WO2009144881A1 - クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置 - Google Patents

クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置 Download PDF

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中南貴裕
柏田耕志
福永淳
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Definitions

  • the present invention relates to a measurement method, a measurement device, and a measurement apparatus for quantifying creatinine and salt contained in a sample.
  • Measurement of the concentration of creatinine contained in a sample is important in the fields of clinical chemistry and analytical chemistry. Since creatinine is a product of the endogenous metabolism of muscle, it is known that the amount of creatinine in urine reflects the total muscle mass. Therefore, it is said that the amount of creatinine in urine excreted by humans in a day is generally constant for each individual and does not vary from day to day. Therefore, the amount of creatinine in urine is sometimes used as a measure of the density of excreted urine. In addition, the amount of creatinine in urine and blood increases or decreases due to uremia or decreased renal function. Therefore, by measuring the amount of creatinine in urine or blood, it is possible to know whether there is uremia or a decrease in renal function.
  • a method using an enzyme that specifically reacts with creatinine is known.
  • a method using an enzyme for example, there is a method of decomposing creatinine using creatinine deiminase (see, for example, Patent Document 2).
  • the concentration of creatinine is obtained by measuring the amount of ammonia produced by the decomposition of creatinine from the change in pH or potential.
  • creatinine amide hydrolase As the enzymes that catalyze the reactions of formulas (1) to (3), creatinine amide hydrolase (creatininase), creatine amidinohydrolase (creatinase), and sarcosine oxidase or sarcosine dehydrogenase are used in this order.
  • a method for quantifying creatinine for example, a method in which a leuco dye or a Trinder reagent is used together with peroxidase and the hydrogen peroxide generated in Formula (3) is colored and spectroscopically quantified is used. (For example, see Patent Document 3).
  • a method of electrochemically oxidizing the hydrogen peroxide generated in Formula (3) with an electrode and quantifying creatinine from a flowing current is used (for example, Patent Documents 4 and 5). reference).
  • Patent Document 6 discloses a creatinine biosensor provided with at least a pair of working electrodes and a counter electrode on a substrate and immobilizing the reagent by drying the reagent solution on the electrode or on the substrate around the electrode.
  • the reagent solution is obtained by dissolving creatininase, creatinase, sarcosine oxidase, and potassium ferricyanide (mediator) in a pH 7 to 8.5 buffer. Further, it is disclosed that when the pH of the buffer solution is less than 7 or more than 8.5, the enzyme activity is lowered, which is not preferable.
  • Patent Document 7 discloses that creatinine is quantified by a colorimetric method or an electrochemical detection method using a mediator incorporated with cyclodextrin together with sarcosine oxidase. Specifically, ⁇ -naphthoquinone (1,4-naphthoquinone) is mentioned as an example of a mediator incorporated by cyclodextrin. However, Patent Document 7 discloses that when the mediator is not included in cyclodextrin, it is inappropriate for the determination of creatinine using an enzyme.
  • Patent Document 8 discloses the use of a mixed reagent composed of creatinine hydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine dehydrogenase, tetrazolium indicator thiazolyl blue and potassium phosphate pH 7.5 as a reagent composition for creatinine quantification. Yes.
  • creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase and sarcosine dehydrogenase are used to change creatinine into glycine and formaldehyde, and then the formed formaldehyde is developed with a colorant, and the absorbance is increased.
  • a method for quantifying creatinine has been proposed (see, for example, Patent Document 9).
  • Patent Document 9 in addition to creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine dehydrogenase and a colorant, a pH 7.5 phosphate buffer and potassium ferricyanide as a reaction accelerator for promoting the formation of formaldehyde are used. It is disclosed.
  • Patent Document 10 discloses that potassium ferricyanide, ferrocene, osmium derivatives, phenazine methosulfate (PMS), and the like can be used as mediators.
  • the conventional method has the following problems.
  • amino acid and protein such as glycine, histidine, glutamine and serine
  • sugar such as glucose
  • interfering components such as acetone and bilirubin
  • a sample containing the above substance such as urine or It is difficult to accurately quantify creatinine in a biological sample such as blood.
  • sugars such as amino acids and glucose react with picric acid.
  • the present invention provides a measurement method, a measurement device, and a measurement apparatus for creatinine concentration that can accurately and accurately quantify creatinine contained in a sample.
  • the first purpose is a measurement method, a measurement device, and a measurement apparatus for creatinine concentration that can accurately and accurately quantify creatinine contained in a sample.
  • the second object of the present invention is to provide a salt content measurement method, a measurement device, and a measurement apparatus that can quantify the salt content in urine with high accuracy and reproducibility.
  • the creatinine concentration measuring method of the present invention is: (A) A reagent for quantitative determination of creatinine containing at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate and a sample containing creatinine are mixed under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present. Reducing the metal complex with creatinine, (B) a step of electrochemically or optically measuring the amount of the metal complex reduced in step A; and (C) based on the amount of the metal complex reduced in step B. Determining the concentration of creatinine.
  • the salinity measurement method of the present invention comprises: (A) A creatinine quantitative reagent containing at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate and urine as a sample are mixed under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present. A step of reducing the reagent by creatinine in urine, (B) a step of electrochemically or optically measuring the amount of the metal complex reduced in step a, (C) measuring the electrical properties of urine, and (d) based on the amount of reduced metal complex measured in step b and the electrical properties measured in step c, the salinity in urine A step of obtaining a value reflecting the excretion amount. Step c is preferably performed before step a or after step b and before step d.
  • the pH of the mixed sample is preferably 2.5 or more and 7 or less, more preferably 3 or more and 6 or less.
  • Step A and Step a when a cationized hydrophilic polymer is mixed with a sample, the reproducibility of the reaction between creatinine and a reagent is improved.
  • the cationized hydrophilic polymer is preferably a cationized guar gum.
  • the creatinine concentration measuring device of the present invention A device used in the creatinine concentration measurement method, A sample storage chamber for storing a sample containing creatinine in a condition in which neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present; A sample inlet for communicating with the sample storage chamber and for introducing the sample into the sample storage chamber; A reagent for quantitative determination of creatinine arranged in a sample storage chamber; Two or more electrodes arranged in the sample storage chamber, or an optical measurement window formed in the sample storage chamber, The reagent for quantifying creatinine contains at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate.
  • the salinity measuring device of the present invention is A device used in the above-described salt content measurement method, A first sample storage chamber for storing the sample urine under conditions in which neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present; A first sample inlet for communicating with the first sample storage chamber and for introducing urine into the first sample storage chamber; A reagent for quantitative determination of creatinine disposed in the first sample storage chamber; Two or more electrodes arranged in the first sample storage chamber, or an optical measurement window formed in the first sample storage chamber; A second sample storage chamber for storing urine; A second sample inlet for communicating with the second sample storage chamber and for introducing urine into the second sample storage chamber; Two or more electrodes disposed in the second sample storage chamber, The reagent for quantifying creatinine contains at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate.
  • the creatinine concentration measuring apparatus of the present invention is Measuring device mounting portion for mounting the creatinine concentration measuring device, In the sample storage chamber of the measurement device, the amount of metal complex reduced by creatinine is measured electrochemically or optically, and the amount of reduced metal complex measured in the measurement unit A calculation unit for determining the concentration of creatinine contained in
  • the salinity measuring apparatus of the present invention is A measuring device mounting portion for mounting the salinity measuring device, A first measurement unit for electrochemically or optically measuring the amount of the metal complex reduced by creatinine in the first sample storage chamber of the measurement device; In the second sample storage chamber of the measurement device, the second measurement unit for measuring the electrical characteristics of urine, the amount of the reduced metal complex measured in the first measurement unit, and the measurement in the second measurement unit And a calculation unit for obtaining a value reflecting the excretion amount of salt in urine based on the electrical characteristics.
  • creatinine contained in a sample can be accurately quantified under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present.
  • creatinine and hexacyanoferrate (common name: ferricyanate), which is a trivalent anion described in the following formula (4), react directly.
  • creatinine and trivalent hexacyanoferrate react with each other in the absence of any enzyme that acts on creatinine (for example, creatinine amide hydrolase, creatinine deiminase) or picric acid, thereby producing an oxide of creatinine.
  • hexacyanoferrate (common name: ferrocyanate) which is a tetravalent anion described in the following formula (5).
  • creatinine and hexacyanoruthenate which is a trivalent anion described in the following formula (6), react directly.
  • creatinine reacts with hexacyanoruthenate, which is a trivalent anion, under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present, and the creatinine oxide and the following formula (7)
  • hexacyanoruthenate which is a tetravalent anion described in (1).
  • the present invention is based on the above new findings, and is characterized in that at least one of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate is used as a reagent for measuring creatinine concentration.
  • Hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate are usually present in the form of complex salts.
  • hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate constitute a complex salt together with the counter cation.
  • the complex salt of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate is ionized, and hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate exist in the state of solvated anions.
  • the reaction rate between creatinine and a reagent in particular, the reaction rate between creatinine and trivalent hexacyanoferrate increases in the presence of a phosphate buffer.
  • the creatinine and the reagent are reacted in the presence of the phosphate buffer, if the cationized hydrophilic polymer is present, the reproducibility of the reaction is improved.
  • the creatinine concentration measuring method of the present invention is: (A) A reagent for quantitative determination of creatinine containing at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate and a sample containing creatinine are mixed under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present. Reducing the metal complex with the creatinine, (B) a step of electrochemically or optically measuring the amount of the metal complex reduced in the step A; and (C) based on the amount of the reduced metal complex measured in the step B. Determining the concentration of the creatinine contained in the sample.
  • creatinine and the metal complex contained in the reagent for quantifying creatinine react directly under the condition where neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present.
  • the reaction proceeds without being affected by interference components such as ionic species such as salt, urea, protein, amino acid, sugar, acetone, and bilirubin. Therefore, even when a biological sample such as urine or blood is used, creatinine contained in the sample can be quantified with higher accuracy than conventional measurement methods.
  • the reagent for quantifying creatinine is preferably hexacyanoferrate.
  • Hexacyanoferrate is chemically stable and reacts efficiently with creatinine.
  • As the complex salt of hexacyanoferrate potassium ferricyanide, sodium ferricyanide and the like can be used.
  • hexacyanoferrate Before reacting with creatinine, hexacyanoferrate may be a trivalent hexacyanoferrate, that is, an oxidized form of hexacyanoferrate, or a tetravalent hexacyanoferrate, that is, a reduced form of hexacyanoferrate. .
  • the creatinine quantification reagent is tetravalent hexacyanoferrate
  • the tetravalent hexacyanoferrate dissolved in the sample may be oxidized to trivalent.
  • Trivalent hexacyanoferrate can be obtained, for example, by oxidizing tetravalent hexacyanoferrate on an electrode.
  • the reagent for quantifying creatinine may be hexacyanoruthenate.
  • As the complex salt of hexacyanoruthenate potassium ruthenium hexacyanide, sodium ruthenium hexacyanide, or the like can be used.
  • hexacyanoruthenate Before reacting with creatinine, hexacyanoruthenate may be trivalent hexacyanoruthenate, that is, an oxidized form of hexacyanoruthenate, or tetravalent hexacyanoruthenate, that is, a reduced form of hexacyanoruthenate. .
  • the creatinine quantification reagent is tetravalent hexacyanoruthenate
  • the tetravalent hexacyanoruthenate dissolved in the sample may be oxidized to trivalent.
  • Trivalent hexacyanoruthenate can be obtained, for example, by oxidizing tetravalent hexacyanoruthenate on an electrode.
  • a buffer may be further mixed with the sample.
  • Buffers include phosphate buffer such as dipotassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate, citric acid buffer, phthalic acid buffer, acetic acid buffer, MES (2-Morpholinoethane sulfonic acid) buffer Agents and the like. It is preferable to adjust the pH of the sample to 3 to 6 by mixing a buffer with the sample. In particular, it is preferable to adjust the pH of the sample to 5 to 6 by mixing a phosphate buffer with the sample.
  • the pH of the sample is preferably adjusted to 5 to 6 by mixing a phosphate buffer with the sample. In this way, the speed of the direct reaction between creatinine and trivalent hexacyanoferrate increases, so that the measurement time can be shortened.
  • the phosphate buffer is preferably composed of dipotassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate. By dissolving these phosphates in the sample, the pH of the sample can be easily adjusted within the range of 5-6.
  • the concentration of the phosphate buffer in the sample is preferably 5 to 1100 mM, and more preferably 5 to 500 mM.
  • the present inventor has found that the reaction rate between creatinine and trivalent hexacyanoferrate increases as the concentration of phosphate ions increases. If the concentration of the phosphate buffer is 5 mM or more, a sufficient reaction rate can be obtained. 1100 mM is the upper limit of the solubility of the phosphate buffer.
  • a cationized hydrophilic polymer may be further mixed with the sample.
  • Hexacyanoferrate, hexacyanoruthenate and phosphate buffer are anionic. Therefore, it is expected that the reagent is attracted electrostatically by the cation group of the cationized hydrophilic polymer, and the reagent becomes uniform. Therefore, it is considered that creatinine contained in the sample can be quantified with good reproducibility.
  • the concentration of the cationized hydrophilic polymer in the sample is preferably 0.02 to 0.5% by weight.
  • concentration of the cationized hydrophilic polymer is 0.02% by weight or more, a sufficient reproducibility improvement effect can be obtained.
  • concentration of a cationized hydrophilic polymer is 0.5 weight% or less, a cationized hydrophilic polymer can melt
  • Examples of the cationized hydrophilic polymer include cationized guar gum.
  • Gua gum is a polysaccharide obtained from the endosperm part of the seed of gua, which is a leguminous plant.
  • Cationized guar gum is a cationized product of guar gum.
  • Examples of the cationized guar gum used in the present invention include guar hydroxypropyltrimonium chloride.
  • the pH of the sample it is most preferable to adjust the pH of the sample within the range of 5 to 6 by mixing a cationized hydrophilic polymer with the sample in addition to the phosphate buffer. preferable.
  • the process B includes (D) a step of bringing two or more electrodes into contact with the sample and applying a voltage between the two electrodes; and (E) a step of detecting a current value or a charge amount flowing between the two electrodes.
  • Process C includes A step of determining the concentration of creatinine contained in the sample based on the current value or the amount of charge detected in step E is included.
  • the concentration of creatinine contained in the sample can be easily determined electrochemically.
  • the process B includes (F) irradiating the sample with incident light, and (G) detecting transmitted light transmitted through the sample or reflected light reflected from the sample.
  • Process C includes A step of determining the concentration of creatinine contained in the sample based on the intensity of the transmitted light or reflected light detected in the step G is included.
  • the concentration of creatinine contained in the sample can be easily determined optically.
  • the salinity measurement method of the present invention uses urine as a sample and includes the following steps c and d in addition to steps A and B of the creatinine concentration measurement method. That is, the salinity measurement method of the present invention comprises: (A) A creatinine quantitative reagent containing at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate and urine as a sample are mixed under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present. A step of reducing the metal complex with creatinine in urine, (B) a step of electrochemically or optically measuring the amount of the metal complex reduced in step a, and (c) a step of measuring electrical characteristics of urine, and (d) a reduction measured in step b. A step of obtaining a value reflecting the amount of salt excreted in urine based on the amount of the metal complex formed and the electrical characteristics measured in step c.
  • the electrical characteristics of urine in which the reagent for quantifying creatinine is not dissolved reflects the concentration of electrolyte contained in urine.
  • the concentration of the electrolyte contained in urine has a correlation with the concentration of salt contained in urine.
  • Ingredients such as salt are affected by water intake, sweating, etc., and concentrated or diluted to be excreted in urine. Therefore, the concentration of urine components such as salt contained in the urine collected at any time during the day and at night varies depending on the effects of urine concentration and dilution.
  • the measured value in step b reflecting the creatinine concentration with high accuracy and good reproducibility and the electrical characteristics measured in step c reflecting the salinity concentration are used.
  • the influence of urine concentration and dilution is corrected with high accuracy and good reproducibility. Therefore, a value that appropriately reflects the amount of salt excreted in urine can be obtained.
  • the values reflecting the amount of urinary salt excretion determined in step d include the amount of salt per unit amount of creatinine, the amount of urinary salt excreted per unit time (for example, 1 day), and the unit time (for example, 1 day).
  • the amount of salt intake per hit is listed.
  • the creatinine concentration measuring device of the present invention A sample storage chamber for storing a sample containing creatinine in a condition in which neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present; A sample inlet for communicating with the sample storage chamber and for introducing the sample into the sample storage chamber; A reagent for quantifying creatinine arranged in a sample storage chamber, The reagent for quantifying creatinine contains at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate, and is used in the creatinine concentration measurement method.
  • creatinine and the metal complex contained in the reagent react directly in the sample storage chamber under the condition that neither the enzyme acting on creatinine nor picric acid is present.
  • the reaction proceeds without being affected by interference components such as ionic species such as salt, urea, protein, amino acid, sugar, acetone, and bilirubin. Therefore, even when a biological sample such as urine or blood is used, creatinine contained in the sample can be quantified with higher accuracy than conventional measurement devices.
  • hexacyanoferrate, hexacyanoruthenate and phosphate buffer are anionic and are attracted electrostatically by the cation group of the cationized hydrophilic polymer, so that the reagent is considered to be uniform. Therefore, it is considered that creatinine contained in the sample can be quantified with good reproducibility.
  • the creatinine concentration measuring device may include a phosphate buffer in the sample storage chamber, and may further include a cationized hydrophilic polymer.
