JP2019039817A - クレアチニンセンサ - Google Patents
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Abstract
【課題】微量の検体を使用してエンドポイントで反応させることによりクレアチニンを効率よく定量できるクレアチニンセンサを提供する。【解決手段】検体中のクレアチニンを定量するためのセンサであって、内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部と、反応部に連通し、反応部に検体を流入させるキャピラリー部を含み、２つ以上の電極のうち、1つ以上の電極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合メディエーターを含む試薬層が形成されており、クレアチナーゼのユニット数がクレアチニナーゼのユニット数の４倍以上である、検体中のクレアチニンを定量する。【選択図】図４
Description
本発明は、クレアチニンを定量するための電気化学センサに関する。
酵素法を用いた電気化学式クレアチニンセンサとして、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびポリマー結合ペンタシアノフェレートをカーボン電極に固定した電極を用いたセンサが開示されている（非特許文献１）。この文献では、検体中のクレアチニンをクレアチニナーゼによりクレアチンに変換し、クレアチンをクレアチナーゼによりサルコシンと尿素とに分解し、サルコシンをサルコシンオキシダーゼと反応させて過酸化水素を生成し、該過酸化水素及びペルオキシダーゼ存在下でフェロシアン化合物を酸化することでフェリシアン化合物を生成し、このフェリシアン化合物が電極上で還元されることにより、クレアチニン濃度に比例した電流を電気化学的に測定する方法が開示されている。
Anal. Chim. Acta, 767, 128-133 (2013).
前記非特許文献１のセンサはバッチ反応方式であり、測定に数ｍＬのクレアチニン溶液を要するため、数μＬの微量検体の測定にそのまま適用することができない。また、非特許文献１のセンサは、測定前に緩衝液に浸漬してPre-conditioningを行う必要があり、クレアチニンの反応が定常状態となるまで３００秒以上かかる。さらに、この文献ではレートアッセイで測定しているが、微量の検体を測定する際には、測定液の蒸発などクレアチニン濃度が変化するため、定常状態となるまで長時間待つことは難しい。
そこで、本発明は微量の検体を使用してエンドポイントで反応させることによりクレアチニンを効率よく定量できるセンサを提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、クレアチニンセンサとして、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合電子メディエーターを含む試薬層が形成された電極を含む反応部に、キャピラリー構造によって検体液を吸引させて供給する構造とし、さらに、前記試薬層におけるクレアチナーゼのユニット数がクレアニチナーゼのユニット数の４倍以上とすることで、微量の検体を使用したエンドポイントの反応でクレアチニンを効率よく定量できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］検体中のクレアチニンを定量するためのセンサであって、
内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部と、
前記反応部に連通し、前記反応部に検体を流入させるキャピラリー部を含み、
前記２つ以上の電極のうち、１つ以上の電極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合メディエーターを含む試薬層が形成されており、クレアチナーゼのユニット数がクレアチニナーゼのユニット数の４倍以上である、検体中のクレアチニンを定量するためのセンサ。
［２］前記キャピラリー部の高さが１５０μｍ以上である、［１］に記載のセンサ。
［３］前記２つ以上の電極が作用極および対極である、［１］または［２］に記載のセンサ。
［４］前記２つ以上の電極が作用極、参照極および対極である、［１］または［２］に記載のセンサ。
［５］前記参照極が銀塩化銀電極である、［４］に記載のセンサ。
［６］メディエーターがフェロシアン化合物である、［１］〜［５］のいずれかに記載のセンサ。
［７］ポリマーがポリビニルイミダゾールである、［１］〜［６］のいずれかに記載のセンサ。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のセンサに検体を導入する工程、
電極に電位を印加して電流を測定する工程、および
電流値からクレアチニン濃度を算出する工程、
を含む、検体中のクレアチニンの定量方法。
［９］電流の測定時間が５分未満である、［８］に記載のクレアチニンの定量方法。
［１０］前記検体は血液である、［８］または［９］に記載のクレアチニンの定量方法。［１１］［１］〜［７］のいずれかに記載のセンサと、
当該センサへの電位印加を制御する、制御部と、
当該センサへの電位印加により得られる、電流を検出する、検出部と、
前記電流の値からクレアチニン濃度を算出する、演算部と、
前記算出されたクレアチニン濃度を出力する出力部と、
を含む、クレアチニン測定装置。
［１］検体中のクレアチニンを定量するためのセンサであって、
内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部と、
前記反応部に連通し、前記反応部に検体を流入させるキャピラリー部を含み、
