JP3803945B2 - 過酸化水素分析型酵素電極 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な過酸化水素分析型酵素電極に関する。
【0002】
【従来の技術】
生体試料中の特定の生化学物質を分析(すなわち、検出又は定量)する手段として、特定の生化学物質に対して特異的に作用する酵素を働かせ、その酵素反応により生じる過酸化水素を、分光光度法又は電気化学的方法を用いて測定することにより、特定の生化学物質を分析することが一般的に行われている。過酸化水素の電気化学的分析法においては、白金電極が専ら使われている。この場合、白金電極には+600mV(vs.Ag/AgCl)以上の高い電位が印加され、電気化学反応により過酸化水素を酸素に酸化し、その際の酸化電流値を測定する。このような白金電極は、印加される電位が非常に高いため、過酸化水素ばかりではなく、生体試料中の様々な共存物質をも酸化してしまう。従って選択性に欠け、酸化電流値に誤差が生じることが問題となっている。
一般的に、電気化学測定の分野では、このように電極反応に選択性がない場合には、電極上に選択透過膜を設けて、目的の物質のみを透過させるようにすることによって妨害物質の影響を回避する方法がとられる。しかしながら、過酸化水素に関しては、そのような選択透過膜が見出されていない。また、ポリアニオン膜を電極上に設ける等の方法が提案されているが、いずれのポリアニオン膜も充分な選択性が得られなかった。
従って、共存物質を酸化することのない低い電位で動作することができる過酸化水素電極が求められていた。
また、従来の過酸化水素分析型酵素電極では、白金という貴金属を使用するので高価になりやすく、使い捨ての電極には不向きであった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、過酸化水素以外の共存物質を酸化させることのない低電位で動作することができ、そして安価な材料から製造することのできる過酸化水素分析型酵素電極を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
前記の課題は、本発明による、ペルオキシダーゼと電子メディエーターとを用いて過酸化水素をアンペロメトリックに分析する酵素電極において、電子メディエーターとして3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを用いることを特徴とする、前記の酵素電極によって解決することができる。
【0005】
【発明の実施の形態】
本発明では、電子メディエーターとして式
【化1】
で表される、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(以下、TMBZと称することがある)を使用する。
このTMBZの電気化学的性質は、従来知られていなかったが、発明者らは、このTMBZの電気化学応答を調べたところ、酸化還元応答が認められ、ペルオキシダーゼ(以下、PODと称することがある)と組合せると、過酸化水素を効率良く分析することができることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【0006】
このTMBZとPODとを用いた過酸化水素分析系のメカニズムは、次のスキームのように考えることができる。
【化2】
【0007】
前記のスキームに示すとおり、過酸化水素はPODにより還元されて水になる。それと同時に、還元型TMBZは酸化され、酸化型TMBZとなる。その酸化型TMBZを電極にて電気化学的に還元して還元型TMBZに変換する。この際の還元電流値が過酸化水素濃度と相関関係を有するので、その還元電流値から過酸化水素の濃度を知ることができる。
【0008】
本発明の過酸化水素分析型酵素電極において、電極に印加する電位は、酸化型TMBZを還元することのできる電位であれば充分である。具体的な印加電位は、使用する被検試料(例えば、生体試料、特には、血液、血清、血漿、又は尿)の種類や検査対象物質(例えば、タンパク質、酵素、糖類、又は脂質)の種類によって適宜決定することができる。例えば、銀/塩化銀電極に対して+230mV以下〔すなわち、+230mV(vs.Ag/AgCl)以下〕であれば充分であり、−200mV(vs.Ag/AgCl)以下で用いることもできる。一般的な電位は、例えば、−250mV〜+200mV(vs.Ag/AgCl)である。
【0009】
本発明の過酸化水素分析型酵素電極は、電子メディエーターとしてTMBZを用いることを除けば、その他の点では、従来公知の過酸化水素分析型酵素電極と特に構成上又は利用上の差異を設ける必要はない。従って、従来公知の過酸化水素分析型酵素電極と同様に、POD及びTMBZを作用極に担持させる。例えば、導電性部材に接触する酵素固定化膜中に共存させたり、又は導電性部材中に共存させるのが電子伝達効率の面から最も好ましい。
【0010】
本発明の過酸化水素分析型酵素電極において、作用極に用いることのできる導電性部材は、特に限定されないが、高電位を印加する必要がないので、利用可能な材料の範囲が拡がり、例えば、金属粉末、グラファイト粉末、又はカーボンブラック粉末なども用いることができる。
【0011】
本発明の過酸化水素分析型酵素電極に用いることのできるペルオキシダーゼも、従来公知の過酸化水素分析型酵素電極と同様に、その由来に特に限定されないが、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ(以下、HRPという)が安定性等の面から最も好ましい。
