JP2003326172A - 酵素模倣ポリマー - Google Patents

酵素模倣ポリマー

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JP2003326172A
JP2003326172A JP2002177781A JP2002177781A JP2003326172A JP 2003326172 A JP2003326172 A JP 2003326172A JP 2002177781 A JP2002177781 A JP 2002177781A JP 2002177781 A JP2002177781 A JP 2002177781A JP 2003326172 A JP2003326172 A JP 2003326172A
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creatine
compound
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Koji Hayade
広司 早出
Tomohiko Yamazaki
智彦 山崎
Shiki Mo
子暉 孟
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Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は環状アミド化合物と結合しその加水分
解反応を触媒するポリマーならびこれを用いた分析方法
およびキットならびにセンサーを提供する。 【解決手段】本発明は環状アミド化合物であるクレアチ
ニンあるいはヒダントインの加水分解反応を触媒するポ
リマーを鋭意検討した結果、環状アミド化合物と結合し
その加水分解反応を触媒するポリマーを開発した。該ポ
リマーを触媒として比検定物質を反応させ、比検定物質
の加水分解によって生成された化合物を測定することに
より、環状アミド化合物が測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は酵素反応を模倣した
新しい触媒機能を有する合成ポリマーとそれを用いた新
規なクレアチニンの測定方法に関する。より詳細には本
発明は触媒機能を有するモノマーおよび分子認識機能を
有するモノマーを分析対象としている分子を鋳型として
存在させた状態で重合して得られるポリマーに関する。
さらに種々の薬剤の合成原料であるヒダントイン加水分
解産物を調製する際に用いるヒダントイン加水分解反応
を触媒するポリマーに関する。さらに臨床検査などの分
野で腎疾患のマーカなどで利用されているクレアチニン
およびクレアチンの測定方法ならびにその方法に基づき
構築される測定用試薬ならびにセンサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】環状アミド化合物はさまざまな生体関連
化合物の中に存在し、薬剤としてあるいは、その生体内
の濃度を計測することによる疾患の診断のマーカーとな
る。環状アミド化合物を基質とする酵素はこれまでに種
々見出されているが。
【０００３】それはいずれも不安定であり、工業規模で
の環状アミド関連化合物の合成や、臨床診断薬や生化学
分析法に応用するには問題があった。
【０００４】そこで、安定性に優れた環状アミド化合物
を基質とする触媒の開発、ならびにそれらの触媒を用い
た新しい合成プロセスならびに分析方法の開発が望まれ
ていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は環状アミド化
合物を認識し、これを加水分解するための触媒機能を有
するポリマー、ヒダントイン加水分解方法、ならびに新
規なクレアチニンおよびクレアチンの測定方法を提供す
ることを目的とする。より詳細には本発明は有機合成分
野に応用される。また臨床検査などの分野で利用され、
クレアチニンおよびクレアチンの測定方法ならびにその
方法に基づき構築される測定用試薬ならびにセンサーを
提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は環状アミド化合
物を基質として加水分解反応を触媒する合成高分子触媒
を鋭意検討した結果、環状アミド化合物と結合し、さら
に該物質の加水分解反応を触媒するポリマーを開発する
ことに成功した。すなわち、ビニルイミダゾールのコバ
ルト錯体およびメチルメタアクリレートを含むポリマー
を合成したところ該触媒活性を有することを見い出し、
さらに同ポリマーを用いてクレアチニン、クレアチンお
よびヒダントインを反応させる方法を見出した。
【０００７】すなわち、本発明は環状アミド化合物と結
合しその加水分解反応を触媒するポリマーならびにこれ
を用いるヒダントイン加水分解ならびにクレアチニンお
よびその関連化合物の測定方法を提供する。別の観点か
らは、環状アミド化合物を遷移金属を配位したイミダゾ
ールとメチルメタアクリレートを含むポリマーと作用さ
せた結果、生成される化合物を測定することを特徴とす
る環状アミド化合物の測定方法を提供する。特に、クレ
アチニンを遷移金属を配位したイミダゾールとメチルメ
タアクリレートを含むポリマーと作用させた結果、生成
される化合物を測定することを特徴とする環状アミド化
合物の測定方法を提供する。
【０００８】すなわち本発明は環状アミド化合物を基質
として、そのＣ−Ｎ結合に作用し、加水分解反応を触媒
することを特徴とする合成高分子ポリマーを提供する。
【０００９】また本発明は、０００８記載のポリマーに
おいて環状アミド化合物が以下の構造で示される環状ア
ミド化合物を基質として、そのＣ−Ｎ結合に作用し、加
水分解反応を触媒することを特徴とする合成高分子ポリ
マーを提供する。
【００１０】本発明はまた、上記記載のポリマーにおい
て以下の反応を触媒することを特徴とする合成高分子ポ
リマーを提供する。
【００１１】さらに本発明は、０００９および００１０
