JP4430134B2 - クレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス及び測定装置、並びにそれらを用いた尿中塩分量の測定方法、測定デバイス及び測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれるクレアチニンや塩分の定量を行うための測定方法、測定デバイス、及び測定装置に関する。

生物学的及び非生物学的サンプル中に含まれる僅かな量の物質の定性及び定量的な検出は、臨床検査、診断、分析、セルフケアなどにおいて日常的に行われている。

このような検出においては、一般にサンプル中に存在する被検知物質を、この被検知物質と特異的に反応する指示物質と反応させる。そして、反応の結果生じた反応生成物もしくは反応複合物を、比色法（吸光計測）、蛍光法、放射線測定法、化学発光法、電気化学法、インピーダンス法、質量変化法（ＱＣＭ）、屈折率変化法（ＳＰＲ）、熱レンズ効果検出法などで検出し、被検知物質の検出または定量を行う。被検知物質の検出または定量において用いられる一般的な指示物質の一つに、５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（化学式：Ｃ₁₄Ｈ₁₄Ｎ₂Ｏ₄Ｓ、以下、ＰＭＳと略称する）がある。特定の被検知物質との反応により還元されたＰＭＳを、電気化学法や比色法で検出することにより、被検知物質の検出や定量が行われている。

しかし、ＰＭＳは不安定であり、水溶液中において、光により容易に酸化される。そのため試薬溶液の保存が困難なことが知られている。この貯蔵時の問題を避けるために、ＰＭＳの誘導体である１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（化学式：Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₅Ｓ、以下、Ｍ−ＰＭＳと略称する）が開発された。Ｍ−ＰＭＳは、ＰＭＳの１位にメトキシ基が導入された化合物であり、光に対して非常に安定である。

一方、試料中に含まれるクレアチニン濃度の測定は、臨床化学や分析化学の分野において重要である。クレアチニンは筋肉の内在代謝の産物であるため、尿中のクレアチニン量は総筋肉質量を反映することが知られている。したがって、人間が一日に排泄する尿中のクレアチニン量は一般に個人ごとに一定であり、日間変動が無いといわれている。そのため、尿中のクレアチニン量は排泄される尿の濃淡の尺度として用いられることがある。また、尿中及び血中のクレアチニン量は尿毒症や腎機能の低下によって増減する。そのため、尿中または血中のクレアチニン量の測定により、尿毒症や腎機能の低下の有無を知ることができる。

クレアチニン濃度の測定方法としては、アルカリ性のピクリン酸溶液を用いたヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）反応に基づく方法が知られている。この方法においては、ピクリン酸がクレアチニンと反応することにより得られる橙赤色の生成物を分光学的に測定する（例えば、特許文献１参照）。

また、他のクレアチニン濃度測定方法として、クレアチニンと特異的に反応をする酵素を用いた方法が知られている。酵素を用いる方法としては、例えば、クレアチニンデイミナーゼを用いてクレアチニンを分解する方法がある。この方法では、クレアチニンの分解により生成するアンモニア量を、ｐＨや電位の変化などから測定することにより、クレアチニンの濃度を得ている（例えば、特許文献２参照）。

酵素を用いる他の方法として、下記の式（１）〜（３）の反応により、クレアチニン濃度を測定する方法がある。
クレアチニン＋水 → クレアチン （１）
クレアチン＋水 → サルコシン＋尿素 （２）
サルコシン＋水＋酸素 →
グリシン＋ホルムアルデヒド＋過酸化水素 （３）

式（１）〜（３）の反応を触媒する酵素として、それぞれ順にクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼ）、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）、及びサルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロゲナーゼが用いられる。ここで、クレアチニンの定量方法としては、例えば、ペルオキシダーゼとともにロイコ色素やトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）試薬を利用し、式（３）において生成した過酸化水素を呈色させて分光学的に定量する方法が用いられている（例えば、特許文献３参照）。また、他のクレアチニン定量方法として、式（３）において生成した過酸化水素を電極で電気化学的に酸化し、流れる電流からクレアチニンを定量する方法が用いられている（例えば、特許文献４及び５参照）。

また、酵素を用いるさらに他の方法として、式（１）及び式（２）の反応に加えて、式（３）の反応に代えて、サルコシンと電子伝達体との反応を用いてクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献６及び７参照）。

特許文献６には、基板上に少なくとも一対の作用極及び対極を備え、電極上または電極周辺の基板上で試薬溶液を乾燥させることにより試薬を固定化したクレアチニンバイオセンサが開示されている。試薬溶液は、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びフェリシアン化カリウム（電子伝達体）をｐＨ７〜８．５の緩衝液中に溶解させることにより得ている。また、緩衝液のｐＨが７未満または８．５を超えると、酵素活性が低下するため好ましくないことが開示されている。

特許文献７には、サルコシンオキシダーゼとともに、シクロデキストリンにより包摂されたメディエータ（電子伝達体）を用い、比色法または電気化学的検出方法によりクレアチニンを定量することが開示されている。具体的には、シクロデキストリンにより包摂されるメディエータの例として、α−ナフトキノン（１，４−ナフトキノン）が挙げられている。しかし、特許文献７では、メディエータがシクロデキストリンに包摂されていない状態では、酵素を用いたクレアチニンの測定に不適切であることが開示されている。

また、酵素を用いるさらに他の方法として、式（１）及び式（２）の反応に加えて、式（３）の反応に代えて、サルコシンとテトラゾリウム指示薬との反応を用いて分光学的にクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献８参照）。特許文献８には、クレアチニン定量用組成物として、クレアチニン加水分解酵素、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、テトラゾリウム指示薬であるチアゾリルブルー及びｐＨ７．５のリン酸カリウムからなる混合試薬を用いることが開示されている。

また、酵素を用いるさらに他の方法として、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ及びサルコシンデヒドロゲナーゼを用いて、クレアチニンをグリシンとホルムアルデヒドとに変えた後、生成したホルムアルデヒドを呈色剤により発色させ、その吸光度によりクレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献９参照）。特許文献９には、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ及び呈色剤に加えて、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液と、ホルムアルデヒドの生成を促す反応促進剤としてフェリシアン化カリウムとを用いることが開示されている。

また、酵素を用いるさらに他の方法として、クレアチニンの加水分解を触媒するポリマー、サルコシン酸化酵素及びメディエータを固定化した電極を用いて、クレアチニンを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１０参照）。特許文献１０には、メディエータとして、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）などを用いることができることが開示されている。

さらに他のクレアチニン濃度測定方法として、１，４−ナフトキノン−２−スルホン酸カリウムを用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１１、非特許文献１〜３参照）。

米国特許第３７０５０１３号明細書 特表２００１−５１２６９２号公報 特開昭６２−２５７４００号公報 特表２００３−５３３６７９号公報 米国特許第５４６６５７５号明細書 特開２００６−３４９４１２号公報 特開２００５−１１８０１４号公報 特開昭５５−０２３９９８号公報 特開昭５４−１５１０９５号公報 特開２００３−３２６１７２号公報 特開昭６３−０３３６６１号公報

サリバン、外１名、「クレアチニンの高特異的テスト」、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、１９５８年、第２３３巻、第２号、ｐ．５３０−５３４（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，"Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ"，１９５８，Ｖｏｌ．２３３，Ｎｏ．２，ｐ．５３０−５３４） ナラヤナン、外１名、「クレアチニン：レヴュー」、クリニカルケミストリー、１９８０年、第２６巻、第８号、ｐ．１１１９−１１２６（Ｎａｒａｙａｎａｎ，"Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ"，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．８，ｐ．１１１９−１１２６） クーパー、外１名、「４つの尿中クレアチニン測定方法の評価」、クリニカル ケミストリー、１９６１年、第７巻、第６号、ｐ．６６５−６７３（Ｃｏｏｐｅｒ，"Ａｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ"，１９６１，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．６，Ｐ．６６５−６７３）

しかしながら、上記従来の方法では、以下のような問題点があった。

特許文献１に記載の方法においては、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、セリン等のアミノ酸やタンパク質、グルコース等の糖、アセトン、ピリルビンなどの妨害成分の影響を受けるため、上記物質を含む試料、例えば尿や血液などの生体試料中においてクレアチニンを正確に定量することは困難である。例えば、アミノ酸やグルコース等の糖は、ピクリン酸と反応してしまう。

また、特許文献２に記載の方法においては、ｐＨや電位の変化が不安定であるため、クレアチニンを正確に定量することは困難である。

また、特許文献２〜１０に記載の方法においては、試料中に塩分等のイオン種や尿素が存在すると、酵素が変性することにより、酵素の活性が低下する。そのため、試料中に含まれるイオン種や尿素の濃度によって、反応速度にばらつきが生じる。したがって、イオン種や尿素を含む試料、例えば尿や血液などの生体試料中のクレアチニンを定量する際には、試料中に含まれるイオン種や尿素の濃度によって測定結果に誤差が生じる。

また、特許文献１１及び非特許文献１に記載されている１，４−ナフトキノン−２−スルホン酸カリウムを用いる方法については、非特許文献２及び３において、測定結果の再現性が非常に低いという問題が報告されている。

そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料中に含まれるクレアチニンを精度良く定量することができるクレアチニン濃度の測定方法、測定デバイス、及び測定装置を提供することを第１の目的とする。

また、本発明は、尿中に含まれる塩分を精度良く定量することができる塩分量の測定方法、測定デバイス、及び測定装置を提供することを第２の目的とする。

上記従来の問題を解決するために、本発明のクレアチニン濃度測定方法は、
（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンを含む試料と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬とを混合して、クレアチニンによって、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを還元させる工程、
（Ｂ）工程Ａにおいて還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
（Ｃ）工程Ｂにおいて測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。

本発明の塩分量測定方法は、
（ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、試料である尿と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬とを混合して、尿中に含まれるクレアチニンによって、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを還元させる工程、
（ｂ）工程ａにおいて還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する工程、
（ｃ）尿の電気特性を測定する工程、及び
（ｄ）工程ｂにおいて測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、工程ｃにおいて測定された電気特性とに基づいて、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める工程を含む。

本発明のクレアチニン濃度測定デバイスは、
上記クレアチニン濃度測定方法に用いられるデバイスであって、
クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
試料収容室と連通し、試料収容室内に試料を導入するための試料導入口と、
試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、
試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、を備える。

本発明の塩分量測定デバイスは、
上記塩分量測定方法に用いられるデバイスであって、
試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
第１の試料収容室と連通し、第１の試料収容室内に尿を導入するための第１の試料導入口と、
第１の試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、
尿を収容するための第２の試料収容室と、
第２の試料収容室と連通し、第２の試料収容室内に尿を導入するための第２の試料導入口と、
第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備える。

本発明のクレアチニン濃度測定装置は、
上記クレアチニン濃度測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
上記クレアチニン濃度測定デバイスの試料収容室内において、クレアチニンによって還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する測定部、及び
測定部において測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める演算部、を備える。

また、本発明の塩分量測定装置は、
上記塩分量測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
上記塩分量測定デバイスの第１の試料収容室内において、クレアチニンによって還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する第１の測定部、
上記塩分量測定デバイスの第２の試料収容室内において、尿の電気特性を測定する第２の測定部、及び
第１の測定部において測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、第２の測定部において測定された電気特性とに基づき、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める演算部、を備える。

