JP2006349412A

JP2006349412A - クレアチニンバイオセンサ

Info

Publication number: JP2006349412A
Application number: JP2005173792A
Authority: JP
Inventors: Masao Goto; 正男後藤; Hideaki Nakamura; 秀明中村; Masao Karube; 征夫輕部
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2005-06-14
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2006-12-28

Abstract

【課題】酵素活性を損なうことなく、簡便に製造可能なクレアチニンバイオセンサを提供する。
【解決手段】基板上に少なくとも一対の作用極および対極を備えたセンサにおいて、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびメデイエーターをpH7〜8.5の緩衝液中に溶解させた試薬溶液を、電極上および／または電極周辺の基板上で乾燥せしめることにより固定化させたクレアチニンバイオセンサ。このクレアチニンバイオセンサは、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼの各酵素とともに、緩衝剤が固形状態で電極上に配置されているため、測定時において酵素を安定化させるための緩衝液を調製することなく、測定試料をそのまま用いることができ、また煩雑な操作を必要とすることなくクレアチニンの測定を行うことが可能となるといった優れた効果を奏する。
【選択図】なし

Description

本発明は、バイオセンサに関する。さらに詳しくは、クレアチニンを定量するためのバイオセンサに関する。

腎臓でグリシンとアルギニンとからトランスアミジナーゼによってグアニド酢酸が合成され、肝臓でメチルトランスフェラーゼの作用で、活性メチオニンからメチルが転移されることによって生成されたクレアチンは、血中に入り、その98％は筋肉に、一部分は神経に分布し、クレアチンキナーゼの作用により高エネルギー化合物のクレアチンリン酸に合成され、エネルギー源として重要な役割を果たしている。

クレアチンは腎臓糸球体からろ過されるが、尿細管で再吸収されるため、成人男性ではほとんど尿中に排泄されない。血清クレアチンが増加すると、腎臓のトランスアミジナーゼが抑制されて生合成が抑えられ、尿中排泄量が増加する。正常成人の体内総クレアチンプール量は、100〜120gであり、その約1％が毎日合成され、同量が脱水されてクレアチニンとなり尿中に排泄される。

クレアチニンは、生体内では筋肉、神経内でクレアチンリン酸から直接に、またクレアチンの脱水によって生成され、血中に出現し、腎臓糸球体からろ過されたのち、ほとんど再吸収されずに尿中に排泄される。その尿中排泄量は主として筋肉のクレアチン総量に比例し、成人では体重当たりほぼ一定で、食事性因子や尿量などにほとんど影響されない。従って、尿中クレアチニンの増加は、神経・筋疾患が大部分で、筋肉におけるクレアチンの利用の低下、筋肉の崩壊・変性・萎縮・細胞膜の透過性亢進などの幾序によるものとされている。

また、血清クレアチニン濃度は糸球体ろ過値(GFR)と密接な相関があり、腎臓機能障害の指標として尿素窒素(BUN)より正確であり、人工透析療法などの普及につれて、その適応および経過判定に尿素窒素と血清クレアチニン(CR)との同時測定が多く行われ、BUN/CR比が病態の把握に利用されている。このようにクレアチニンの測定には、多くの臨床的意義が認められる。

血中クレアチニンの正常値は、成人男性で0.8〜1.3mg/dl、成人女性で0.5〜0.9mg/dl、であるのに対して、異常値は、正常範囲を逸脱する場合が該当し、糸球体ろ過値(GFR)が50％付近で血中クレアチニン量は1.2〜2.4mg/dlとなり、これは病状として腎機能障害に相当し、またGFR 10％以上〜50％未満では血中クレアチニン量は2.5〜7.9mg/dlとなり、これは腎不全に相当する。さらに、GFR 10％未満となると血中クレアチン量は8.0mg/dl以上となり、これは尿毒症期と診断される。一方、正常範囲より値が低い場合は、尿崩症や筋ジストロフィー、多発性筋炎の疑いがある。