において、環状アミド化合物が以下の構造（クレアチニ
ン）を有することを特徴とする環状アミド化合物を基質
として、加水分解反応を触媒することを特徴とする合成
高分子ポリマーを提供する。
【００１２】また、本発明は０００９および００１０に
おいて、環状アミド化合物が以下の構造（ヒダントイ
ン）を有することを特徴とする環状アミド化合物を基質
として、加水分解反応を触媒することを特徴とする合成
高分子ポリマーを提供する。
【００１３】本発明は上記記載のポリマーにおいてイミ
ダゾール、特に４−（５）−ビニルイミダゾールを含む
化合物を用いて合成して得られるポリマーを提供する。
【００１４】さらに本発明は上記記載のポリマーにおい
て遷移金属を含むことを特徴とするポリマーを提供す
る。
【００１５】また本発明は上記ポリマーにおいてメチル
メタアクリレートを含むことを特徴とするポリマーを提
供する。
【００１６】さらに本発明は上記記載のポリマーにおい
て架橋試薬を用いて合成されたポリマーを提供する。
【００１７】また本発明は上記記載のポリマーにおいて
架橋試薬がジビニルベンゼンであることを特徴とするポ
リマーを提供する。
【００１８】さらに本発明は上記記載のポリマーにおい
て遷移金属として亜鉛あるいはコバルトを含むことを特
徴とするポリマーを提供する。
【００１９】本発明はまた、上記記載のポリマーにおい
て鋳型分子を重合時に添加し合成されることを特徴する
ポリマーを提供する。
【００２０】本発明は００１９記載のポリマーにおい
て、重合後、鋳型分子が取り除かれて調製されることを
特徴とするポリマーを提供する。
【００２１】本発明はさらに、００１９から００２０記
載のポリマーにおいて鋳型分子がクレアチニンであるこ
とを特徴とするポリマーを提供する。
【００２２】本発明は００１９から００２０記載のポリ
マーにおいて鋳型分子がヒダントインであることを特徴
とするポリマーを提供する。
【００２３】本発明はクレアチニンの測定方法であり、
上記０００８から００２１に記載されたポリマーと反応
させた結果生じる化合物を計測することを特徴とするク
レアチニンの測定方法を提供する。
【００２４】本発明はまた、００２３記載の方法におい
て生じる化合物としてクレアチンを測定することを特徴
とするクレアチニンの測定方法を提供する。
【００２５】さらに本発明は００２３記載の方法におい
て生じる化合物として尿素を計測することを特徴とする
クレアチニンの測定方法を提供する。
【００２６】本発明はまた、００２３記載の方法におい
て生じる化合物としてサルコシンを計測することを特徴
とするクレアチニンの測定方法を提供する。
【００２７】さらに本発明は００２６記載の方法におい
てサルコシンの計測に酵素サルコシン酸化酵素を用いる
ことを特徴とするクレアチニンの測定方法を提供する。
【００２８】すなわち本発明は００２３から００２７記
載の方法を含むクレアチニン測定キットを提供する。
【００２９】さらに本発明は００２３から００２８記載
の方法においてクレアチニンの加水分解か起った結果を
電気化学的手法により計測することを特徴とするクレア
チニンの測定方法を提供する。
【００３０】また本発明は００２９記載の方法を含むク
レアチニンセンサーを提供する。
【００３１】さらに本発明はクレアチンを上記００８か
ら００２１記載のポリマーを触媒として反応させ、生じ
た化合物を計測することを特徴とするクレアチンの測定
方法を提供する。
【００３２】また、本発明は００３１記載の方法におい
て生じる化合物として尿素を計測することを特徴とする
クレアチンの測定方法を特徴とする。
【００３３】本発明は００３１記載の方法において生じ
る化合物としてサルコシンを計測することを特徴とする
クレアチンの測定方法である。
【００３４】本発明はまた、上記００３３記載の方法に
おいてサルコシンの計測に酵素サルコシン酸化酵素を用
いることを特徴とするクレアチンの測定方法を提供す
る。
【００３５】さらに、本発明は上記００３１から００３
４記載の方法を含むクレアチン測定キットを提供する。
【００３６】また、本発明は上記００３１から００３４
記載の方法においてクレアチンの加水分解か起った結果
を電気化学的手法により計測することを特徴とするクレ
アチンの測定方法を提供する。
【００３７】本発明は上記００３６記載の方法を含むク
レアチンセンサーを特徴とする。
【００３８】
【発明の実施の形態】本発明の環状アミド化合物と結合
し、その加水分解反応を触媒する能力を有するポリマー
はビニルイミダゾールの重合、あるいはビニルイミダゾ
ール基およびメチルメタアクリレートの共重合、あるい
はビニルイミダゾールに遷移金属が配位した状態で合成
されたポリマー、あるいはメチルメタアクリレートとビ
ニルイミダゾールに遷移金属が配位した状態として合成
される。このようなポリマーを合成するためにはモノマ
ーとして例えば（４）−５ビニルイミダゾールがある
が、イミダゾール基を有するモノマーであれば限定され
るものではない。また、遷移金属としてはコバルトや亜
鉛などが使えるが、遷移金属であればこれらに限定され
るものではない。さらに、このようにして作成されるポ
リマーの組成にアクリル酸、アクリルアミドなどのほか
の重合可能なモノマーを混在させ、同時に重合してもよ
い。
【００３９】また本発明のポリマーを架橋することによ
り安定なポリマーが合成される。例えばジビニルベンゼ
ンやＥＧＤＭＡをポリマー重合時に添加することにより
該ポリマーが合成できる。
【００４０】さらに上記架橋時に分子認識の対象となる
鋳型分子を混合させておくことにより、合成されたポリ
マーに高い分子認識機能を付与することが可能となる。
例えば、（４）−５ビニルイミダゾールにコバルトが配
位した状態でメチルメタアタリレートを混合し、架橋剤
としてジビニルベンセンを加えラジカル重合を開始する
際に、環状アミド化合物の１つであるクレアチニンを添
加して重合することにより、得られるポリマーのクレア
チニン加水分解機能は鋳型分子を混合せずに合成したポ