  • the creatinine concentration measuring device may further include two or more electrodes in the sample storage chamber or an optical measurement window formed in the sample storage chamber.
  • the concentration of creatinine contained in the sample can be easily determined electrochemically or optically.
  • the salinity measuring device of the present invention comprises: A first sample storage chamber for storing the sample urine under conditions in which neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present; A first sample inlet for communicating with the first sample storage chamber and for introducing urine into the first sample storage chamber; A reagent for quantitative determination of creatinine disposed in the first sample storage chamber; A second sample storage chamber for storing urine; A second sample inlet for communicating with the second sample storage chamber and for introducing urine into the second sample storage chamber; And at least two electrodes disposed in the second sample storage chamber,
  • the reagent for quantifying creatinine contains at least one metal complex of hexacyanoferrate and hexacyanoruthenate, and is used in the above-described salt content measurement method.
  • the salinity measurement device may further include two or more electrodes in the first sample storage chamber, or an optical measurement window formed in the sample storage chamber.
  • the creatinine concentration measuring apparatus of the present invention is Measuring device mounting portion for mounting the creatinine concentration measuring device, In the sample storage chamber of the measurement device, the amount of the metal complex reduced by creatinine is measured electrochemically or optically, and the amount of the reduced reagent measured in the measurement unit is added to the sample. A calculation unit for obtaining the concentration of creatinine contained therein is provided.
  • the concentration of creatinine contained in the sample can be measured electrochemically or optically using the creatinine concentration measuring device.
  • the measurement unit for example, a light source that emits incident light that enters the sample storage chamber of the measurement device, and transmitted light that passes through the sample storage chamber or the sample storage A light receiver for detecting reflected light reflected in the room is provided.
  • the calculation unit obtains the concentration of creatinine contained in the sample based on the intensity of transmitted light or reflected light detected by the light receiver.
  • the measurement unit includes, for example, a voltage application unit that applies a voltage between the two electrodes, and a gap between the two electrodes. It has a detection unit for detecting the value of flowing current or the amount of charge. The calculation unit obtains the concentration of creatinine contained in the sample based on the current value or the charge amount detected by the detection unit.
  • the salinity measuring apparatus of the present invention is A measuring device mounting portion for mounting the salinity measuring device, A first measurement unit for electrochemically or optically measuring the amount of the metal complex reduced by creatinine in the first sample storage chamber of the measurement device; In the second sample storage chamber of the measurement device, the second measurement unit for measuring the electrical characteristics of urine, the amount of the reduced metal complex measured in the first measurement unit, and the measurement in the second measurement unit And a calculation unit for obtaining a value reflecting the excretion of salt in urine based on the electrical characteristics.
  • the concentration of urine can be corrected based on the measured electrical characteristics of urine using the creatinine concentration in urine quantified with high accuracy and good reproducibility. Therefore, the amount of salt contained in urine can be determined with high accuracy and good reproducibility.
  • Specimens include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, interstitial fluid, lymphatic fluid, saliva in addition to aqueous solutions.
  • body fluids such as blood, serum, plasma, urine, interstitial fluid, lymphatic fluid, saliva in addition to aqueous solutions.
  • urine is a very effective sample for non-invasive daily health management at home. Since the concentrations of ionic species and urea in these body fluids are relatively high, the effects of the present invention can be obtained very high.
  • the material of the electrode in the present invention is preferably a material containing at least one of gold, platinum, palladium, an alloy or mixture thereof, and carbon. These materials are chemically and electrochemically stable, and stable measurement can be realized.
  • an electrode having a stable potential for example, a reference electrode such as an Ag / AgCl or saturated calomel electrode may be used in combination with the above two electrodes. It is preferable to regulate the potential of one of the two electrodes with respect to the third electrode because the potential for measurement becomes stable. Further, for example, an Ag / AgCl or saturated calomel electrode may be used as the other of the two electrodes.
  • the reagent for quantifying creatinine is provided in a dry state and is disposed so as to dissolve in the sample when the sample is introduced into the sample storage chamber.
  • the buffer and the cationized hydrophilic polymer are provided in a dry state, and are arranged so as to dissolve in the sample when the sample is introduced into the sample storage chamber.
  • a porous carrier composed of glass fiber, filter paper, or the like is impregnated with a solution containing a creatinine quantification reagent, and then dried, whereby the creatinine quantification reagent is supported on the carrier. Then, the carrier may be provided in a portion in contact with the sample.
  • the reagent for measuring creatinine may be arranged by directly applying a solution containing the reagent for quantifying creatinine on the wall surface of the part in contact with the sample in the measuring device and then drying.
  • a buffer or a cationized hydrophilic polymer may be included in the solution containing the creatinine quantitative reagent.
  • the measurement device is preferably attached to the measurement device attachment portion of the measurement apparatus in a detachable state.
  • the measuring device is preferably disposable from a hygienic viewpoint.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view showing the configuration of the measuring device 100.
  • the measuring device 100 is used in a method for electrochemically quantifying the concentration of creatinine contained in a sample.
  • the measuring device 100 has a structure in which an insulating first substrate 102 and an insulating second substrate 104 having air holes 108 are combined with an insulating spacer 106 having a slit 110 interposed therebetween. ing.
  • the first substrate 102, the second substrate 104, and the spacer 106 are made of, for example, polyethylene terephthalate.
  • the first substrate 102 is electrically connected to the first electrode 112, the second electrode 114, the first lead 122 electrically connected to the first electrode 112, and the second electrode 114.
  • a second lead 124 is disposed.
  • a reagent layer 130 containing a creatinine quantitative reagent is disposed on the first electrode 112 and the second electrode 114.
  • the dimensions of the first substrate 102 may be set as appropriate. For example, the width is about 7 mm, the length is about 30 mm, and the thickness is about 0.7 mm.
  • potassium ferricyanide which is a complex salt of hexacyanoferrate is used as a reagent for quantifying creatinine.
  • first electrode 112 is sputtered with a resin electrode pattern mask placed on the first substrate 102.
  • the first electrode 112 is sputtered with a resin electrode pattern mask placed on the first substrate 102.
  • the first electrode 112 is sputtered with a resin electrode pattern mask placed on the first substrate 102.
  • the first electrode 112 is sputtered with a resin electrode pattern mask placed on the first substrate 102.
  • the first electrode 112 the second electrode 114, the first lead 122, and the second lead 124 are formed.
  • the first electrode 112 and the second electrode 114 are electrically connected to a terminal of a creatinine concentration measuring device described later by a first lead 122 and a second lead 124, respectively.
  • the concentration of the trivalent hexacyanoferrate in the aqueous solution containing the reagent is about 0.1M, and the dropping amount of the aqueous solution is about 1.4 ⁇ L.
  • concentration of the cationized guar gum in aqueous solution is about 0.25 weight%, and the dripping amount is about 1.4 microliters.
  • the area of the region in which the reagent layer 130 is formed may be appropriately selected in view of the solubility of the reagent in the sample, and the area is, for example, about 3 mm 2 .
  • the first substrate 102 on which the electrode and reagent layer 130 is formed, the spacer 106, and the second substrate 104 are combined.
  • An adhesive is applied to each joint portion of the first substrate 102, the spacer 106, and the second substrate 104, and these are bonded together, and then pressed and allowed to stand to adhere.
  • the joining portion may be welded by heat or ultrasonic waves using a commercially available welding machine.
  • it functions as a sample storage chamber.
  • the opening of the slit 110 functions as the sample inlet 132.
  • FIG. 2 is a perspective view showing the external appearance of the measuring apparatus 200
  • FIG. 3 is a block diagram showing the configuration of the measuring apparatus 200.
  • the housing 202 of the measurement apparatus 200 has a measurement device attachment unit 208 for attaching the measurement device 100, a display 204 on which measurement results are displayed, and a measurement start button for starting measurement of the creatinine concentration by the measurement apparatus 200. 206 is provided.
  • a first terminal and a second terminal that are electrically connected to the first lead 122 and the second lead 124 of the measuring device 100 are provided inside the measuring device mounting portion 208.
  • the measuring apparatus 200 includes a voltage application unit 302, an electric signal detection unit 304, a control unit 306, a timer unit 308, and a storage unit 310 inside the housing 202.
  • the voltage application unit 302 has a function of applying a voltage or a potential to the first electrode 112 and the second electrode 114 of the measurement device 100 attached to the measurement device attachment unit 208.
  • the application of the voltage or the potential is performed via a first terminal and a second terminal that are electrically connected to the first lead 122 and the second lead 124 of the measuring device 100, respectively.
  • the electrical signal detection unit 304 has a function of detecting electrical signals from the first electrode 112 and the second electrode 114 via the first terminal and the second terminal.
  • the electric signal detection unit 304 corresponds to the detection unit in the present invention.
  • the storage unit 310 stores correlation data corresponding to a calibration curve representing the correlation between the creatinine concentration and the electrical signal detected by the electrical signal detection unit 304.
  • a memory such as a RAM or a ROM can be used.
  • the control unit 306 has a function of converting the electrical signal detected by the electrical signal detection unit 304 into a creatinine concentration with reference to the correlation data.
  • the control unit 306 corresponds to the calculation unit in the present invention.
  • a microcomputer such as a CPU (Central Processing Unit) can be used.
  • the user inserts the lead side of the measuring device 100 into the measuring device mounting portion 208 of the measuring apparatus 200.
  • the first lead 122 and the second lead 124 of the measurement device 100 and the first terminal and the second terminal provided in the measurement device mounting portion 208 are brought into electrical contact with each other. Conducted to.
  • an insertion detection switch composed of a micro switch provided in the measurement device attachment portion 208 is activated and outputs a signal to the control portion 306.
  • the control unit 306 detects the insertion of the measuring device 100 based on the output signal from the insertion detection switch, the control unit 306 controls the voltage application unit 302 to perform the first terminal and the second terminal via the first terminal.
  • a voltage for example, 0.2 V for detecting sample introduction is applied between the first electrode 112 and the second electrode 114.
  • the user brings the sample into contact with the sample introduction port 132 of the measuring device 100.
  • the sample for example, about 0.6 ⁇ L
  • the sample storage chamber is filled with the sample.
  • the electrical signal detection unit 304 detects a change in the electrical signal caused by the change.
  • control unit 306 When the control unit 306 detects that the sample has been introduced into the sample storage chamber based on the output signal from the electrical signal detection unit 304, the control unit 306 controls the voltage application unit 302 to apply the voltage applied by the voltage application unit 302. Switch to a different voltage (eg 0V or open circuit). In addition, along with the detection of sample introduction, the control unit 306 starts timing by the timer unit 308 that is a timer.
  • potassium ferricyanide contained in the reagent layer 130 is dissolved in the sample.
  • trivalent hexacyanoferrate is produced.
  • the produced trivalent hexacyanoferrate directly reacts with creatinine contained in the sample, whereby creatinine oxide and tetravalent hexacyanoferrate are produced.
  • the control unit 306 determines that a predetermined time (for example, 60 seconds) has elapsed based on a signal from the time measuring unit 308, the control unit 306 controls the voltage application unit 302, and the first electrode 112 and the second electrode A voltage for measuring the concentration of tetravalent hexacyanoferrate is applied between the first and second layers.
  • the first electrode 112 applies a voltage that is +0.5 to +0.6 V compared to the second electrode 114.
  • an electrical signal such as a current flowing between the first electrode 112 and the second electrode 114 is measured by the electrical signal detection unit 304 after a certain time (for example, 5 seconds) has elapsed since the voltage was applied.
  • a certain time for example, 5 seconds
  • the control unit 306 reads the correlation data representing the correlation between the electrical signal stored in the storage unit 310 and the creatinine concentration, and refers to it. As a result, the electrical signal detected by the electrical signal detection unit 304 is converted into a creatinine concentration in the sample.
  • the obtained creatinine concentration is displayed on the display 204. By displaying the creatinine concentration on the display 204, the user knows that the creatinine concentration measurement has been completed.
  • the obtained creatinine concentration is preferably stored in the storage unit 310 together with the time measured by the time measuring unit 308.
  • the measuring device 100 unlike the conventional measuring device, creatinine and trivalent hexacyanoferrate directly react in the sample storage chamber under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present. Thus, the reaction proceeds without being affected by interference components such as ionic species such as salt, urea, protein, amino acid, sugar, acetone, and bilirubin. Therefore, even when a biological sample such as urine or blood is used, creatinine contained in the sample can be quantified with higher accuracy than conventional measurement devices.
  • Hexacyanoferrate and phosphate buffer are anionic and are expected to be electrostatically attracted by the cationic groups of the cationized hydrophilic polymer to form a uniform reagent. Therefore, it is considered that creatinine contained in the sample can be quantified with good reproducibility.
  • hexacyanoferrate is used as a creatinine quantification reagent
  • hexacyanoruthenate may be used instead.
  • hexacyanoruthenate is used as a creatinine quantification reagent
  • creatinine contained in the sample is more accurate than conventional measurement devices without being affected by interference species such as ionic species such as salt, urea, amino acids, and sugars. Can be quantified.
  • the measurement device may include two reagent layers, for example, a first reagent layer containing a creatinine quantitative reagent and a second reagent layer containing a phosphate buffer.
  • the control unit detects that the sample has been introduced into the sample storage chamber, so that the voltage applied by the voltage application unit is switched to a different voltage.
  • the present invention is not limited to this. It is not always necessary to switch the applied voltage as long as a current depending on the concentration of creatinine is obtained.
  • a voltage value necessary for measurement (for example, a voltage at which the first electrode becomes +0.5 V to +0.6 V compared to the second electrode) is applied from the time of detecting the insertion of the measuring device, The voltage value may be applied continuously.
  • an example in which the potential applied to the first electrode for obtaining an electric signal corresponding to the concentration of tetravalent hexacyanoferrate is 0.5 to 0.6 V with respect to the second electrode.
  • the voltage between the first electrode and the second electrode is a reduced form of a metal complex contained in a reagent for quantification of creatinine produced by an oxidation-reduction reaction with creatinine (in this embodiment, tetravalent hexacyanoferrate). Any voltage that oxidizes can be used.
  • reaction time the time (reaction time) until detection of an electric signal after detection of sample introduction is set to 60 seconds
  • the reaction time may be shorter than the above as long as the difference in current value with respect to the difference in creatinine concentration can be detected significantly.
  • the reaction time is longer, there is an increased possibility that the reaction between creatinine and the trivalent anion hexacyanoferrate reaches a complete state or a steady state. Therefore, it becomes easy to quantify the abundance of creatinine more accurately without being affected by environmental conditions such as temperature.
  • an example is shown in which an electric signal is detected 5 seconds after applying a potential to an electrode, but the present invention is not limited to this time. This time should just be the time which can detect the difference of an electrical signal with respect to the difference in creatinine concentration significantly.
  • the shape, number, arrangement, and the like of the electrode system, leads, and terminals are not limited to the present embodiment. The same applies to other embodiments.
  • this embodiment an example in which the amount of the reduced metal complex is measured is shown.
  • the amount of the reduced form of the metal complex is indirectly obtained by measuring the reduced amount of the oxidized form of the metal complex. May be.
  • a lecithin layer is obtained by applying a solution obtained by dissolving lecithin in toluene or other organic solvent to the inner wall of the second substrate and drying it. May be formed.
  • the creatinine concentration measuring apparatus may further include a recording unit for recording the measurement result on a storage medium such as an SD card.
  • a recording unit for recording the measurement result on a storage medium such as an SD card.
  • the measurement device may further include a transmission unit for transmitting the measurement result to the outside of the measurement device.
  • a measurement result can be transmitted to the analysis related department in a hospital, an analysis related trader, or the like. Therefore, the time from measurement to analysis can be shortened.
  • the measuring device may further include a receiving unit for receiving the result of analysis in an analysis related department or an analysis related contractor. As a result, the analysis result can be quickly fed back to the user.
  • FIG. 4 is an exploded perspective view showing the configuration of the measuring device 400.
  • the measuring device 400 is used in a method for optically quantifying the concentration of creatinine contained in a sample.
  • the measuring device 400 has a structure in which a first substrate 102 and a second substrate 104 having air holes 108 are combined with a spacer 106 having a slit 110 interposed therebetween.
  • the first substrate 102, the second substrate 104, and the spacer 106 are made of, for example, polyethylene terephthalate.
  • the measurement device 400 includes a first electrode 112, a second electrode 114, a first lead 122, and a second lead 124 on the first substrate 102. Not placed.
  • a reagent layer 130 containing a creatinine quantification reagent is disposed on the first substrate 102 instead of on the first electrode 112 and the second electrode 114.
  • a method for manufacturing the measuring device 400 will be described.
  • a fixed amount of an aqueous solution containing the same creatinine quantitative reagent as in Embodiment 1 is dropped onto the first substrate 102 using a microsyringe or the like.
  • the reagent layer 130 is formed by allowing the first substrate 102 to stand in an environment of room temperature to 30 ° C. and drying.
  • the concentration and amount of the aqueous solution containing the reagent to be applied may be selected according to the required device characteristics and size. For example, it may be the same as in the first embodiment.
  • the first substrate 102 on which the reagent layer 130 is formed, the spacer 106, and the second substrate 104 are combined.
  • An adhesive is applied to each joint portion of the first substrate 102, the spacer 106, and the second substrate 104, and these are bonded together, and then pressed and allowed to stand to adhere.
  • the joining portion may be welded by heat or ultrasonic waves using a commercially available welding machine.
  • it functions as a sample storage chamber.
  • the opening of the slit 110 functions as the sample inlet 132.