前記２つ以上の電極のうち、１つ以上の電極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合メディエーターを含む試薬層が形成されており、クレアチナーゼのユニット数がクレアチニナーゼのユニット数の４倍以上である、検体中のクレアチニンを定量するためのセンサ。
［２］前記キャピラリー部の高さが１５０μｍ以上である、［１］に記載のセンサ。
［３］前記２つ以上の電極が作用極および対極である、［１］または［２］に記載のセンサ。
［４］前記２つ以上の電極が作用極、参照極および対極である、［１］または［２］に記載のセンサ。
［５］前記参照極が銀塩化銀電極である、［４］に記載のセンサ。
［６］メディエーターがフェロシアン化合物である、［１］〜［５］のいずれかに記載のセンサ。
［７］ポリマーがポリビニルイミダゾールである、［１］〜［６］のいずれかに記載のセンサ。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のセンサに検体を導入する工程、
電極に電位を印加して電流を測定する工程、および
電流値からクレアチニン濃度を算出する工程、
を含む、検体中のクレアチニンの定量方法。
［９］電流の測定時間が５分未満である、［８］に記載のクレアチニンの定量方法。
［１０］前記検体は血液である、［８］または［９］に記載のクレアチニンの定量方法。［１１］［１］〜［７］のいずれかに記載のセンサと、
当該センサへの電位印加を制御する、制御部と、
当該センサへの電位印加により得られる、電流を検出する、検出部と、
前記電流の値からクレアチニン濃度を算出する、演算部と、
前記算出されたクレアチニン濃度を出力する出力部と、
を含む、クレアチニン測定装置。
本発明によれば、指先血のような微量の検体を用いる時でもクレアチニンを正確に測定できる。
（クレアチニンセンサ）
本発明のクレアチニンセンサは、
内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部と、
前記反応部に連通し、前記反応部に検体を流入させるキャピラリー部を含み、
前記２つ以上の電極のうち、１つ以上の電極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合電子メディエーターを含む試薬層が形成されており、クレアチナーゼのユニット数がクレアチニナーゼのユニット数の４倍以上であることを特徴とする。
以下、それぞれの構成要素について説明する。
本発明のクレアチニンセンサは、
内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部と、
前記反応部に連通し、前記反応部に検体を流入させるキャピラリー部を含み、
前記２つ以上の電極のうち、１つ以上の電極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合電子メディエーターを含む試薬層が形成されており、クレアチナーゼのユニット数がクレアチニナーゼのユニット数の４倍以上であることを特徴とする。
以下、それぞれの構成要素について説明する。
（電極）
本発明のクレアチニンセンサは、内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部を有するが、作用極（酵素電極）と対極を含む２電極系でもよいし、作用極と対極に加えて、参照電極を含む３電極系でもよい。
作用極や対極などの電極は、導電性のある素材であれば特に制限されないが、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、銀（Ａｇ）、ルテニウム（Ｒｕ）およびパラジウム（Ｐｄ）のような金属材料、或いはグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンなどのカーボンに代表される炭素材料を用いて形成することができる。なお、対極や参照電極は銀／塩化銀電極とすることもできる。
本発明のクレアチニンセンサは、内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部を有するが、作用極（酵素電極）と対極を含む２電極系でもよいし、作用極と対極に加えて、参照電極を含む３電極系でもよい。
作用極や対極などの電極は、導電性のある素材であれば特に制限されないが、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、銀（Ａｇ）、ルテニウム（Ｒｕ）およびパラジウム（Ｐｄ）のような金属材料、或いはグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンなどのカーボンに代表される炭素材料を用いて形成することができる。なお、対極や参照電極は銀／塩化銀電極とすることもできる。
電極は、例えば、絶縁性基板上に形成される。絶縁性基板は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極および絶縁性基板の大きさ、厚さは適宜設定可能である。
（試薬）
前記電極のうち、少なくとも１つの電極、すなわち、少なくとも作用極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合電子メディエーターを含む試薬層が設けられている。
前記電極のうち、少なくとも１つの電極、すなわち、少なくとも作用極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合電子メディエーターを含む試薬層が設けられている。
クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび電子メディエーターの反応は以下のとおりである。
クレアチニンは、クレアチニナーゼを触媒として加水分解され、クレアチンとなる。
Creatinine＋ H2O → Creatine・・・（１）