リマー（コントロールポリマー）に比べ１．５倍以上、
好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上となる。
さらに該ポリマーはクレアチンの加水分解能力を示し、
その結果として尿素とサルコシンを生成する。
【００４１】また架橋時に分子認識の対象となる鋳型分
子としてヒダントインを混合させておくことにより、合
成されたポリマーにヒダントインに対する高い分子認識
機能を付与することが可能となる。例えば、（４）−５
ビニルイミダゾールにコバルトが配位した状態でメチル
メタアクリレートを混合し、架橋剤としてジビニルベン
センを加えラジカル重合を開始する際に、環状アミド化
合物の１つであるヒダントインを添加して重合すること
により、得られるポリマーのヒダントイン加水分解機能
は鋳型分子を混合せずに合成したポリマー（コントロー
ルポリマー）に比べ１．５倍以上、好ましくは２倍以
上、より好ましくは３倍以上となる。
【００４５】このようにして各鋳型化合物を用いて合成
されたポリマーはそれぞれの鋳型に対して選択性を示
す。すなわち、該ポリマーをクレアチニンを鋳型として
００４０記載の方法にしたがって合成された場合は、そ
のポリマーはクレアチニンの加水分解反応を触媒し、こ
れはコントロールポリマーの比べ１．５倍以上、好まし
くは２倍以上、より好ましくは３倍以上となるが、ヒダ
ントインの加水分解反応を触媒する能力はコントロール
ポリマーと同レベルである。これに対して、該ポリマー
をヒダントインを鋳型として００４１記載の方法にした
がって合成された場合は、そのポリマーはヒダントイン
の加水分解を触媒し、これはコントロールポリマーの比
べ１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは
３倍以上となるが、クレアチニンの加水分解反応を触媒
する能力はコントロールポリマーと同レベルである。
【００４６】本発明におけるクレアチニンを測定する方
法は、クレアチニンをこのようにして合成されたポリマ
ーと作用させることにより達成される。
【００４７】（４）−５ビニルイミダゾールにコバルト
が配位した状態でメチルメタアクリレートを混合し、架
橋剤としてジビニルベンセンを加えラジカル重合を開始
する際に、環状アミド化合物の１つであるクレアチニン
を添加して重合することにより、得られるポリマーを触
媒とし、基質としてクレアチニンを用いたとき、時間と
ともにクレアチニンが加水分解される。この過程は生成
されるクレアチンを測定することで観測される。このク
レアチンの生成速度を指標にクレアチニンの濃度を測定
できる。クレアチンの検出方法としては反応試料を液体
クロマトグラフィーで測定する方法、あるいはクレアチ
ンをダイアセチル／１−ナフトール複合体と反応させる
ことにより生成する５２０ｎｍに特徴的な吸収波長を有
する色素を計測することにより行える。すなわち、本発
明のポリマーを触媒とし、未知濃度のクレアチニンを１
ｍＭ以下の感度で定量できる。
【００４８】また、（４）−５ビニルイミダゾールにコ
バルトが配位した状態でメチルメタアクリレートを混合
し、架橋剤としてジビニルベンセンを加えラジカル重合
を開始する際に、環状アミド化合物の１つであるクレア
チニンを添加して重合することにより、得られるポリマ
ーを触媒とし、基質としてクレアチニンを用いたとき、
時間とともにクレアチニンが加水分解されクレアチンが
生成するが、さらに該ポリマーはクレアチンの加水分解
反応も触媒し、尿素およびサルコシンを生成する。この
過程は生成される尿素およびサルコシンを測定すること
により観測される。尿素の測定は方法としては酵素ウレ
アーゼを用いる一般的な生化学分析法あるいはパラジメ
チルアミノベンズアルデヒド（ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＤＡＢ）が利用
できる。またサルコシンの測定方法は酵素サルコシン酸
化酵素を用いて、生成するか酸化水素を発色法あるいは
電気化学法により検出する方法が利用できる。
【００４９】この尿素あるいはサルコシンの生成速度を
指標にクレアチニンの濃度を測定できる。すなわち、本
発明のポリマーを触媒とし、未知濃度のクレアチニンを
１ｍＭ以下の感度で定量できる。
【００５０】サルコシンの濃度をサルコシン酸化酵素の
反応を計測することにより測定できることから、クレア
チニンの濃度をアンペロメトリックに測定する原理を提
供できる。すなわち、該ポリマーおよび酵素サルコシン
酸化酵素を電極に固定し、クレアチニンの加水分解、そ
の反応によって生じるクレアチンが引き続き加水分解さ
れることによって生じるサルコシンが酸化酵素によって
酸化され生じる過酸化水素、あるいは消費する酸素を電
気化学的に検出することができる。
【００５１】また、サルコシンの酵素酸化においてサル
コシン酸化酵素の還元された補酵素を適当な電子メディ
エーターを用いて再酸化し、その際に還元された電子メ
ディエーターを電気化学的に測定することによっても検
出できる。
【００５２】このような電極としては金電極、白金電極
あるいは炭素電極などが利用できる。さらに電子受容体
としてはフェナジンメトサルフェート、各種フォルマザ
ン色素誘導体、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘
導体、オスミウム誘導体などが利用できる。
【００５３】さらに該ポリマーがクレアチンの加水分解
反応を触媒することを利用して、生成する尿素およびサ
ルコシンを上記と同様の方法を用いることにより、クレ
アチンの濃度を計測することができる。
【００５４】アッセイキット 別の観点においては、本発明は、本発明のポリマーを用
いた測定方法を含むクレアチニンあるいはクレアチンの
測定キットを特徴とする。本発明のクレアチンあるいは
クレアチニン測定キットは、本発明に従う（４）−５ビ
ニルイミダゾールにコバルトが配位した状態でメチルメ
タアクリレートを混合し、架橋剤としてジビニルベンセ