なお、リン酸系緩衝剤の存在下では、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムは不安定である。そこで、リン酸系緩衝剤の存在下においてクレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとを反応させる場合、１価アニオンの電解質塩をリン酸系緩衝剤とともに用いることが好ましい。

本発明のクレアチニン濃度測定方法によれば、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、試料中に含まれるクレアチニンを精度良く定量することができる。

本発明の実施の形態１におけるクレアチニン濃度測定デバイスの構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態におけるクレアチニン濃度測定装置の外観を示す斜視図である。 同クレアチニン濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施の形態２におけるクレアチニン濃度測定デバイスの構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態におけるクレアチニン濃度測定装置の外観を示す斜視図である。 同クレアチニン濃度測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施の形態３における塩分量測定デバイスを第１の基板の第１の面側からみた構成を示す分解斜視図である。 同塩分量測定デバイスを第１の基板の第２の面側からみた構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態における塩分量測定装置の外観を示す斜視図である。 同塩分量測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施の形態４における塩分量測定デバイスを第１の基板の第１の面側からみた構成を示す分解斜視図である。 同塩分量測定デバイスを第１の基板の第２の面側からみた構成を示す分解斜視図である。 同実施の形態における塩分量測定装置の外観を示す斜視図である。 同塩分量測定装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施例１における試料中のクレアチニン濃度と測定された電流値との関係を示すグラフである。 本発明の実施例２における試料中のｐＨと測定された電流値との関係を示すグラフである。 本発明の実施例３におけるクレアチニン濃度が０ｍＭの試料について測定された吸光スペクトルの経時変化を示すグラフである。 同実施例におけるクレアチニン濃度が１０ｍＭの試料について測定された吸光スペクトルの経時変化を示すグラフである。 同実施例におけるクレアチニン添加から５分後に測定された波長５１０ｎｍにおける吸光度と試料中のクレアチニン濃度との関係を示すグラフである。 参考例１の試料及び基準試料について測定された酸化電流値の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例４において測定された電流値と試料中に含まれるクレアチニンの濃度との関係を示すグラフである。 参考例２において測定された１価アニオンの電解質塩としてメチル硫酸ナトリウムを用いた場合に得られたＣＶ値と、Ｍ−ＰＭＳ濃度及び電解質塩濃度の総和に対するリン酸緩衝剤濃度の比との関係を示すグラフである。 同参考例において測定された１価アニオンの電解質塩として硝酸ナトリウムを用いた場合に得られたＣＶ値と、Ｍ−ＰＭＳ濃度及び電解質塩濃度の総和に対するリン酸緩衝剤濃度の比との関係を示すグラフである。

本発明の発明者は、クレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとが直接的に反応することを新たに見出した。この反応においては、クレアチニンに作用する酵素（例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ）およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件にもかかわらず、クレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとが反応する。その結果、クレアチニン及び１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量が減少し、クレアチニンの酸化物と、還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとが生成する。

本発明は、上記の新たな知見に基づいてなされ、クレアチニン定量用試薬もしくは試薬組成物の有効成分として、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを用いることを特徴とする。１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムは、通常、塩の状態で存在する。例えば固体の状態では、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムはカウンターアニオンとともに塩を構成している。一方、溶液中では、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの塩は電離しており、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムは溶媒和したカチオンの状態で存在する。

本発明において用いる１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの塩としては、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムクロライド等が挙げられる。なかでも下記式（４）の構造式で表される１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（化学式：Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₅Ｓ、以下、Ｍ−ＰＭＳと略称する）が好ましい。

本発明のクレアチニン濃度測定方法は、
（Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンを含む試料と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬とを混合して、クレアチニンによって、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを還元させる工程、
（Ｂ）工程Ａにおいて還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
（Ｃ）工程Ｂにおいて測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。

この方法によると、従来の測定方法と異なり、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件において、クレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖などの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定方法よりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。

工程Ａにおいて、試料に緩衝剤を混合してもよい。

緩衝剤としては、リン酸系緩衝剤、クエン酸系緩衝剤、フタル酸系緩衝剤、酢酸系緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤などが挙げられる。
工程Ａでは、試料にリン酸系緩衝剤を混合することにより、試料のｐＨが５〜１０に調整されることが好ましく、６〜７に調整されることがより好ましい。

このようにすると、クレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとの直接反応（クレアチニンによる１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの還元）の速度が速くなるため、測定時間を短縮することができる。これに関しては図１６に言及している実施例と共に後に詳しく説明する。

リン酸系緩衝剤としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸、またはそれらの水和物などが挙げられる。

リン酸系緩衝剤は、リン酸水素塩とリン酸二水素塩とから構成されることが好ましく、リン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとから構成されることが、さらに好ましい。これらのリン酸塩が試料中に溶解することによって、試料のｐＨを６〜７の範囲内に容易に調整することができる。

工程Ａでは、試料におけるリン酸系緩衝剤の濃度（リン原子の濃度）が５〜１０００ｍＭであることが好ましく、５〜５００ｍＭであることが、さらに好ましい。本発明者は、リン酸系イオンの濃度の増加に伴い、クレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとの反応の速度が速くなることを見出した。リン酸系緩衝剤の濃度が５ｍＭ以上であれば、十分な反応速度が得られる。また、１０００ｍＭは、試料のｐＨを６〜７に調整する緩衝能を有するリン酸系緩衝剤の溶解度の上限である。

工程Ａにおいて、試料に１価アニオンの電解質塩を混合してもよい。試料中に１価アニオンが存在することにより、リン酸系緩衝剤の存在下であっても、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムが安定に存在するようになる。よって、再現性良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。

電解質塩における１価アニオンとしては、塩化物イオン、硝酸イオン及びメチル硫酸イオンからなる群から選択されるアニオンが挙げられる。

１価アニオンの電解質塩としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、メチル硫酸リチウム、メチル硫酸ナトリウム、メチル硫酸カリウム等が挙げられる。クレアチニン定量用試薬組成物は、これらの１価アニオンの電解質塩のうち、複数種の電解質塩を含んでいてもよい。

工程Ａでは、試料中における１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの濃度が１〜１００ｍＭであり、１価アニオンの濃度が５〜１０００ｍＭであることが好ましい。

工程Ａにおいて、試料中に含まれるリン酸系緩衝剤のモル濃度（リン原子のモル濃度）は、１価アニオンのモル濃度と１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェートのモル濃度との合計の２分の１以下であることが好ましい。

このようにすると、試料中において１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェートがより安定に存在するようになる。よって、試料中に含まれるクレアチニンをさらに再現性良く、定量することができる。
以上より、クレアチニン定量用試薬は、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムと、リン酸系緩衝剤と、１価アニオンの電解質塩とを含むクレアチニン定量用試薬組成物として用いることが好ましい。

試薬組成物中に含まれるリン酸系緩衝剤の量（リン原子のモル数）は、１価アニオンの電解質塩の量（１価アニオンのモル数）と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量（モル数）との合計の２分の１以下であることが好ましい。

還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を電気化学的に測定する場合、
例えば、工程Ｂは、
（Ｄ）試料に２つ以上の電極を接触させ、前記２つの電極間に電圧を印加する工程、及び
（Ｅ）前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する工程を含む。

また、工程Ｃは、
工程Ｅにおいて検出された電流値または電荷量に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。

このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を電気化学的に容易に求めることができる。

還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を光学的に測定する場合、
例えば、工程Ｂは、
（Ｆ）試料に入射光を照射する工程、及び
（Ｇ）試料を透過した透過光または試料において反射した反射光を検出する工程を含む。

また、工程Ｃは、
工程Ｇにおいて検出された透過光または反射光の強度に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める工程を含む。

このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を光学的に容易に求めることができる。

本発明の塩分量測定方法は、試料として尿を用い、上記のクレアチニン濃度測定方法の工程Ａ及びＢに加えて、下記の工程ｃ及びｄをさらに含む。

すなわち、本発明の塩分量測定方法は、
（ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、試料である尿と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬とを混合して、尿中に含まれるクレアチニンによって、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを還元させる工程、
（ｂ）工程ａにおいて還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
（ｃ）尿の電気特性を測定する工程、及び
（ｄ）工程ｂにおいて測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、工程ｃにおいて測定された電気特性とに基づいて、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める工程、を含む。

工程ｃは、工程ａの前、例えば工程ｂの後かつ工程ｄの前に行われることが好ましい。

クレアチニン定量用試薬が溶解していない尿の電気特性は、尿中に含まれる電解質の濃度を反映している。尿中に含まれる電解質の濃度は、尿中に含まれる塩分の濃度と相関がある。塩分等の成分は、水分摂取、発汗などの影響を受け、濃縮または希釈されて尿中に排泄される。随時尿は、昼間、夜間を問わず随時に採取された尿である。随時尿中に含まれる塩分等の尿中成分の濃度は、尿の濃縮および希釈の影響を受けて変動する。

一方、上述のように、クレアチニンは筋肉量に依存して産生される。よって、単位時間当たりの尿中へのクレアチニンの排泄量は一定であることが知られている。随時尿を用いた場合であっても、例えば、測定された尿中成分濃度のクレアチニン濃度に対する比（尿中成分／クレアチニン比）を求めることにより、尿の濃縮および希釈の影響を補正することができる。

工程ｂにおける測定値は、クレアチニン濃度を高精度かつ再現性良く反映している。工程ｃにおける電気特性は、塩分濃度を反映している。よって、本発明の塩分量測定方法では、尿の濃縮および希釈の影響が高精度かつ再現性良く補正される。そのため、尿中への塩分の排泄量を適切に反映する値を求めることができる。

ここで、尿の電気特性としては、抵抗、導電率、インピーダンス、入力された電流（または電圧）信号に対して出力される電圧（または電流）信号、入力された交流信号の位相と出力される交流信号の位相との位相差等が挙げられる。

工程ｄにおいて求められる尿中への塩分の排泄量を反映する値としては、クレアチニン単位量当たりの塩分量、単位時間（例えば１日）当たりの尿中塩分排泄量、単位時間（例えば１日）当たりの塩分摂取量等が挙げられる。

本発明のクレアチニン濃度測定デバイス（以下、測定デバイスＡとも称する）は、
クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
試料収容室と連通し、試料収容室内に試料を導入するための試料導入口と、
試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、を備え、上記のクレアチニン濃度測定方法に用いられる。

測定デバイスＡによると、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンと１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖、アセトンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。

測定デバイスＡは、試料収容室内にリン酸系緩衝剤等の緩衝剤を備えていてもよく、試料収容室内に１価アニオンの電解質塩をさらに備えていてもよい。試料収容室内に１価アニオンと、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムと、リン酸系緩衝剤とを共存させることにより、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムが安定に存在するようになる。そのため、再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。

測定デバイスＡは、試料収容室内に２つ以上の電極をさらに備えていてもよい。

このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を、電気化学的に容易に求めることができる。

測定デバイスＡは、試料収容室に形成された光学測定用の窓部をさらに備えていてもよい。

このようにすると、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を、光学的に容易に求めることができる。