【0012】
以下、これらの材料を用いて、本発明の酵素電極を作成する手順を具体的に説明する。先ず、絶縁性樹脂シート(例えば、ポリエチレンテレフタレート又は尿素樹脂など)の上に、スクリーン印刷用導電性ペーストインク(例えば、カーボンペーストインク又は銀ペーストインクなど)を用いて、印刷等の手法によりリード線を形成する。このリード線と電気的に接続可能な任意箇所(例えば、リード線の先端)に、本発明の作用極を形成する。作用極は、粉末状導電性材料(例えば、グラファイト粉末)を適当なバインダー(例えば、ポリビニルブチラール樹脂)と共に溶媒(例えば、ブチルセロソルブアセテート)と混和し、ペースト状に練り上げ、このペーストにTMBZ及び酵素(POD及び過酸化水素を誘導するその他の酵素)を加えて充分に混和した後に、スクリーン印刷等によりリード線上に印刷し、加熱乾燥することによって形成することができる。
【0013】
本発明の過酸化水素分析型酵素電極は、低電位で動作可能である。従って、生体試料中の共存物質を酸化することなく、正確に過酸化水素の分析(すなわち、検出又は定量)を行うことができる。また、導電性材料としてカーボンなどの安価な材料を使用し、更に印刷など量産に適した手法も使用することができ、製造コスト全体を低くすることができるので、例えば、使い捨て型の過酸化水素分析型酵素電極に好適に適用することができる。
【0014】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例1】
ポリエチレンテレフタレート製シートに、銀ペーストインク及びカーボンペーストインクを用いてリード線をスクリーン印刷し、加熱乾燥して、基板を製造した。導電性粉末としてのアセチレンブラック1g、バインダーとしてのポリビニルブチラール樹脂1g、及び溶媒としてのブチルセロソルブアセテート10gを乳鉢にて混合し、カーボンペーストを作成した。次に、このカーボンペースト1gにTMBZ0.1gを加え、20分間混和した。HRP2500Uを、燐酸緩衝液(pH7.4)100μlに溶解し、上記カーボンペーストに添加した後、更に10分間混和した。
こうして調製したカーボンペーストをインクとし、スクリーン印刷にて前記基板上のリード線の先端に、直径2mmの円として印刷した後、40℃で1時間乾燥することにより酵素電極とした。
【0015】
この酵素電極の0.1M燐酸緩衝液(pH7.4)中でのサイクリックボルタモグラムを図1に示す。サイクリックボルタンメトリーは、対極として白金電極、参照電極として銀/塩化銀電極を用い、開始電位+100mV、折り返し電位+500mV、スイープ速度1mV・s-1にて実施した。TMBZ由来の酸化還元応答について観測されたデータを実線で示す。前記の0.1M燐酸緩衝液(pH7.4)4ml中に、100mM過酸化水素10μlを添加すると還元電流が増加し、触媒電流が観察された。その結果を破線で示す。従って、TMBZの還元ピークである+230mVよりも低い電位に設定すれば、過酸化水素の測定が可能になることになる。
酵素電極に−100mV(vs.Ag/AgCl)の電位を印加して、0.1M燐酸緩衝液(pH7.4)中での過酸化水素濃度(μM)を測定したところ、過酸化水素の濃度に対応して電流の増加が観測された。その結果を、図2に示す。
【0016】
【実施例2】
実施例1で調製したHRP含有カーボンペーストに、更に燐酸緩衝液(pH7.4)100μlに溶解したグルコースオキシダーゼ1000Uの酵素液を添加し、10分間混和した。このグルコースオキシダーゼを含むカーボンペーストを用いて、実施例1と同様に印刷を行い、酵素電極を作成した。
この酵素電極にグルコースを接触させると、グルコースオキシダーゼの触媒作用によりグルコースが酸化され、過酸化水素が発生する。この酵素電極に+230mV(vs.Ag/AgCl)以下の電位を印加すると、前記の酵素反応により発生した過酸化水素を測定することができ、この過酸化水素濃度はグルコース濃度と相関関係にあるため、グルコース濃度を求めることができる。
前記の酵素電極に0V(vs.Ag/AgCl)の電位を印加し、0.1M燐酸緩衝液(pH7.4)中の種々の濃度のグルコース(mM)に対する応答電流値(μA)を測定した。この結果を、図3に示す。
【0017】
【発明の効果】
本発明の過酸化水素分析型酵素電極によると、低電位で動作することにより共存物質を酸化させず、従って過酸化水素を選択的に測定することができる。また、本発明の過酸化水素分析型酵素電極は、安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1における酵素電極のサイクリックボルタモグラムである。
【図2】実施例1における過酸化水素濃度と応答電流値の関係を示すグラフである。
【図3】実施例2におけるグルコース濃度と応答電流値の関係を示すグラフである。
Claims (1)
- ペルオキシダーゼと電子メディエーターとを用いて過酸化水素をアンペロメトリックに分析する酵素電極において、電子メディエーターとして3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを用いることを特徴とする、前記の酵素電極。
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