  • FIG. 5 is a perspective view showing the appearance of the measuring apparatus 500
  • FIG. 6 is a block diagram showing the configuration of the measuring apparatus 500. As shown in FIG.
  • a measurement device mounting portion 208 for mounting the measurement device 400, a display 204 on which measurement results and the like are displayed, and a measurement start button for starting measurement of the creatinine concentration by the measurement device 500 are provided on the housing 202 of the measurement device 500. 206 is provided.
  • the measuring apparatus 500 includes a light source 502, a light receiver 504, a control unit 306, a timer unit 308, and a storage unit 310 inside the housing 202.
  • the light source 502 has a function of emitting light that enters the sample storage chamber of the measurement device 400 attached to the measurement device attachment portion 208.
  • the wavelength of the light emitted from the light source 502 may be selected such that the absorption intensity changes according to the reaction between the metal complex in the creatinine quantitative reagent and creatinine.
  • the light receiver 504 has a function of detecting light emitted from the light source 502 and reflected in the sample storage chamber of the measurement device 400 attached to the measurement device attachment unit 208.
  • the storage unit 310 stores correlation data corresponding to a calibration curve representing a correlation between the concentration of creatinine and the intensity of reflected light detected by the light receiver 504.
  • a memory such as a RAM or a ROM can be used.
  • the control unit 306 has a function of converting the intensity of the reflected light detected by the light receiver 504 into a creatinine concentration with reference to the correlation data.
  • the control unit 306 corresponds to the calculation unit in the present invention.
  • a microcomputer such as a CPU (Central Processing Unit) can be used.
  • an insertion detection switch including a micro switch provided in the measurement device attachment portion 208 is activated to output a signal to the control portion 306.
  • the control unit 306 detects the insertion of the measuring device 400 based on the output signal from the insertion detection switch, the control unit 306 activates the light source 502. Thereby, the sample storage chamber of the measurement device 400 is irradiated with light from the light source 502.
  • the user brings the sample into contact with the sample introduction port 132 of the measuring device 400.
  • the sample is sucked into the sample storage chamber of the measuring device 400 through the sample introduction port 132 by capillary action, and the sample storage chamber is filled with the sample.
  • the transmittance in the sample storage chamber changes.
  • the light receiver 504 detects a change in reflected light intensity caused by the change.
  • control unit 306 When the control unit 306 detects that the sample has been introduced into the sample storage chamber based on the output signal from the light receiver 504, the control unit 306 starts timing by the timer unit 308 that is a timer.
  • potassium ferricyanide contained in the reagent layer 130 is dissolved in the sample.
  • trivalent hexacyanoferrate is produced.
  • the produced trivalent hexacyanoferrate directly reacts with creatinine contained in the sample, whereby creatinine oxide and tetravalent hexacyanoferrate are produced.
  • the absorption spectrum of the sample changes.
  • the amount of change in the absorption spectrum of the sample depends on the concentration of the produced tetravalent hexacyanoferrate.
  • the control unit 306 determines that a predetermined time (for example, 60 seconds) has elapsed from the signal from the time measuring unit 308, the intensity of the light reflected in the sample storage chamber is measured by the light receiver 504. At this time, the intensity of the reflected light measured by the light receiver 504 depends on the concentration of creatinine contained in the sample.
  • the control unit 306 reads the correlation data corresponding to the calibration curve representing the correlation between the creatinine concentration stored in the storage unit 310 and the intensity of the reflected light detected by the light receiver 504, and refers to it. Thereby, the intensity of the reflected light detected by the light receiver 504 is converted into the creatinine concentration in the sample.
  • the obtained creatinine concentration is displayed on the display 204. By displaying the creatinine concentration on the display 204, the user knows that the measurement is complete.
  • the obtained creatinine concentration is preferably stored in the storage unit 310 together with the time measured by the time measuring unit 308.
  • the measuring device 400 unlike the conventional measuring device, creatinine and trivalent hexacyanoferrate react directly in the sample storage chamber under the condition that neither an enzyme acting on creatinine nor picric acid is present. Thus, the reaction proceeds without being affected by interference components such as ionic species such as salt, urea, protein, amino acid, sugar, acetone, and bilirubin. Therefore, even when a biological sample such as urine or blood is used, creatinine contained in the sample can be quantified with higher accuracy than conventional measurement devices.
  • Hexacyanoferrate and phosphate buffer are anionic and are expected to be electrostatically attracted by the cationic groups of the cationized hydrophilic polymer to form a uniform reagent. Therefore, it is assumed that creatinine contained in the sample can be quantified with good reproducibility.
  • the measurement device may include two or more reagent layers.
  • reaction time the time (reaction time) until detection of the reflected light intensity after detecting the introduction of the sample is 60 seconds is shown, but the value is not necessarily required. As long as the difference in reflected light intensity with respect to the difference in creatinine concentration can be detected significantly, the reaction time may be shorter than the above. On the other hand, when the reaction time is made longer, the amount of creatinine present can be quantified more accurately.
  • the measurement device may include a lecithin layer in the same manner as in the first embodiment in order to facilitate the introduction of the sample into the sample storage chamber.
  • the creatinine concentration measuring apparatus may further include a recording unit for recording the measurement result on a storage medium such as an SD card.
  • the measurement device may further include a transmission unit for transmitting the measurement result to the outside of the measurement device.
  • the measuring device may further include a receiving unit for receiving the result of analysis in an analysis related department or an analysis related business.
  • FIG. 7 is an exploded perspective view showing the configuration of the first surface side of the first substrate of the measuring device 700
  • FIG. 8 is an exploded perspective view showing the configuration of the second surface side of the first substrate. is there.
  • the measurement device 700 electrochemically measures creatinine contained in the urine sample, and measures the electrical characteristics of the urine, and uses these measurement results to be contained in the urine excreted daily. Used in methods for estimating salinity.
  • the first surface 702 of the insulating first substrate 102 and the insulating first spacer 106 having the slit 110 are in contact with each other, and the first substrate 102 and the air hole 108 are in contact with each other.
  • the second surface 802 of the first substrate 102 and the insulating second spacer 706 having the slit 710 are in contact with each other, and the first substrate 102 and the third substrate 704 having the air holes 708 are in contact.
  • the first substrate 102, the first spacer 106, the second substrate 104, the second spacer 706, and the third substrate 704 are made of, for example, polyethylene terephthalate.
  • the first electrode 112, the second electrode 114, and the first electrode 112 are electrically connected.
  • the first lead 122 and the second lead 124 electrically connected to the second electrode 114 are disposed.
  • a reagent layer 130 containing a creatinine quantitative reagent is disposed on the first electrode 112 and the second electrode 114.
  • a third electrode 712, a fourth electrode 714, a fifth electrode 716, and a sixth electrode 718 are disposed on the second surface 802 of the first substrate 102. Further, on the second surface 802, a third lead 722 electrically connected to the third electrode 712, a fourth lead 724 electrically connected to the fourth electrode 714, a fifth lead A fifth lead 726 electrically connected to the electrode 716 and a sixth lead 728 electrically connected to the sixth electrode 718 are disposed.
  • the dimensions of the first substrate 102 may be set as appropriate. For example, the width is about 7 mm, the length is about 30 mm, and the thickness is about 0.7 mm.
  • the measuring device 700 Next, a method for manufacturing the measuring device 700 will be described. First, palladium is sputtered on a first surface 702 of the first substrate 102 with a resin electrode pattern mask installed. Thus, the first electrode 112, the second electrode 114, the first lead 122, and the second lead 124 are formed. The first electrode 112 and the second electrode 114 are electrically connected to a terminal of a salinity measuring device described later by a first lead 122 and a second lead 124, respectively.
  • the third electrode 712, the fourth electrode 714, the fifth electrode 716, the sixth electrode 718, the third lead 722, the fourth lead 724, the fifth lead 726, and the sixth lead. 728 is formed.
  • the third electrode 712, the fourth electrode 714, the fifth electrode 716, and the sixth electrode 718 are respectively a third lead 722, a fourth lead 724, a fifth lead 726, and a sixth lead.
  • the terminal 728 is electrically connected to a terminal of a salinity measuring device described later.
  • an aqueous solution containing the same creatinine quantification reagent as that in Embodiment 1 is added.
  • a predetermined amount is dropped using a syringe or the like.
  • the reagent layer 130 is formed by allowing the first substrate 102 to stand in an environment of room temperature to 30 ° C. and drying.
  • the concentration and amount of the aqueous solution containing the reagent to be applied may be selected according to the required device characteristics and size. For example, it may be the same as in the first embodiment.
  • the second surface 802 of the first substrate 102 and the first spacer 106 are in contact with each other, and the second surface 802 of the first substrate 102 and the second spacer 706 are in contact with each other.
  • the substrate 104, the first spacer 106, the first substrate 102, the second spacer 706, and the third substrate 704 are combined.
  • An adhesive is applied to each joint portion of each member, and after bonding them together, they are pressed and allowed to stand to adhere.
  • the joining portion may be welded by heat or ultrasonic waves using a commercially available welding machine.
  • the space formed by the above functions as a first sample storage chamber for measuring creatinine concentration.
  • the opening of the slit 110 functions as the first sample introduction port 132.
  • the second spacer 706 is provided between the first substrate 102 and the third substrate 704.
  • the space formed by the slit 710 functions as a second sample storage chamber for measuring the electrical characteristics of urine.
  • the opening of the slit 710 functions as the second sample introduction port 732.
  • FIG. 9 is a perspective view showing the appearance of the measuring apparatus 900
  • FIG. 10 is a block diagram showing the configuration of the measuring apparatus 900. As shown in FIG.
  • a measurement device attachment unit 208 for attaching the measurement device 700, a display 204 on which measurement results are displayed, and measurement of the creatinine concentration and electrical characteristics of the urine by the measurement device 900 are started on the housing 202 of the measurement device 900.
  • a measurement start button 206 is provided.
  • the measurement device mounting portion 208 includes a first lead 122, a second lead 124, a third lead 722, a fourth lead 724, a fifth lead 726, and a sixth lead.
  • a first terminal, a second terminal, a third terminal, a fourth terminal, a fifth terminal, and a sixth terminal that are electrically connected to the lead 728 are provided.
  • the measuring apparatus 900 includes a voltage application unit 302, an electric signal detection unit 304, a constant current AC power source 902, a voltage detector 904, a control unit 306, a timing unit 308, and a storage unit 310 inside the housing 202.
  • the voltage application unit 302 has a function of applying a voltage or a potential to the first electrode 112 and the second electrode 114 of the measurement device 700 attached to the measurement device attachment unit 208.
  • the application of the voltage or potential is performed via a first terminal and a second terminal that are electrically connected to the first lead 122 and the second lead 124 of the measuring device 700, respectively.
  • the electrical signal detection unit 304 has a function of detecting electrical signals from the first electrode 112 and the second electrode 114 via the first terminal and the second terminal.
  • the electric signal detection unit 304 corresponds to the detection unit in the present invention.
  • the constant current AC power source 902 has a function of applying a constant AC current between the third electrode 712 and the sixth electrode 718 of the measurement device 700 attached to the measurement device attachment unit 208.
  • the constant alternating current is applied through a third terminal and a sixth terminal that are electrically connected to the third lead 722 and the sixth lead 728 of the measuring device 700, respectively.
  • the alternating current to be applied has, for example, a frequency of about 1 kHz and a current value of about 0.1 mA.
  • the voltage detector 904 has a function of detecting the voltage (effective value of the AC voltage) between the fourth electrode 714 and the fifth electrode 716 via the fourth terminal and the fifth terminal.
  • the daily urinary salt excretion amount and the creatinine concentration is stored.
  • a memory such as a RAM or a ROM can be used.
  • the control unit 306 (I) A function of referring to the first correlation data and converting the electrical signal detected by the electrical signal detection unit 304 into a creatinine concentration, (II) a function of referring to the second correlation data and converting the voltage detected by the voltage detector 904 into a salinity concentration; (III) A function of correcting the salt concentration using the obtained creatinine concentration, and (IV) A function of converting the corrected salt concentration into a daily urinary salt excretion amount with reference to the third correlation data.
  • the control unit 306 corresponds to the calculation unit in the present invention.
  • a microcomputer such as a CPU (Central Processing Unit) can be used.
  • the user inserts the lead side of the measuring device 700 into the measuring device mounting portion 208 of the measuring apparatus 900.
  • the first lead 122, the second lead 124, the third lead 722, the fourth lead 724, the fifth lead 726, and the sixth lead 728 of the measuring device 700, and the measuring device attachment portion 208 are measured.
  • the first terminal, the second terminal, the third terminal, the fourth terminal, the fifth terminal, and the sixth terminal provided inside are electrically connected to each other.
  • an insertion detection switch composed of a micro switch provided in the measurement device attachment portion 208 is activated and outputs a signal to the control portion 306.
  • the control unit 306 detects the insertion of the measurement device 700 based on the output signal from the insertion detection switch, the control unit 306 controls the voltage application unit 302 to pass the first terminal and the second terminal through the first terminal.
  • a voltage (for example, 0.2 V) is applied between the first electrode 112 and the second electrode 114.
  • the user brings the sample into contact with the first sample inlet 132 and the second sample inlet 732 of the measurement device 700.
  • the sample is sucked into the two sample storage chambers of the measurement device 700 through the first sample introduction port 132 and the second sample introduction port 732 by capillary action, and the two sample storage chambers are filled with the sample. Filled.
  • the electrical signal detection unit 304 detects a change in the electrical signal caused by the change.
  • the control unit 306 Based on the output signal from the electrical signal detection unit 304, the control unit 306 detects that the sample has been introduced into the first and second sample storage chambers. When the control unit 306 detects that the sample has been introduced into the first and second sample storage chambers, the control unit 306 controls the voltage application unit 302 to change the voltage applied by the voltage application unit 302 to a different voltage (for example, 0V or open circuit). In addition, along with the detection of sample introduction, the control unit 306 starts timing by the timer unit 308 that is a timer.
  • the control unit 306 controls the constant current AC power source 902 to connect the third electrode 712 and the third electrode via the third terminal and the sixth terminal.
  • a constant alternating current (for example, frequency 1 kHz, current value 0.1 mA) is applied between the six electrodes 718.
  • the voltage detector 904 measures the voltage (effective value of the alternating current) between the fourth electrode 714 and the fifth electrode 716 after a predetermined time has elapsed from the application of the alternating current (for example, after 5 seconds).
  • the control unit 306 reads the second correlation data representing the correlation between the concentration of the salt stored in the storage unit 310 and the voltage detected by the voltage detector 904, and refers to it. Thereby, the voltage detected by the voltage detector 904 is converted into the salinity concentration in the sample. The obtained salinity concentration is displayed on the display 204.
  • potassium ferricyanide contained in the reagent layer 130 is dissolved in the sample.
  • trivalent hexacyanoferrate is produced.
  • the produced trivalent hexacyanoferrate directly reacts with creatinine contained in the sample, whereby creatinine oxide and tetravalent hexacyanoferrate are produced.
  • the control unit 306 determines that a predetermined time (for example, 60 seconds) has elapsed based on a signal from the time measuring unit 308, the control unit 306 controls the voltage application unit 302 to control the first electrode 112 and the second electrode.
  • a different voltage is applied again between the electrode 114 (for example, a voltage at which the first electrode 112 becomes +0.5 to +0.6 V compared to the second electrode 114).
  • an electrical signal such as a current flowing between the first electrode 112 and the second electrode 114 is measured by the electrical signal detection unit 304 after a certain time (for example, 5 seconds) has elapsed since the voltage was applied.
  • tetravalent hexacyanoferrate is oxidized at the first electrode 112.
  • the electrical signal measured by the electrical signal detection unit 304 depends on the concentration of creatinine contained in the sample.
  • the control unit 306 reads out the first correlation data representing the correlation between the electrical signal stored in the storage unit 310 and the creatinine concentration, and refers to it. As a result, the electrical signal detected by the electrical signal detector 304 is converted into the creatinine concentration in the sample.
  • control unit 306 corrects the salinity concentration using the obtained creatinine concentration. Subsequently, the control unit 306 has a third correlation corresponding to a third calibration curve representing the correlation between the daily urinary salt excretion amount stored in the storage unit 310 and the salt concentration corrected by the creatinine concentration. Read data and refer to it. Thereby, the corrected salt concentration is converted into the amount of urinary salt excretion per day.
  • the obtained creatinine concentration and urinary salt excretion amount per day are displayed on the display 204.
  • the user By displaying the creatinine concentration and the daily urinary salt excretion amount on the display 204, the user knows that the measurement has been completed.
  • the obtained creatinine concentration and daily urinary salt excretion amount are preferably stored in the storage unit 310 together with the time measured by the time measuring unit 308.
  • the amount of urinary salt excretion per day can be calculated based on the salt concentration corrected by the creatinine concentration measured with high accuracy. Therefore, the amount of urinary salt excretion per day can be obtained with high accuracy.
  • hexacyanoferrate is used as a creatinine quantification reagent
  • hexacyanoruthenate may be used instead. Even when hexacyanoruthenate is used, it is possible to quantify creatinine contained in a sample more accurately than a conventional measuring device without being affected by interference components such as ionic species such as salt, urea, amino acids, and sugars. it can.
  • the measurement device may include two or more reagent layers.
  • the voltage between the first electrode and the second electrode may be a voltage at which tetravalent hexacyanoferrate is oxidized.
  • the time (reaction time) from detection of sample introduction to detection of an electrical signal is not limited as in the first embodiment.