ンを加えラジカル重合を開始する際に、環状アミド化合
物の１つであるクレアチニンを添加して重合することに
より、得られるポリマーを触媒として備えた反応液を少
なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的に
は、クレアチニン測定キットは、該ポリマーとｐＨ６．
０〜１０に調整された緩衝液、ダイアセチル／１−ナフ
トール複合体、キャリブレーションカーブ作製のための
クレアチニンの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。
【００５５】また別の観点からは、クレアチニン測定キ
ットは、該ポリマーとｐＨ６．０〜１０に調整された緩
衝液、尿素検出用ウレアーゼならびに発色試薬、キャリ
ブレーションカーブ作製のためのクレアチニンの標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。
【００５６】また別の観点からは、クレアチニン測定キ
ットは、該ポリマーとｐＨ６．０〜１０に調整された緩
衝液、サルコシン検出用サルコシンオキシダーゼならび
に発色試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのク
レアチニンの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。
【００５７】また別の観点からは、クレアチン測定キッ
トは、該ポリマーとｐＨ６．０〜１０に調整された緩衝
液、尿素検出用ウレアーゼならびに発色試薬、キャリブ
レーションカーブ作製のためのクレアチンの標準溶液、
ならびに使用の指針を含む。
【００５８】また別の観点からは、クレアチン測定キッ
トは、該ポリマーとｐＨ６．０〜１０に調整された緩衝
液、サルコシン検出用サルコシンオキシダーゼならびに
発色試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのクレ
アチンの標準溶液、ならびに使用の指針を含む。
【００５９】本発明に従うクレアチニンあるいはクレア
チン分析キットは種々の形態で、例えば凍結乾燥された
試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供
することができる。
【００６０】センサー 別の観点においては、本発明は、クレアチニンあるいは
クレアチン計測用センサーを特徴とする。本発明に従う
（４）−５ビニルイミダゾールにコバルトが配位した状
態でメチルメタアクリレートを混合し、架橋剤としてジ
ビニルベンセンを加えラジカル重合を開始する際に、環
状アミド化合物の１つであるクレアチニンを添加して重
合することにより、得られるポリマーが基質の加水分解
反応を触媒し、生じるサルコシンがさらに電極上に固定
化されているサルコシン酸化酵素によって酸化される。
このときにメディエータが還元され、還元されたメディ
エータを電極上で電気化学的に酸化し、得られた電流値
を指標に基質の濃度を決定することができる。電極とし
ては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、こ
の電極上に本発明の一般塩基触媒を固定化する。固定化
方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリッ
クス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋
性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどが
あり、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００６１】本発明の測定原理に従い、以下のようにク
レアチニンあるいはクレアチン計測用センサーが構築で
きる。
【００６２】カーボン電極、金電極、白金電極などを用
いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電
極として環状アミド化合物と結合し、該物質の加水分解
を触媒するポリマーならびにサルコシン酸化酵素を固定
化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照
電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、メディエ
ーターを含む緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。
作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて電流の増
加値を測定する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナ
ジンメトサルフェートなどを用いることができる。
【００６３】さらにカーボン電極、金電極、白金電極な
どを用いてアンペロメトリック系で測定する方法とし
て、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわ
ち、作用電極として環状アミド化合物と結合し、該物質
の加水分解を触媒するポリマーならびにサルコシン酸化
酵素をおよびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オ
スミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電
子メディエータを吸着あるいは共有結合法により高分子
マトリックスに固定化したこれらの電極を用い、対極
（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／Ａｇ
Ｃｌ電極）とともに、緩衝液中に挿入して一定温度に保
持する。作用電極に一定の電圧を印加し、試料を加えて
電流の増加値を測定する。