従来のクレアチニンの代表的な測定法には、化学法(Jaffe法)がある。Jaffe法とは、クレアチニンをアルカリ溶液中でピクリン酸と反応させ、クレアチニンピクレート形成に基づく橙赤色を呈した反応物質を生じさせ、その比色定量から値を求める方法であり、その測定法には、蛋白を除いたFolin-Wu法と蛋白を含んだ方法が挙げられる。かかる反応物質の主たるものはクレアチニンであるが、アセトン、ピルビン酸、ブドウ糖、蛋白、ビリルビン、アスコルビン酸、高濃度抗生物質などもピクリン酸と反応してJaffe反応陽性物質を生成するため、測定値は真のクレアチニンの値よりも高値を示すという問題があり、また操作も煩雑であるといった欠点があった。
臨床検査法提要(金原出版)、150-152頁、469頁、512-517頁(1993) 酵素工学概論(コロナ社)、133頁(1995) Medical Technology、26巻、389〜395頁(1998) 広範囲血液・尿化学検査、免疫学的検査(上)、402〜406頁

かかる問題を解決すべく、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼを電極上に固定化させたクレアチニンバイオセンサが提案されている。しかるにかかるセンサは、固定化に際して酵素活性が低下するものであったり、あるいはセンサの作製過程が複雑であったりと、改良が望まれているのが現状である。
Clin. Chem.、29巻1号、51頁(1983年) 特表２００３−５３３６７９号公報

本発明の目的は、酵素活性を損なうことなく、簡便に製造可能なクレアチニンバイオセンサを提供することにある。

かかる本発明の目的は、基板上に少なくとも一対の作用極および対極を備えたセンサにおいて、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびメデイエーターをpH7〜8.5の緩衝液中に溶解させた試薬溶液を、電極上および／または電極周辺の基板上で乾燥せしめることにより固定化させたクレアチニンバイオセンサによって達成される。

本発明に係るクレアチニンバイオセンサは、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼの各酵素とともに、緩衝剤が固形状態で電極上に配置されているため、測定時において酵素を安定化させるための緩衝液を調製することなく、測定試料をそのまま用いることができ、また煩雑な操作を必要とすることなくクレアチニンの測定を行うことが可能となるといった優れた効果を奏する。

さらに、センサの作成方法についても、各酵素およびメディエーターを緩衝液に溶解したものをセンサ電極上および／または電極周辺の基板上で乾燥させれば足りるので、簡単に製造することができ、かかる作成方法により得られるクレアチニンバイオセンサは大量生産が可能である。

メデイエーターとしてはフェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体などが用いられる。これらは、試料液中に存在する溶存酸素の測定結果への妨害を排除するとともに、測定感度も向上せしめるといった効果を奏する。

緩衝液としては、pH7〜8.5の緩衝液、例えばpH7〜8.5のリン酸塩緩衝液またはpH7〜8.5のマレイン酸緩衝液が用いられる。pHが、これ以上でもこれ以下でも、酵素活性の低下がみられるため好ましくない。

クレアチニナーゼ(EC3.5.2.10)、クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)およびザルコシンオキシダーゼ(EC1.5.3.1)の各酵素は、メデイエーターとともに、pH7〜8.5の緩衝液中に溶解されて試薬溶液とした後、基板上に少なくとも一対の作用極および対極を備えたセンサの電極上および／または電極周辺の基板上に乾燥させることにより固定化される。

これらの各酵素およびメディエーターは、クレアチニナーゼ0.0005〜0.01U、好ましくは0.001〜0.005U、クレアチナーゼ0.0005〜0.01U、好ましくは0.001〜0.004U、ザルコシンオキシダーゼ0.0005〜0.01U、好ましくは0.001〜0.005U、メデイエーター0.01〜0.3mg、好ましくは0.06〜1.2mgを1μlの緩衝液中に溶解した後、電極上および／または電極周辺の基板上にピペット、デスペンサーなどを用いて滴下し、4℃〜室温、好ましくは4〜10℃、30分〜24時間乾燥させることにより固定化される。