Creatinine＋ H2O → Creatine・・・（１）
クレアチンは、クレアチナーゼを触媒とする反応で加水分解されてサルコシンとなる。
Creatine + H2O → Sarcosine + Urea・・・（２）
Creatine + H2O → Sarcosine + Urea・・・（２）
サルコシンは、サルコシンオキシダーゼによって酸化されて、過酸化水素を発生する。
Sarcosine + O2 + H2O → Glycine + HCHO + H2O2・・・（３）
Sarcosine + O2 + H2O → Glycine + HCHO + H2O2・・・（３）
過酸化水素は、ペルオキシダーゼで還元され、それと共役して電子メディエーター（ここではフェリシアン化合物で示す）が酸化される。
H2O2 + 2H+ ＋2PVI[Fe(CN)5]3- → 2H2O + 2PVI[Fe(CN)5]2-・・・（４）
H2O2 + 2H+ ＋2PVI[Fe(CN)5]3- → 2H2O + 2PVI[Fe(CN)5]2-・・・（４）
酸化された電子メディエーターは電極で電子を受け取り再還元される。
PVI[Fe(CN)5]2- + e- → PVI[Fe(CN)5]3-・・・（５）
PVI[Fe(CN)5]2- + e- → PVI[Fe(CN)5]3-・・・（５）
この時に流れる電流の値はクレアチニン濃度に比例するので、当該電流値に基づきクレアチニンの濃度を求めることができる。
クレアチニナーゼ(EC3.5.2.10)はCreatinine amidohydrolaseとも呼ばれる。クレアチニ
ナーゼは上記の反応（１）を触媒できる限り由来などは特に制限されないが、例えば、微生物由来のクレアチニナーゼを使用できる。クレアチニナーゼは市販されている酵素を使用することもできる。
クレアチニナーゼの使用量は、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好まし
くは０．１〜２０Ｕ、より好ましくは０．２〜２．０Ｕである。
ナーゼは上記の反応（１）を触媒できる限り由来などは特に制限されないが、例えば、微生物由来のクレアチニナーゼを使用できる。クレアチニナーゼは市販されている酵素を使用することもできる。
クレアチニナーゼの使用量は、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好まし
くは０．１〜２０Ｕ、より好ましくは０．２〜２．０Ｕである。
クレアチナーゼ(EC3.5.3.3)はCreatine amidohydrolaseとも呼ばれる。クレアチナーゼは上記の反応（２）を触媒できる限り由来などは特に制限されないが、例えば、微生物由来のクレアチニナーゼを使用できる。クレアチナーゼは市販されている酵素を使用することもできる。
クレアチナーゼの使用量は、クレアチニナーゼのユニット数の４倍以上とする。本発明のクレアチニンセンサはエンドポイントで反応させるので、反応の進行にともない基質量が少なくなるとクレアチニナーゼの逆反応が無視できなくなる。そのため、クレアチニナーゼの反応生成物であるクレアチンの蓄積を防ぐためクレアチナーゼを十分量加えることが重要である。クレアチナーゼの添加量は、具体的には、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好ましくは０．６Ｕ〜１２０Ｕ、より好ましくは１．２Ｕ〜１２Ｕである。
クレアチナーゼの使用量は、クレアチニナーゼのユニット数の４倍以上とする。本発明のクレアチニンセンサはエンドポイントで反応させるので、反応の進行にともない基質量が少なくなるとクレアチニナーゼの逆反応が無視できなくなる。そのため、クレアチニナーゼの反応生成物であるクレアチンの蓄積を防ぐためクレアチナーゼを十分量加えることが重要である。クレアチナーゼの添加量は、具体的には、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好ましくは０．６Ｕ〜１２０Ｕ、より好ましくは１．２Ｕ〜１２Ｕである。
サルコシンオキシダーゼ(EC1.5.3.1)は上記の反応（３）を触媒できる限り由来などは特
に制限されないが、例えば、微生物由来のサルコシンオキシダーゼを使用できる。サルコシンオキシダーゼは市販されている酵素を使用することもできる。サルコシンオキシダーゼの使用量は、クレアチニナーゼと同程度であればよいが、具体的には、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好ましくは０．０１Ｕ〜２０Ｕ、より好ましくは０．０２Ｕ〜２．０Ｕである。
に制限されないが、例えば、微生物由来のサルコシンオキシダーゼを使用できる。サルコシンオキシダーゼは市販されている酵素を使用することもできる。サルコシンオキシダーゼの使用量は、クレアチニナーゼと同程度であればよいが、具体的には、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好ましくは０．０１Ｕ〜２０Ｕ、より好ましくは０．０２Ｕ〜２．０Ｕである。
ペルオキシダーゼは過酸化水素を還元できる限り由来などは特に制限されないが、例えば、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを使用できる。ペルオキシダーゼは市販されている酵素を使用することもできる。ペルオキシダーゼの使用量は、クレアチニナーゼと同程度であればよいが、具体的には、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、好ましくは０．０１〜２０Ｕ、より好ましくは０．０２Ｕ〜２．０Ｕである。
（電子メディエーター）