【００６４】いずれの電極を用いる場合にも、標準濃度
のクレアチニンあるいはクレアチン溶液により作製した
キャリブレーションカーブに従い、試料中のクレアチニ
ンあるいはクレアチン濃度を求めることができる。
【００６５】以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【００６６】実施例１ クレアチニン加水分解能力を有するモレキュラーインプ
リンティングカタリスト（ＭＩＣ；ＣＴ４）は以下のよ
うにして調製した。１．１２５ ｍｍｏｌのＣｏＣｌ２
と２．５ｍｍｏｌの４，（５）−−ビニルイミダゾール
を４ｍｌのアセトニトリル水溶液（９：１）に懸濁し
た。ここへ０．１８８ｍｍｏｌのクレアチニンならびに
１．２５ｍｍｏｌのメチルメタアクリレートを添加し、
この混合物を１晩冷蔵庫にて４℃で保管した。その後に
架橋剤として２１ｍｍｏｌのジビニルベンジル、重合開
始剤としてアゾビスジメチルバレニトリルを０．２５ｍ
ｍｏｌ添加した。ポリマーの重合はアルゴンガスで５分
間パージした後で、３６６ｎｍの紫外線を４℃で一晩照
射することにより行った。ポリマーは重合した後、破砕
し、これを篩いにかけ、１０−２５μｍの粒子を収集し
た。 このようにして調製したＭＩＣは３０ｍｌの１０
０ｍＭの２，２’−ビピリジルメタノール溶液で８時
間、３０ｍｌのメタノール溶液で３０分３回、３０ｍｌ
の１００ｍＭ ＣｏＣｌ２のメタノール溶液ならびに３
０ｍｌのメタノール溶液でおのおの３０分間３回洗浄
し、鋳型であるクレアチニンをポリマーから除去した。
さらに４５℃で乾燥した後に反応に用いた。また、遷移
金属として亜鉛を用いる場合には、１．１２５ ｍｍｏ
ｌのＺｎＣｌ２をＣｏＣｌ２の代わりに用いた（ＣＴ
３）。また機能性モノマーとして１ビニルイミダゾール
を用いるときには、２．５ｍｍｏｌの１ビニルイミダゾ
ールを４，（５）−−ビニルイミダゾールを用いた。そ
のときに遷移金属として亜鉛を用いたときに合成された
ポリマーをＣＴ１とした。また、コントロールポリマー
は上記と同じポリマーの合成方法において鋳型分子であ
るクレアチニンを加えないで合成したポリマーである。
【００６７】実施例２ クレアチニンの加水分解反応は以下のようにして行っ
た。実施例１において合成した２０ｍｇのモレキュラー
インプリンティングカタリストポリマーあるいはコント
ロールポリマーを５００μｌのアセトニトリルならびに
４．５ｍｌの１１１ｍＭクレアチニンのＴｒｉｓＨＣｌ
ｐＨ７．０、５０ｍＭ緩衝液と混合し、３７℃で反応
させた。その反応溶液から一定時間おきに１００μｌ採
取し、これを試料として以下のように逆相液体クロマト
グラフィーにより生成されるクレアチン量を測定した。
逆相液体クロマトグラフィーはＭｉｇｈｔｙｓｌ ＲＰ
１８カラム（４．６ｍｍ ｘ ２００ｍｍ）に対して、
水を溶媒として、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで運転し、紫
外吸収２２０ｎｍを記録した。標準クレアチン溶液によ
り、ここに現れるピークを帰属、また定量することによ
り、生成されるクレアチン量を測定した。その結果、ク
レアチニンを鋳型としてポリマーを合成した場合、ＣＴ
１（図１），ＣＴ３（図２），ＣＴ４（図３）のいずれ
の場合もクレアチニンを鋳型として用いないで合成した
ポリマーよりもクレアチニンの加水分解反応が見られ
た。またその効果は遷移金属としてコバルトを用いた場
合がもっとも高い反応速度を示した（図４）。さらにモ
ノマーとしては４，（５）−−ビニルイミダゾールを用
いた場合にもっとも高いクレアチニンの加水分解速度が
達成された。さらにＣＴ４による加水分解反応はクレア
チニンに選択的であることがしめされた。図５に示すよ
うに、クレアチニンを鋳型として合成されたポリマーは
ヒダントインに対してはほとんど加水分解能力をしめさ
なかった。
【００６８】実施例３ クレアチニンの測定方法１ クレアチニンの濃度測定は種々の原理が考えられるが、
その中の一つである生成するクレアチンを発色法により
定量した結果を示す（図６）。実施例１において合成し
た４０ｍｇのモレキュラーインプリンティングカタリス
トポリマーあるいはコントロールポリマーを１ｍｌのア
セトニトリルならびに９ｍｌの種々の濃度（０．０５−
３ｍＭ）のクレアチニンのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．０
５０ｍＭ緩衝液と混合し、３７℃で反応させた。その
反応溶液から一定時間おきに５０μｌ採取し、これを試
料とした。この試料を遠心分離し上清２００μｌを発色
法による分析に供した。５０μｌのこの試料と２５０μ
ｌのジアセチル−１−ナフトール溶液（２５ｍｌ５５．
５ｍＭ １−ナフトールと３ｍｌのｘｘ ｍＭダイアセ
チル水溶液と１１ｍｌの蒸留水を混合して作成する）と
混合し、生成する色素を分光光度計において特徴的な５
２０ｎｍの吸収を測定することにより求めた。これをク
レアチンの標準試料と比較することにより、クレアチニ
ンの加水分解により生成するクレアチンを測定すること
により、クレアチニンを測定した。この結果、５０μＭ
から３．０ｍＭまで測定が可能であった。また、本方法
においてポリマーを添加しない測定を行いあらかじめ存
在するクレアチンの測定もおこなえることから、クレア
チンとクレアチニンの混合物におけるクレアチニンの濃
度測定も行える。
【００６９】実施例４ 実施例１で作成したポリマーによるクレアチニンの加水
分解反応と尿素の検出 実施例１において合成した２０ｍｇのモレキュラーイン
プリンティングカタリストポリマーあるいはコントロー
ルポリマーを５００μｌのアセトニトリルならびに４．
５ｍｌの１１１ｍ ＭクレアチニンのＴｈｒｉｓＨＣｌ
ｐＨ７．０、５０ｍＭ緩衝液と混合し、３７℃で反応
させた。その反応溶液から一定時間おきに１００μｌ採
取し、この試料０．１ｍｌをパラジメチルアミノベンズ
アルデヒド（ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚ
ａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＤＡＢ）溶液（２．０ｇＤＡＢを
１００ｍｌＤＭＳＯ，１５ｍｌ濃塩酸で溶解したもの）
０．２ｍｌと混合し、２５℃２０分反応したのち、生成
する色素を４３５ｎｍの特異的な吸収波長を検出する。
これを既知濃度の尿素試料と比較することで尿度濃度を
もとめる。このようにして、尿素濃度をもとめたとこ
ろ、このポリマーはクレアチニンを基質としたときに時
間とともに尿素を生成していることがわかった（図
７）。すなわち、このポリマーはクレアチンを加水分解
する能力があった。ここで生成する尿素を分析すること
により、クレアチニンを測定できる。
【００７０】実施例５ ヒダントイン加水分解能力を有するモレキュラーインプ
リンティングカタリスト（ＭＩＣ：Ｈ２）は以下のよう
にして調製した。１．１２５ ｍｍｏｌのＣｏＣｌ２と
２．５ｍｍｏｌの４，（５）−−ビニルイミダゾールを
４ｍｌのアセトニトリル水溶液（９：１）に懸濁した。
ここへ０．１８８ｍｍｏｌのヒダントインならびに１．
２５ｍｍｏｌのメチルメタアクリレートを添加し、この
混合物を１晩冷蔵庫にて４℃で保管した。その後に架橋
剤として２１ｍｍｏｌのジビニルベンジル、重合開始剤
としてアゾビスジメチルバレニトリルを０．２５ｍｍｏ
ｌ添加した。ポリマーの重合はアルゴンガスで５分間パ
ージした後で、３６６ｎｍの紫外線を４℃で一晩照射す
ることにより行った。ポリマーは重合した後、破砕し、
これを篩いにかけ、１０−２５μｍの粒子を収集した。
このようにして調製したＭＩＣは３０ｍｌの１００ｍ
Ｍの２，２’−ビピリジルメタノール溶液で８時間、３
０ｍｌのメタノール溶液で３０分３回、３０ｍｌの１０
０ｍＭ ＣｏＣｌ２のメタノール溶液ならびに３０ｍｌ
のメタノール溶液でおのおの３０分間３回洗浄し、鋳型
であるヒダントインをポリマーから除去した。さらに４
５℃で乾燥した後に反応に用いた。また、遷移金属とし
て亜鉛を用いる場合には、１．１２５ ｍｍｏｌのＺｎ
Ｃｌ２をＣｏＣｌ２の代わりに用いた（Ｈ１）。また機
能性モノマーとして１ビニルイミダゾールを用いるとき
には、２．５ｍｍｏｌの１ビニルイミダゾールを４，
（５）−−ビニルイミダゾールを用いた。そのときに遷
移金属として亜鉛を用いたときに合成されたポリマーを
Ｈ３とした。また、コントロールポリマーは上記と同じ
ポリマーの合成方法においてそれぞれ鋳型分子であるヒ
ダントインを加えないで合成したポリマーである。
【００７１】実施例６ ヒダントインの加水分解反応は以下のようにして行っ
た。実施例ｘｘにおいて合成した２０ｍｇのモレキュラ
ーインプリンティングカタリストポリマーあるいはコン
トロールポリマーを５００μｌのアセトニトリルならび
に４．５ｍｌの１１１ｍＭヒダントインのＴｒｉｓＨＣ
ｌ ｐＨ８．５、１００ｍＭ緩衝液と混合し、３７℃で
反応させた。その反応溶液から一定時間おきに２００μ
ｌ採取し、これを試料として以下のように液体クロマト
グラフィーにより生成されるｈｙｄａｎｔｏｉｃ ａｃ
ｉｄを測定した。液体クロマトグラフィーはＴＳＫ−Ｇ
ＥＬ１２０Ｔカラム（４．６ｍｍ ｘ ２００ｍｍ）に
対して、水を溶媒として、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで運
転し、紫外吸収２２０ｎｍを記録した。標準ｈｙｄａｎ
ｔｏｉｃ ａｃｉｄ溶液により、ここに現れるピークを
帰属、また定量することにより、生成されるｈｙｄａｎ
ｔｏｉｃ ａｃｉｄ量を測定した。その結果、ヒダント
インを鋳型としてポリマーを合成した場合、Ｈ１（図
８），Ｈ２（図９），Ｈ３（図１０）のいずれの場合も
ヒダントインを鋳型として用いないで合成したポリマー
よりもヒダントインの加水分解反応が見られた。またそ
の効果は遷移金属としてコバルトを用いた場合がもっと
も高い反応速度を示した（Ｈ１，Ｈ２）。さらにモノマ
ーとしては４，（５）−−ビニルイミダゾールを用いた
場合にもっとも高いヒダントインの加水分解速度が達成
された（Ｈ１，Ｈ２）（図１１）。さらにＨ２による加
水分解反応はヒダントインに選択的であることがしめさ
れた。すなわち図１２に示すように、ヒダントインを鋳
型として合成されたポリマーはクレアチニンに対しては
ほとんど加水分解能力をしめさなかった。１２０Ｔカラ
ム（４．６ｍｍ ｘ ２００ｍｍ）に対して、水を溶媒
として、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで運転し、紫外吸収２
２０ｎｍを記録した。標準ｈｙｄａｎｔｏｉｃ ａｃｉ
ｄ溶液により、ここに現れるピークを帰属、また定量す
ることにより、生成されるｈｙｄａｎｔｏｉｃ ａｃｉ
ｄ量を測定した。その結果、ヒダントインを鋳型として
ポリマーを合成した場合、Ｈ１（図８），Ｈ２（図
９），Ｈ３（図１０）のいずれの場合もヒダントインを
鋳型として用いないで合成したポリマーよりもヒダント
インの加水分解反応が見られた。またその効果は遷移金
属としてコバルトを用いた場合がもっとも高い反応速度
を示した（Ｈ１，Ｈ２）。さらにモノマーとしては４，
（５）−−ビニルイミダゾールを用いた場合にもっとも
高いヒダントインの加水分解速度が達成された（Ｈ１，
Ｈ２）（図１１）。さらにＨ２による加水分解反応はヒ
ダントインに選択的であることがしめされた。すなわち
図１２に示すように、ヒダントインを鋳型として合成さ
れたポリマーはクレアチニンに対してはほとんど加水分
解能力をしめさなかった。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１で合成されたポリマーＣＴ１のクレアチ
ニン加水分解能力を評価した図である。図２は実施例１
で合成されたポリマーＣＴ３のクレアチニン加水分解能
力を評価した図である。図３は実施例１で合成されたポ
リマーＣＴ４のクレアチニン加水分解能力を評価した図