センサーを構成する基板材料としては、ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、生分解性材料、紙、セラミックス、ガラスなどが用いられ、この基板上に電極がスクリーン印刷法、スパッタリング法、蒸着法、メッキ法、箔貼り付け法などにより、好ましくはスクリーン印刷法により形成される。

電極材料としては、一般的に用いられる電極材料、例えば白金、金、カーボン、グラファイト、ナノカーボンなどによって形成される。ナノカーボンを含む材料を電極材料として用いた場合には、選択性の向上などが期待できる。ナノカーボンとしては、カーボンナノホーン、コクーンなどのカーボンナノチューブのほか、カーボンナノコイル、フラーレンおよびその誘導体など、好ましくはカーボンナノチューブが用いられる。カーボンナノチューブとしては、アーク放電法、気相成長法、レーザー蒸発法などにより製造されたものが用いられ、構造的には多層または単層のいずれのものも用いられる。

クレアチニンバイオセンサの電極としては、作用極と対極の２極またはこれに参照極を加えた３極の電極のものが用いられ、好ましくはクレアチニンバイオセンサを小型化する観点からは、２極のものが、測定精度の信頼性を高める観点からは、銀／塩化銀などの参照極を加えた３極のものが用いられる。なお、電極の大きさ、配置は特に限定されない。

測定試料液としては、生体液試料、例えば血液試料あるいは尿試料をそのまま用いることができ、クレアチニンの測定に際しては、酸化電流もしくは還元電流を測定するポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法またはクーロメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法などが用いられる。

上述のようなバイオセンサを用いて測定する場合には、測定装置に上記バイオセンサを取り付け、バイオセンサに生じた電気的な値を測定する。この測定装置には、バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、計測された値を表示する表示部が備えられる。この計測部における計測方法としては、上述した如くポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法、ボルタンメトリー法などを用いることができる。

また、この装置には、計測値を保存するためのメモリーを備えることもできる。さらに、測定値を遠隔的に管理する場合には、バイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段、好ましくは非接触型ICカードまたは短距離無線通信(例えば、ブルートゥース；登録商標)などの無線手段を搭載することもできる。

測定に際しては、白金やグラファイトを電極材料とした電極で測定する場合には、電極に電圧をかけて測定するが、カーボンナノチューブを含む電極を使用した場合には、電極間電圧を特定の電圧に設定することにより測定が行われ、測定妨害物質の影響を避けて目的物質を選択的に測定することができる。白金やグラファイトを電極材料とした電極では、電圧により過酸化水素やメデイエーターだけでなく、アスコルビン酸、尿酸、アセトアミノフェンなどの妨害物質にも反応してしまうが、カーボンナノチューブを配合した電極は、電圧を選択して特定電圧にて測定を行うことにより、過酸化水素やメデイエーターに反応する一方で、これらの妨害物質にそれほど反応しない状態を設定でき、選択性にすぐれたクレアチニンバイオセンサを形成することが可能となる。

クレアチニンバイオセンサの原理は以下の通りである。クレアチニンは、クレアチニナーゼを触媒として加水分解され、クレアチンとなる。
Creatinine＋H₂O → Creatine
そのクレアチンは、クレアチナーゼを触媒とする反応で加水分解されてザルコシンとなる。
Creatine + H₂O → Sarcosine + Urea
ザルコシンは、ザルコシンオキシダーゼによって酸化されて、過酸化水素を発生する。
Sarcosine + O₂+ H₂O → glycine + HCHO + H₂O₂

発生した過酸化水素は、電極で酸化または還元されて、発生した電流が測定される。
電極による酸化の場合：H₂O₂ → O₂ + 2H⁺ + 2e^-
電極による還元の場合：H₂O₂ + 2H⁺ + 2e^- → 2H₂O
この電流値は、クレアチニン濃度に比例するので、クレアチニンの濃度を求めることができる。

このようなクレアチニンバイオセンサにおいて、反応がサンプル中の溶存酸素濃度に律速され、低濃度のサンプルしか測定できない場合には、高濃度のサンプルの測定を目的として酵素とともに電子伝達体(メディエーター)が使用される。

