明の実施
の形態について説明する。以下において単に「本発明」
と言うときは、第１発明〜第６発明を一括して指してい
る。

【００２５】〔バイオセンサ〕本発明のバイオセンサ
は、電極表面に酵素又は酵素基質のいずれか一方を含む
親水性高分子膜を成膜する点を特徴とする。この特徴点
を除いては構成及び使用材料に関して特段に限定はな
く、公知の種々のバイオセンサのいずれかと同様に構成
することができる。上記電極は前記したクラーク型電極
として構成されていることも好ましい。

【００２６】電極基板を構成する材料には、電気絶縁性
の材料であることを前提として、例えばポリエチレンテ
レフタレート，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニル，ポリ
カーボネート，ポリスルフォン等の疎水性材料が用いら
れる。電極基板上には例えばスクリーン印刷法その他の
公知の任意の手法により、銀ペースト等を用いて、作用
極（カソード）と対極（アノード）とが形成される。本
発明において「電極表面」とは、電極基板における電極
が形成された面を言い、このような電極表面が、例えば
テフロン（テトラフルオロエチレン重合体），シリコー
ン樹脂，ネガ型フォトレジスト等の疎水性材料膜で被覆
されていても良い。バイオセンサには、上記した各要素
の他、後述の実施例において開示され、あるいは通常の
バイオセンサが備えることがある任意の構成要素、例え
ば基質透過制限膜，試料吸収膜等を備えることができ
る。

【００２７】本発明のバイオセンサは、酵素と酵素基質
との反応量を、当該酵素反応により直接に増大又は減少
する物質の濃度に依存する電極の電流値変化として検出
する方式のバイオセンサである。酵素反応により直接に
増大又は減少する物質としては、例えば酸化還元酵素に
係る酵素反応においては、酸素や過酸化水素が挙げられ
る。本発明においては、従来技術に関して前記した理由
から、メディエータを利用する方式のバイオセンサを含
まない。

【００２８】〔親水性高分子膜〕バイオセンサの電極表
面に成膜される親水性高分子膜は、電極表面の全体を覆
うように成膜しても良いが、電極表面における少なくと
も作用極と対極とを覆うように成膜されていれば足り
る。親水性高分子膜の厚さは限定されないが、例えば
０．１μｍ〜１０μｍ程度とすることができる。親水性
高分子膜を酸素電極上に成膜させると、反応系を外気か
ら遮断できると言う効果もある。

【００２９】親水性高分子膜を構成する親水性高分子の
種類は限定されない。好ましくは、生体高分子、合成高
分子又はこれらの誘導体が用いられる。これらの内、特
に好ましくは、親水性で、乾燥状態における吸水性（水
に対する膨潤性）が優れたものが用いられる。好ましい
親水性高分子の具体例として、生体高分子であるゼラチ
ン，アガロース，コラーゲン、又は合成高分子であるポ
リビニルアルコール等が挙げられる。

【００３０】親水性高分子膜に対する酵素又は酵素基質
の配合量は目的に応じて任意に設定できる。そして、酵
素又は酵素基質のいずれか一方を含む親水性高分子膜を
成膜する方法も限定されないが、例えば、酵素又は酵素
基質のいずれか一方と、親水性高分子とを所定の濃度に
溶解させた水溶液を準備し、これを適当な方法で電極表
面に施して所定の厚さの膜状に固化、乾燥させることが
できる。この親水性高分子膜は、使用時において検体試
料液と接触させた時、迅速に検体試料液を吸収し、所定
の酵素反応を起こす。

【００３１】〔酵素又は酵素基質〕本発明のバイオセン
サの使用目的は限定されない。代表的な使用目的が、前
記第４発明及び第５発明のようなバイオセンサである。

【００３２】第４発明のバイオセンサにおいては、試料
中の検出目的物が特定の酵素の基質であり、親水性高分
子膜には該酵素が含まれている。従って、検体試料液が
親水性高分子膜に接触して吸収された時、酵素と検出目
的物である酵素基質とが反応する。そして当該酵素反応
により直接に増大又は減少する物質の濃度に依存する電
極の電流値変化が検出され、これによって、結果的に検
出目的物である酵素基質の有無又は濃度が測定される。