電子メディエーターは、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の還元反応と共役して酸化され、かつ、電極から電子を受け取って再還元される物質であればよいが、例えば、酵素電極で電子メディエーターとして使用される、フェリシアン化合物、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体およびオスミウム錯体などが挙げられる。この中では、フェリシアン化カリウムなどのフェリシアン化合物がより好ましい。
電子メディエーターはポリマーと結合させて用いる。これにより、電子メディエーターがペルオキシダーゼの反応に選択的に利用され、サルコシンオキシダーゼの反応には利用されないため、精度よく測定が可能である。なお、電子メディエーターとポリマーとの結合は化学結合が好ましい。
ポリマーとしては、例えば、ポリビニルイミダゾール（PVI）、ポリビニルピリジンなど
のビニル系ポリマーが使用できるが、ポリビニルイミダゾールが好ましい。
非特許文献１には、ポリビニルイミダゾール結合フェリシアン化合物（PVI[Fe(CN)5]）が開示されており、電子メディエーターとポリマーとの結合は、例えば、非特許文献１の方法を参考にして行うことができる。
電子メディエーターは、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の還元反応と共役して酸化され、かつ、電極から電子を受け取って再還元される物質であればよいが、例えば、酵素電極で電子メディエーターとして使用される、フェリシアン化合物、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体およびオスミウム錯体などが挙げられる。この中では、フェリシアン化カリウムなどのフェリシアン化合物がより好ましい。
電子メディエーターはポリマーと結合させて用いる。これにより、電子メディエーターがペルオキシダーゼの反応に選択的に利用され、サルコシンオキシダーゼの反応には利用されないため、精度よく測定が可能である。なお、電子メディエーターとポリマーとの結合は化学結合が好ましい。
ポリマーとしては、例えば、ポリビニルイミダゾール（PVI）、ポリビニルピリジンなど
のビニル系ポリマーが使用できるが、ポリビニルイミダゾールが好ましい。
非特許文献１には、ポリビニルイミダゾール結合フェリシアン化合物（PVI[Fe(CN)5]）が開示されており、電子メディエーターとポリマーとの結合は、例えば、非特許文献１の方法を参考にして行うことができる。
試薬層における電子メディエーターの含有量は、ペルオキシダーゼより多く含有されていることが好ましく、測定検体の種類等によって適宜決定できるが、例えば、電極上の試薬層の単位表面積（１ｍｍ２）当たり、２ｎｍｏｌ〜５００ｎｍｏｌが好ましく、より好ましくは２０ｎｍｏｌ〜１００ｎｍｏｌである。
（その他の成分）
試薬層は、前記酵素およびポリマー結合電子メディエーターを含むが、これらに加えてバ
インダーや架橋剤を含有させてもよい。
試薬層に使用することのできるバインダーとしては、例えば、ブチラール樹脂系、ポリエステル樹脂系などの樹脂バインダーを使用してもよいし、再表２００５／０４３１４６に開示された層状無機化合物を使用することもできる。
また、架橋剤としては、例えば、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（PEGDGE）、グルタルアルデヒドが挙げられる。
試薬層は、前記酵素およびポリマー結合電子メディエーターを含むが、これらに加えてバ
インダーや架橋剤を含有させてもよい。
試薬層に使用することのできるバインダーとしては、例えば、ブチラール樹脂系、ポリエステル樹脂系などの樹脂バインダーを使用してもよいし、再表２００５／０４３１４６に開示された層状無機化合物を使用することもできる。
また、架橋剤としては、例えば、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（PEGDGE）、グルタルアルデヒドが挙げられる。
また、試薬層は、緩衝剤や界面活性剤などの添加剤を追加的に含んでもよい。緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、アミン系緩衝剤などが挙げられる。
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、ペルフルオ
ロオクタンスルホン酸またはステアリン酸ナトリウムやアルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等が挙げられる。
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、ペルフルオ
ロオクタンスルホン酸またはステアリン酸ナトリウムやアルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等が挙げられる。
クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの各酵素およびポリマー結合電子メディエーターは、別々に溶液を調製して電極上に塗布してもよいし、２つ以上の成分を予め混合した試薬溶液を調製し、電極上に塗布してもよい。試薬溶液を電極上に塗布し、乾燥させることで酵素電極を得ることができる。
試薬層は少なくとも作用極上に設けられるが、作用極および対極の両方に設けられてもよい。なお、試薬層を効率的に電極上にのみ設けるために、電極表面をマスキングしてプラズマ処理することが好ましい。
なお、酵素を含む試薬層の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等が挙げられる。