この場合、ザルコシン生成までの反応は上記と同様であるが、ザルコシンオキシダーゼの反応は以下のようになり、
Sarcosine + 2[Fe(CN)₆]^3- → glycine + 2[Fe(CN)₆]^4- +2H⁺
電極反応は、以下のようになる。
2[Fe(CN)₆]^4- → 2[Fe(CN)₆]^3- + 2e^-

このようなクレアチニンバイオセンサは、同一基板上にグルコースバイオセンサ、ケトン体(ベータヒドロキシ酪酸)バイオセンサおよびpHセンサの少なくとも一種、例えばクレアチニンバイオセンサとグルコースバイオセンサ、クレアチニンバイオセンサーとケトン体バイオセンサ、更に３種の組み合わせとして、クレアチニンバイオセンサー、グルコースバイオセンサおよびケトン体バイオセンサの組み合わせ、さらにはこれらにpHセンサなどを加えて複合センサを形成することがきできる。

グルコースバイオセンサとしては、例えば酵素としてグルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムなどのメディエーターを電極上に配置した構成のものが用いられ、ケトン体バイオセンサとしては、例えばヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを電極上に配置した構成のものが用いられ、pHセンサとしては、例えばキンヒドロンおよび塩化ナトリウムを電極上に配置した構成のものが用いられる。

クレアチニン測定により、糖尿病に伴う腎機能障害のチェックが、グルコース測定により血糖のチェックが、ケトン体測定により糖尿病に伴うケトーシス(血中ケトン体が3ミリモル/L以上)のチェックが、pH測定によりアシドーシス(血液pHが7.3以下)のチェックおよび糖尿病性ケトアシドーシスのチェックが同時に可能となる。このようにかかる複合センサは、糖尿病の患者にとって便利なバイオセンサとなり得る。

以上述べた本発明に係るクレアチニンバイオセンサは、サンプル中のクレアチン量がほぼ一定濃度で、濃度が大幅に変動しないサンプルを前提にしている。この場合、サンプル中のクレアチンと反応しても、その出力分はほぼ一定であるため、クレアチニンバイオセンサとして機能する。

一方、クレアチン量が変動しやすいサンプルの場合は、測定方法としてクレアチン量を差し引く差動測定方式を採用することが好ましい。これは、同一基板上にクレアチニンバイオセンサとクレアチンバイオセンサを形成し、クレアチニンバイオセンサの出力からクレアチンバイオセンサの出力を差動回路を用いて差し引く方法であり、このようなクレアチンバイオセンサとしては、上述したクレアチニンバイオセンサにおいて、クレアチニナーゼを用いないもの、すなわちクレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびメデイエーターをpH7〜8.5の緩衝液中に溶解させた試薬溶液を乾燥せしめた作用極および対極からなるものが相当する。差動測定方式のクレアチニンバイオセンサは、例えば同一基板上に1本の共通対極、その両側に２本の作用極を形成し、一方の作用極にクレアチニンバイオセンサーを形成し、他方の作用極にクレアチンバイオセンサを形成して作成される。

次に、実施例について本発明を説明する。

実施例１
センサは、ポリエチレンテレフタレート基板上にスクリーンインク(アサヒ化学研究所製品TU15ST)を用いて、スクリーン印刷により2極構造のカーボン電極形成することにより作製した。クレアチニナーゼ(シグマ社製品C-3172)0.003U、クレアチナーゼ(シグマ社製品C-7024)0.002U、ザルコシンオキシダーゼ(東洋紡製品SAO-341)0.0034Uおよびフェリシアン化カリウム(関東化学製品)0.078mgをpH 7.41の中性リン酸塩緩衝液1μlに溶解し、これをマイクロピペットを用いて電極上に滴下した。滴下後、4℃、24時間の条件下で乾燥を行い、クレアチニンバイオセンサを作製した。

クレアチニンサンプル(関東化学製品)を、所定濃度となるように中性リン酸塩pH7.41標準液(和光純薬工業製品)に溶解したもの10μlを用いて、クレアチニン濃度に対する出力値の測定が行われた。測定機器としては、ボルタンメタリーアナライザー BAS CV-50W(BAS社製品)を用い、ポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法により測定が行われた。測定条件は、電圧1300mV、サンプル滴下後反応時間80秒において電圧印加時間10秒であった。