  • an example is shown in which an electrical signal is detected after 5 seconds from the application of a voltage between the first electrode and the second electrode, but the present invention is not limited to this time.
  • correlation data indicating the correlation between the electrical signal detected by the electrical signal detector, the voltage detected by the voltage detector, and the urinary salt excretion per unit time (for example, 1 day) is stored. It may be stored in the section. In this case, the creatinine concentration and the salt concentration need not be obtained.
  • the urinary salt excretion per unit time can be directly obtained.
  • a lecithin layer similar to that in Embodiment 1 may be formed on the inner walls of the second substrate and the third substrate.
  • the salt content measuring device may further include a recording unit for recording the measurement result in a storage medium such as an SD card.
  • the salt content measuring device may further include a transmission unit for transmitting the measurement result to the outside of the measuring device.
  • the salinity measuring device may further include a receiving unit for receiving the result of analysis in an analysis related department or an analysis related business.
  • Example 1 In order to confirm the effect of the creatinine concentration measuring method according to the present invention, the following experiment was conducted.
  • hexacyanoferrate and potassium ferricyanide (potassium ferricyanate), which is a complex salt thereof, were used as the metal complex contained in the creatinine quantitative reagent.
  • the obtained aqueous solution was put into a glass cell container, and the first electrode, the second electrode, and the third electrode were each immersed in the aqueous solution in the cell container.
  • a gold electrode (electrode area 2 mm 2 ) was used as the first electrode.
  • the second electrode was obtained by winding a platinum wire having a length of 5 cm in a coil shape.
  • an Ag / AgCl (saturated KCl aqueous solution) reference electrode was used. All of these electrodes are commercially available products from BAS Corporation.
  • the connection terminals of the first electrode, the second electrode, and the third electrode were sequentially connected to the connection terminals of the working electrode, the counter electrode, and the reference electrode of an electrochemical analyzer (ALS-660A, manufactured by ALS).
  • ALS-660A an electrochemical analyzer
  • a small amount of a 500 mM creatinine aqueous solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., the same for the following Examples and Reference Examples) was added to the aqueous solution in the cell container.
  • the addition amount of the creatinine aqueous solution was adjusted for each measurement so that the creatinine concentration contained in the aqueous solution in the cell container became a predetermined value.
  • Timing was started with the addition of creatinine, and a potential of 0.5 V was applied to the first electrode with respect to the third electrode 10 minutes after the addition of creatinine. And the electric current value 5 seconds after an electric potential application was measured.
  • the above experiment was performed at room temperature (about 25 ° C.).
  • FIG. 11 is a graph in which measured current values are plotted against creatinine concentration.
  • the horizontal axis represents the creatinine concentration (mM) contained in the aqueous solution in the cell container, and the vertical axis represents the measured current value ( ⁇ A).
  • the obtained current value increases linearly (that is, proportionally) with respect to the increase in the creatinine concentration contained in the aqueous solution in the cell container, and the current value and the creatinine concentration are high. Correlation was shown. Therefore, it is understood that creatinine can be quantified based on the obtained current value by the creatinine concentration measuring method according to the present invention.
  • the reaction products were analyzed by chromatography using a column for a plurality of aqueous solutions having different creatinine concentrations remaining in the cell container.
  • tetravalent hexacyanoferrate was generated in the aqueous solution in the cell container.
  • the amount of tetravalent hexacyanoferrate produced was a maximum of 4 molecules per creatinine molecule.
  • trivalent hexacyanoferrate reacts with creatinine in the presence of a phosphate buffer to be reduced and converted to tetravalent hexacyanoferrate. That is, creatinine is oxidized by donating electrons to trivalent hexacyanoferrate by this reaction. At this time, creatinine can be considered to have undergone oxidation of up to 4 electrons by this reaction.
  • a potential that accepts electrons from tetravalent hexacyanoferrate is applied to the first electrode. Therefore, the produced tetravalent hexacyanoferrate is electrochemically oxidized at the first electrode. Along with this, a current flows through the first electrode.
  • the concentration of tetravalent hexacyanoferrate produced in a certain time depends on the creatinine concentration.
  • the oxidation current of tetravalent hexacyanoferrate depends on the concentration of tetravalent hexacyanoferrate present in the sample. Therefore, the obtained current value depends on the creatinine concentration.
  • Example 2 Next, in order to investigate a preferable pH range in the creatinine concentration measuring method according to the present invention, the following experiment was performed. Since the sample preparation method and apparatus configuration used in the experiment, and the experimental procedure are the same as those in Example 1, description thereof is omitted. However, in this example, the creatinine concentration in the sample was 27 mM. Further, in the case where the pH of the phosphate buffer added to the sample is 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9, the same measurement as in Example 1 is performed. It was.
  • Table 1 shows the measurement results of current values.
  • pH 5-6 can be imparted by a phosphate buffer. It has also been found that the reaction rate between creatinine and trivalent hexacyanoferrate increases in the presence of a phosphate buffer. Therefore, it is preferable to adjust the pH to 5-6 by mixing a phosphate buffer with the sample. Such pH is also brought about by hydrogen phosphate ions and dihydrogen phosphate ions.
  • a combination of, for example, dipotassium hydrogen phosphate or disodium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate or sodium dihydrogen phosphate is considered preferable to use a combination of, for example, dipotassium hydrogen phosphate or disodium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate or sodium dihydrogen phosphate as the phosphate buffer.
  • a current value is obtained even in the pH range of 2.5 to 7, and creatinine can be quantified.
  • Example 3 in the method for measuring the concentration of creatinine according to the present invention, the following experiment was conducted in order to examine the influence of coexisting substances that can be included in the sample.
  • coexisting substances that can be contained in the biological sample include ionic species, enzyme denaturing agents, creatinine enzyme reaction products, sugars, amino acids, and the like. Therefore, in this example, as representative examples of coexisting substances, NaCl that generates ionic species by dissolving in a sample, urea that is an enzyme denaturing agent, creatine that is an enzyme reaction product of creatinine, sarcosine and glycine, sugar And the amino acids histidine, taurine, glutamine, and serine were used.
  • Table 2 shows the coexisting substances used, their concentrations, and the measured current values.
  • sample 1 is a phosphate buffer solution that does not contain coexisting substances and contains 3 mM creatinine.
  • Samples 2 to 11 contain the coexisting substances listed in Table 2 and do not contain creatinine.
  • the measured current value represents a relative value when the measured current value for Sample 1 is 100.
  • Table 2 shows that no significant current was measured in the sample containing any coexisting substance as compared to Sample 1 containing creatinine and no coexisting substance. From this result, the creatinine concentration measurement method according to the present invention is affected even if any of NaCl, urea, creatine, sarcosine, glycine, glucose, histidine, taurine, glutamine, and serine is contained in the sample. I knew it was n’t there.
  • Sample 12 was prepared by adding creatinine to the phosphate buffer so that the concentration was 3 mM.
  • Sample 13 was prepared by adding NaCl to sample 12 as a coexisting substance so that the concentration was 0.5M.
  • Sample 14 was prepared by adding urea to sample 12 as a coexisting substance so that the concentration would be 1M.
  • experiments were performed in the same manner as in this example, except that the samples were heated to 40 ° C. in order to promote the reaction.
  • Table 3 shows the results obtained for the comparative example.
  • the current value was shown as a relative value with the current value measured for Sample 12 as 100.
  • Example 4 In order to confirm the effect of the creatinine concentration measuring method according to the present invention, the following experiment was conducted.
  • a hexacyanoruthenate potassium salt manufactured by Mitsuwa Chemicals Co., Ltd.
  • which is a tetravalent anion represented by the following formula (8) was used as a creatinine quantitative reagent.
  • a 200 mM dipotassium hydrogen phosphate aqueous solution and a 200 mM potassium dihydrogen phosphate aqueous solution were prepared. While monitoring using a pH meter, the pH of the resulting mixed aqueous solution was adjusted to 6 by alternately mixing the two aqueous solutions.
  • the potential applied to the first electrode is swept from 0.5 V to 1 V with respect to the third electrode by an electrochemical analyzer (ALS-660A, manufactured by ALS), and then from 1 V to 0 Sweeping to 5 V, the current flowing at that time was measured.
  • the potential sweep rate was 1 mV / sec.
  • FIG. 12 shows the measurement results (cyclic voltammogram).
  • curves A to E show the measurement results when the creatinine concentrations are 0, 8, 16, 32, and 64 mM, respectively.
  • a redox reaction on the first electrode of hexacyanoruthenate having a redox potential around 0.75 V was observed.
  • the addition of creatinine significantly increased the current at a potential more positive than 0.8V.
  • the above results suggest that creatinine is oxidized by an oxidized form of hexacyanoruthenate, and the resulting reduced form of hexacyanoruthenate is oxidized at the first electrode. That is, it shows that the electrochemical catalytic oxidation reaction of creatinine proceeds through hexacyanoruthenate.
  • FIG. 13 is a graph in which the difference in the obtained oxidation current values is plotted against the creatinine concentration. As shown in FIG. 13, the obtained oxidation current value increased as the concentration of creatinine increased. Therefore, it was found that creatinine can be quantified by performing cyclic voltammetry as in this example and obtaining the oxidation current value.
  • the oxidation current was measured by cyclic voltammetry, but the present invention is not limited to this.
  • a constant potential of 0.9 V may be applied to the first electrode with respect to the third electrode, and the oxidation current flowing after a certain time (for example, 3 minutes) from the addition of creatinine may be measured.
  • a certain time for example, 3 minutes
  • creatinine can be quantified.
  • Example 5 In order to confirm the effect of the creatinine concentration measuring method according to the present invention, the following experiment was conducted.
  • potassium ferricyanide potassium ferricyanate
  • cationized guar gum was used as the cationized hydrophilic polymer.
  • a creatinine concentration measuring device having the structure shown in FIG. 1 was produced by the same procedure as in the first embodiment.
  • commercially available guar hydroxypropyltrimonium chloride was used as the cationized guar gum.
  • a reagent layer 130 was formed by dropping 1.4 ⁇ L of the aqueous solution prepared by the above procedure on the first electrode 112 and the second electrode 114.
  • the area of the region for forming the reagent layer 130 was 3 mm 2 .
  • the volume of the sample storage chamber of the produced creatinine concentration measuring device is 0.6 ⁇ L.
  • a creatinine concentration measuring device having the structure shown in FIG. 1 was prepared by the same procedure as in Example 1 except that cationized guar gum was not added to the aqueous solution used when forming the reagent layer. did.
  • a terminal for the working electrode of the electrochemical analyzer (ALS, ALS-660A), and two terminals for the counter electrode and the reference electrode were connected to the first lead and the second lead of the creatinine concentration measuring device, respectively.
  • an aqueous solution in which creatinine as a sample was dissolved was brought into contact with the sample introduction port of the creatinine concentration measuring device, thereby introducing a 0.6 ⁇ L sample into the sample storage chamber.