以下、本発明のクレアチニンセンサの一例について、図１に基づいて説明する。図１（Ａ）〜（Ｅ）は、クレアチニンセンサを製造する一連の工程を示した斜視図である。なお、本発明のクレアチニンセンサは以下の態様には限定されない。
図１（Ｅ）に示すように、このクレアチニンセンサＡは、基板１０、リード部１１ａを有する対極１１と、リード部１２ａを有する作用極１２およびリード部１３ａを有する参照極１３とから構成された電極系、絶縁層１４、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合電子メディエーターを含む試薬層１６、開口部を有するスペーサー１８および貫通孔２０を有するカバー１９を備えている。図１（Ｂ）に示すように、基板１０上には、検出部１５が設けられており、検出部１５には、作用極１２と対極１１とが基板１０の幅方向に並行して配置され、さらに参照極１３も配置されている。また、作用極１２と対極１１との間は、絶縁部となっている。このような電極系を備えた基板１０の上には、図１（Ｂ）に示すように、リード部１１ａ、１２ａ、１３ａおよび検出部１５を除いて、絶縁層１４が積層されており、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４が積層されていない前記検出部１５の作用極１２上には、試薬層１６が載置されている。そして、絶縁層１４の上には、図１（Ｄ）に示すように、基板１０の一端（リード部と反対側の一端）から検出部１５までに対応する箇所が開口部になっているスペーサー１８が配置されている。さらにスペーサー１８の上には、前記開口部に対応する一部に貫通孔２０を有するカバー１９が配置されている（図１（Ｅ））。このクレアチニンセンサ１において、前記開口部の空間部分であり、かつ、基板１０とカバー１９とに挟まれた空間部分が、キャピラリーの検体供給部１７となる（絶縁層１４は非常に薄い膜であるため、スペーサーの厚みをキャピラリーの高さとすることができる）。そ
して、前記貫通孔２０が、検体を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
して、前記貫通孔２０が、検体を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
サルコシンオキシダーゼの反応がキャピラリー内の酸素量で律速しないよう、キャピラリー構造の厚み（高さ）は１５０μｍより大きくすることが好ましい。例えば、上記のようにスペーサーの厚みを調整することで、キャピラリーの高さを調整することができる。
このようなクレアチニンセンサは、例えば、以下のようにして作製できる。
まず、図１（Ａ）に示すように、基板１０上にリード部１１ａを有する対極１１、リード部１２ａを有する作用極１２およびリード部１３ａを有する参照極１３からなる電極系を形成する。
まず、図１（Ａ）に示すように、基板１０上にリード部１１ａを有する対極１１、リード部１２ａを有する作用極１２およびリード部１３ａを有する参照極１３からなる電極系を形成する。
続いて、図１（Ｂ）に示すように、前記電極１１、１２、１３を形成した基板１０上に絶縁層１４を形成する。この絶縁層は、電極のリード部１１ａ、１２ａ、１３ａと、検出部１５を除いた基板１０上に形成する。前記絶縁層１４は、例えば、絶縁性樹脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを前記基板１１上に印刷し、これを加熱処理または紫外線処理して形成することができる。絶縁性樹脂としては、例えば、ポリエステル、ブチラール樹脂、フェノール樹脂等が挙げられ、前記溶媒としては、例えば、カルビトールアセテート、二塩基酸エステル系混合溶剤（ＤＢＥソルベント）等が挙げられる。
次に、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４が形成されていない検出部１５において、作用極１２に、試薬層１６を形成する。試薬層１６は、例えば、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの各酵素およびポリマー結合電子メディエーターと、必要に応じて緩衝剤およびバインダーまたは架橋剤が分散された分散液を調製し、これを作用極１２上に分注して、乾燥することによって形成できる。
次に、図１（Ｄ）に示すように、絶縁層１４上にスペーサー１８を配置する。図示のように、スペーサー１８は、前記検出部１５に対応する箇所が開口部となっている。スペーサー１８の材料としては、例えば、樹脂製フィルムやテープ等が使用できる。また、両面テープであれば、前記絶縁膜１４との接着だけでなく、後述するカバー１９も容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスペーサーを形成してもよい。
次に、図１（Ｅ）に示すように、前記スペーサー１８上にカバー１９を配置する。前記カバー１９の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用でき、好ましくは、ＰＥＴ等の透明樹脂が挙げられる。
このようにして、基板とスペーサーとカバーにより形成されるキャピラリー部を介して、検体を導入し、本発明のクレアチニンセンサの作用極にクレアチニンを含む検体を接触させると、一連の酵素反応によって電子メディエーターは酸化される。そして、作用極に還元電位を印加することで、作用極表面で酸化型の電子メディエーターは還元され、これによって還元電流が発生する。この電流値に基づいて検体中のクレアチニン濃度を測定することができる。
（検体）
検体はクレアチニンを含む検体であれば特に制限されないが、生体由来の検体が好ましく、血液、尿などが挙げられる。
検体はクレアチニンを含む検体であれば特に制限されないが、生体由来の検体が好ましく、血液、尿などが挙げられる。