【００３３】第５発明のバイオセンサにおいては、試料
中の検出目的物が抗原抗体反応等を利用して特定の酵素
で標識されており、親水性高分子膜にはその酵素の基質
が含まれている。従って、検体試料液が親水性高分子膜
に接触して吸収された時、検出目的物と結合した酵素
と、酵素基質とが反応する。そして当該酵素反応により
直接に増大又は減少する物質の濃度に依存する電極の電
流値変化が検出され、これにより、結果的に酵素と結合
した検出目的物の有無又は濃度が測定される。

【００３４】以上の第４発明及び第５発明の場合におい
て、用いる酵素の種類は限定されないが、良く用いられ
るものが酸化還元酵素である。又、第４発明及び第５発
明の場合において利用価値の高い酸化還元酵素と酵素基
質との組合わせとして、次のものを例示できる。（１）酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素基質
がグルコースである。（２）酵素がクレアチナーゼ，クレアチニナーゼ又はサ
ルコシンオキシダーゼであり、酵素基質がクレアチニン
である。（３）酵素がコレステロールオキシダーゼであり、酵素
基質がコレステロールである。（４）酵素がアルコールオキシダーゼであり、酵素基質
がアルコールである。

【００３５】

【発明の有益な実施態様】本発明は、以下の実施態様に
おいて好ましく実施することができる。これらの実施態
様の記載において、「上記」とは、該当する先行実施態
様番号に係る各実施態様の全てを、択一的に指してい
る。

【００３６】１）酵素と酵素基質との反応量を、当該反
応により直接に増大又は減少する物質の濃度に依存する
電極の電流値変化として検出するバイオセンサにおい
て、疎水性材料からなり又は疎水性材料膜で被覆された
電極表面に、前記酵素又は酵素基質のいずれか一方を含
む親水性高分子膜を成膜したバイオセンサ。

【００３７】２）上記疎水性材料がポリエチレンテレフ
タレートであり、又は上記疎水性材料膜がテフロン（テ
トラフルオロエチレン重合体）からなる。

【００３８】３）上記親水性高分子膜を構成する親水性
高分子が、生体高分子、合成高分子又はこれらの誘導体
である。

【００３９】４）上記親水性高分子が、乾燥状態におい
て吸水性（水に対する膨潤性）に優れた高分子である。

【００４０】５）上記親水性高分子が、ゼラチン、アガ
ロース、コラーゲン、ポリビニルアルコール又はこれら
のいずれかの誘導体である。

【００４１】６）上記親水性高分子膜が、電極表面にお
ける少なくとも作用極と対極とを覆うように形成されて
いる。

【００４２】７）上記親水性高分子膜の厚さが０．１μ
ｍ〜１０μｍである。

【００４３】８）上記親水性高分子膜が、酵素又は酵素
基質のいずれか一方と、親水性高分子とを所定の濃度に
溶解させた水溶液を電極表面に施して成膜させることに
より形成されたものである。

【００４４】９）上記バイオセンサが親水性高分子膜に
酵素を含み、該酵素は試料中の検出目的物である酵素基
質と反応させるためのものである。

【００４５】１０）上記バイオセンサが親水性高分子膜
に酵素基質を含み、該酵素基質は試料中の検出目的物と
結合した酵素と反応させるためのものである。

【００４６】１１）上記酵素が酸化還元酵素である。

【００４７】１２）上記酸化還元酵素と酵素基質との組
合わせが、酵素がグルコースオキシダーゼであり、酵素
基質がグルコースである。

【００４８】１３）上記酸化還元酵素と酵素基質との組
合わせが、酵素がクレアチナーゼ，クレアチニナーゼ又
はサルコシンオキシダーゼであり、酵素基質がクレアチ
ニンである。

【００４９】１４）上記酸化還元酵素と酵素基質との組
合わせが、酵素がコレステロールオキシダーゼであり、
酵素基質がコレステロールである。

【００５０】１５）上記酸化還元酵素と酵素基質との組
合わせが、酵素がアルコールオキシダーゼであり、酵素
基質がアルコールである。

【００５１】

【実施例】以下、本発明の実施例をクレアチニン計測用
バイオセンサで詳細に説明する。クレアチニンセンサの
分解斜視図を図１に、組付け状態における断面図を図２
に、それぞれ示す。銀（Ag）ペーストを用いて、スクリ
ーン印刷法により、ポリエチレンテレフタレート製の基
板１上に一対の有機物／Ag電極２，３（作用極が２であ
り、対極が３である）を印刷した。これを電気炉中、１
２０°Ｃで３０分間加熱処理した。次いで一対の電極
２，３のうち、片方の電極３のみを０．１Ｍ塩酸中で塩
化処理し、Ag／AgCl膜とした。