得られた結果は、表1および図1に示される。測定範囲は、臨床的に必要とされる測定範囲0.5〜8.0mg/dlを含んでおり、再現性は変動係数で9％であった。
表１
測定電流(μA)
クレアチニン１２３平均
0 mg/dl 39.46 39.25 40.22 39.64
1 〃 39.72 39.42 40.93 40.02
5 〃 37.58 40.48 43.34 40.47
10 〃 39.82 41.25 40.81 40.63
15 〃 40.48 44.16 37.96 40.87

実施例２
実施例１において、緩衝液として中性リン酸塩pH6.86標準液(和光純薬工業製品)、中性リン酸塩pH7.41標準液(同社製品)、マレイン酸pH8.10標準液(同社製品)またはホウ酸塩pH9.18標準液(同社製品)が用いられ、クレアチニンサンプルとしては、クレアチニン濃度が10mg/dlのものが用いられた。

得られた結果は、次の表２および図２に示される。センサーの最適pHは、出力の大きさからみて、pＨ7.0〜8.5であることが示された。
表２
測定電流(μA)
pH １２３平均
6.86 37.07 39.62 33.18 36.62
7.41 44.87 39.54 48.13 44.18
8.10 39.03 46.59 50.68 45.43
9.18 25.57 25.47 25.44 25.49

本発明に係るクレアチニンバイオセンサは、生体液試料、例えば血液試料あるいは尿試料をそのまま用いて、これらに含まれるクレアチニン量を簡単に測定することができるので、腎臓機能障害を簡易にチェック可能なクレアチニン測定器具として有効に用いられる。

本発明に係るクレアチニンセンサのクレアチニンに対する検量性を調べたグラフである。本発明に係るクレアチニンセンサ作製時に用いられる緩衝液の最適pHを調べたグラフである。

Claims

基板上に少なくとも一対の作用極および対極を備えたセンサにおいて、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびメデイエーターをpH7〜8.5の緩衝液中に溶解させた試薬溶液を、電極上および／または電極周辺の基板上で乾燥せしめることにより固定化させたことを特徴とするクレアチニンバイオセンサ。
同一基板上に、さらにクレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびメデイエーターをpH7〜8.5の緩衝液中に溶解させた試薬溶液を乾燥せしめた作用極および対極よりなるクレアチンバイオセンサが併せて形成された請求項１記載のクレアチニンバイオセンサ。
対極が、クレアチニンバイオセンサおよびクレアチンバイオセンサで共通である請求項２記載のクレアチニンバイオセンサ。
クレアチニンバイオセンサの出力からクレアチンバイオセンサの出力を差し引く差動出力形式でクレアチニンの測定が行われる請求項２または３記載のクレアチニンバイオセンサ。
メデイエーターが、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体およびオスミウム錯体の少なくとも一種である請求項１乃至４のいずれかに記載のクレアチニンバイオセンサ。
pH7〜8.5の緩衝液として、リン酸塩緩衝液またはマレイン酸緩衝液が用いられる請求項１乃至４のいずれかに記載のクレアチニンバイオセンサ。
電極材料として、ナノカーボンを含むものが用いられる請求項１乃至４のいずれかに記載のクレアチニンバイオセンサ。
同一基板上に、グルコースバイオセンサ、ケトン体バイオセンサおよびpHセンサーの少なくとも一種が併せて形成された請求項１乃至７のいずれかに記載のクレアチニンバイオセンサ。
請求項１乃至８のいずれかに記載のバイオセンサと、バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、計測部における計測値を表示する表示部と、計測値を保存するメモリー部とを備えたバイオセンサ装置。
計測部における計測方法としてポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法またはサイクリックボルタンメトリー法が適用される請求項９記載のバイオセンサ装置。
さらにバイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段を備え、無線手段が非接触型ICカードまたは短距離無線通信である請求項９または１０記載のバイオセンサ装置。