  • a voltage at which the first electrode was +0.6 V compared to the second electrode was applied using the electrochemical analyzer.
  • Ten seconds after the voltage application the current flowing between the first electrode and the second electrode was measured.
  • the above experiment was performed at room temperature (about 25 ° C.).
  • FIG. 14 is a graph in which the current value measured using the creatinine concentration measuring device of Example 5 is plotted against the creatinine concentration.
  • the horizontal axis indicates the creatinine concentration (mM) contained in the sample, and the vertical axis indicates the measured current value ( ⁇ A).
  • the obtained current value increases linearly (that is, proportionally) with respect to the increase in the concentration of creatinine contained in the sample, and the current value and the creatinine concentration show a high correlation. It was.
  • FIG. 15 is a graph showing variation (coefficient of variation) in current value measured using the creatinine concentration measuring device of Example 5 and Reference Example.
  • the horizontal axis represents the creatinine concentration (mM) contained in the sample, and the vertical axis represents the coefficient of variation (%).
  • the white bar graph shows the data of Example 5, and the black bar graph shows the data of the reference example.
  • the coefficient of variation of the creatinine concentration measuring device of Example 5 is lower than that of the reference example when any sample having a different creatinine concentration is measured. This result shows that the reproducibility of creatinine concentration measurement is improved by adding cationized guar gum to the reagent layer.
  • the present invention is useful for quantifying creatinine contained in a sample, particularly a biological sample such as urine.

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Abstract

　（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む試料とを混合して、前記クレアチニンによって前記金属錯体を還元させる工程、（Ｂ）前記工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに（Ｃ）前記工程Ｂにおいて測定された前記還元された金属錯体の量に基づき、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める工程を含む、クレアチニン濃度測定方法。

Description

クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置
　本発明は、試料中に含まれるクレアチニンや塩分の定量を行うための測定方法、測定デバイス、及び測定装置に関する。
　試料中に含まれるクレアチニン濃度の測定は、臨床化学や分析化学の分野において重要である。クレアチニンは筋肉の内在代謝の産物であるため、尿中のクレアチニン量は総筋肉質量を反映することが知られている。したがって、人間が一日に排泄する尿中のクレアチニン量は一般に個人ごとに一定であり、日間変動が無いといわれている。そのため、尿中のクレアチニン量は排泄される尿の濃淡の尺度として用いられることがある。また、尿中及び血中のクレアチニン量は尿毒症や腎機能の低下によって増減する。そのため、尿中または血中のクレアチニン量の測定により、尿毒症や腎機能の低下の有無を知ることができる。
　クレアチニン濃度の測定方法としては、アルカリ性のピクリン酸溶液を用いたヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）反応に基づく方法が知られている。この方法においては、ピクリン酸がクレアチニンと反応することにより得られる橙赤色の生成物を分光学的に測定する（例えば、特許文献１参照）。
　また、他のクレアチニン濃度の測定方法として、クレアチニンと特異的に反応する酵素を用いる方法が知られている。酵素を用いる方法としては、例えば、クレアチニンデイミナーゼを用いてクレアチニンを分解する方法がある（例えば、特許文献２参照）。この方法では、クレアチニンの分解により生成するアンモニア量をｐＨや電位の変化などから測定することにより、クレアチニン濃度を得ている。
　酵素を用いる他の方法として、下記の式（１）～（３）の反応により、クレアチニン濃度を測定する方法がある。
　　クレアチニン＋水　→　クレアチン　　　（１）
　　クレアチン＋水　→　サルコシン＋尿素　　　（２）
　　サルコシン＋水＋酸素　→
    グリシン＋ホルムアルデヒド＋過酸化水素　　　（３）
　式（１）～（３）の反応を触媒する酵素として、それぞれ順にクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼ）、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）、及びサルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロゲナーゼが用いられる。ここで、クレアチニンの定量方法としては、例えば、ペルオキシダーゼとともにロイコ色素やトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）試薬を利用し、式（３）において生成した過酸化水素を呈色させて分光学的に定量する方法が用いられている（例えば、特許文献３参照）。また、他のクレアチニン定量方法として、式（３）において生成した過酸化水素を電極で電気化学的に酸化し、流れる電流からクレアチニンを定量する方法が用いられている（例えば、特許文献４及び５参照）。
　また、酵素を用いるさらに他の方法として、上記式（１）及び（２）の反応に加えて、上記式（３）の反応に代えて、サルコシンと電子伝達体（メディエータ）との反応を用いてクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献６及び７参照）。
　特許文献６には、基板上に少なくとも一対の作用極及び対極を備え、電極上または電極周辺の基板上で試薬溶液を乾燥させることにより試薬を固定化したクレアチニンバイオセンサが開示されている。試薬溶液は、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びフェリシアン化カリウム（メディエータ）をｐＨ７～８．５の緩衝液中に溶解させることにより得ている。また、緩衝液のｐＨが７未満またはｐＨが８．５を超えると、酵素活性が低下するため好ましくないことが開示されている。
　特許文献７には、サルコシンオキシダーゼとともに、シクロデキストリンにより包摂されたメディエータを用い、比色法または電気化学的検出方法によりクレアチニンを定量することが開示されている。具体的には、シクロデキストリンにより包摂されるメディエータの例として、α－ナフトキノン（１，４－ナフトキノン）が挙げられている。しかし、特許文献７では、メディエータがシクロデキストリンに包摂されていない状態では、酵素を用いたクレアチニンの定量に不適切であることが開示されている。
　また、酵素を用いるさらに他の方法として、式（１）及び（２）の反応に加えて、式（３）の反応に代えて、サルコシンとテトラゾリウム指示薬との反応を用いて分光学的にクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献８参照）。特許文献８には、クレアチニン定量用試薬組成物として、クレアチニン加水分解酵素、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、テトラゾリウム指示薬であるチアゾリルブルー及びｐＨ７．５のリン酸カリウムからなる混合試薬を用いることが開示されている。
　また、酵素を用いるさらに他の方法として、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ及びサルコシンデヒドロゲナーゼを用いて、クレアチニンをグリシンとホルムアルデヒドとに変えた後、生成したホルムアルデヒドを呈色剤により発色させ、その吸光度によりクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献９参照）。特許文献９には、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ及び呈色剤に加えて、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液と、ホルムアルデヒドの生成を促す反応促進剤としてフェリシアン化カリウムとを用いることが開示されている。
　また、酵素を用いるさらに他の方法として、クレアチニンの加水分解を触媒するポリマー、サルコシン酸化酵素及びメディエータを固定化した電極を用いて、クレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１０参照）。特許文献１０には、メディエータとして、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）などを用いることができることが開示されている。
　さらに他のクレアチニン定量方法として、１，４－ナフトキノン－２－スルホン酸カリウムを用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１１、非特許文献１～３参照）。
米国特許第３７０５０１３号明細書 特表２００１－５１２６９２号公報 特開昭６２－２５７４００号公報 特表２００３－５３３６７９号公報 米国特許第５４６６５７５号明細書 特開２００６－３４９４１２号公報 特開２００５－１１８０１４号公報 特開昭５５－０２３９９８号公報 特開昭５４－１５１０９５号公報 特開２００３－３２６１７２号公報 特開昭６３－０３３６６１号公報
サリバン、外１名、「クレアチニンの高特異的テスト」、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、１９５８年、第２３３巻、第２号、ｐ．５３０－５３４（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，"Ａ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ"，１９５８，Ｖｏｌ．２３３，Ｎｏ．２，ｐ．５３０－５３４） ナラヤナン、外１名、「クレアチニン：レヴュー」、クリニカル　ケミストリー、１９８０年、第２６巻、第８号、ｐ．１１１９－１１２６（Ｎａｒａｙａｎａｎ，"Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ：Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ"，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．８，ｐ．１１１９－１１２６） クーパー、外１名、「４つの尿中クレアチニン測定方法の評価」、クリニカル　ケミストリー、１９６１年、第７巻、第６号、ｐ．６６５－６７３（Ｃｏｏｐｅｒ，"Ａｎ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｕｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｕｒｉｎａｒｙ　Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ"，１９６１，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．６，Ｐ．６６５－６７３）
　しかしながら、上記従来の方法では、以下のような問題点があった。
　特許文献１に記載の方法においては、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、セリン等のアミノ酸やタンパク質、グルコース等の糖、アセトン、ビリルビン等の妨害成分の影響を受けるため、上記物質を含む試料、例えば尿や血液などの生体試料中においてクレアチニンを正確に定量することは困難である。例えば、アミノ酸やグルコース等の糖は、ピクリン酸と反応してしまう。
　また、特許文献２に記載の方法においては、ｐＨや電位の変化が不安定であるため、クレアチニンを正確に定量することは困難である。
　また、特許文献２～１０に記載の方法においては、試料中に塩分等のイオン種や尿素が存在すると、酵素が変性することにより、酵素の活性が低下する。そのため、試料中に含まれるイオン種や尿素の濃度によって、反応速度にばらつきが生じる。したがって、イオン種や尿素を含む試料、例えば尿や血液などの生体試料中のクレアチニンを定量する際には、試料中に含まれるイオン種や尿素の濃度によって測定結果に誤差が生じる。
　また、特許文献１１及び非特許文献１に記載されている１，４－ナフトキノン－２－スルホン酸カリウムを用いる方法については、非特許文献２及び３において、測定結果の再現性が非常に低いという問題が報告されている。
　そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料中に含まれるクレアチニンを精度良く、かつ再現性良く定量することができるクレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置を提供することを第１の目的とする。
　また、本発明は、尿中に含まれる塩分を精度良く、かつ再現性良く定量することができる塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置を提供することを第２の目的とする。
　上記従来の問題を解決するために、本発明のクレアチニン濃度測定方法は、
　（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む試料とを混合して、クレアチニンによって金属錯体を還元させる工程、
　（Ｂ）工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
　（Ｃ）工程Ｂにおいて測定された還元された金属錯体の量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。
　本発明の塩分量測定方法は、
　（ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、試料である尿とを混合して、尿中のクレアチニンによって試薬を還元させる工程、
　（ｂ）工程ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、
　（ｃ）尿の電気特性を測定する工程、及び
　（ｄ）工程ｂにおいて測定された還元された金属錯体の量と、工程ｃにおいて測定された電気特性とに基づいて、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める工程を含む。
　工程ｃは工程ａの前に行うか、工程ｂの後かつ工程ｄの前に行うことが好ましい。
　工程Ａおよび工程ａでは、混合後の試料のｐＨを２．５以上、７以下とすることが好ましく、３以上、６以下とすることがさらに好ましい。工程Ａおよび工程ａでは、試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合することが好ましく、この場合、試料のｐＨを５～６に調整することが特に好ましい。工程Ａおよび工程ａにおいて、試料にカチオン化親水性ポリマーを混合すると、クレアチニンと試薬との反応の再現性が向上する。カチオン化親水性ポリマーは、カチオン化グアガムであることが好ましい。
　本発明のクレアチニン濃度測定デバイスは、
　上記クレアチニン濃度測定方法に用いられるデバイスであって、
　クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
　試料収容室と連通し、試料収容室内に試料を導入するための試料導入口と、
　試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、
　試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、を備え、
　クレアチニン定量用試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含む。
　また、本発明の塩分量測定デバイスは、
　上記塩分量測定方法に用いられるデバイスであって、
　試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
　第１の試料収容室と連通し、第１の試料収容室内に尿を導入するための第１の試料導入口と、
　第１の試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、
　第１の試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または第１の試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、
　尿を収容するための第２の試料収容室と、
　第２の試料収容室と連通し、第２の試料収容室内に尿を導入するための第２の試料導入口と、
　第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備え、
　クレアチニン定量用試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含む。
　本発明のクレアチニン濃度測定装置は、
　上記クレアチニン濃度測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
　測定デバイスの試料収容室内において、クレアチニンによって還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する測定部、及び
　測定部において測定された還元された金属錯体の量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める演算部、を備える。
　本発明の塩分量測定装置は、
　上記塩分量測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
　測定デバイスの第１の試料収容室内において、クレアチニンによって還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する第１の測定部、
　測定デバイスの第２の試料収容室内において、尿の電気特性を測定する第２の測定部、及び
　第１の測定部において測定された還元された金属錯体の量と、第２の測定部において測定された電気特性とに基づき、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める演算部、を備える。
　本発明のクレアチニン濃度測定方法によれば、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、試料中に含まれるクレアチニンを精度良く定量することができる。
本発明の実施の形態１におけるクレアチニン濃度測定デバイスの構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態におけるクレアチニン濃度測定装置の外観を示す斜視図である。 同クレアチニン濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施の形態２におけるクレアチニン濃度測定デバイスの構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態におけるクレアチニン濃度測定装置の外観を示す斜視図である。 同クレアチニン濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施の形態３における塩分量測定デバイスを第１の基板の第１の面からみた構成を示す分解斜視図である。 同塩分量測定デバイスを第１の基板の第２の面からみた構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態における塩分量測定装置の外観を示す斜視図である。 同塩分量測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施例１における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 本発明の実施例４において第１の電極に印加された電位と測定された電流値との関係を示すグラフである。 同実施例における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 本発明の実施例５における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 同実施例及び参考例のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて測定された電流値のばらつきを示すグラフである。
　本発明の発明者は、クレアチニンと、下記式（４）に記載の３価のアニオンであるヘキサシアノフェレート（慣用名：フェリシアネート）とが直接的に反応することを新たに見出した。この反応においては、クレアチニンに作用する酵素（例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンデイミナーゼ）およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとが反応して、クレアチニンの酸化物と、下記式（５）に記載の４価のアニオンであるヘキサシアノフェレート（慣用名：フェロシアネート）とが生成する。本発明者が分析した結果、メチルグアニジンおよびＮ－メチル尿酸が反応生成物として得られていることがわかった。そのため、この反応におけるクレアチニンの酸化物は、クレアトールであると推測される。
　[Fe(CN)6]3-　　　（４）
　[Fe(CN)6]4-　　　（５）
　また、本発明者は、クレアチニンと、下記式（６）に記載の３価のアニオンであるヘキサシアノルテネートとが直接的に反応することを新たに見出した。この反応においては、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと、３価のアニオンであるヘキサシアノルテネートとが反応して、クレアチニンの酸化物と、下記式（７）に記載の４価のアニオンであるヘキサシアノルテネートとが生成する。
　[Ru(CN)6]3-　　　（６）
　[Ru(CN)6]4-　　　（７）
　本発明は上記の新たな知見に基づいており、クレアチニン濃度測定用試薬として、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方を用いることを特徴とする。
　ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートは、通常、錯塩の状態で存在する。例えば固体の状態では、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートは、カウンターカチオンとともに錯塩を構成している。一方、溶液中では、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートの錯塩は電離しており、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートは溶媒和したアニオンの状態で存在する。
　クレアチニンと試薬との反応、特にクレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの反応速度は、リン酸系緩衝剤の存在下で速くなる。また、リン酸系緩衝剤の存在下において、クレアチニンと試薬とを反応させる際、カチオン化親水性ポリマーが存在すると、反応の再現性が向上する。
　本発明のクレアチニン濃度測定方法は、
　（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む試料とを混合して、前記クレアチニンによって前記金属錯体を還元させる工程、
　（Ｂ）前記工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
　（Ｃ）前記工程Ｂにおいて測定された前記還元された金属錯体の量に基づき、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める工程を含む。
　この方法によると、従来の測定方法と異なり、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件において、クレアチニンとクレアチニン定量用試薬に含まれる金属錯体とが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定方法よりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
　クレアチニン定量用試薬は、ヘキサシアノフェレートであることが好ましい。ヘキサシアノフェレートは、化学的に安定であり、かつクレアチニンと効率よく反応する。ヘキサシアノフェレートの錯塩としては、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウムなどを用いることができる。
　ヘキサシアノフェレートは、クレアチニンと反応する前は、３価のヘキサシアノフェレート、すなわちヘキサシアノフェレートの酸化体であっても、４価のヘキサシアノフェレート、すなわちヘキサシアノフェレートの還元体であってもよい。クレアチニン定量用試薬が、４価のヘキサシアノフェレートである場合は、試料中に溶解した４価のヘキサシアノフェレートを、３価へと酸化させればよい。３価のヘキサシアノフェレートは、例えば、４価のヘキサシアノフェレートを電極上で酸化することにより得ることができる。
　クレアチニン定量用試薬は、ヘキサシアノルテネートであってもよい。ヘキサシアノルテネートの錯塩としては、ルテニウムヘキサシアン化カリウム、ルテニウムヘキサシアン化ナトリウムなどを用いることができる。
　ヘキサシアノルテネートは、クレアチニンと反応する前は、３価のヘキサシアノルテネート、すなわちヘキサシアノルテネートの酸化体であっても、４価のヘキサシアノルテネート、すなわちヘキサシアノルテネートの還元体であってもよい。クレアチニン定量用試薬が、４価のヘキサシアノルテネートである場合は、試料中に溶解した４価のヘキサシアノルテネートを、３価へと酸化させればよい。３価のヘキサシアノルテネートは、例えば、４価のヘキサシアノルテネートを電極上で酸化することにより得ることができる。
　工程Ａにおいて、試料に緩衝剤をさらに混合してもよい。
　緩衝剤としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸系緩衝剤、クエン酸系緩衝剤、フタル酸系緩衝剤、酢酸系緩衝剤、ＭＥＳ（2-Morpholinoethane sulfonic acid）緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤を試料と混合することにより、試料のｐＨを３～６に調整することが好ましい。特に、リン酸系緩衝剤を試料と混合することにより、試料のｐＨを５～６に調整することが好ましい。
　クレアチニン定量用試薬がヘキサシアノフェレートである場合は、特に試料にリン酸系緩衝剤を混合することにより、試料のｐＨが５～６に調整されることが好ましい。このようにすると、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの直接反応の速度が速くなるため、測定時間を短縮することができる。