本発明の塩分量測定デバイス（以下、測定デバイスＢとも称する）は、
試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
第１の試料収容室と連通し、第１の試料収容室内に尿を導入するための第１の試料導入口と、
第１の試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、
尿を収容するための第２の試料収容室と、
第２の試料収容室と連通し、第２の試料収容室内に尿を導入するための第２の試料導入口と、
第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備え、上記の塩分量測定方法に用いられる。

測定デバイスＢによると、クレアチニン濃度を精度良く反映している還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、塩分濃度を反映している尿の電気特性とを測定することができる。還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と電気特性とを用いることにより、尿の濃縮および希釈の影響が精度良く補正される。よって、尿中への塩分の排泄量を適切に反映する値を求めることができる。

測定デバイスＢは、第１の試料収容室内に２つ以上の電極をさらに備えていてもよい。

このようにすると、尿中への塩分の排泄量を適切に反映する値を、電気化学的に容易に求めることができる。

本発明のクレアチニン濃度測定装置（以下、測定装置Ａとも称する）は、
測定デバイスＡを取付けるための測定デバイス取付け部、
測定デバイスＡの試料収容室内において、クレアチニンによって還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する測定部、及び
測定部において測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量に基づき、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める演算部、を備える。

測定装置Ａによると、測定デバイスＡを用いて、電気化学的または光学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を高精度かつ再現性良く測定することができる。

試料収容室内において、還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を光学的に測定する場合、測定部は、例えば、測定デバイスＡの試料収容室内に入射する入射光を出射する光源、及び試料収容室内を透過した透過光または試料収容室内において反射した反射光を検出する受光器を有する。この場合、演算部は、受光器において検出された透過光または反射光の強度に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める。

この構成によると、測定デバイスＡを用いて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を、光学的に容易に求めることができる。

光源は、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムとクレアチニンとの反応に応じて吸収強度が変化する波長を含む光を出射する。光源としては、例えば、ＬＥＤ、レーザ等が挙げられる。

測定デバイスＡが、試料収容室内に２つ以上の電極をさらに備える場合、測定部は、例えば、前記２つの電極間に電圧を印加する電圧印加部、及び前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する検出部を有する。この場合、演算部は、検出部により検出された電流値または電荷量に基づいて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を求める。

この構成によると、測定デバイスＡを用いて、試料中に含まれるクレアチニンの濃度を、電気化学的に容易に求めることができる。

本発明の塩分量測定装置（以下、測定装置Ｂとも称する）は、
測定デバイスＢを取付けるための測定デバイス取付け部、
測定デバイスＢの第１の試料収容室内において、クレアチニンによって還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する第１の測定部、
測定デバイスＢの第２の試料収容室内において、尿の電気特性を測定する第２の測定部、及び
第１の測定部において測定された還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、第２の測定部において測定された電気特性とに基づき、尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める演算部、を備える。

測定装置Ｂによると、測定デバイスＢを用いて、電気化学的または光学的に尿中への塩分の排泄量を反映する値を高精度かつ再現性良く測定することができる。

第１の試料収容室内において、還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を光学的に測定する場合、測定部は、例えば、第１の試料収容室内に入射する入射光を出射する光源、及び第１の試料収容室内を透過した透過光または試料収容室内において反射した反射光を検出する受光器を有する。この場合、演算部は、受光器において検出された透過光または反射光の強度に基づいて、還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を求める。

この構成によると、測定デバイスＢを用いて、尿中への塩分の排泄量を反映する値を、光学的に容易に求めることができる。

測定デバイスＢが、第１の試料収容室内に２つ以上の電極をさらに備える場合、測定部は、例えば、前記２つの電極間に電圧を印加する電圧印加部、及び前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する検出部を有する。この場合、演算部は、検出部により検出された電流値または電荷量に基づいて、還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を求める。

この構成によると、測定デバイスＢを用いて、尿中への塩分の排泄量を反映する値を、電気化学的に容易に求めることができる。

試料としては、水溶液の他、血液、血清、血漿、尿、間質液、リンパ液、唾液などの体液が挙げられる。特に、尿は非侵襲的に在宅での日常の健康管理を行うためには非常に有効な試料である。これらの体液中のイオン種および尿素の濃度は比較的高いので、本発明の効果が非常に高く得られる。

本発明における２つ以上の電極の材料としては、金、白金、パラジウムあるいはそれらの合金または混合物、及びカーボンのいずれかを少なくとも含むことが好ましい。これらの材料は化学的および電気化学的に安定であり、安定した測定を実現することができる。第３の電極として、電位の安定した電極、例えばＡｇ／ＡｇＣｌや飽和カロメル電極等の参照電極を、上記２つの電極と組み合わせて使用してもよい。２つの電極のうち一方の電極の電位を第３の電極に対して規制すると、測定のための電位が安定するので好ましい。また、２つの電極のうち他方の電極として、例えばＡｇ／ＡｇＣｌや飽和カロメル電極等を用いても良い。

測定デバイスＡおよびＢにおいては、クレアチニン定量用試薬が乾燥状態で備えられ、試料収容室内に試料が導入されたときに試料に溶解するように配置されていることが好ましい。

測定デバイスＡおよびＢにおいては、Ｍ−ＰＭＳ、１価アニオンの電解質塩及びリン酸系緩衝剤が乾燥状態で備えられ、試料収容室内に試料が導入されたときに試料に溶解するように配置されていることが、特に好ましい。

例えば、ガラス繊維や濾紙等から構成される多孔性の担体に、クレアチニン定量用試薬を含む溶液を含浸させた後、乾燥させることにより、クレアチニン定量用試薬を上記担体に担持させる。そして、当該担体を試料と接する部分に設ければよい。また、測定デバイスにおける試料と接する部分の壁面に、クレアチニン定量用試薬を含む溶液を直接塗布した後、乾燥することにより、クレアチニン定量用試薬を当該壁面に配置してもよい。クレアチニン定量用試薬を含む溶液に緩衝剤や１価アニオンの電解質塩を含ませても良い。

測定デバイスＡおよびＢは、着脱可能な状態で測定装置ＡおよびＢの測定デバイス取付け部に取付けられることが好ましい。また、特に尿や血液などの生体液を用いる場合には衛生的な観点から、測定デバイスＡおよびＢは使い捨てであることが好ましい。
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。

（実施の形態１）
本発明の実施の形態１に係るクレアチニン濃度測定デバイス１００について、図１を用いて説明する。図１は、測定デバイス１００の構成を示す分解斜視図である。

測定デバイス１００は、電気化学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を定量する方法に用いられる。測定デバイス１００は、絶縁性の第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する絶縁性の第２の基板１０４とが、スリット１１０を有する絶縁性のスペーサ１０６を挟んで組み合わされた構造を有している。第１の基板１０２、第２の基板１０４及びスペーサ１０６は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。

第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１の電極１１２と電気的に接続された第１のリード１２２、及び第２の電極１１４と電気的に接続された第２のリード１２４が配置されている。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４の上には、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。

次に、測定デバイス１００の製造方法について説明する。

まず、第１の基板１０２上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これによって、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４を形成する。第１の電極１１２及び第２の電極１１４は、それぞれ第１のリード１２２及び第２のリード１２４によって、後述するクレアチニン濃度測定装置の端子と電気的に接続される。
次に、第１の基板１０２上に設けられた第１の電極１１２及び第２の電極１１４の上に、Ｍ−ＰＭＳ、リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二カリウムを溶解し、必要に応じて１価アニオンの電解質塩を溶解した水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。１価アニオンの電解質塩には、例えば１価アニオンであるメチル硫酸イオンのナトリウム塩であるメチル硫酸ナトリウムを用いることが好ましい。その後、第１の基板１０２を、室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。

塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよい。例えば、試薬を含む水溶液中のＭ−ＰＭＳの濃度は１０ｍＭ程度であり、試薬を含む水溶液の滴下量は１．４μＬ程度である。また、試薬層１３０を形成する領域の面積は、試料に対する試薬の溶解性などを鑑みて適宜選択すればよいが、例えば、その面積を３ｍｍ²程度とする。

次に、電極及び試薬層１３０が形成された第１の基板１０２と、スペーサ１０６と、第２の基板１０４とを組み合わせる。第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずにこれらを組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。

第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、スペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が試料導入口１３２として機能する。

次に、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定装置２００及びそれを用いたクレアチニン濃度測定方法について、図２及び３を用いて説明する。図２は、測定装置２００の外観を示す斜視図であり、図３は測定装置２００の構成を示すブロック図である。
まず、測定装置２００の構成について、図２を参照しながら説明する。

測定装置２００の筐体２０２には、測定デバイス１００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置２００によるクレアチニン濃度の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続される第１の端子及び第２の端子が設けられている。

次に、測定装置２００の筐体２０２内部の構成について、図３を参照しながら説明する。

測定装置２００は、筐体２０２内部に、電圧印加部３０２、電気信号検出部３０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。
電圧印加部３０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス１００の第１の電極１１２及び第２の電極１１４に、電圧または電位を印加する機能を有する。電圧または電位の印加は、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続された第１の端子及び第２の端子を介して行われる。

電気信号検出部３０４は、第１の電極１１２及び第２の電極１１４からの電気信号を、第１の端子及び第２の端子を介して検出する機能を有する。電気信号検出部３０４は、本発明における検出部に相当する。

記憶部３１０には、クレアチニンの濃度と電気信号検出部３０４により検出される電気信号との相関を表す検量線に相当する相関データが格納されている。記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。

制御部３０６は、上記相関データを参照して、電気信号検出測定部３０４により検出された電気信号をクレアチニン濃度に換算する機能を有する。制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。

次に、測定デバイス１００及び測定装置２００を用いた、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定方法について説明する。

まず、使用者が、測定デバイス１００のリード側を、測定装置２００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス１００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子及び第２の端子とが、それぞれ接触することにより電気的に導通する。

測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス１００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス１００の挿入を検知すると、制御部３０６は電圧印加部３０２を制御して、第１の端子及び第２の端子を介して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に、試料導入を検知するための電圧（例えば０．２Ｖ）が印加される。

次に、使用者が、測定デバイス１００の試料導入口１３２に、試料を接触させる。この接触により、試料導入口１３２を通って測定デバイス１００の試料収容室内に、試料（例えば、０．６μＬ程度）が毛管現象により吸引され、試料収容室内が試料によって充填される。試料が第１の電極１１２及び第２の電極１１４に接触すると、試料を介して第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に電流が流れるようになる。そのため、それに起因する電気信号の変化を電気信号検出部３０４が検出する。

電気信号検出部３０４からの出力信号により、試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、電圧印加部３０２による印加電圧を異なる電圧（例えば０Ｖまたは開回路）に切り替える。また、試料導入の検知に伴い、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。

試料収容室内に露出している試薬層１３０と試料とが接触すると、試薬層１３０に含まれるＭ−ＰＭＳが試料中に溶解する。試料中に溶解したＭ−ＰＭＳが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、反応生成物（クレアチニンの酸化物と、還元されたＭ−ＰＭＳ）が生成する。

計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に、還元されたＭ−ＰＭＳ濃度を測定するための電圧を印加する。例えば、第１の電極１１２が第２の電極１１４に比べて＋０．６Ｖとなる電圧を印加する。このように電圧を印加してから一定時間（例えば５秒）後、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間で流れる電流等の電気信号を、電気信号検出部３０４において測定する。このとき、第１の電極１１２では、還元されたＭ−ＰＭＳが酸化される。よって、電気信号検出部３０４において測定される電気信号は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。