である。図４は実施例１で合成されたＣＴ１，ＣＴ３．
ＣＴ４のクレアチニン加水分解能力を比較した図であ
る。図５は実施例１で合成されたＣＴ４の基質特異性を
評価した図である。図６は実施例１で合成されたＣＴ４
を用いて実施例３に従いクレアチニンを測定した図であ
る。図７は実施例１で合成されたＣＴ４を用いて実施例
４に従いクレアチンの加水分解、ならびに生じたクレア
チンの該ポリマーによる加水分解反応を触媒することに
伴う尿素の生成を測定した図である。図８は実施例５に
従い合成されたＨ１によるヒダントインの加水分解能力
を評価した図である。図９は実施例５に従い合成された
Ｈ２によるヒダントインの加水分解能力を評価した図で
ある。図１０実施例５に従い合成されたＨ３によるヒダ
ントインの加水分解能力を評価した図である。図１１は
実施例５に従い合成されたＨ１，Ｈ２，Ｈ３によるヒダ
ントインの加水分解能力を比較した図である。図１２は
実施例５に従い合成されたＨ２の基質特異性を評価した
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 33/70 27/416 27/30 ３５１ 33/70 ３５３Ｄ ３５３Ｒ 27/46 ３３６Ｊ (72)発明者 山崎 智彦 東京都目黒区上目黒３−42−32 (72)発明者 孟 子暉 東京都小金井市中町２−24−16 小金井国 際交流会館106 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BB52 DA42 FB01 FB05 FB06 FB11 GC10 GC20 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ80 QQ84 QR03 QS39 QX04 4G069 AA02 AA08 BA22A BA22B BC29A BC35B BC67B BE13A BE13B BE38A BE38B CB35 DA08 EA01Y FA01 4J100 AL03Q AQ19P BC73P CA01 CA04 CA31 HA53 HB16 HB29 HC01 JA15 JA50

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】環状アミド化合物を基質として、そのＣ−
    Ｎ結合に作用し、加水分解反応を触媒することを特徴と
    する合成高分子ポリマー。
  2. 【請求項２】請求項１記載のポリマーにおいて環状アミ
    ド化合物が以下の構造で示される環状アミド化合物を基
    質として、そのＣ−Ｎ結合に作用し、加水分解反応を触
    媒することを特徴とする合成高分子ポリマー。
  3. 【請求項３】請求項１および２記載のポリマーにおいて
    以下の反応を触媒することを特徴とする合成高分子ポリ
    マー。
  4. 【請求項４】請求項２および３において、環状アミド化
    合物が以下の構造（クレアチニン）を有することを特徴
    とする環状アミド化合物を基質として、加水分解反応を
    触媒することを特徴とする合成高分子ポリマー。
  5. 【請求項５】請求項２および３において、環状アミド化
    合物が以下の構造（ヒダントイン）を有することを特徴
    とする環状アミド化合物を基質として、加水分解反応を
    触媒することを特徴とする合成高分子ポリマー。
  6. 【請求項６】請求項１から５記載のポリマーにおいてイ
    ミダゾールを含む化合物を合成して得られるポリマー。
  7. 【請求項７】請求項１から５記載のポリマーにおいて
    （４）−５−ビニルイミダゾールを含む化合物を用いて
    合成して得られるポリマー。
  8. 【請求項８】請求項１から７の記載のポリマーにおいて
    遷移金属を含むことを特徴とするポリマー。
  9. 【請求項９】請求項１から８記載のポリマーにおいてメ
    チルメタアクリレートを含むことを特徴とするポリマ
    ー。
  10. 【請求項１０】請求項１から９記載のポリマーにおいて
    架橋試薬を用いて合成されたポリマー。
  11. 【請求項１１】請求項１から１０記載のポリマーにおい
    て架橋試薬がジビニルベンゼンであることを特徴とする
    ポリマー。
  12. 【請求項１２】請求項１から１１記載のポリマーにおい
    て遷移金属としてコバルトを含むことを特徴とするポリ
    マー。
  13. 【請求項１３】請求項１から１２記載のポリマーにおい
    て鋳型分子を重合時に添加し合成されることを特徴する
    ポリマー。
  14. 【請求項１４】請求項１３記載のポリマーにおいて、重
    合後、鋳型分子が取り除かれて調製されることを特徴と
    するポリマー。
  15. 【請求項１５】請求項１３から１４記載のポリマーにお
    いて鋳型分子がクレアチニンであることを特徴とするポ
    リマー。
  16. 【請求項１６】請求項１３から１４記載のポリマーにお
    いて鋳型分子がヒダントインであることを特徴とするポ
    リマー。
  17. 【請求項１７】クレアチニンの測定方法であり、請求項
    １〜１５に記載されたポリマーと反応させた結果生じる
    化合物を計測することを特徴とするクレアチニンの測定
    方法。
  18. 【請求項１８】請求項１７記載の方法において生じる化
    合物としてクレアチンを測定することを特徴とするクレ
    アチニンの測定方法。
  19. 【請求項１９】請求項１７記載の方法において生じる化
    合物として尿素を計測することを特徴とするクレアチニ
    ンの測定方法。
  20. 【請求項２０】請求項１７記載の方法において生じる化
    合物としてサルコシンを計測することを特徴とするクレ
    アチニンの測定方法。
  21. 【請求項２１】請求項２０記載の方法においてサルコシ
    ンの計測に酵素サルコシン酸化酵素を用いることを特徴