　リン酸系緩衝剤は、リン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとから構成されることが好ましい。これらのリン酸塩が試料中に溶解することによって、試料のｐＨを５～６の範囲内に容易に調整することができる。
　試料におけるリン酸系緩衝剤の濃度（リン原子の濃度）は、５～１１００ｍＭであることが好ましく、５～５００ｍＭであることが、さらに好ましい。本発明者は、リン酸系イオンの濃度の増加に伴い、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの反応の速度が速くなることを見出した。リン酸系緩衝剤の濃度が５ｍＭ以上であれば、十分な反応速度が得られる。また、１１００ｍＭはリン酸系緩衝剤の溶解度の上限である。
　工程Ａでは、緩衝剤に加えて、さらに、カチオン化親水性ポリマーを試料に混合してもよい。ヘキサシアノフェレート、ヘキサシアノルテネート及びリン酸系緩衝剤は、アニオン性である。よって、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により、試薬が静電気的に引き寄せられ、試薬が均一になるものと予想される。そのため、再現性良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと考察される。
　試料におけるカチオン化親水性ポリマーの濃度は、０．０２～０．５重量％であることが好ましい。カチオン化親水性ポリマーの濃度が０．０２重量％以上であれば、十分な再現性向上の効果が得られる。また、カチオン化親水性ポリマーの濃度が０．５重量％以下であれば、カチオン化親水性ポリマーが試料中に良好に溶解することができる。
　カチオン化親水性ポリマーとしては、カチオン化グアガム（ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｇｕａｒ　ｇｕｍ）が挙げられる。グアガムはマメ科の植物であるグアの種子の胚乳部から得られる多糖類である。カチオン化グアガムは、グアガムのカチオン化物である。本発明において用いるカチオン化グアガムとしては、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドが挙げられる。
　本発明のクレアチニン濃度測定方法においては、リン酸系緩衝剤に加えて、さらに、カチオン化親水性ポリマーを試料に混合することにより、試料のｐＨを５～６の範囲内に調整することが最も好ましい。
　還元された金属錯体の量を電気化学的に測定する場合、
　例えば、工程Ｂは、
　（Ｄ）試料に２つ以上の電極を接触させ、前記２つの電極間に電圧を印加する工程、及び
　（Ｅ）前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する工程を含む。
　また、工程Ｃは、
　工程Ｅにおいて検出された電流値または電荷量に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。
　このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を電気化学的に容易に求めることができる。
　還元された金属錯体の量を光学的に測定する場合、
　例えば、工程Ｂは、
　（Ｆ）試料に入射光を照射する工程、及び
　（Ｇ）試料を透過した透過光または試料において反射した反射光を検出する工程を含む。
　また、工程Ｃは、
　工程Ｇにおいて検出された透過光または反射光の強度に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。
　このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を光学的に容易に求めることができる。
　本発明の塩分量測定方法は、試料として尿を用い、上記クレアチニン濃度測定方法の工程Ａ及びＢに加えて、下記の工程ｃ及びｄを含む。
　すなわち、本発明の塩分量測定方法は、
　（ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、試料である尿とを混合して、尿中のクレアチニンによって金属錯体を還元する工程、
　（ｂ）工程ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
　（ｃ）尿の電気特性を測定する工程、及び
　（ｄ）工程ｂにおいて測定された還元された金属錯体の量と、工程ｃにおいて測定された電気特性とに基づいて、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める工程を含む。
　クレアチニン定量用試薬が溶解していない尿の電気特性は、尿中に含まれる電解質の濃度を反映している。尿中に含まれる電解質の濃度は、尿中に含まれる塩分の濃度と相関がある。塩分等の成分は、水分摂取、発汗などの影響を受け、濃縮または希釈されて尿中に排泄される。そのため、昼間、夜間を問わず随時に採取された尿である随時尿中に含まれる塩分等の尿中成分の濃度は、尿の濃縮及び希釈の影響を受けて変動する。
　一方、上述のように、クレアチニンは筋肉量に依存して産生されることから、単位時間当たりの尿中へのクレアチニンの排泄量は一定であることが知られている。そこで、随時尿を用いた場合であっても、例えば、測定された尿中成分濃度のクレアチニン濃度に対する比（尿中成分／クレアチニン比）を求めることにより、尿の濃縮及び希釈の影響を補正することができる。
　本発明の塩分量測定方法では、クレアチニン濃度を高精度かつ再現性良く反映している、工程ｂにおける測定値と、塩分濃度を反映している、工程ｃにおいて測定された電気特性とを用いる。これにより、尿の濃縮及び希釈の影響が高精度かつ再現性良く補正される。よって、尿中への塩分の排泄量を適切に反映する値を求めることができる。
　ここで、尿の電気特性としては、抵抗、導電率、インピーダンス、入力された電流（または電圧）信号に対して出力される電圧（または電流）信号、入力された交流信号の位相と出力される交流信号の位相との位相差等が挙げられる。
　工程ｄにおいて求められる尿中への塩分の排泄量を反映する値としては、クレアチニン単位量当たりの塩分量、単位時間（例えば１日）当たりの尿中塩分排泄量、単位時間（例えば１日）当たりの塩分摂取量等が挙げられる。
　本発明のクレアチニン濃度測定デバイスは、
　クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
　試料収容室と連通し、試料収容室内に試料を導入するための試料導入口と、
　試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、を備え、
　クレアチニン定量用試薬は、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含み、上記クレアチニン濃度測定方法に用いられる。
　このデバイスによると、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと試薬に含まれる金属錯体とが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、ヘキサシアノフェレート、ヘキサシアノルテネート及びリン酸系緩衝剤は、アニオン性であり、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により静電気的に引き寄せられるため、試薬が均一となるものと考えられる。そのため、再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと考察される。
　クレアチニン濃度測定デバイスは、試料収容室内にリン酸系緩衝剤を備えていてもよく、さらにカチオン化親水性ポリマーを備えていてもよい。
　クレアチニン濃度測定デバイスは、試料収容室内に２つ以上の電極、または試料収容室に形成された光学測定用の窓部をさらに備えていてもよい。
　このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を電気化学的または光学的に容易に求めることができる。
　本発明の塩分量測定デバイスは、
　試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
　第１の試料収容室と連通し、第１の試料収容室内に尿を導入するための第１の試料導入口と、
　第１の試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、
　尿を収容するための第２の試料収容室と、
　第２の試料収容室と連通し、第２の試料収容室内に尿を導入するための第２の試料導入口と、
　第２の試料収容室内に配置された少なくとも２つの電極と、を備え、
　クレアチニン定量用試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含み、上記塩分量測定方法に用いられる。
　このデバイスによると、クレアチニン濃度を精度良く反映している、還元された金属錯体の量と、塩分濃度を反映している尿の電気特性とを効率的に測定することができる。上記還元された金属錯体の量と電気特性とを用いることにより、尿の濃縮及び希釈の影響が精度良く補正される。よって、尿中への塩分の排泄量を適切に反映する値を求めることができる。
　塩分量測定デバイスは、第１の試料収容室内に２つ以上の電極、または試料収容室に形成された光学測定用の窓部をさらに備えていてもよい。
　本発明のクレアチニン濃度測定装置は、
　上記クレアチニン濃度測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
　測定デバイスの試料収容室内において、クレアチニンによって還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する測定部、及び
　測定部において測定された還元された試薬の量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める演算部を備える。
　この測定装置によると、上記のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて、電気化学的または光学的に、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を測定することができる。
　光学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を測定する場合、測定部は、例えば、測定デバイスの試料収容室内に入射する入射光を出射する光源、及び試料収容室内を透過した透過光または試料収容室内において反射した反射光を検出する受光器を有する。また、演算部は、受光器において検出された透過光または反射光の強度に基づいて試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める。
　クレアチニン濃度測定デバイスが、試料収容室内に配置された２つ以上の電極をさらに備える場合、測定部は、例えば、前記２つの電極間に電圧を印加する電圧印加部、及び前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する検出部を有する。また、演算部は、検出部により検出された電流値または電荷量に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める。
　本発明の塩分量測定装置は、
　上記塩分量測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
　測定デバイスの第１の試料収容室内において、クレアチニンによって還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する第１の測定部、
　測定デバイスの第２の試料収容室内において、尿の電気特性を測定する第２の測定部、及び
　第１の測定部において測定された還元された金属錯体の量と、第２の測定部において測定された電気特性とに基づき、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める演算部を備える。
　この測定装置によると、高精度かつ再現性良く定量された尿中のクレアチニン濃度を用いて、測定された尿の電気特性に基づいて尿の濃淡を補正することができる。よって、高精度かつ再現性良く、尿中に含まれる塩分の量を求めることができる。
　試料としては、水溶液の他、血液、血清、血漿、尿、間質液、リンパ液、唾液などの体液が挙げられる。特に、尿は非侵襲的に在宅での日常の健康管理を行うためには非常に有効的な試料である。これらの体液中のイオン種および尿素の濃度は比較的高いので、本発明の効果が非常に高く得られる。
　本発明における電極の材料としては、金、白金、パラジウムあるいはそれらの合金または混合物、及びカーボンのいずれかを少なくとも含む材料が好ましい。これらの材料は化学的及び電気化学的に安定であり、安定した測定を実現することができる。第３の電極として、電位の安定した電極、例えばＡｇ／ＡｇＣｌや飽和カロメル電極のような参照電極を、上記２つの電極と組み合わせて使用してもよい。２つの電極のうち一方の電極の電位を第３の電極に対して規制すると、測定のための電位が安定するので好ましい。また、２つの電極のうち他方の電極として、例えばＡｇ／ＡｇＣｌや飽和カロメル電極を用いても良い。
　本発明の測定デバイスにおいては、クレアチニン定量用試薬が乾燥状態で備えられ、試料収容室内に試料が導入されたときに試料に溶解するように配置されていることが好ましい。
　本発明の測定デバイスにおいては、緩衝剤及びカチオン化親水性ポリマーが乾燥状態で備えられ、試料収容室内に試料が導入されたときに試料に溶解するように配置されていることが好ましい。
　例えば、ガラス繊維や濾紙等から構成される多孔性の担体に、クレアチニン定量用試薬を含む溶液を含浸させた後、乾燥させることにより、クレアチニン定量用試薬を上記担体に担持させる。そして、当該担体を試料と接する部分に設ければよい。また、測定デバイスにおける試料と接する部分の壁面に、クレアチニン定量用試薬を含む溶液を直接塗布した後、乾燥することにより、クレアチニン測定用試薬を配置してもよい。クレアチニン定量用試薬を含む溶液に、緩衝剤やカチオン化親水性ポリマーを含ませてもよい。
　上記測定デバイスは、着脱可能な状態で測定装置の測定デバイス取付け部に取付けられることが好ましい。また、特に尿や血液などの生体液を用いる場合には、衛生的な観点から、測定デバイスは使い捨てであることが好ましい。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。
　（実施の形態１）
　本発明の実施の形態１に係るクレアチニン濃度測定デバイス１００について、図１を用いて説明する。図１は、測定デバイス１００の構成を示す分解斜視図である。
　測定デバイス１００は、電気化学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を定量する方法に用いられる。測定デバイス１００は、絶縁性の第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する絶縁性の第２の基板１０４とが、スリット１１０を有する絶縁性のスペーサ１０６を挟んで組み合わされた構造を有している。第１の基板１０２、第２の基板１０４及びスペーサ１０６は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。
　第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１の電極１１２と電気的に接続された第１のリード１２２、及び第２の電極１１４と電気的に接続された第２のリード１２４が配置されている。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上には、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。
　次に、測定デバイス１００の製造方法について説明する。本実施の形態においては、クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノフェレートの錯塩であるフェリシアン化カリウムを用いている。
　まず、第１の基板１０２上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これによって、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４を形成する。第１の電極１１２及び第２の電極１１４は、それぞれ第１のリード１２２及び第２のリード１２４によって、後述するクレアチニン濃度測定装置の端子と電気的に接続される。
　次に、第１の基板１０２上に設けられた第１の電極１１２及び第２の電極１１４上に、フェリシアン化カリウム、リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二カリウムを溶解した水溶液、あるいはフェリシアン化カリウム、カチオン化グアガム、リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二カリウムを溶解した水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温～３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。
　塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよい。例えば、試薬を含む水溶液中の３価のヘキサシアノフェレートの濃度は０．１Ｍ程度であり、水溶液の滴下量は１．４μＬ程度である。また、試薬を含む水溶液がカチオン化グアガムを含む場合、水溶液中のカチオン化グアガムの濃度は０．２５重量％程度であり、滴下量は１．４μＬ程度である。
　試薬層１３０を形成する領域の面積は、試料に対する試薬の溶解性などを鑑みて適宜選択すればよいが、例えば、その面積を３ｍｍ2程度とする。
　次に、電極及び試薬層１３０が形成された第１の基板１０２、スペーサ１０６、及び第２の基板１０４を組み合わせる。第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずにこれらを組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。
　第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、スペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が試料導入口１３２として機能する。
　次に、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定装置２００及びそれを用いたクレアチニン濃度測定方法について、図２及び３を用いて説明する。図２は、測定装置２００の外観を示す斜視図であり、図３は測定装置２００の構成を示すブロック図である。
　まず、測定装置２００の構成について、図２を参照しながら説明する。
　測定装置２００の筐体２０２には、測定デバイス１００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置２００によるクレアチニン濃度の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続される第１の端子及び第２の端子が設けられている。
　次に、測定装置２００の筐体２０２内部の構成について、図３を参照しながら説明する。
　測定装置２００は、筐体２０２内部に、電圧印加部３０２、電気信号検出部３０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
　電圧印加部３０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス１００の第１の電極１１２及び第２の電極１１４に、電圧または電位を印加する機能を有する。電圧または電位の印加は、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続された第１の端子及び第２の端子を介して行われる。
　電気信号検出部３０４は、第１の電極１１２及び第２の電極１１４からの電気信号を、第１の端子及び第２の端子を介して検出する機能を有する。電気信号検出部３０４は、本発明における検出部に相当する。
　記憶部３１０には、クレアチニン濃度と電気信号検出部３０４により検出される電気信号との相関を表す検量線に相当する相関データが格納されている。記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。
　制御部３０６は、上記相関データを参照して、電気信号検出部３０４により検出された電気信号をクレアチニン濃度に換算する機能を有する。制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。
　次に、測定デバイス１００及び測定装置２００を用いた、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定方法について説明する。
　まず、使用者が測定デバイス１００のリード側を、測定装置２００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子及び第２の端子とが、それぞれ接触することにより電気的に導通する。
　測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス１００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス１００の挿入を検知すると、制御部３０６が電圧印加部３０２を制御して、第１の端子及び第２の端子を介して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に、試料導入を検知するための電圧（例えば０．２Ｖ）が印加される。
　次に、使用者が、測定デバイス１００の試料導入口１３２に、試料を接触させる。この接触により、試料導入口１３２を通って測定デバイス１００の試料収容室内に、試料（例えば０．６μＬ程度）が毛管現象により吸引され、試料収容室内が試料によって充填される。試料が第１の電極１１２及び第２の電極１１４に接触すると、試料を介して第１の電極１１２及び第２の電極１１４との間に電流が流れるようになる。そのため、それに起因する電気信号の変化を電気信号検出部３０４が検出する。
　電気信号検出部３０４からの出力信号により、試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、電圧印加部３０２による印加電圧を異なる電圧（例えば０Ｖまたは開回路）に切り替える。また、試料導入の検知に伴い、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。
　試料収容室内に露出している試薬層１３０に試料が接触すると、試薬層１３０に含まれるフェリシアン化カリウムが試料中に溶解する。フェリシアン化カリウムが試料中に溶解することにより、３価のヘキサシアノフェレートが生成する。生成した３価のヘキサシアノフェレートが、試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、クレアチニンの酸化物と、４価のヘキサシアノフェレートとが生成する。
　計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、制御部３０６は電圧印加部３０２を制御して、第１の電極１１２及び第２の電極１１４との間に、４価のヘキサシアノフェレートの濃度を測定するための電圧を印加する。例えば、第１の電極１１２が第２の電極１１４に比べて＋０．５～＋０．６Ｖとなる電圧を印加する。このように電圧を印加してから一定時間（例えば５秒）後、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間で流れる電流等の電気信号を、電気信号検出部３０４において測定する。このとき、第１の電極１１２では、４価のヘキサシアノフェレートが酸化される。よって、電気信号検出部３０４において測定される電気信号は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。
　制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている電気信号とクレアチニン濃度との相関を表す相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電気信号検出部３０４において検出された電気信号を試料中のクレアチニン濃度に換算する。
　得られたクレアチニン濃度はディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度が表示されることにより、ユーザはクレアチニン濃度測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。
　測定デバイス１００によれば、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、ヘキサシアノフェレート及びリン酸系緩衝剤はアニオン性であって、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により静電気的に引き寄せられ、均一な試薬を形成すると予想される。そのため、再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと考察される。
　本実施の形態においては、クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノフェレートを用いる例を示したが、代わりにヘキサシアノルテネートを用いてもよい。クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノルテネートを用いる場合にも、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖などの妨害成分の影響を受けることなく、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
　本実施の形態では、測定デバイスが１つの試薬層を備える例を示したが、これに限定されない。測定デバイスが、２つの試薬層、例えばクレアチニン定量用試薬を含む第１の試薬層と、リン酸系緩衝剤を含む第２の試薬層とを備えていてもよい。
　本実施の形態では、試料収容室に試料が導入されたことを制御部が検知することにより、電圧印加部による印加電圧が異なる電圧に切り替えられる例について示したが、これに限定されない。クレアチニンの濃度に依存した電流が得られる限り、必ずしも印加電圧を切り替える必要はない。測定に必要な電圧値（例えば、第１の電極が第２の電極に比べて＋０．５Ｖ～＋０．６Ｖとなる電圧）を測定デバイスの挿入検知時から印加し、試料導入の検知後も、その電圧値を継続して印加してもよい。
　本実施の形態では、４価のヘキサシアノフェレートの濃度に対応する電気信号を得るための第１の電極への印加電位を、第２の電極に対して０．５～０．６Ｖとする例を示したが、これに限定されることはない。第１の電極と第２の電極との間の電圧は、クレアチニンとの酸化還元反応により生成したクレアチニン定量用試薬に含まれる金属錯体の還元体（本実施の形態では４価のヘキサシアノフェレート）が酸化される電圧であればよい。
　本実施の形態では、試料導入の検知後、電気信号を検出するまでの時間（反応時間）を６０秒とする例を示したが、必ずしもその値である必要はない。クレアチニン濃度の違いに対する電流値の差を有意に検出できる限り、反応時間は上記より短くてもよい。一方、反応時間をより長くした場合、クレアチニンと３価のアニオンであるヘキサシアノフェレートとの反応が完了状態あるいは定常状態に達する可能性が高まる。そのため、温度などの環境条件の影響を受けずにクレアチニンの存在量をより正確に定量しやすくなる。
　本実施の形態では、電極に電位を印加してから５秒後に電気信号を検出する例を示したが、この時間に限定されない。この時間は、クレアチニン濃度の違いに対する電気信号の差を有意に検出できる時間であればよい。
　また、電極系、リード、及び端子の形状、個数、配置等は、本実施の形態に限定されない。他の実施の形態についても同様である。
　なお、本実施の形態では、還元された金属錯体の量を測定する例を示したが、金属錯体の酸化体の減少量を測定することにより、間接的に金属錯体の還元体の量を得てもよい。
　測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、レシチンをトルエンまたはその他の有機溶媒に溶解した溶液を、第２の基板の内壁に塗布して乾燥させることにより、レシチン層を形成してもよい。このような構造にすることにより、試料量をより再現性よく一定とすることができる。そのため、より精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
　クレアチニン濃度測定装置は、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。取り外し可能な記憶媒体に測定結果を保存することにより、測定結果を測定装置から容易に取り出すことができる。よって、分析関連業者に測定結果の分析を依頼することが容易になる。
　測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。これにより、測定結果を、病院内の分析関連部門または分析関連業者等に送信することができる。よって、測定から分析までの時間を短縮することができる。
　測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。これにより、分析結果を迅速に使用者にフィードバックすることができる。
　（実施の形態２）
　次に、本発明の実施の形態２に係るクレアチニン濃度測定デバイス４００について、図４を用いて説明する。図４は、測定デバイス４００の構成を示す分解斜視図である。