このクレアチニンセンサ１の使用方法について、検体が血液であり、電子メディエーターがフェリシアン化合物である例を挙げて説明する。
まず、全血検体をクレアチニンセンサ１の開口部１７の一端に接触させる。この開口部１
７は、前述のようにキャピラリー構造となっており、その他端に対応するカバー１９には空気孔２０が設けられているため、毛管現象によって前記検体が内部に吸引される。吸引された前記検体は、検出部１５の作用極１２上に設けられた試薬層１６表面に達する。そして、表面に達した検体中のクレアチニンは、試薬層１６中のクレアチニナーゼと反応し、一連の酵素反応が進行する。
７は、前述のようにキャピラリー構造となっており、その他端に対応するカバー１９には空気孔２０が設けられているため、毛管現象によって前記検体が内部に吸引される。吸引された前記検体は、検出部１５の作用極１２上に設けられた試薬層１６表面に達する。そして、表面に達した検体中のクレアチニンは、試薬層１６中のクレアチニナーゼと反応し、一連の酵素反応が進行する。
全血検体の供給から一定時間経過後、電位印加手段により作用極１２と対極１１との間に電位を印加して、流れる還元電流を作用極１２リード部１２ａを介して前記電気信号を測定する手段等によって検出する。この還元電流の値は、検体中のクレアチニンの濃度に比例するため、これを前記演算手段によりクレアチニン濃度に演算すれば、検体中のクレアチニン濃度を求めることができる。
作用極１２に印加する電位としては、作用極の電子メディエーターの酸化電位よりも小さい還元電位であることが好ましく、電子伝達物質の種類に応じて適宜設定できるが、例えば、電子伝達物質がフェリシアン化合物の場合、−２００ｍＶ〜０ｍＶが好ましく、−１５０ｍＶ〜−５０ｍＶが好ましく、約−１００ｍＶがより好ましい。検体を接触させた後、所定の時間非印加の状態で保持した後、電極系に電位を印加してもよいし、前記検体との接触と同時に電極系に電位を印加してもよい。非印加の状態で保持する時間としては、例えば、３０秒以下、または１０秒以下である。また、測定時間は、検体を導入してから５分未満であることが好ましい。
（装置）
次に、図面を用いて、本発明のクレアチニンセンサを備えた測定装置の一態様について説明する。ただし、本発明のクレアチニンセンサを備えた測定装置は以下の態様には限定されない。
次に、図面を用いて、本発明のクレアチニンセンサを備えた測定装置の一態様について説明する。ただし、本発明のクレアチニンセンサを備えた測定装置は以下の態様には限定されない。
図２は、測定装置Ｂ内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ２８、ポテンショスタット２９、電力供給装置３１が、筐体内に収容された基板３０上に設けられている。制御コンピュータ２８は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ））のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、出力部２１、制御部２２、演算部２３および検出部２４を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ２８は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ）やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいてもよい。
制御部２２は、電位印加のタイミング、印加電位値などを制御する。電力供給装置３１は、バッテリ２６を有しており、制御コンピュータ２８やポテンショスタット２９に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置３１は、筐体の外部に置くこともできる。ポテンショスタット２９は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部２２によって制御され、端子ＣＲ、Ｗを用いて、クレアチニンセンサ２７の対極と作用極との間に所定の電位（還元電位）を印加し、端子Ｗで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部２４に送る。
演算部２３は検出された電流値から測定対象物質の濃度の演算を行い、記憶する。出力部２１は、表示ユニット２５との間でデータ通信を行い、演算部２３によるクレアチニンの濃度の演算結果を表示ユニット２５に送信する。表示ユニット２５は、例えば、測定装置Ｂから受信されたクレアチニン濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。
図３は、制御コンピュータ２８によるクレアチニン濃度測定処理の例を示すフローチャートである。制御コンピュータ２８のＣＰＵ（制御部２２）は、クレアチニン濃度測定の開始指示を受け付けると、制御部２２は、ポテンショスタット２９を制御して、作用極への所定の電位を印加し、作用極からの応答電流の測定を開始する（ステップＳ０１）。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。
次に、ポテンショスタット２９は、電位印加によって得られる応答電流、すなわち、検体内の測定対象物質（クレアチニン）に依存する、電子の電極から電子メディエーターへの移動に基づく電流、例えば、電位印加から１〜２０秒後の定常電流を測定し、検出部２４へ送る（ステップＳ０２）。
演算部２３は、電流値に基づいて演算処理を行い、クレアチニン濃度を算出する（ステップＳ０３）。例えば、制御コンピュータ２８の演算部２３はクレアチニン濃度の計算式またはクレアチニン濃度の検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてクレアチニン濃度を算出する。