制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている電気信号とクレアチニン濃度との相関を表す相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電気信号検出部３０４において検出された電気信号が試料中のクレアチニン濃度に換算される。

得られたクレアチニン濃度はディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度が表示されることにより、ユーザはクレアチニン濃度測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。

測定デバイス１００によれば、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンとＭ−ＰＭＳとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖、アセトンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、試料中に１価アニオンが存在することにより、リン酸系緩衝剤の存在下において、Ｍ−ＰＭＳが安定に存在するようになる。よって、試料中に１価アニオンが存在する場合には、さらに再現性良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。

なお、本実施の形態においては、１価アニオンの電解質塩としてメチル硫酸ナトリウムを用いることが好ましいが、必ずしも１価アニオンの電解質塩を用いる必要はない。また、１価アニオンの電解質塩は、メチル硫酸ナトリウムに限定されない。メチル硫酸ナトリウムの代わりに、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、メチル硫酸リチウム、メチル硫酸ナトリウム、メチル硫酸カリウム等を用いてもよい。これらの１価アニオンの電解質塩を用いる場合にも、試料中に１価アニオンが存在することにより、リン酸系緩衝剤の存在下でＭ−ＰＭＳが安定に存在するようになる。

本実施の形態では、測定デバイスが１つの試薬層を備える例を示したが、これに限定されない。測定デバイスが、２つの試薬層、例えばクレアチニン定量用試薬を含む第１の試薬層と、リン酸系緩衝剤を含む第２の試薬層とを備えていてもよい。

本実施の形態では、試料収容室に試料が導入されたことを制御部が検知することにより、電圧印加部による印加電圧が異なる電圧に切り替えられる例について示したが、これに限定されない。クレアチニンの濃度に依存した電流が得られる限り、必ずしも電圧印加部による印加電圧を切り替える必要はない。測定に必要な電圧値（例えば、第１の電極が第２の電極に比べて＋０．６Ｖとなる電圧）を測定デバイスの挿入検知時から印加し、試料導入の検知後もその電圧値を継続して印加してもよい。

本実施の形態では、還元されたＭ−ＰＭＳ濃度に対応する電気信号を得るための第１の電極への印加電位を、第２の電極に対して０．６Ｖとする例を示したが、これに限定されることはない。第１の電極と第２の電極との間の電圧は、クレアチニンとＭ−ＰＭＳとの酸化還元反応により還元されたＭ−ＰＭＳが酸化される電圧であればよい。

本実施の形態においては、試料導入の検知後、電気信号を検出するまでの時間（反応時間）を６０秒とする例を示したが、必ずしもその値である必要はない。クレアチニン濃度の違いに対する電流値の差を有意に検出できる限り、反応時間は上記より短くてもよい。一方、反応時間をより長くした場合、クレアチニンとＭ−ＰＭＳとの反応が完了状態あるいは定常状態に達する可能性が高まる。そのため、温度などの環境条件の影響を受けずにクレアチニンの存在量をより正確に定量しやすくなる。

本実施の形態においては、電極に電位を印加してから５秒後に電気信号を検出する例を示したが、この時間に限定されない。この時間は、クレアチニン濃度の違いに対する電気信号の差を有意に検出できる時間であればよい。

また、電極系、リード、及び端子の形状、個数、配置等は、本実施の形態に限定されない。他の実施の形態についても同様である。

測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、レシチンをトルエンまたはその他の有機溶媒に溶解した溶液を、第２の基板の内壁に塗布して乾燥させることにより、レシチン層を形成してもよい。このような構造にすることにより、試料量をより再現性よく一定とすることができる。そのため、より精度良く試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。

クレアチニン濃度測定装置は、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。取り外し可能な記憶媒体に測定結果を保存することにより、測定結果を測定装置から容易に取り出すことができる。よって、分析関連業者に測定結果の分析を依頼することが容易になる。

測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。これにより、測定結果を、病院内の分析関連部門または分析関連業者等に送信することができる。よって、測定から分析関連部門または分析関連業者などによる分析までの時間を短縮することができる。

測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。これにより、分析結果を迅速に使用者にフィードバックすることができる。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２に係るクレアチニン濃度測定デバイス４００について、図４を用いて説明する。図４は、測定デバイス４００の構成を示す分解斜視図である。

測定デバイス４００は、光学的に試料中に含まれるクレアチニンの濃度を定量する方法に用いられる。測定デバイス４００は、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する第２の基板１０４とが、スリット１１０を有するスペーサ１０６を挟んで組み合わされた構造を有している。第１の基板１０２、第２の基板１０４及びスペーサ１０６は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。

測定デバイス４００は、実施の形態１に係る測定デバイス１００と異なり、第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４は配置されていない。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４の上ではなく、第１の基板１０２上に、実施の形態１と同様の試薬層１３０が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。

次に、測定デバイス４００の製造方法について説明する。

まず、第１の基板１０２上に、実施の形態１と同様のクレアチニン定量用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、実施の形態１と同様にすればよい。

次に、試薬層１３０が形成された第１の基板１０２と、スペーサ１０６と、第２の基板１０４とを組み合わせる。第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずにこれらを組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。

第１の基板１０２、スペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、スペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部が試料導入口１３２として機能する。

次に、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定装置５００及びそれを用いたクレアチニン濃度測定方法について、図５及び６を用いて説明する。図５は、測定装置５００の外観を示す斜視図であり、図６は測定装置５００の構成を示すブロック図である。

まず、測定装置５００の構成について、図５を参照しながら説明する。

測定装置５００の筐体２０２には、測定デバイス４００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８と、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４と、測定装置５００によるクレアチニン濃度の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。

次に、測定装置５００の筐体２０２内部の構成について、図６を参照しながら説明する。

測定装置５００は、筐体２０２内部に、光源５０２、受光器５０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。

光源５０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス４００の試料収容室内に入射する光を出射する機能を有する。光源５０２から出射される光の波長は、Ｍ−ＰＭＳとクレアチニンとの反応に応じて吸収強度が変化する波長を選択すればよい。光源５０２としては、例えば、５１０ｎｍを含む波長範囲の光を出射する青緑色ＬＥＤを用いる。

受光器５０４は、光源５０２から出射され、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス４００の試料収容室内において反射した光を検出する機能を有する。

記憶部３１０には、クレアチニンの濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す検量線に相当する相関データが格納されている。記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。

制御部３０６は、上記相関データを参照して、受光器５０４により検出される反射光の強度をクレアチニン濃度に換算する機能を有する。制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。

次に、測定デバイス４００及び測定装置５００を用いた、本実施の形態に係るクレアチニン濃度測定方法について説明する。

まず、使用者が、測定デバイス４００の、試料導入口１３２の反対側を測定装置５００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。

測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス４００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス４００の挿入を検知すると、制御部３０６は光源５０２を作動させる。これにより、測定デバイス４００の試料収容室に光源５０２からの光が照射される。

次に、使用者が、測定デバイス４００の試料導入口１３２に、試料を接触させる。この接触により、試料導入口１３２を通って、測定デバイス４００の試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、試料収容室内が試料によって充填される。試料が試料収容室内における光の照射位置に到達すると、試料収容室内の透過率が変化する。それに起因する反射光強度の変化を、受光器５０４が検出する。

受光器５０４からの出力信号により、試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。

試料収容室内に露出している試薬層１３０と試料とが接触すると、試薬層１３０に含まれるＭ−ＰＭＳが試料中に溶解する。試料中に溶解したＭ−ＰＭＳが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、反応生成物（クレアチニンの酸化物と、還元されたＭ−ＰＭＳ）が生成する。Ｍ−ＰＭＳが還元され、減少することにより、試料の吸収スペクトルが変化する。ここで、試料の吸収スペクトルの変化量は、還元されたＭ−ＰＭＳの濃度に依存する。

計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、試料収容室内において反射した光の強度を受光器５０４において測定する。このとき、受光器５０４において測定される反射光の強度は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。

制御部３０６は、記憶部３１０に格納されているクレアチニンの濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す検量線に相当する相関データを読み出し、それを参照する。これにより、受光器５０４において検出された反射光の強度が、試料中のクレアチニン濃度に換算される。

得られたクレアチニン濃度はディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度が表示されることにより、ユーザは測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。

測定デバイス４００によれば、従来の測定デバイスと異なり、試料収容室内において、クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンとＭ−ＰＭＳとが直接反応する。よって、塩分等のイオン種、尿素、アミノ酸、糖、アセトンなどの妨害成分の影響を受けることなく反応が進行する。そのため、尿や血液などの生体試料を用いた場合であっても、従来の測定デバイスよりも高精度かつ再現性良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。また、実施の形態１と同様に、試料中に１価アニオンが存在する場合には、より再現性良く、試料中に含まれるクレアチニンを定量することができる。本実施の形態においても、１価アニオンの電解質塩はメチル硫酸ナトリウムに限定されない。

本実施の形態では、実施の形態１と同様に、測定デバイスが２つ以上の試薬層を備えていてもよい。

本実施の形態においては、試料導入の検知後、反射光強度を検出するまでの時間（反応時間）を６０秒とする例を示したが、必ずしもその値である必要はない。クレアチニン濃度の違いに対する反射光強度の差を有意に検出できる限り、反応時間は上記より短くてもよい。一方、実施の形態１と同様に、反応時間をより長くした場合、クレアチニンの存在量をより正確に定量しやすくなる。

測定デバイスは、試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、実施の形態１と同様に、レシチン層を具備してもよい。

実施の形態１と同様に、クレアチニン濃度測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。また、測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。さらに、測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。

（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３に係る塩分量測定デバイス７００について、図７及び８を用いて説明する。図７は、測定デバイス７００を第１の基板の第１の面側からみた構成を示す分解斜視図であり、図８は、第１の基板の第２の面側からみた構成を示す分解斜視図である。

測定デバイス７００は、試料である尿中に含まれるクレアチニンを電気化学的に測定するとともに、尿の電気特性を測定し、これらの測定結果を用いて、１日に排泄される尿中に含まれる塩分の量を推定する方法に用いられる。

測定デバイス７００においては、絶縁性の第１の基板１０２の第１の面７０２と、スリット１１０を有する絶縁性の第１のスペーサ１０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する絶縁性の第２の基板１０４とが、第１のスペーサ１０６を挟むように組み合わされている。さらに、第１の基板１０２の第２の面８０２と、スリット７１０を有する絶縁性の第２のスペーサ７０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔７０８を有する絶縁性の第３の基板７０４とが、第２のスペーサ７０６を挟むように組み合わされている。第１の基板１０２、第１のスペーサ１０６、第２の基板１０４、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４は、例えば、ポリエチレンテレフタレート製である。

第１の基板１０２の第１の面７０２上には、実施の形態１に係る測定デバイス１００と同様に、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１の電極１１２と電気的に接続された第１のリード１２２、及び第２の電極１１４と電気的に接続された第２のリード１２４が配置されている。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４上には、クレアチニン定量用試薬を含む試薬層１３０が配置されている。