　測定デバイス４００は、光学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を定量する方法に用いられる。測定デバイス４００は、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する第２の基板１０４とが、スリット１１０を有するスペーサ１０６を挟んで組み合わされた構造を有している。第１の基板１０２、第２の基板１０４及びスペーサ１０６は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。
　測定デバイス４００は、実施の形態１に係る測定デバイス１００と異なり、第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４は配置されていない。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上ではなく、第１の基板１０２上に、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。
　次に、測定デバイス４００の製造方法について説明する。
　まず、第１の基板１０２上に、実施の形態１と同様のクレアチニン定量用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温～３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、実施の形態１と同様にすればよい。
　次に、試薬層１３０が形成された第１の基板１０２、スペーサ１０６、及び第２の基板１０４を組み合わせる。第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずに組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。
　第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、スペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が試料導入口１３２として機能する。
　次に、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定装置５００及びそれを用いたクレアチニン濃度測定方法について、図５及び６を用いて説明する。図５は、測定装置５００の外観を示す斜視図であり、図６は測定装置５００の構成を示すブロック図である。
　まず、測定装置５００の構成について、図５を参照しながら説明する。
　測定装置５００の筐体２０２には、測定デバイス４００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置５００によるクレアチニン濃度の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。
　次に、測定装置５００の筐体２０２内部の構成について、図６を参照しながら説明する。
　測定装置５００は、筐体２０２内部に、光源５０２、受光器５０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
　光源５０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス４００の試料収容室内に入射する光を出射する機能を有する。光源５０２から出射される光の波長は、クレアチニン定量用試薬中の金属錯体とクレアチニンとの反応に応じて吸収強度が変化する波長を選択すればよい。
　受光器５０４は、光源５０２から出射され、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス４００の試料収容室内において反射した光を検出する機能を有する。
　記憶部３１０には、クレアチニンの濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す検量線に相当する相関データが格納されている。記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。
　制御部３０６は、上記相関データを参照して、受光器５０４により検出される反射光の強度をクレアチニン濃度に換算する機能を有する。制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。
　次に、測定デバイス４００及び測定装置５００を用いた、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定方法について説明する。
　まず、使用者が測定デバイス４００の、試料導入口１３２の反対側を測定装置５００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。
　測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス４００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス４００の挿入を検知すると、制御部３０６は光源５０２を作動させる。これにより、測定デバイス４００の試料収容室に光源５０２からの光が照射される。
　次に、使用者が、測定デバイス４００の試料導入口１３２に、試料を接触させる。この接触により、試料導入口１３２を通って測定デバイス４００の試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、試料収容室内が試料によって充填される。試料が試料収容室内における光の照射位置に到達すると、試料収容室内の透過率が変化する。それに起因する反射光強度の変化を、受光器５０４が検出する。
　受光器５０４からの出力信号により、試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。
　試料収容室内に露出している試薬層１３０と試料とが接触すると、試薬層１３０に含まれるフェリシアン化カリウムが試料中に溶解する。フェリシアン化カリウムが試料中に溶解することにより、３価のヘキサシアノフェレートが生成する。生成した３価のヘキサシアノフェレートが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、クレアチニンの酸化物と、４価のヘキサシアノフェレートとが生成する。３価のヘキサシアノフェレートが４価のヘキサシアノフェレートに変化することにより、試料の吸収スペクトルが変化する。ここで、試料の吸収スペクトルの変化量は、生成した４価のヘキサシアノフェレートの濃度に依存する。
　計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、試料収容室内において反射した光の強度を受光器５０４において測定する。このとき、受光器５０４において測定される反射光の強度は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。
　制御部３０６は、記憶部３１０に格納されているクレアチニン濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す検量線に相当する相関データを読み出し、それを参照する。これにより、受光器５０４において検出された反射光の強度が、試料中のクレアチニン濃度に換算される。
　得られたクレアチニン濃度は、ディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度が表示されることにより、ユーザは測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。
　測定デバイス４００によれば、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、タンパク質、アミノ酸、糖、アセトン、ビリルビンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、ヘキサシアノフェレート及びリン酸系緩衝剤はアニオン性であって、カチオン化親水性ポリマーのカチオン基により静電気的に引き寄せられ、均一な試薬を形成するものと予想される。そのため、再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができるものと推察される。
　本実施の形態では、実施の形態１と同様に、測定デバイスが２つ以上の試薬層を備えていてもよい。
　本実施の形態では、試料導入の検知後、反射光強度を検出するまでの時間（反応時間）を６０秒とする例を示したが、必ずしもその値である必要はない。クレアチニン濃度の違いに対する反射光強度の差を有意に検出できる限り、反応時間は上記より短くてもよい。一方、反応時間をより長くした場合、クレアチニンの存在量をより正確に定量しやすくなる。
　測定デバイスは、試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、実施の形態１と同様に、レシチン層を具備してもよい。
　実施の形態１と同様に、クレアチニン濃度測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。また、測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。さらに、測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。
　（実施の形態３）
　次に、本発明の実施の形態３に係る塩分量測定デバイス７００について、図７及び８を用いて説明する。図７は、測定デバイス７００を第１の基板の第１の面側の構成を示す分解斜視図であり、図８は、第１の基板の第２の面側の構成を示す分解斜視図である。
　測定デバイス７００は、試料である尿中に含まれるクレアチニンを電気化学的に測定するとともに、尿の電気特性を測定し、これらの測定結果を用いて、１日に排泄される尿中に含まれる塩分の量を推定する方法に用いられる。
　測定デバイス７００においては、絶縁性の第１の基板１０２の第１の面７０２と、スリット１１０を有する絶縁性の第１のスペーサ１０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する第２の基板１０４とが、第１のスペーサ１０６を挟んで組み合わされている。さらに、第１の基板１０２の第２の面８０２と、スリット７１０を有する絶縁性の第２のスペーサ７０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔７０８を有する第３の基板７０４とが、第２のスペーサ７０６を挟んで組み合わされている。第１の基板１０２と、第１のスペーサ１０６、第２の基板１０４、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４は、例えば、ポリエチレンテレフタレート製である。
　第１の基板１０２の第１の面７０２上には、実施の形態１に係る測定デバイス１００と同様に、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１の電極１１２と電気的に接続された第１のリード１２２、及び第２の電極１１４と電気的に接続された第２のリード１２４が配置されている。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上には、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。
　一方、第１の基板１０２の第２の面８０２上には、第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、及び第６の電極７１８が配置されている。さらに、第２の面８０２上には、第３の電極７１２と電気的に接続された第３のリード７２２、第４の電極７１４と電気的に接続された第４のリード７２４、第５の電極７１６と電気的に接続された第５のリード７２６、及び第６の電極７１８と電気的に接続された第６のリード７２８が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。
　次に、測定デバイス７００の製造方法について説明する。
　まず、第１の基板１０２の第１の面７０２上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これにより、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４を形成する。第１の電極１１２及び第２の電極１１４は、それぞれ第１のリード１２２及び第２のリード１２４によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。
　次に、第１の基板１０２の第２の面８０２上に、上記の電極パターンマスクとは異なるパターンを有する電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これにより、第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、第６の電極７１８、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８を形成する。第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、及び第６の電極７１８は、それぞれ第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。
　次に、第１の基板１０２の第１の面７０２上に設けられた第１の電極１１２及び第２の電極１１４上に、実施の形態１と同様のクレアチニン定量用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温～３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、実施の形態１と同様にすればよい。
　次に、第１の基板１０２の第１の面７０２と第１のスペーサ１０６とが接し、第１の基板１０２の第２の面８０２と第２のスペーサ７０６とが接するように、第２の基板１０４、第１のスペーサ１０６、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６、及び第３の基板７０４を組み合わせる。各部材の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずにこれらを組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。
　第１の基板１０２、第１のスペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、第１のスペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、クレアチニン濃度測定用の第１の試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が第１の試料導入口１３２として機能する。
　一方、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第３の基板７０４との間で、第２のスペーサ７０６に設けられたスリット７１０により形成される空間部が、尿の電気特性測定用の第２の試料収容室として機能する。また、スリット７１０の開口部が第２の試料導入口７３２として機能する。
　次に、本実施の形態に係る塩分量測定装置９００及びそれを用いた塩分量測定方法について、図９及び１０を用いて説明する。図９は、測定装置９００の外観を示す斜視図であり、図１０は測定装置９００の構成を示すブロック図である。
　まず、測定装置９００の構成について、図９を参照しながら説明する。
　測定装置９００の筐体２０２には、測定デバイス７００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置９００によるクレアチニン濃度及び尿の電気特性の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス７００の第１のリード１２２、第２のリード１２４、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８とそれぞれ電気的に接続される第１の端子、第２の端子、第３の端子、第４の端子、第５の端子、及び第６の端子が設けられている。
　次に、測定装置９００の筐体２０２内部の構成について、図１０を参照しながら説明する。
　測定装置９００は、筐体２０２内部に、電圧印加部３０２、電気信号検出部３０４、定電流交流電源９０２、電圧検出器９０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
　電圧印加部３０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス７００の第１の電極１１２及び第２の電極１１４に電圧または電位を印加する機能を有する。電圧または電位の印加は、測定デバイス７００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続された第１の端子及び第２の端子を介して行われる。
　電気信号検出部３０４は、第１の電極１１２及び第２の電極１１４からの電気信号を、第１の端子及び第２の端子を介して検出する機能を有する。電気信号検出部３０４は、本発明における検出部に相当する。
　定電流交流電源９０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス７００の第３の電極７１２と第６の電極７１８との間に一定の交流電流を印加する機能を有する。一定の交流電流の印加は、測定デバイス７００の第３のリード７２２及び第６のリード７２８とそれぞれ電気的に接続された第３の端子及び第６の端子を介して行われる。印加する交流電流は、例えば、周波数が１ｋＨｚ程度、電流値が０．１ｍＡ程度である。
　電圧検出器９０４は、第４の端子及び第５の端子を介して、第４の電極７１４と第５の電極７１６との間の電圧（交流電圧の実効値）を検出する機能を有する。
　記憶部３１０には、
　（i）クレアチニンの濃度と電気信号検出部３０４により検出される電気信号との相関を表す第１の検量線に相当する第１の相関データ、
　（ii）塩分濃度と電圧検出器９０４により検出される電圧との相関を表す第２の検量線に相当する第２の相関データ、及び
　（iii）１日当たりの尿中塩分排泄量とクレアチニン濃度により補正された塩分濃度との相関を表す第３の検量線に相当する第３の相関データ、が格納されている。
　記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。
　制御部３０６は、
　（I）第１の相関データを参照して、電気信号検出部３０４により検出された電気信号を、クレアチニン濃度に換算する機能、
　（II）第２の相関データを参照して、電圧検出器９０４により検出された電圧を、塩分濃度に換算する機能、
　（III）得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する機能、及び
　（IV）第３の相関データを参照して、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する機能、を有する。
　制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。
　次に、測定デバイス７００及び測定装置９００を用いた、本実施の形態に係る尿中塩分量測定方法について説明する。
　まず、使用者が測定デバイス７００のリード側を測定装置９００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス７００の第１のリード１２２、第２のリード１２４、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子、第２の端子、第３の端子、第４の端子、第５の端子、及び第６の端子とが、それぞれ電気的に導通する。
　測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス７００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス７００の挿入を検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の端子及び第２の端子を介して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に電圧（例えば０．２Ｖ）を印加する。
　次に、使用者が、測定デバイス７００の第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２に、試料を接触させる。この接触により、第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２を通って、測定デバイス７００の２つの試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、２つの試料収容室内が試料によって充填される。
　第１の試料収容室において、試料が第１の電極１１２及び第２の電極１１４に接触すると、試料を介して第１の電極１１２及び第２の電極１１４間に電流が流れるようになる。そのため、それに起因する電気信号の変化を電気信号検出部３０４が検出する。
　電気信号検出部３０４からの出力信号により、第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知する。
　第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、電圧印加部３０２による印加電圧を異なる電圧（例えば０Ｖまたは開回路）に切り替える。また、試料導入の検知に伴い、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。
　第２の試料収容室への試料導入の検知に伴い、制御部３０６は、定電流交流電源９０２を制御して、第３の端子及び第６の端子を介して、第３の電極７１２と第６の電極７１８との間に一定の交流電流（例えば、周波数１ｋＨｚ、電流値０．１ｍＡ）を印加する。交流電流の印加から所定時間経過後（例えば５秒後）に、電圧検出器９０４は、第４の電極７１４と第５の電極７１６との間の電圧（交流電流の実効値）を測定する。
　制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている塩分の濃度と電圧検出器９０４により検出される電圧との相関を表す第２の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電圧検出器９０４により検出された電圧を試料中の塩分濃度に換算する。得られた塩分濃度はディスプレイ２０４に表示される。
　第１の試料収容室において、試薬層１３０と試料とが接触すると、試薬層１３０に含まれるフェリシアン化カリウムが試料中に溶解する。フェリシアン化カリウムが試料中に溶解することにより、３価のヘキサシアノフェレートが生成する。生成した３価のヘキサシアノフェレートが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、クレアチニンの酸化物と４価のヘキサシアノフェレートとが生成する。
　計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に、再度異なる電圧を印加する（例えば、第１の電極１１２が第２の電極１１４に比べて＋０．５～＋０．６Ｖとなる電圧）。このように電圧を印加してから一定時間（例えば５秒）後、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間で流れる電流等の電気信号を、電気信号検出部３０４において測定する。このとき、第１の電極１１２では、４価のヘキサシアノフェレートが酸化される。電気信号検出部３０４において測定される電気信号は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。
　制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている電気信号とクレアチニン濃度との相関を表す第１の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電気信号検出部３０４において検出された電気信号は試料中のクレアチニン濃度に換算される。
　次に、制御部３０６は、得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する。続いて、制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている１日当たりの尿中塩分排泄量とクレアチニン濃度により補正された塩分濃度との相関を表す第３の検量線に相当する第３の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する。
　得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量は、ディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量が表示されることにより、ユーザは測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。
　測定装置９００によれば、高い精度で測定されたクレアチニン濃度により補正された塩分濃度に基づいて、１日当たりの尿中塩分排泄量を算出できる。よって、１日当たりの尿中塩分排泄量を精度良く求めることができる。
　なお、本実施の形態においては、クレアチニン定量用試薬としてヘキサシアノフェレートを用いる例を示したが、代わりにヘキサシアノルテネートを用いてもよい。ヘキサシアノルテネートを用いる場合にも、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖などの妨害成分の影響を受けることなく、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。
　本実施の形態では、実施の形態１と同様に、測定デバイスが、２つ以上の試薬層を備えていてもよい。
　本実施の形態においても、クレアチニンの濃度に依存した電流が得られる限り、必ずしも電圧印加部による印加電圧を異なる電圧に切り替える必要はない。
　本実施の形態においても、第１の電極と第２の電極との間の電圧は、４価のヘキサシアノフェレートが酸化される電圧であればよい。
　本実施の形態においても、実施の形態１と同様に、試料導入の検知後、電気信号を検出するまでの時間（反応時間）は限定されない。
　本実施の形態では、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加してから５秒後に電気信号を検出する例を示したが、この時間に限定されない。
　本実施の形態では、記憶部に、上記の第１～第３の相関データが格納されている例を示したが、これに限定されない。これに代えて、電気信号検出部により検出される電気信号と、電圧検出器により検出される電圧と、単位時間当たり（例えば１日）の尿中塩分排泄量との相関を示す相関データが記憶部に格納されていてもよい。この場合は、クレアチニン濃度や塩分濃度を求めなくてもよい。電気信号検出部により検出される電気信号と、電圧検出器により検出される電圧とを用いて、単位時間当たりの尿中塩分排泄量を直接求めることができる。
　塩分量測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、実施の形態１と同様のレシチン層を、第２の基板及び第３の基板の内壁に形成してもよい。
　塩分量測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。
　塩分量測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。
　塩分量測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。
　（実施例１）
　本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために以下の実験を行った。本実施例では、クレアチニン定量用試薬に含まれる金属錯体としてヘキサシアノフェレート、その錯塩であるフェリシアン化カリウム（ポタシウムフェリシアネート）を用いた。
　まず、４００ｍＭのリン酸水素二カリウム（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）の水溶液と、４００ｍＭのリン酸二水素カリウム（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）の水溶液とを調製した。ｐＨメーターを用いてモニターしながら２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。このようにして得られた４００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝６）に、フェリシアン化カリウムを濃度が４００ｍＭとなるよう溶解した。
　得られた水溶液をガラス製のセル容器に入れ、第１の電極、第２の電極、及び第３の電極を、それぞれ、前記セル容器中の水溶液に浸漬した。第１の電極としては、金電極（電極面積２ｍｍ2）を用いた。第２の電極は、長さ５ｃｍの白金線をコイル状に巻くことにより得た。第３の電極としては、Ａｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ水溶液）参照極を用いた。これら電極は全て、ビー・エー・エス株式会社の市販品である。第１の電極、第２の電極及び第３の電極の接続端子を、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ－６６０Ａ）の作用極、対極、参照極の接続端子にそれぞれ順に接続した。