出力部２１は、クレアチニン濃度の算出結果を、表示ユニット２５との間に形成された通信リンクを通じて表示ユニット２５へ送信する（ステップＳ０４）。その後、制御部２２は、測定エラーの有無を検知し（ステップＳ０５）、エラーがなければ測定を終了し、クレアチニン濃度を表示部に表示する。エラーがあればエラー表示をした後に、図３のフローによる処理を終了する。また、算出結果を演算部２３に保存し、後から算出結果を呼び出して、表示部に表示し確認することも可能である。なお、ここでは、算出結果の表示ユニット２５への送信（ステップＳ０４）後に、制御部２２による測定エラー検知（ステップＳ０５）を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の態様には限定されない。
（１）クレアチニンセンサの作製
クレアチニンセンサは、図１に示すように、以下の手順で作製した。まず、図１（Ａ）に示すように、絶縁性基板１０として、ＰＥＴ製基板（長さ３５０ｍｍ、幅３５０ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、導電性カーボンインクでリード部をそれぞれ有する対極１１、作用極１２および参照極１３からなるカーボン電極対を形成した。さらに参照極１３上にスクリーン印刷により、銀塩化銀ペーストを印刷した。
クレアチニンセンサは、図１に示すように、以下の手順で作製した。まず、図１（Ａ）に示すように、絶縁性基板１０として、ＰＥＴ製基板（長さ３５０ｍｍ、幅３５０ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、導電性カーボンインクでリード部をそれぞれ有する対極１１、作用極１２および参照極１３からなるカーボン電極対を形成した。さらに参照極１３上にスクリーン印刷により、銀塩化銀ペーストを印刷した。
次に、図１（Ｂ）に示すように、前記電極対上に絶縁層１４を形成した。まず、絶縁性樹脂ポリエステルを、７５％（ｗｔ）となるように溶媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷した。なお、検出部１５上と、リード部１１ａ、１２ａ、１３ａ上には、スクリーン印刷を行わなかった。そして、１５５℃で２０分間、加熱処理し、絶縁層１４を形成した。
さらに、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４を形成しなかった検出部１５の作用極１２上に、試薬層１６を形成した。
試薬層作製用調製液は以下の通り調製した。
まず、クレアチニナーゼ７７．４ｍｇ／ｍＬを１．０μＬ（０．３８Ｕ）、クレアチナーゼ９６３ｍｇ／ｍＬを１０μＬ（ユニット数２．６Ｕ）、サルコシンオキシダーゼ１３８
ｍｇ／ｍＬを１μＬ（ユニット数０．０４７Ｕ）、ペルオキシダーゼ６４．９ｍｇ／ｍＬを１μＬ（０．１３Ｕ）およびポリマー結合電子メディエーターPVI[Fe(CN)5]２０μＬを添加し、さらに架橋剤PEGDGE（１／１０希釈）を２μLを添加して試薬層作製用調製液と
した。
まず、クレアチニナーゼ７７．４ｍｇ／ｍＬを１．０μＬ（０．３８Ｕ）、クレアチナーゼ９６３ｍｇ／ｍＬを１０μＬ（ユニット数２．６Ｕ）、サルコシンオキシダーゼ１３８
ｍｇ／ｍＬを１μＬ（ユニット数０．０４７Ｕ）、ペルオキシダーゼ６４．９ｍｇ／ｍＬを１μＬ（０．１３Ｕ）およびポリマー結合電子メディエーターPVI[Fe(CN)5]２０μＬを添加し、さらに架橋剤PEGDGE（１／１０希釈）を２μLを添加して試薬層作製用調製液と
した。
作用極１２の表面をプラズマ処理した後、試薬層作製用調製液を作用極１２上に分注した。なお、作用極１２の表面積は約１．６ｍｍ２であった。そして、これを、３０℃で乾燥させて、試薬層１６を形成した。
図１（Ｄ）に示すように、開口部を有するスペーサー１８を絶縁層１４上に配置した。さらに、図１（Ｅ）に示すように、スペーサー１８上に空気孔となる貫通孔２０を有するカバー１９を配置してクレアチニンセンサを作製した。前記カバー１９と絶縁層１４とに挟まれたスペーサー１８の開口部の空間が、キャピラリー構造となるため、これを検体供給部１７とした。
（２）クレアチニン測定
各濃度（０、０．５、１．０または２．０ｍＭ）のクレアチニンを含む、全血検体を調製した。
各濃度（０、０．５、１．０または２．０ｍＭ）のクレアチニンを含む、全血検体を調製した。
そして、各全血検体を前記クレアチニンセンサの検体供給部から供給して１０秒間反応させたのち、作用極に−１００ｍＶの電位を６０秒間印加した。電位印加時を基準として、６０秒後における電流値をサンプリングし、各クレアチニン濃度における応答電流値をプロットした。
（３）結果
図４に示すように、クレアチニンと応答電流値には相関がみられ、本発明のクレアチニンセンサを用いることにより、微量の検体からでも精度よくクレアチニンが定量できることが分かった。
図４に示すように、クレアチニンと応答電流値には相関がみられ、本発明のクレアチニンセンサを用いることにより、微量の検体からでも精度よくクレアチニンが定量できることが分かった。
（４）スペーサーの厚さの検討
センサにおけるスペーサーの厚さが測定結果に与える影響について検討を行った。
上記（１）と同様にして試薬層作製用調製液を調製したが、ここでは、酵素として、クレアチニナーゼは添加せず、クレアチナーゼとサルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼのみを加え、試料にサルコシンを使用して評価を行った。
また、センサについては、図１の手順でセンサを作成するに当たり、スペーサーの厚さを１５０μｍまたは３００μｍの２種類用意した。これにより、スペーサーの厚さを１５０μｍとした場合はキャピラリーの断面積は０．３６ｍｍ２となり、体積は２．１６ｍｍ３となり、スペーサーの厚さを３００μｍとした場合はキャピラリーの断面積は０．７２ｍｍ２となり、体積は４．３２ｍｍ３となる。