    とするクレアチニンの測定方法。
  22. 【請求項２２】請求項１７〜２１記載の方法を含むクレ
    アチニン測定キット。
  23. 【請求項２３】請求項１７〜２２記載の方法においてク
    レアチニンの加水分解か起った結果を電気化学的手法に
    より計測することを特徴とするクレアチニンの測定方
    法。
  24. 【請求項２４】請求項２３記載の方法を含むクレアチニ
    ンセンサー。
  25. 【請求項２５】クレアチンを請求項１〜１５記載のポリ
    マーを触媒として反応させ、生じた化合物を計測するこ
    とを特徴とするクレアチンの測定方法。
  26. 【請求項２６】請求項２５記載の方法において生じる化
    合物として尿素を計測することを特徴とするクレアチン
    の測定方法。
  27. 【請求項２７】請求項２５記載の方法において生じる化
    合物としてサルコシンを計測することを特徴とするクレ
    アチンの測定方法。
  28. 【請求項２８】請求項２７記載の方法においてサルコシ
    ンの計測に酵素サルコシン酸化酵素を用いることを特徴
    とするクレアチンの測定方法。
  29. 【請求項２９】請求項２５〜２８記載の方法を含むクレ
    アチン測定キット。
  30. 【請求項３０】請求項２５〜２８記載の方法においてク
    レアチンの加水分解か起った結果を電気化学的手法によ
    り計測することを特徴とするクレアチンの測定方法。
  31. 【請求項３１】請求項３０記載の方法を含むクレアチン
    センサー。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009136497A1 (ja) 2008-05-09 2009-11-12 パナソニック株式会社 クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス及び測定装置、並びにそれらを用いた尿中塩分量の測定方法、測定デバイス及び測定装置
WO2009144881A1 (ja) 2008-05-16 2009-12-03 パナソニック株式会社 クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置
US8092720B2 (en) 2006-07-25 2012-01-10 National University Corporation Hokkaido University Polymer-supported metal complex catalyst
JP2013501108A (ja) * 2009-08-05 2013-01-10 モナシュ ユニバーシティ 分子インプリントポリマー、それらを製造するための方法およびそれらの使用
WO2024123469A3 (en) * 2022-12-07 2024-07-18 Massachusetts Institute Of Technology Evolving random heteropolymers towards catalytically active materials

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8092720B2 (en) 2006-07-25 2012-01-10 National University Corporation Hokkaido University Polymer-supported metal complex catalyst
WO2009136497A1 (ja) 2008-05-09 2009-11-12 パナソニック株式会社 クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス及び測定装置、並びにそれらを用いた尿中塩分量の測定方法、測定デバイス及び測定装置
US7879617B2 (en) 2008-05-09 2011-02-01 Panasonic Corporation Method, device and apparatus for measuring the concentration of creatinine, and method, device and apparatus for measuring the amount of salt in urine using the same
WO2009144881A1 (ja) 2008-05-16 2009-12-03 パナソニック株式会社 クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置、並びにそれらを用いた塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置
US7816145B2 (en) 2008-05-16 2010-10-19 Panasonic Corporation Method, device and apparatus for measuring the concentration of creatinine, and method, device and apparatus for measuring the amount of salt using the same
JP2013501108A (ja) * 2009-08-05 2013-01-10 モナシュ ユニバーシティ 分子インプリントポリマー、それらを製造するための方法およびそれらの使用
WO2024123469A3 (en) * 2022-12-07 2024-07-18 Massachusetts Institute Of Technology Evolving random heteropolymers towards catalytically active materials

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