　次に、濃度５００ｍＭのクレアチニン水溶液（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）を、前記セル容器中の水溶液に少量添加した。クレアチニン水溶液の添加量は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が所定の値になるよう測定毎に調整した。
　クレアチニンの添加とともに計時を開始し、クレアチニンの添加から１０分後に、第３の電極に対して０．５Ｖの電位を第１の電極に印加した。そして、電位印加後５秒後の電流値を測定した。以上の実験は、室温（約２５℃）で行った。
　セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が、０、１、２、５、１０、２０、３０、４０、及び５０ｍＭの場合について、それぞれ以上の測定を行った。
　図１１は、測定された電流値をクレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１１において、横軸はセル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は測定された電流値（μＡ）を示す。図１１から明らかなように、得られた電流値は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度の増加に対して直線的に増加し（すなわち、比例し）、電流値とクレアチニン濃度とは高い相関を示した。したがって、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法により、得られる電流値に基づいてクレアチニンの定量を行うことが可能であることがわかる。
　測定後に、セル容器中に残った、クレアチニン濃度の異なる複数の水溶液について、カラムを用いたクロマトグラフィーにより、反応生成物の分析を行った。分析の結果、セル容器中の水溶液には、４価のヘキサシアノフェレートが生成していることがわかった。また、４価のヘキサシアノフェレートの生成量は、クレアチニン１分子あたり最大４分子であった。以上の分析結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法における反応を次のように説明することができる。
　試料中において、３価のヘキサシアノフェレートは、リン酸系緩衝剤の存在下、クレアチニンと反応して還元され、４価のヘキサシアノフェレートに変換される。すなわち、クレアチニンは、本反応によって３価のヘキサシアノフェレートに電子を供与し、酸化される。このとき、クレアチニンは、本反応によって、最大４電子の酸化を受けているものと考察することができる。第１の電極には、４価のヘキサシアノフェレートより電子を受容するような電位が印加されている。そのため、生成した４価のヘキサシアノフェレートは、第１の電極において、電気化学的に酸化される。これに伴い、第１の電極には電流が流れる。一定時間に生成する４価のヘキサシアノフェレートの濃度は、クレアチニン濃度に依存する。また、４価のヘキサシアノフェレートの酸化電流は、試料中に存在する４価のヘキサシアノフェレートの濃度に依存する。よって、得られる電流値は、クレアチニン濃度に依存する。
　（実施例２）
　次に、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法における好ましいｐＨ範囲を調べるために、以下の実験を行った。実験に用いた試料の調製方法及び装置構成、並びに実験手順は、実施例１と同様であるため、説明を省略する。ただし、本実施例においては、試料中のクレアチニン濃度は２７ｍＭとした。また、試料中に添加するリン酸系緩衝液のｐＨが、２、２．５、３、４、５、６、７、８、及び９の場合について、それぞれ実施例１と同様の測定を行った。
　表１に、電流値の測定結果を示す。ｐＨが２．５～７の領域、特に３～６の領域において、顕著に電流値が大きく、かつ電流値が安定している。この結果から、前記ｐＨ領域において、クレアチニンの定量が特に感度良く、かつ高い再現性で測定できることがわかった。前記領域のうち、ｐＨ５～６は、リン酸系緩衝剤によって付与できる。また、リン酸系緩衝剤の存在下で、クレアチニンと３価のヘキサシアノフェレートとの反応速度が速くなることがわかっている。したがって、リン酸系緩衝剤を試料と混合し、ｐＨを５～６に調整することが好ましい。また、このようなｐＨは、リン酸水素イオンとリン酸二水素イオンとによってもたらされる。よって、リン酸系緩衝剤として、例えばリン酸水素二カリウムまたはリン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムまたはリン酸二水素ナトリウムとを組み合わせて用いるのが好ましいと考えられる。また、ｐＨが２．５～７の領域においても電流値は得られており、クレアチニンの定量が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例３）
　次に、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法において、試料中に含まれ得る共存物質の影響を調べるため、以下の実験を行った。
　生体試料中に含まれ得る共存物質としては、イオン種、酵素変性剤、クレアチニンの酵素反応生成物、糖、アミノ酸等が挙げられる。そこで、本実施例では、共存物質の代表例として、試料中に溶解することによりイオン種を生成するＮａＣｌ、酵素変性剤である尿素、クレアチニンの酵素反応生成物であるクレアチン、サルコシン及びグリシン、糖であるグルコース、並びにアミノ酸であるヒスチジン、タウリン、グルタミン、及びセリンを用いた。
　実施例１と同様の手順により、濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝６）を調製し、その緩衝液に、所定の濃度となるように、各共存物質を溶解した。室温２５℃での測定と、反応を促進するために試料を６０℃に加温しての測定とを行った。その他の試料の調製方法及び装置構成、並びに実験の手順は、実施例１と同様であるため説明を省略する。
　表２に、用いた共存物質及びその濃度と、測定された電流値を示す。表２において、試料１は、共存物質を含まず、３ｍＭのクレアチニンを含んでいるリン酸緩衝液である。また、試料２～１１は、表２に記載の各共存物質を含み、クレアチニンは含んでいない。表２において、測定された電流値は、試料１について測定された電流値を１００とした場合の相対値を示している。
　表２から、いずれの共存物質を含む試料の場合も、クレアチニンを含み、共存物質が存在しない試料１と比べて、有意な電流は測定されなかったことがわかる。この結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法は、ＮａＣｌ、尿素、クレアチン、サルコシン、グリシン、グルコース、ヒスチジン、タウリン、グルタミン、及びセリンのいずれの物質が試料中に含まれていても影響も受けないことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　一方、ヤッフェ法のように、アルカリ性溶液中で酸化剤を用いてクレアチニンの定量を行う従来の方法においては、測定結果に与える糖やアミノ酸の影響は大きいことが知られている。これは、アルカリ性溶液中では、ピクリン酸がクレアチニンと同様に多くの有機分子と反応しやすいためである。
　比較例として、従来の酵素法により、同様の実験を行った。まず、７Ｕ／ｍＬクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼ）（東洋紡株式会社製、ＣＮＨ－３１１）、１０Ｕ／ｍＬクレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）（東洋紡株式会社製、ＣＲＨ－２２１）、５Ｕ／ｍＬサルコシンオキシダーゼ（東洋紡株式会社製、ＳＡＯ－３５１）、及び１００ｍＭフェリシアン化カリウムを含む、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を調製した。
　上記のリン酸緩衝液に、濃度が３ｍＭとなるようにクレアチニンを添加し、試料１２を調製した。
　試料１２に、さらに共存物質として、濃度が０．５ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、試料１３を調製した。
　試料１２に、さらに共存物質として、濃度が１Ｍとなるように尿素を添加し、試料１４を調製した。
　試料１２～１４について、反応を促進するために試料を４０℃に加温した以外は、本実施例と同様の手順により実験を行った。
　表３に、比較例について得られた結果を示す。電流値は、試料１２について測定された電流値を１００とした相対値で示した。
　表３からわかるように、試料中に０．５ＭのＮａＣｌまたは１Ｍの尿素が存在するとき、共存物質が存在しない場合と比較して、クレアチニンに由来する電流値は大きく低下した。このような結果は、高濃度のＮａＣｌや尿素により、酵素タンパク質が変性されたためであると考えられる。これらの共存物質により、測定に用いた酵素の活性が２５～８０％に低下することがわかった。酵素の変性の結果、酵素活性が低下して、一定時間における反応の進行が低下するため、電流値が減少したものと考えられる。このような傾向は室温においても同様であると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法により、イオン種、尿素、クレアチニンの酵素反応生成物、糖、アミノ酸などの共存成分の影響を受けることなく、従来の測定方法よりも精度良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができることがわかった。
　（実施例４）
　本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために、以下の実験を行った。
　本実施例では、クレアチニン定量用試薬として、下記式（８）に示す、４価のアニオンであるヘキサシアノルテネートのカリウム塩（三津和化学薬品株式会社製）を用いた。
　K4[Ru(CN)6]      （８）
　まず、２００ｍＭのリン酸水素二カリウム水溶液と、２００ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液とを調製した。ｐＨメーターを用いてモニターしながら、２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。このようにして得られた２００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝６）に、式（８）に示すヘキサシアノルテネートのカリウム塩を濃度が１ｍＭとなるよう溶解した。
　本実施例に用いたセル及び測定装置の構成は、実施例１と同様であるので説明を省略する。
　次に、濃度５００ｍＭのクレアチニン水溶液を、前記セル容器中の水溶液に少量添加した。クレアチニン水溶液の添加量は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が所定の値になるよう、測定毎に調整した。セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が、０、８、１６、３２、及び６４ｍＭの場合について、それぞれ以下の測定を行った。
　クレアチニン水溶液の添加後、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ－６６０Ａ）により、第１の電極に印加する電位を第３の電極に対して０．５Ｖから１Ｖへ掃引し、続いて１Ｖから０．５Ｖへと掃引し、そのときに流れる電流を測定した。電位の掃引速度は１ｍＶ／秒とした。
　図１２に、測定結果（サイクリックボルタモグラム）を示す。図１２において、曲線Ａ～Ｅは、それぞれクレアチニン濃度が０、８、１６、３２、及び６４ｍＭの場合の測定結果を示している。クレアチニンが存在しない場合、０．７５Ｖ付近を酸化還元電位とするヘキサシアノルテネートの第１の電極上での酸化還元反応が見られた。クレアチニンを添加することにより、０．８Ｖよりポジティブな電位での電流が有意に増加した。以上の結果は、クレアチニンがヘキサシアノルテネートの酸化体により酸化され、生成したヘキサシアノルテネートの還元体が第１の電極で酸化されていることを示唆している。すなわち、クレアチニンの電気化学的な触媒酸化反応が、ヘキサシアノルテネートを通して進行していることを示している。
　クレアチニン濃度が異なる各試料について、図１２に示すサイクリックボルタモグラムから０．９Ｖにおける酸化電流値を求め、クレアチニン濃度が０の場合の酸化電流値との差を算出した。図１３は、得られた酸化電流値の差をクレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１３に示すように、得られた酸化電流値はクレアチニンの濃度の増大と共に増加した。したがって、本実施例のようにサイクリックボルタンメトリーを行い、酸化電流値を求めることにより、クレアチニンの定量を行うことができることがわかった。
　なお、本実施例においては、サイクリックボルタンメトリーにより酸化電流を測定したが、これに限定されない。これに代えて、例えば、第３の電極に対して０．９Ｖの一定電位を第１の電極に印加し、クレアチニンの添加から一定時間（例えば３分）後に流れる酸化電流を測定してもよい。この場合も、酸化電流値は、試料中に含まれるクレアチニンの濃度に応じて増加するため、クレアチニンの定量が可能である。
　（実施例５）
　本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために、以下の実験を行った。
　本実施例では、ヘキサシアノフェレートの金属錯体として、フェリシアン化カリウム（ポタシウムフェリシアネート）、カチオン化親水性ポリマーとして、カチオン化グアガムを用いた。また、実施の形態１と同様の手順により、図１に示す構造を有するクレアチニン濃度測定デバイスを作製した。本実施例においては、カチオン化グアガムとして、市販のグアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドを用いた。
　試薬層１３０を形成する際に用いた、試薬を含む水溶液は、以下のように調製した。まず、４００ｍＭのリン酸水素二カリウム水溶液と、４００ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液とを調製した。次に、ｐＨメーターを用いてモニターしながら、２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。最後に、このようにして得られた４００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝６）に、フェリシアン化カリウムを濃度が１００ｍＭとなるよう溶解させ、カチオン化グアガムを濃度が０．２５重量％となるように溶解させることにより、試薬を含む水溶液が得られた。
　第１の電極１１２及び第２の電極１１４上に、上記の手順により調製された水溶液を１．４μＬ滴下することにより、試薬層１３０を形成した。試薬層１３０を形成する領域の面積は３ｍｍ2とした。また、作製されたクレアチニン濃度測定デバイスの試料収容室の容積は０．６μＬである。
　また、参考例として、試薬層を形成する際に用いた水溶液中にカチオン化グアガムを添加しない点以外は、実施例１と同様の手順により、図１に示す構造を有するクレアチニン濃度測定デバイスを作製した。
　クレアチニン濃度測定デバイスの第１のリード、及び第２のリードに、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ－６６０Ａ）の作用極用の端子、及び対極、参照極用の２つの端子をそれぞれ接続した。その後、クレアチニン濃度測定デバイスの試料導入口に、試料であるクレアチニンを溶解した水溶液を接触させることにより、試料収容室内に０．６μＬの試料を導入した。試料の導入から６０秒経過後、上記電気化学アナライザーを用いて、第１の電極が第２の電極に比べて＋０．６Ｖとなる電圧を印加した。電圧の印加から１０秒後に、第１の電極と第２の電極との間に流れる電流を測定した。以上の実験は、室温（約２５℃）で行った。
　クレアチニン濃度が、０、１０、３０、及び４０ｍＭの試料について、それぞれ以上の測定を行った。
　図１４は、実施例５のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて測定された電流値を、クレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１４において、横軸は試料中に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は測定された電流値（μＡ）を示す。図１４から明らかなように、得られた電流値は、試料中に含まれるクレアチニン濃度の増加に対して直線的に増加し（すなわち、比例し）、電流値とクレアチニン濃度とは高い相関を示した。
　図１５は、実施例５及び参考例のクレアチニン濃度測定デバイスを用いて測定された電流値のばらつき（変動係数）を示すグラフである。図１５において、横軸は試料中に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は変動係数（％）を示す。また、白の棒グラフが実施例５のデータ、黒の棒グラフが参考例のデータを示す。
　図１５からわかるように、クレアチニン濃度の異なるいずれの試料について測定を行った場合でも、参考例に比べて、実施例５のクレアチニン濃度測定デバイスでは、変動係数が低くなっている。この結果から、試薬層にカチオン化グアガムを添加することにより、クレアチニン濃度測定の再現性が向上していることが分かる。
　本発明は、試料、特に尿などの生体試料中に含まれるクレアチニンを定量する際に有用である。
　１００、４００　　クレアチニン濃度測定デバイス
　１０２　　第１の基板
　１０４　　第２の基板
　１０６　　スペーサ（第１のスペーサ）
　１０８、７０８　　空気孔
　１１０、７１０　　スリット
　１１２　　第１の電極
　１１４　　第２の電極
　１２２　　第１のリード
　１２４　　第２のリード
　１３０　　試薬層
　１３２　　試料導入口（第１の試料導入口）
　２００、５００　　クレアチニン濃度測定装置
　２０２　　筺体
　２０４　　ディスプレイ
　２０６　　測定開始ボタン
　２０８　　測定デバイス取付け部
　３０２　　電圧印加部
　３０４　　電気信号検出部
　３０６　　制御部
　３０８　　計時部
　３１０　　記憶部
　５０２　　光源
　５０４　　受光器
　７００　　塩分量測定デバイス
　７０２　　第１の面
　７０４　　第３の基板
　７０６　　第２のスペーサ
　７１２　　第３の電極
　７１４　　第４の電極
　７１６　　第５の電極
　７１８　　第６の電極
　７２２　　第３のリード
　７２４　　第４のリード
　７２６　　第５のリード
　７２８　　第６のリード
　７３２　　第２の試料導入口
　８０２　　第２の面
　９００　　塩分量測定装置
　９０２　　定電流交流電源
　９０４　　電圧検出器

Claims (24)

  1. 　（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、クレアチニンを含む試料とを混合して、前記クレアチニンによって前記金属錯体を還元させる工程、
    　（Ｂ）前記工程Ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
    　（Ｃ）前記工程Ｂにおいて測定された前記還元された金属錯体の量に基づき、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める工程を含む、クレアチニン濃度測定方法。
  2. 　工程Ａにおいて混合後の前記試料のｐＨが、２．５以上、７以下である、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  3. 　工程Ａにおいて混合後の前記試料のｐＨが、３以上、６以下である、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  4. 　前記工程Ａにおいて、
    　前記試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合する、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  5. 　前記工程Ａにおいて、
    　前記試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合することにより、前記試料のｐＨを５～６に調整する、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  6. 　前記工程Ａにおいて、
    　前記試料にカチオン化親水性ポリマーをさらに混合する、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  7. 　前記カチオン化親水性ポリマーが、カチオン化グアガムである、請求項６に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  8. 　前記工程Ｂが、
    　（Ｄ）前記試料に２つ以上の電極を接触させ、前記２つの電極間に電圧を印加する工程、及び
    　（Ｅ）前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する工程を含み、
    　前記工程Ｃにおいて、
    　前記工程Ｅにおいて検出された前記電流値または前記電荷量に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  9. 　前記工程Ｂが、
    　（Ｆ）前記試料に入射光を照射する工程、及び
    　（Ｇ）前記試料を透過した透過光または前記試料において反射した反射光を検出する工程を含み、
    　前記工程Ｃにおいて、
    　前記工程Ｇにおいて検出された前記透過光または前記反射光の強度に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
  10. 　（ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン定量用試薬と、試料である尿とを混合して、前記尿中のクレアチニンによって前記金属錯体を還元させる工程、
    　（ｂ）前記工程ａにおいて還元された金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する工程、
    　（ｃ）前記尿の電気特性を測定する工程、及び
    　（ｄ）前記工程ｂにおいて測定された前記還元された金属錯体の量と、前記工程ｃにおいて測定された前記電気特性とに基づいて、前記尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める工程を含む、塩分量測定方法。
  11. 　前記工程ｃが、前記工程ａの前に行われる、請求項１０に記載の塩分量測定方法。
  12. 　前記工程ｃが、前記工程ｂの後かつ前記工程ｄの前に行われる、請求項１０に記載の塩分量測定方法。
  13. 　前記工程ａにおいて、
    　前記試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合することにより、前記試料のｐＨを５～６に調整する、請求項１０に記載の塩分量測定方法。
  14. 　前記工程ａにおいて、
    　前記試料にカチオン化親水性ポリマーをさらに混合する、請求項１０に記載の塩分量測定方法。
  15. 　前記カチオン化親水性ポリマーが、カチオン化グアガムである、請求項１４に記載の塩分量測定方法。
  16. 　クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
    　前記試料収容室と連通し、前記試料収容室内に前記試料を導入するための試料導入口と、
    　前記試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、
    　前記試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または前記試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、
    を備え、
    　前記試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含む、クレアチニン濃度測定デバイス。
  17. 　前記試料収容室内にリン酸系緩衝剤をさらに備える、請求項１６に記載のクレアチニン濃度測定デバイス。
  18. 　前記試料収容室内にカチオン化親水性ポリマーをさらに備える、請求項１６に記載のクレアチニン濃度測定デバイス。
  19. 　前記カチオン化親水性ポリマーが、カチオン化グアガムである、請求項１８に記載のクレアチニン濃度測定デバイス。
  20. 　試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
    　前記第１の試料収容室と連通し、前記第１の試料収容室内に前記尿を導入するための第１の試料導入口と、
    　前記第１の試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、
    　前記第１の試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または前記試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、
    　前記尿を収容するための第２の試料収容室と、
    　前記第２の試料収容室と連通し、前記第２の試料収容室内に前記尿を導入するための第２の試料導入口と、
    　前記第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備え、
    　前記試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含む、塩分量測定デバイス。
  21. 　クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、前記試料収容室と連通し、前記試料収容室内に前記試料を導入するための試料導入口と、前記試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、前記試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または前記試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、を備え、前記試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含むクレアチニン濃度測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
    　前記試料収容室内において、クレアチニンによって還元された前記金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する測定部、及び
    　前記測定部において測定された前記還元された金属錯体の量に基づき、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める演算部、を備えるクレアチニン濃度測定装置。
  22. 　前記測定部が、
    　前記試料収容室内に入射する入射光を出射する光源、及び
    　前記試料収容室内を透過した透過光または前記試料収容室内において反射した反射光を検出する受光器を有し、
    　前記演算部が、
    　前記受光器において検出された前記透過光または前記反射光の強度に基づいて前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項２１に記載のクレアチニン濃度測定装置。
  23. 　前記測定部が、
    　前記２つの電極間に電圧を印加する電圧印加部、及び
    　前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する検出部を有し、
    　前記演算部が、
    　前記検出部により検出された前記電流値または前記電荷量に基づいて前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項２１に記載のクレアチニン濃度測定装置。
  24. 　試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、前記第１の試料収容室と連通し、前記第１の試料収容室内に前記尿を導入するための第１の試料導入口と、前記第１の試料収容室内に配置されたクレアチニン定量用試薬と、前記第１の試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または前記試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、前記尿を収容するための第２の試料収容室と、前記第２の試料収容室と連通し、前記第２の試料収容室内に前記尿を導入するための第２の試料導入口と、前記第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備え、前記試薬が、ヘキサシアノフェレート及びヘキサシアノルテネートのうち少なくとも一方の金属錯体を含む塩分量測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
    　前記第１の試料収容室内において、クレアチニンによって還元された前記金属錯体の量を、電気化学的または光学的に測定する第１の測定部、
    　前記第２の試料収容室内において、前記尿の電気特性を測定する第２の測定部、及び
    　前記第１の測定部において測定された前記還元された金属錯体の量と、前記第２の測定部において測定された前記電気特性とに基づき、前記尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める演算部を備える、塩分量測定装置。
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