一方、第１の基板１０２の第２の面８０２上には、第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、及び第６の電極７１８が配置されている。更に、第２の面８０２上には、第３の電極７１２と電気的に接続された第３のリード７２２、第４の電極７１４と電気的に接続された第４のリード７２４、第５の電極７１６と電気的に接続された第５のリード７２６、及び第６の電極７１８と電気的に接続された第６のリード７２８が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。

次に、測定デバイス７００の製造方法について説明する。

まず、第１の基板１０２の第１の面７０２上に、樹脂製の電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これにより、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４を形成する。第１の電極１１２及び第２の電極１１４は、それぞれ第１のリード１２２及び第２のリード１２４によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。

次に、第１の基板１０２の第２の面８０２上に、上記の電極パターンマスクとは異なるパターンを有する電極パターンマスクを設置した状態で、パラジウムをスパッタリングする。これにより、第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、第６の電極７１８、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８を形成する。第３の電極７１２、第４の電極７１４、第５の電極７１６、及び第６の電極７１８は、それぞれ第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。

次に、第１の基板１０２の第１の面７０２上に設けられた第１の電極１１２及び第２の電極１１４の上に、実施の形態１と同様のクレアチニン測定用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより、試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、実施の形態１と同様にすればよい。

次に、第１の基板１０２の第１の面７０２と第１のスペーサ１０６とが接し、第１の基板１０２の第２の面８０２と第２のスペーサ７０６とが接するように、第２の基板１０４、第１のスペーサ１０６、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６、及び第３の基板７０４を組み合わせる。各部材の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し、接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずに組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。

第１の基板１０２、第１のスペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、第１のスペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、クレアチニン濃度測定用の第１の試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部がクレアチニン濃度測定用の第１の試料導入口１３２として機能する。

一方、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第３の基板７０４との間で、第２のスペーサ７０６に設けられたスリット７１０により形成される空間部が、尿の電気特性測定用の第２の試料収容室として機能する。また、スリット７１０の開口部が尿の電気特性測定用の第２の試料導入口７３２として機能する。

次に、本実施の形態に係る塩分量測定装置９００及びそれを用いた塩分量測定方法について、図９及び１０を用いて説明する。図９は、測定装置９００の外観を示す斜視図であり、図１０は測定装置９００の構成を示すブロック図である。

まず、測定装置９００の構成について、図９を参照しながら説明する。

測定装置９００の筐体２０２には、測定デバイス７００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置９００によるクレアチニン濃度及び尿の電気特性の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス７００の第１のリード１２２、第２のリード１２４、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８とそれぞれ電気的に接続される第１の端子、第２の端子、第３の端子、第４の端子、第５の端子、及び第６の端子が設けられている。

次に、測定装置９００の筐体２０２内部の構成について、図１０を参照しながら説明する。

測定装置９００は、筐体２０２内部に、電圧印加部３０２、電気信号検出部３０４、定電流交流電源９０２、電圧検出器９０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。

電圧印加部３０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス７００の第１の電極１１２及び第２の電極１１４に電圧または電位を印加する機能を有する。電圧または電位の印加は、測定デバイス７００の第１のリード１２２及び第２のリード１２４とそれぞれ電気的に接続された第１の端子及び第２の端子を介して行われる。

電気信号検出部３０４は、第１の電極１１２及び第２の電極１１４からの電気信号を、第１の端子及び第２の端子を介して検出する機能を有する。電気信号検出部３０４は、本発明における検出部に相当する。

定電流交流電源９０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス７００の第３の電極７１２と第６の電極７１８との間に一定の交流電流を印加する機能を有する。一定の交流電流の印加は、測定デバイス７００の第３のリード７２２及び第６のリード７２８とそれぞれ電気的に接続された第３の端子及び第６の端子を介して行われる。印加する交流電流は、例えば、周波数が１ｋＨｚ程度、電流値が０．１ｍＡ程度である。

電圧検出器９０４は、第４の端子及び第５の端子を介して、第４の電極７１４と第５の電極７１６との間の電圧（交流電圧の実効値）を検出する機能を有する。

記憶部３１０には、
（i）クレアチニンの濃度と電気信号検出部３０４により検出される電気信号との相関を表す第１の検量線に相当する第１の相関データ、
（ii）塩分の濃度と電圧検出器９０４により検出される電圧との相関を表す第２の検量線に相当する第２の相関データ、及び
（iii）１日当たりの尿中塩分排泄量とクレアチニン濃度により補正された塩分濃度との相関を表す第３の検量線に相当する第３の相関データ、が格納されている。
記憶部３１０としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリを用いることができる。

制御部３０６は、
（I）第１の相関データを参照して、電気信号検出部３０４により検出された電気信号を、クレアチニン濃度に換算する機能、
（II）第２の相関データを参照して、電圧検出器９０４により検出された電圧を、塩分濃度に換算する機能、
（III）得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する機能、及び
（IV）第３の相関データを参照して、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する機能、を有する。
制御部３０６は、本発明における演算部に相当する。制御部３０６としては、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等のマイクロコンピュータを用いることができる。

次に、測定デバイス７００及び測定装置９００を用いた、本実施の形態に係る尿中塩分量測定方法について説明する。

まず、使用者が、測定デバイス７００のリード側を測定装置９００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス７００の第１のリード１２２、第２のリード１２４、第３のリード７２２、第４のリード７２４、第５のリード７２６、及び第６のリード７２８と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子、第２の端子、第３の端子、第４の端子、第５の端子、及び第６の端子とがそれぞれ電気的に導通する。

測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス７００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により、制御部３０６が測定デバイス７００の挿入を検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の端子及び第２の端子を介して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に電圧（例えば０．２Ｖ）が印加される。

次に、使用者が、測定デバイス７００の第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２に、試料を接触させる。この接触により、第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２を通って、測定デバイス７００の２つの試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、２つの試料収容室内が試料によって充填される。

第１の試料収容室において、試料が第１の電極１１２及び第２の電極１１４に接触すると、試料を介して第１の電極１１２及び第２の電極１１４間に電流が流れるようになる。そのため、それに起因する電気信号の変化を電気信号検出部３０４が検出する。

電気信号検出部３０４からの出力信号により、第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知する。

第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、電圧印加部３０２による印加電圧を異なる電圧（例えば０Ｖまたは開回路）に切り替える。また、試料導入の検知に伴い、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。

第２の試料収容室への試料導入の検知に伴い、制御部３０６は定電流交流電源９０２を制御して、第３の端子及び第６の端子を介して、第３の電極７１２と第６の電極７１８との間に一定の交流電流（例えば、周波数１ｋＨｚ、電流値０．１ｍＡ）を印加する。交流電流の印加から所定時間経過後（例えば５秒後）に、電圧検出器９０４は、第４の電極７１４と第５の電極７１６との間の電圧（交流電圧の実効値）を測定する。

制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている塩分の濃度と電圧検出器９０４により検出される電圧との相関を表す第２の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電圧検出器９０４により検出された電圧を試料中の塩分濃度に換算する。得られた塩分濃度はディスプレイ２０４に表示される。

第１の試料収容室において、試料が試薬層１３０と接触すると、試薬層１３０に含まれるＭ−ＰＭＳが試料中に溶解する。試料中に溶解したＭ−ＰＭＳが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、反応生成物（クレアチニンの酸化物と、還元されたＭ−ＰＭＳ）が生成する。

計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、制御部３０６は、電圧印加部３０２を制御して、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間に再度異なる電圧を印加する（例えば、第１の電極１１２が第２の電極１１４に比べて＋０．６Ｖとなる電圧）。このように電圧を印加してから一定時間（例えば５秒）後、第１の電極１１２と第２の電極１１４との間で流れる電流等の電気信号を、電気信号検出部３０４において測定する。このとき、第１の電極１１２では、還元されたＭ−ＰＭＳが酸化される。電気信号検出部３０４において測定される電気信号は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。

制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている電気信号とクレアチニン濃度との相関を表す第１の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電気信号検出部３０４において検出された電気信号は試料中のクレアチニン濃度に換算される。

次に、制御部３０６は、得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する。続いて、制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている１日当たりの尿中塩分排泄量とクレアチニン濃度により補正された塩分濃度との相関を表す第３の検量線に相当する第３の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する。

得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量は、ディスプレイ２０４に表示される。ディスプレイ２０４にクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量が表示されることにより、ユーザは測定が完了したことがわかる。得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量は、計時部３０８により計時された時刻とともに記憶部３１０に保存されることが好ましい。

測定装置９００によれば、高い精度で測定されたクレアチニン濃度により補正された塩分濃度に基づいて、１日当たりの尿中塩分排泄量を算出できる。よって、１日当たりの尿中塩分排泄量を高精度かつ再現性良く求めることができる。

本実施の形態では、実施の形態１と同様に、塩分量測定デバイスが２つ以上の試薬層を備えていてもよい。

本実施の形態においても、実施の形態１と同様に、クレアチニンの濃度に依存した電流が得られる限り、必ずしも電圧印加部による印加電圧を異なる電圧に切り替える必要はない。

本実施の形態においても、実施の形態１と同様に、第１の電極と第２の電極との間の電圧は、還元されたＭ−ＰＭＳが酸化される電圧であればよい。

本実施の形態においても、実施の形態１と同様に、試料導入の検知後、電気信号を検出するまでの時間（反応時間）は限定されない。

本実施の形態では、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加してから５秒後に電気信号を検出する例を示したが、この時間に限定されない。

本実施の形態では、記憶部に、上記の第１〜第３の相関データが格納されている例を示したがこれに限定されない。これに代えて、電気信号検出部により検出される電気信号と、電圧検出器により検出される電圧と、単位時間当たり（例えば１日）の尿中塩分排泄量との相関を示す相関データが記憶部に格納されていてもよい。この場合は、クレアチニン濃度や塩分濃度を求めなくてもよい。電気信号検出部により検出される電気信号と、電圧検出器により検出される電圧とを用いて、単位時間当たりの尿中塩分排泄量を直接求めることができる。

また、測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、実施の形態１と同様のレシチン層を、第２の基板及び第３の基板の内壁に形成してもよい。

また、塩分量測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。

また、塩分量測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。

また、塩分量測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。

（実施の形態４）
次に、本発明の実施の形態４に係る塩分量測定デバイス１０００について、図１１及び１２を用いて説明する。図１１は、塩分量測定デバイス１０００を第１の基板の第１の面側の構成を示す分解斜視図であり、図１２は、第１の基板の第２の面側の構成を示す分解斜視図である。

測定デバイス１０００は、試料である尿中に含まれるクレアチニンを光学的に測定するとともに、尿の電気特性を測定し、これらの測定結果を用いて、１日に排泄される尿中に含まれる塩分の量を推定する方法に用いられる。

測定デバイス１０００においては、絶縁性の第１の基板１０２の第１の面７０２と、スリット１１０を有する第１のスペーサ１０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔１０８を有する第２の基板１０４とが、第１のスペーサ１０６を挟むように組み合わされている。さらに、第１の基板１０２の第２の面８０２と、スリット７１０を有する第２のスペーサ７０６とが接しており、第１の基板１０２と、空気孔７０８を有する第３の基板７０４とが、第２のスペーサ７０６を挟むように組み合わされている。第１の基板１０２、第１のスペーサ１０６、第２の基板１０４、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４は、例えばポリエチレンテレフタレート製である。