この２種類のセンサを使用して、０、０．５、１または２ｍＭのサルコシンを含む試料を供給して電流測定を行った（０Ｖ、６０秒）。その結果、図５に示すように、スペーサーの幅が３００μｍのときに、サルコシン濃度と電流値のより強い相関がみられた。この結果は、クレアチニナーゼとクレアチナーゼをさらに使用し、クレアチニン含有試料を用いても同様と考えられる。
センサにおけるスペーサーの厚さが測定結果に与える影響について検討を行った。
上記（１）と同様にして試薬層作製用調製液を調製したが、ここでは、酵素として、クレアチニナーゼは添加せず、クレアチナーゼとサルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼのみを加え、試料にサルコシンを使用して評価を行った。
また、センサについては、図１の手順でセンサを作成するに当たり、スペーサーの厚さを１５０μｍまたは３００μｍの２種類用意した。これにより、スペーサーの厚さを１５０μｍとした場合はキャピラリーの断面積は０．３６ｍｍ２となり、体積は２．１６ｍｍ３となり、スペーサーの厚さを３００μｍとした場合はキャピラリーの断面積は０．７２ｍｍ２となり、体積は４．３２ｍｍ３となる。
この２種類のセンサを使用して、０、０．５、１または２ｍＭのサルコシンを含む試料を供給して電流測定を行った（０Ｖ、６０秒）。その結果、図５に示すように、スペーサーの幅が３００μｍのときに、サルコシン濃度と電流値のより強い相関がみられた。この結果は、クレアチニナーゼとクレアチナーゼをさらに使用し、クレアチニン含有試料を用いても同様と考えられる。
Ａ・・・クレアチニンセンサ
１０・・・基板
１１・・・対極
１１ａ・・・リード部
１２・・・作用極
１２ａ・・・リード部
１３・・・参照極
１３a・・・リード部
１４・・・絶縁層
１５・・・検出部
１６・・・試薬層
１７・・・開口部
１８・・・スペーサー
１９・・・カバー
２０・・・空気孔
Ｂ・・・測定装置
２１・・・出力部
２２・・・制御部
２３・・・演算部
２４・・・検出部
２５・・・表示部ユニット
２６・・・バッテリ
２７・・・クレアチニンセンサ
２８・・・制御コンピュータ
２９・・・ポテンショスタット
３０・・・基板
３１・・・電力供給装置
ＣＲ、Ｗ・・・端子
１０・・・基板
１１・・・対極
１１ａ・・・リード部
１２・・・作用極
１２ａ・・・リード部
１３・・・参照極
１３a・・・リード部
１４・・・絶縁層
１５・・・検出部
１６・・・試薬層
１７・・・開口部
１８・・・スペーサー
１９・・・カバー
２０・・・空気孔
Ｂ・・・測定装置
２１・・・出力部
２２・・・制御部
２３・・・演算部
２４・・・検出部
２５・・・表示部ユニット
２６・・・バッテリ
２７・・・クレアチニンセンサ
２８・・・制御コンピュータ
２９・・・ポテンショスタット
３０・・・基板
３１・・・電力供給装置
ＣＲ、Ｗ・・・端子
Claims (11)
- 検体中のクレアチニンを定量するためのセンサであって、
内部に配置された２つ以上の電極を含む反応部と、
前記反応部に連通し、前記反応部に検体を流入させるキャピラリー部を含み、
前記2つ以上の電極のうち、１つ以上の電極上には、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ
、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびポリマー結合メディエーターを含む試薬層が形成されており、クレアチナーゼのユニット数がクレアチニナーゼのユニット数の４倍以上である、検体中のクレアチニンを定量するためのセンサ。 - 前記キャピラリー部の高さが１５０μｍ以上である、請求項１に記載のセンサ。
- 前記２つ以上の電極が作用極および対極である、請求項１または２に記載のセンサ。
- 前記２つ以上の電極が作用極、参照極および対極である、請求項１または２に記載のセンサ。
- 前記参照極が銀塩化銀電極である、請求項４に記載のセンサ。
- メディエーターがフェロシアン化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセンサ。
- ポリマーがポリビニルイミダゾールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のセンサ。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載のセンサに検体を導入する工程、
電極に電位を印加して電流を測定する工程、および
電流値からクレアチニン濃度を算出する工程、
を含む、検体中のクレアチニンの定量方法。 - 電流の測定時間が５分未満である、請求項８に記載のクレアチニンの定量方法。
- 前記検体は血液である、請求項８または９に記載のクレアチニンの定量方法。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載のセンサと、
当該センサへの電位印加を制御する、制御部と、
当該センサへの電位印加により得られる、電流を検出する、検出部と、
前記電流の値からクレアチニン濃度を算出する、演算部と、
前記算出されたクレアチニン濃度を出力する出力部と、
を含む、クレアチニン測定装置。
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-
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- 2017-08-25 JP JP2017162219A patent/JP7011906B2/ja active Active
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