【００５２】両面粘着性のテープの中央部に四角形状の
窓部４ａをくり抜いてスペーサ４とし、電極２の感応部
２ａ及び電極３の感応部３ａが窓部４ａにくるように、
これを基板１上に貼り付けた。

【００５３】スペーサ４の窓４ａ内に１Ｍ塩化カリウム
を注入し、酸素透過膜５であるポリテトラフルオロエチ
レン膜を貼り付けた。

【００５４】１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．０８
μＬ，クレアチニナーゼ（１０ｕ／μＬ）０．３３μ
Ｌ，クレアチナーゼ（１０ｕ／μＬ）０．０９μＬ，サ
ルコシンオキシダーゼ（３ｕ／μＬ）０．１μＬ，２０
％ゼラチン０．２５μＬからなる混合液を予め４０°Ｃ
で保温しておき、この混合液を電極極２の感応部２ａ上
に相当する酸素透過膜５上に滴下して酵素膜６とし、酵
素膜６上に０．８μｍポアサイズのポリカーボネートか
らなる基質透過制限膜７を貼り付け、室温で１５分間乾
燥した。

【００５５】両面粘着性のテープの中央部に四角形状の
窓部８ａをくり抜いてスペーサ８とし、基質透過制限膜
７が窓部８ａにくるように、これを酸素透過膜５上に貼
り付けた。最後に、スペーサ８上に試料吸収膜９である
セルロース膜を貼り付け、クレアチニンセンサとした。

【００５６】このクレアチニンセンサの対極である電極
３に対して作用極である電極２にマイナスの電圧０．８
Ｖを印加し、印加開始６０秒後に試料吸収膜９上に０．
１〜２ｍｇ／ｍＬのクレアチニン溶液１５μＬを滴下し
た。

【００５７】その結果、図３に示す出力電流曲線が得ら
れ、９０秒と１００秒の電流差（Δ電流）を求めると、
図４に示すように、クレアチニン０．１〜２ｍｇ／ｍＬ
で良好な直線性（相関係数ｒ＝０．９９０）を得た。

【００５８】本実施例ではクレアチニン計測用バイオセ
ンサについて示したが、酵素としてグルコースオキシダ
ーゼ，コレステロールオキシダーゼ，アルコールオキシ
ダーゼなどの酸化還元酵素を用いれば、グルコースセン
サ，コレステロールセンサ，アルコールセンサなどを作
製することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例に係るバイオセンサの分解斜視図であ
る。

【図２】図１のバイオセンサの組付け状態における断面
図である。

【図３】実施例に係る出力電流測定結果を示すグラフ線
図である。

【図４】実施例に係るクレアチニンの検量線を示すグラ
フ線図である。

【符号の説明】

１基板２，３電極６酵素膜

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｒ 27/46 ３３６Ｊ３３６Ｇ３３８ (72)発明者浅見修愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内Ｆターム(参考） 2G045 DA31 DA42 DA69 DA80 FB01 FB05 GC20 4B029 AA07 BB16 CC03 CC11 FA12 4B063 QA01 QA18 QQ03 QR02 QR48 QR82 QS36 QX05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素と酵素基質との反応量を、当該反応
により直接に増大又は減少する物質の濃度に依存する電
極の電流値変化として検出するバイオセンサにおいて、疎水性材料からなり、又は疎水性材料膜で被覆された前
記電極表面に、前記酵素又は酵素基質のいずれか一方を
含む親水性高分子膜を成膜したことを特徴とするバイオ
センサ。
【請求項２】前記親水性高分子膜を構成する親水性高
分子が、生体高分子、合成高分子又はこれらの誘導体で
あることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】前記親水性高分子が、ゼラチン、アガロ
ース、コラーゲン、ポリビニルアルコール又はこれらの
いずれかの誘導体であることを特徴とする請求項２に記
載のバイオセンサ。
【請求項４】前記親水性高分子膜が酵素を含む場合に
おいて、該酵素は、試料中の検出目的物である酵素基質
と反応させるためのものであることを特徴とする請求項
１〜請求項３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項５】前記親水性高分子膜が酵素基質を含む場
合において、該酵素基質は、試料中の検出目的物と結合
した酵素と反応させるためのものであることを特徴とす
る請求項１〜請求項３のいずれかに記載のバイオセン
サ。
【請求項６】前記酵素が酸化還元酵素であることを特
徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載のバイオ
センサ。