測定デバイス１０００は、実施の形態１に係る測定デバイス１００と異なり、第１の基板１０２には、第１の電極１１２、第２の電極１１４、第１のリード１２２、及び第２のリード１２４は配置されていない。また、第１の電極１１２及び第２の電極１１４の上ではなく、第１の基板１０２上に、実施の形態１と同様の試薬層１３０が配置されている。

一方、第１の基板１０２の第２の面８０２上には、第１の電極７１２、第２の電極７１４、第３の電極７１６、及び第４の電極７１８が配置されている。更に、第２の面８０２上には、第１の電極７１２と電気的に接続された第１のリード７２２、第２の電極７１４と電気的に接続された第２のリード７２４、第３の電極７１６と電気的に接続された第３のリード７２６、及び第４の電極７１８と電気的に接続された第４のリード７２８が配置されている。第１の基板１０２の寸法は、適宜設定すればよいが、例えば、幅が７ｍｍ程度、長さが３０ｍｍ程度、厚みが０．７ｍｍ程度である。

次に、測定デバイス１０００の製造方法について説明する。

まず、第１の電極７１２、第２の電極７１４、第３の電極７１６、第４の電極７１８、第１のリード７２２、第２のリード７２４、第３のリード７２６、及び第４のリード７２８を、実施の形態３の第３〜６の電極、及び第３〜第６のリードと同様に形成する。第１の電極７１２、第２の電極７１４、第３の電極７１６、及び第４の電極７１８は、それぞれ第１のリード７２２、第２のリード７２４、第３のリード７２６、及び第４のリード７２８によって、後述する塩分量測定装置の端子と電気的に接続される。

次に、第１の基板１０２の第１の面７０２上に、実施の形態１と同様のクレアチニン定量用試薬を含む水溶液を、マイクロシリンジなどを用いて一定量滴下する。その後、第１の基板１０２を室温〜３０℃程度の環境に静置して乾燥させることにより試薬層１３０を形成する。塗布する試薬を含む水溶液の濃度及び量は、必要とするデバイスの特性やサイズに応じて選択すればよいが、例えば、実施の形態１と同様にすればよい。

次に、第１の基板１０２の第１の面７０２と第１のスペーサ１０６とが接し、第１の基板１０２の第２の面８０２と第２のスペーサ７０６とが接するように、第２の基板１０４、第１のスペーサ１０６、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６、及び第３の基板７０４を組み合わせる。各部材の各接合部分に接着剤を塗布し、これらを貼り合わせた後、押圧して静置し接着させる。この方法に代えて、接着剤を塗布せずに組み合わせた後、市販の溶着機を用いて接合部分を熱または超音波によって溶着させてもよい。

第１の基板１０２、第１のスペーサ１０６及び第２の基板１０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第２の基板１０４との間で、第１のスペーサ１０６に設けられたスリット１１０により形成される空間部が、クレアチニン濃度測定用の第１の試料収容室として機能する。また、スリット１１０の開口部がクレアチニン濃度測定用の第１の試料導入口１３２として機能する。

一方、第１の基板１０２、第２のスペーサ７０６及び第３の基板７０４を組み合わせたときに、第１の基板１０２と第３の基板７０４との間で、第２のスペーサ７０６に設けられたスリット７１０により形成される空間部が、尿の電気特性測定用の第２の試料収容室として機能する。また、スリット７１０の開口部が尿の電気特性測定用の第２の試料導入口７３２として機能する。

次に、本実施の形態に係る塩分量測定装置１３００及びそれを用いた塩分量測定方法について、図１３及び１４を用いて説明する。図１３は、測定装置１３００の外観を示す斜視図であり、図１４は測定装置１３００の構成を示すブロック図である。

まず、測定装置１３００の構成について、図１３を参照しながら説明する。

測定装置１３００の筐体２０２には、測定デバイス１０００を取付けるための測定デバイス取付け部２０８、測定結果等が表示されるディスプレイ２０４、及び測定装置９００によるクレアチニン及び尿の電気特性の測定を開始させるための測定開始ボタン２０６が設けられている。また、測定デバイス取付け部２０８の内部には、測定デバイス１０００の第１のリード７２２、第２のリード７２４、第３のリード７２６、及び第４のリード７２８とそれぞれ電気的に接続される第１の端子、第２の端子、第３の端子、及び第４の端子が設けられている。

次に、測定装置１３００の筐体２０２内部の構成について、図１４を参照しながら説明する。

測定装置１３００は、筐体２０２内部に、光源５０２、受光器５０４、定電流交流電源９０２、電圧検出器９０４、制御部３０６、計時部３０８、及び記憶部３１０を備えている。

光源５０２は、測定デバイス取付け部２０８に取付けられた測定デバイス１０００の第１の試料収容室内に入射する光を出射する機能を有する。光源５０２から出射される光の波長は、実施の形態２と同様に選択すればよい。

受光器５０４は、光源５０２から出射され、測定デバイス１０００の第１の試料収容室内において反射した光を検出する機能を有する。

定電流交流電源９０２は、第１の端子及び第４の端子を介して、測定デバイス１０００の第１の電極７１２と第４の電極７１８との間に一定の交流電流を印加する機能を有する。印加する交流電流は、例えば、周波数が１ｋＨｚ程度、電流値が０．１ｍＡ程度である。

電圧検出器９０４は、第２の端子及び第３の端子を介して、第２の電極７１４と第３の電極７１６との間の電圧（交流電圧の実効値）を検出する機能を有する。

記憶部３１０には、クレアチニンの濃度と受光器５０４により検出される反射光の強度との相関を表す第１の検量線に相当する第１の相関データが格納されている。また、記憶部３１０には、実施の形態３の記憶部３１０と同様の第２の検量線に相当する第２の相関データ、及び第３の検量線に相当する第３の相関データが格納されている。

制御部３０６は、
（I）第１の相関データを参照して、受光器５０４により検出された反射光の強度をクレアチニン濃度に換算する機能、
（II）第２の相関データを参照して、電圧検出器９０４により検出された電圧を、塩分濃度に換算する機能、
（III）得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する機能、及び
（IV）第３の相関データを参照して、補正後の塩分濃度を１日当たりの尿中塩分排泄量に換算する機能、を有する。

次に、測定デバイス１０００及び測定装置１３００を用いた、本実施の形態に係る塩分量測定方法について説明する。

まず、使用者が測定デバイス１０００のリード側を、測定装置１３００の測定デバイス取付け部２０８に挿入する。これにより、測定デバイス１０００の第１のリード７２２、第２のリード７２４、第３のリード７２６、及び第４のリード７２８と、測定デバイス取付け部２０８内部に設けられている第１の端子、第２の端子、第３の端子、及び第４の端子とがそれぞれ電気的に導通する。

測定デバイス取付け部２０８に測定デバイス１０００が挿入されると、測定デバイス取付け部２０８内に設けられたマイクロスイッチからなる挿入検知スイッチが作動して、制御部３０６に信号を出力する。挿入検知スイッチからの出力信号により制御部３０６が測定デバイス１０００の挿入を検知すると、制御部３０６は光源５０２を作動させる。これにより、測定デバイス７００の第１の試料収容室に光源５０２からの光が照射される。

次に、使用者が、測定デバイス１０００の第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２に、試料を接触させる。この接触により、第１の試料導入口１３２及び第２の試料導入口７３２を通って測定デバイス１０００の２つの試料収容室内に、試料が毛管現象により吸引され、２つの試料収容室内が試料によって充填される。試料が第１の試料収容室内における光の照射位置に到達すると、試料収容室内の透過率が変化する。それに起因する反射光強度の変化を、受光器５０４が検出する。

受光器５０４からの出力信号により、第１および第２の試料収容室に試料が導入されたことを制御部３０６が検知すると、制御部３０６がタイマーである計時部３０８による計時を開始させる。

第２の試料収容室への試料導入の検知に伴い、制御部３０６は定電流交流電源９０２を制御して、第１の端子及び第４の端子を介して、第１の電極７１２と第４の電極７１８との間に一定の交流電流（例えば、周波数１ｋＨｚ、電流値０．１ｍＡ）を印加する。交流電流の印加から所定時間経過後（例えば５秒後）に、電圧検出器９０４は第２の電極７１４と第３の電極７１６との間の電圧（交流電流の実効値）を測定する。

制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている第２の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、電圧検出器９０４により検出された電圧は試料中の塩分濃度に換算される。

第１の試料収容室において、試料が試薬層１３０と接触すると、試薬層１３０に含まれるＭ−ＰＭＳが試料中に溶解する。試料中に溶解したＭ−ＰＭＳが試料中に含まれるクレアチニンと直接反応することにより、反応性生物（クレアチニンの酸化物と還元されたＭ−ＰＭＳ）が生成する。Ｍ−ＰＭＳが還元されることにより、試料の吸収スペクトルが変化する。

計時部３０８からの信号によって、所定時間（例えば、６０秒）経過したことを制御部３０６が判断すると、試料収容室内において反射した光の強度を受光器５０４において測定する。このとき、受光器５０４において測定される反射光の強度は、試料中に含まれるクレアチニン濃度に依存する。

制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている第１の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、受光器５０４において検出された反射光の強度は試料中のクレアチニン濃度に換算される。

次に、制御部３０６は、得られたクレアチニン濃度を用いて塩分濃度を補正する。続いて、制御部３０６は、記憶部３１０に格納されている第３の相関データを読み出し、それを参照する。これにより、補正後の塩分濃度は１日当たりの尿中塩分排泄量に換算される。得られたクレアチニン濃度及び１日当たりの尿中塩分排泄量はディスプレイ２０４に表示される。

測定装置１３００によれば、高い精度で測定されたクレアチニン濃度により補正された塩分濃度に基づいて、１日当たりの尿中塩分排泄量を算出できる。よって、１日当たりの尿中塩分排泄量を高精度かつ再現性良く求めることができる。

本実施の形態では、実施の形態１と同様に、測定デバイスが２つ以上の試薬層を備えていてもよい。

また、本実施の形態においても、実施の形態２と同様に、試料導入の検知後、反射光強度を検出するまでの時間は限定されない。

また、本実施の形態では、記憶部に、上記第１〜第３の相関データに代えて、受光器により検出される反射光の強度と、電圧検出器により検出される電圧と、単位時間当たり（例えば１日）の尿中塩分排泄量との相関を示す相関データが格納されていてもよい。この場合は、クレアチニン濃度や塩分濃度を求めなくてもよい。受光器により検出される反射光の強度と電圧検出器により検出される電圧とを用いて、単位時間当たりの尿中塩分排泄量を直接求めることができる。

また、測定デバイスの試料収容室内への試料の導入をより円滑にするために、実施の形態１と同様のレシチン層を、第２の基板及び第３の基板の内壁に形成してもよい。

また、測定装置が、測定結果をＳＤカードなどの記憶媒体に記録するための記録部をさらに備えていてもよい。

また、測定装置が、測定結果を測定装置外に送信するための送信部をさらに備えていてもよい。

また、測定装置が、分析関連部門または分析関連業者などにおいて分析した結果を受信するための受信部をさらに備えていてもよい。

（実施例１）
本発明に係るクレアチニン濃度測定方法の効果を確認するために以下の実験を行った。

まず、１００ｍＭのリン酸水素二カリウム（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）の水溶液と、１００ｍＭのリン酸二水素カリウム（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）の水溶液とを調製した。ｐＨメーターを用いてモニターしながら２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを７に調整した。このようにして得られた１００ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝７）に、Ｍ−ＰＭＳ（株式会社同仁化学研究所製、以下同様）を濃度が１０ｍＭとなるよう溶解した。

得られた水溶液をガラス製のセル容器に入れ、第１の電極、第２の電極、及び第３の電極を、それぞれ、前記セル容器中の水溶液に浸漬した。第１の電極としては、金電極（電極面積２ｍｍ²）を用いた。第２の電極は、長さ５ｃｍの白金線をコイル状に巻くことにより得た。第３の電極としては、Ａｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ水溶液）参照極を用いた。これら電極は全て、ビー・エー・エス株式会社の市販品である。第１の電極、第２の電極及び第３の電極の接続端子を、電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ−６６０Ａ）の作用極、対極、参照極の接続端子にそれぞれ順に接続した。

次に、濃度５００ｍＭのクレアチニン水溶液（和光純薬工業株式会社製、以下の実施例および参考例についても同様）を、前記セル容器中の水溶液に少量添加した。クレアチニン水溶液の添加量は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が所定の値になるよう測定毎に調整した。

クレアチニンの添加とともに計時を開始し、クレアチニンの添加から１０分後に、第３の電極に対して０．６Ｖの電位を第１の電極に印加した。そして、電位印加後５秒後の電流値を測定した。以上の実験は室温（約２５℃）で行った。

セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が、０、６、１８、２７、及び５４ｍＭの場合について、それぞれ以上の測定を行った。

図１５は、測定された電流値をクレアチニン濃度に対してプロットしたグラフである。図１５において、横軸はセル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は測定された電流値（μＡ）を示す。図１５から明らかなように、得られた電流値は、セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度の増加に対して直線的に増加し（すなわち、比例し）、電流値とクレアチニン濃度とは高い相関を示した。したがって、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法により、得られる電流値に基づいてクレアチニンの定量を行うことが可能であることがわかる。

以上の結果から、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法における反応を次のように説明することができる。

試料中において、Ｍ−ＰＭＳはリン酸系緩衝剤の存在下、クレアチニンと反応して還元される。すなわち、クレアチニンは、本反応によってＭ−ＰＭＳに電子を供与し、酸化されている。第１の電極には、還元されたＭ−ＰＭＳから電子を受容するような電位が印加されている。そのため、還元されたＭ−ＰＭＳは、第１の電極において電気化学的に酸化される。これに伴い、第１の電極には電流が流れる。一定時間に還元されるＭ−ＰＭＳの濃度はクレアチニンの濃度に依存する。また、還元されたＭ−ＰＭＳの酸化電流は、試料中に存在する還元されたＭ−ＰＭＳの濃度もしくは量に依存する。よって、得られる電流値はクレアチニンの濃度に依存する。

（実施例２）
次に、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法における好ましいｐＨ範囲を調べるために以下の実験を行った。実験に用いた試料の調製方法及び装置構成、並びに実験の手順は実施例１と同様であるため説明を省略する。ただし、本実施例においては、緩衝液の濃度を４００ｍＭとし、試料中のクレアチニン濃度は２７ｍＭとした。また、試料中に添加するリン酸系緩衝液のｐＨが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３の場合について、それぞれ実施例１と同様の測定を行った。

図１６に電流値の測定結果を示す。ｐＨが５〜１０の領域において１μＡ以上の電流値が生じる。そして、ｐＨが６〜７の領域において顕著に電流値が大きく、かつ電流値が安定している。この結果から、前記ｐＨ領域においてクレアチニンの定量が特に感度良く、かつ高い再現性で測定できることがわかった。ｐＨが６〜７の領域は、リン酸水素イオンとリン酸二水素イオンとによって付与される。したがって、リン酸系緩衝剤として、例えばリン酸水素二カリウムまたはリン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムまたはリン酸二水素ナトリウムとを組み合わせて用いるのが好ましいと考えられる。

（実施例３）
まず、５０ｍＭのリン酸水素二カリウム水溶液と、５０ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液とを調製した。ｐＨメーターを用いてモニターしながら２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを７に調整した。このようにして得られた５０ｍＭのリン酸系緩衝液（ｐＨ＝７）にＭ−ＰＭＳを濃度が１０ｍＭとなるよう溶解した。

次に、得られたＭ−ＰＭＳ水溶液に、濃度５００ｍＭのクレアチニン水溶液を少量添加した。クレアチニン水溶液の添加量は、Ｍ−ＰＭＳ水溶液に含まれるクレアチニン濃度が所定の値になるよう測定毎に調整した。

得られた水溶液を試料としてガラス製のセル容器に入れ、吸光光度計（株式会社島津製作所製、型式：ＭｕｌｔｉＳｐｅｃ−１５００）を用いて、４００〜８００ｎｍの波長範囲について吸光スペクトルを測定した。吸光スペクトルは、クレアチニンの添加から１、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、及び８０分後にそれぞれ測定した。以上の実験は室温（約２５℃）にて行った。

セル容器中の水溶液に含まれるクレアチニン濃度が、０、１０、２０、及び４０ｍＭの場合について、それぞれ以上の測定を行った。

測定結果について図１７〜１９を参照しながら説明する。図１７は、クレアチニン濃度が０ｍＭの試料について測定された吸光スペクトルの経時変化を示すグラフである。図１８は、クレアチニン濃度が１０ｍＭの試料について測定された吸光スペクトルの経時変化を示すグラフである。図１９は、クレアチニン添加から５分後に測定された波長５１０ｎｍにおける吸光度と試料中のクレアチニン濃度との関係を示すグラフである。図１７及び図１８において、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度（任意強度）を示す。図１９において、横軸は試料中のクレアチニン濃度（ｍＭ）、縦軸は波長５１０ｎｍにおける吸光度（任意強度）を示す。

図１７からわかるように、クレアチニンを含まない試料では、吸光スペクトルには経時変化はみられない。それに対して、図１８からわかるように、クレアチニンを含む試料では、クレアチニンの添加から時間の経過にしたがって、波長５１０ｎｍ近傍の吸収ピークの強度が小さくなる。また、クレアチニンの添加から３０分程度で、ピーク強度の変化が飽和している。そこで、クレアチニン添加から５分後に測定された波長５１０ｎｍにおける吸光度を試料中のクレアチニン濃度に対してプロットすると、図１９に示すようになる。すなわち、得られた吸光度は、試料中に含まれるクレアチニン濃度の増加に対して直線的に減少し、吸光度とクレアチニン濃度とは高い相関を示した。したがって、本発明に係るクレアチニン濃度測定方法により、得られる吸光度に基づいてクレアチニンの定量を行うことが可能であることがわかる。

（参考例１）
Ｍ−ＰＭＳの安定化の効果を確認するために、以下の実験を行った。本参考例では、１価アニオンの電解質塩として、メチル硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムを用いた。

本参考例の試料は、以下のように調製した。まず、１Ｍのリン酸水素二カリウム水溶液と、１Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液とを調製した。次に、ｐＨメーターを用いてモニターしながら２つの水溶液を交互に混合することにより、得られる混合水溶液のｐＨを６に調整した。このようにして得られたリン酸緩衝液（ｐＨ＝６）と、１価アニオンの電解質塩水溶液とを、最終濃度がそれぞれ、４００ｍＭおよび８００ｍＭになるよう混合した。最後に、Ｍ−ＰＭＳ水溶液を、最終濃度が１００ｍＭになるよう前記混合水溶液に添加することにより、本参考例の試料が得られた。

また、１価アニオンの電解質塩を添加しない点以外は同様の手順により、基準試料を調製した。

Ｍ−ＰＭＳの添加から１分毎に試料を０．６μＬずつ採取し、電気化学計測を行うセンサーチップに充填し、電気化学的な測定を行った。電気化学計測用のセンサーチップとしては、アークレイ株式会社が販売しているセンサーチップ（商品名：Ｇセンサー）を用いた。センサーチップは純水中において超音波洗浄を５分間行い、センサーチップ内の試薬を除去してから用いた。センサーチップの電極は、パラジウムから構成されており、センサーチップ内に存在する第一のパラジウム電極および第二のパラジウム電極を、それぞれ電気化学アナライザー（ＡＬＳ社製、ＡＬＳ−７００Ａ）の作用極および参照極の接続端子に順に接続した。電気化学的な測定は、試料導入直後に、第２の電極に対して４００ｍＶの電位を第１の電極に５秒間印加し、印加開始５秒後に流れた電流を測定することにより実施した。反応は室温（約２５℃）にて行った。

図２０は、本参考例の試料及び基準試料について測定された、酸化電流値の経時変化を示すグラフである。図２０において、黒丸が基準試料のデータ、白丸がメチル硫酸ナトリウムを添加した場合のデータ、黒三角が硝酸ナトリウムを添加した場合のデータ、×印が塩化ナトリウムを添加した場合のデータを示す。

基準試料の場合、時間経過に比例して直線的に酸化電流値の増加が観測された。一方、１価アニオンの電解質塩であるメチル硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを添加した試料の場合、１５分後においても電流値の増加が抑制された。このことから、Ｍ−ＰＭＳがリン酸緩衝液中において安定に存在したことが確認された。また、図２０からわかるように、電流値増加の抑制効果は、１価アニオンの電解質塩がメチル硫酸ナトリウムである試料において最も大きかった。

以上の結果により、１価アニオンの電解質塩の添加によりＭ−ＰＭＳがリン酸緩衝液中において安定に存在することがわかった。このような電気化学応答は本実施例において用いたセンサーチップに限定された結果ではなく、作用極、対極、参照極を用いた３極式のバッチ型のような一般的な電気化学測定システムにおいても観察された。また、電極材料もパラジウムに限定されることなく、グラッシーカーボン、金、白金などの電極材料でも同様な挙動が観察される。

（実施例４）
次に、本発明に係る試薬組成物のクレアチニン濃度測定に対する影響を調べるために以下の実験を行った。本実施例では、１価アニオンの電解質塩としてメチル硫酸ナトリウムを用いた。

本実施例においては、参考例１と同様の手順により調製した試料に、さらにクレアチニン水溶液を添加することにより、クレアチニン濃度が０、１０．８、２１．６、４２．３及び５４ｍＭである５種類の試料を調製した。また、１価アニオンの電解質塩を添加しない点以外は同様の手順により、基準試料を調製した。参考例１と同じセンサーチップ及び測定装置を用いて電流値を測定した。

図２１は、本実施例において測定された電流値と試料中に含まれるクレアチニンの濃度との関係を示すグラフである。図２１において、黒丸が本実施例のデータ、白丸は基準試料のデータを示す。

基準試料の場合、クレアチニンの濃度の増加に応じた電流値の増加が確認された。一方、本実施例の試料の場合、基準試料と比較して電流値は減少したが、クレアチニンの濃度に応じた酸化電流値の増加が確認された。本実施例の試料と基準試料との間において、クレアチニン濃度に対する電流値の傾きに相違は観察されなかった。以上の結果から、１価アニオンの電解質塩であるメチル硫酸ナトリウムは、Ｍ−ＰＭＳの不安定性の解消にのみ寄与し、Ｍ−ＰＭＳとクレアチニンとの間の反応には影響を与えないことが確認できた。

以上の結果は、次のように説明することができる。リン酸緩衝液中において、クレアチニンとＭ−ＰＭＳと反応が促進され、反応生成物が生じる。生じた反応生成物は、第１の電極により酸化され、電流が生じる。生じた電流値は反応したクレアチニン濃度に依存するため、クレアチニンの検出が達成される。しかし、基準試料においては、Ｍ−ＰＭＳはリン酸イオンにより不安定化され、不安定生成物に由来した酸化電流値の増加が生じる。本実施例においては、１価アニオンの電解質塩であるメチル硫酸ナトリウムの存在により、Ｍ−ＰＭＳの不安定化は解消される。そのため、不安定生成物に由来した酸化電流値の増加は消失する。一方で、メチル硫酸ナトリウムは、Ｍ−ＰＭＳとクレアチニンの反応を阻害しない。

（参考例２）
次に、本発明による測定再現性向上の効果について調べるために、以下の実験を行った。本参考例では、１価アニオンの電解質塩として、メチル硫酸ナトリウム及び硝酸ナトリウムを用いた。

本参考例においては、Ｍ−ＰＭＳの濃度を１００ｍＭに固定し、１価アニオンの電解質塩の濃度およびリン酸緩衝剤の濃度を変化させ、試料中のイオン組成を変化させた。調製した試料について、参考例１と同様のセンサーチップ及び測定装置を用いて、Ｍ−ＰＭＳの添加から１分後の電流値を計測した。第２の電極に対して４００ｍＶの電位を第１の電極に５秒間印加し、印加開始５秒後の電流値を計測した。この計測を、同条件の試料に対して３回行ない、そのときの値のばらつきを変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ、以下、ＣＶ値と略称する）により評価した。

図２２は、１価アニオンの電解質塩としてメチル硫酸ナトリウムを用いた場合に得られたＣＶ値と、Ｍ−ＰＭＳ濃度及び電解質塩濃度の総和に対するリン酸緩衝剤濃度（リン原子の濃度）の比との関係を示すグラフである。図２３は、１価アニオンの電解質塩として硝酸ナトリウムを用いた場合に得られたＣＶ値と、Ｍ−ＰＭＳ濃度及び電解質塩濃度の総和に対するリン酸緩衝剤濃度（リン原子の濃度）の比との関係を示すグラフである。図２２及び２３からわかるように、溶液中に存在するＭ−ＰＭＳ濃度及び電解質塩濃度の総和に対してリン酸緩衝剤の濃度が上昇するにつれ、Ｍ−ＰＭＳの酸化電流値のばらつきが増加した。１価アニオンの電解質塩の添加量を増加させ、溶液中の１価アニオンの電解質塩の濃度を増加させることにより、Ｍ−ＰＭＳの酸化電流値のばらつきの低減に成功した。さらに、Ｍ−ＰＭＳ濃度と電解質塩濃度の総和が、リン酸緩衝剤に対して２倍以上の濃度のとき、Ｍ−ＰＭＳの酸化電流値のばらつきが５％以内に到達した。クレアチニンを含んでいない溶液中で、Ｍ−ＰＭＳの酸化電流値のばらつきが５％以内であれば、Ｍ−ＰＭＳを用いたクレアチニンを計測するセンサとして十分な信頼性を得ることができる。そのため、リン酸緩衝剤に対して、Ｍ−ＰＭＳ濃度と電解質塩濃度の総和が２倍以上となるような、試薬組成が最適であることがわかった。

以上の結果より、Ｍ−ＰＭＳとリン酸緩衝剤から構成される試薬組成物に、１価アニオンを生じる電解質塩を加えることにより、Ｍ−ＰＭＳの安定化が促されることが確認できた。加える電解質塩の量は、試薬組成物中に含まれるリン酸系緩衝剤の量が、１価アニオンの電解質塩の量とＭ−ＰＭＳの量との合計の２分の１以下であれば十分であることを確認することができた。

本発明は、試料、特に尿などの生体試料中に含まれるクレアチニンを定量する際に有用である。

１００、４００ クレアチニン濃度測定デバイス
１０２ 第１の基板
１０４ 第２の基板
１０６ スペーサ（第１のスペーサ）
１０８、７０８ 空気孔
１１０、７１０ スリット
１１２ 第１の電極
１１４ 第２の電極
１２２ 第１のリード
１２４ 第２のリード
１３０ 試薬層
１３２ 試料導入口（第１の試料導入口）
２００、５００ クレアチニン濃度測定装置
２０２ 筐体
２０４ ディスプレイ
２０６ 測定開始ボタン
２０８ 測定デバイス取付け部
３０２ 電圧印加部
３０４ 電気信号検出部
３０６ 制御部
３０８ 計時部
３１０ 記憶部
５０２ 光源
５０４ 受光器
７００、１０００ 塩分量測定デバイス
７０２ 第１の面
７０４ 第３の基板
７０６ 第２のスペーサ
７１２ 第１の電極または第３の電極
７１４ 第２の電極または第４の電極
７１６ 第３の電極または第５の電極
７１８ 第４の電極または第６の電極
７２２ 第１のリードまたは第３のリード
７２４ 第２のリードまたは第４のリード
７２６ 第３のリードまたは第５のリード
７２８ 第４のリードまたは第６のリード
７３２ 第２の試料導入口
８０２ 第２の面
９００、１３００ 塩分量測定装置
９０２ 定電流交流電源
９０４ 電圧検出器

Claims (23)

1. （Ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、クレアチニンを含む試料と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬とを混合して、前記クレアチニンによって、前記１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを還元させる工程、
   （Ｂ）前記工程Ａにおいて還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する工程、並びに
   （Ｃ）前記工程Ｂにおいて測定された前記還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量に基づき、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める工程、を含む、クレアチニン濃度測定方法。
2. 前記工程（Ａ）における前記試料のｐＨが、５以上１０以下である、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
3. 前記工程（Ａ）における前記試料のｐＨが、６以上７以下である、請求項２に記載のクレアチニン濃度測定方法。
4. 前記クレアチニン定量用試薬が、メチルスルフェートアニオンをさらに含む、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
5. 前記工程Ａにおいて、
   前記試料にリン酸系緩衝剤をさらに混合する、請求項３に記載のクレアチニン濃度測定方法。
6. 前記リン酸系緩衝剤が、リン酸水素塩及びリン酸二水素塩を含む、請求項５に記載のクレアチニン濃度測定方法。
7. 前記工程Ａにおいて、
   前記試料に、１価アニオンの電解質塩をさらに混合する、請求項３に記載のクレアチニン濃度測定方法。
8. 前記１価アニオンが、塩化物イオン、硝酸イオン及びメチル硫酸イオンからなる群より選択される、請求項７に記載のクレアチニン濃度測定方法。
9. 前記リン酸系緩衝剤のモル量が、前記１価アニオンの電解質塩のモル量と前記１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムのモル量との合計の２分の１以下である、請求項７に記載のクレアチニン濃度測定方法。
10. 前記工程Ｂが、
    （Ｄ）前記試料に２つ以上の電極を接触させ、前記２つの電極間に電圧を印加する工程、及び
    （Ｅ）前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する工程を含み、
    前記工程Ｃにおいて、
    前記工程Ｅにおいて検出された前記電流値または前記電荷量に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
11. 前記工程Ｂが、
    （Ｆ）前記試料に入射光を照射する工程、及び
    （Ｇ）前記試料を透過した透過光または前記試料において反射した反射光を検出する工程を含み、
    前記工程Ｃにおいて、
    前記工程Ｇにおいて検出された前記透過光または前記反射光の強度に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項１に記載のクレアチニン濃度測定方法。
12. （ａ）クレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で、試料である尿と、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬とを混合して、前記尿中に含まれるクレアチニンによって、前記１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを還元させる工程、
    （ｂ）前記工程ａにおいて還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する工程、
    （ｃ）前記尿の電気特性を測定する工程、及び
    （ｄ）前記工程ｂにおいて測定された前記還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、前記工程ｃにおいて測定された前記電気特性とに基づいて、前記尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める工程、を含む、塩分量測定方法。
13. 前記工程（ｃ）が、前記工程（ａ）の前に行われる、請求項１２に記載の塩分量測定方法。
14. 前記工程（ｃ）が、前記工程（ｂ）の後かつ前記工程（ｄ）の前に行われる、請求項１２に記載の塩分量測定方法。
15. クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
    前記試料収容室と連通し、前記試料収容室内に前記試料を導入するための試料導入口と、
    前記試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、
    前記試料収容室内に配置された２つ以上の電極、または前記試料収容室に形成された光学測定用の窓部と、を備えるクレアチニン濃度測定デバイス。
16. 前記試料収容室内に、リン酸系緩衝剤をさらに備える、請求項１５に記載のクレアチニン濃度測定デバイス。
17. 前記試料収容室内に、１価アニオンの電解質塩をさらに備える、請求項１６に記載のクレアチニン濃度測定デバイス。
18. 試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
    前記第１の試料収容室と連通し、前記第１の試料収容室内に前記尿を導入するための第１の試料導入口と、
    前記第１の試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、
    前記尿を収容するための第２の試料収容室と、
    前記第２の試料収容室と連通し、前記第２の試料収容室内に前記尿を導入するための第２の試料導入口と、
    前記第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備える塩分量測定デバイス。
19. 前記第１の試料収容室内に、２つ以上の電極をさらに備える、請求項１８に記載の塩分量測定デバイス。
20. クレアチニンを含む試料をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための試料収容室と、
    前記試料収容室と連通し、前記試料収容室内に前記試料を導入するための試料導入口と、
    前記試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、を備える、クレアチニン濃度測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
    前記試料収容室内において、前記クレアチニンによって還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する測定部、及び
    前記測定部において測定された前記還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量に基づき、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める演算部、を備えるクレアチニン濃度測定装置。
21. 前記クレアチニン濃度測定デバイスが、前記試料収容室内に２つ以上の電極をさらに備え、
    前記測定部が、
    前記２つの電極間に電圧を印加する電圧印加部、及び
    前記２つの電極間に流れる電流値または電荷量を検出する検出部を有し、
    前記演算部が、
    前記検出部により検出された前記電流値または前記電荷量に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項２０に記載のクレアチニン濃度測定装置。
22. 前記測定部が、
    前記測定デバイス取付け部に取付けられた前記クレアチニン濃度測定デバイスの前記試料収容室内に入射する入射光を出射する光源、及び
    前記試料収容室内を透過した透過光または前記試料収容室内において反射した反射光を検出する受光器を有し、
    前記演算部が、
    前記受光器において検出された前記透過光または前記反射光の強度に基づいて、前記試料中に含まれる前記クレアチニンの濃度を求める、請求項２０に記載のクレアチニン濃度測定装置。
23. 試料である尿をクレアチニンに作用する酵素およびピクリン酸のいずれもが存在しない条件で収容するための第１の試料収容室と、
    前記第１の試料収容室と連通し、前記第１の試料収容室内に前記尿を導入するための第１の試料導入口と、
    前記第１の試料収容室内に配置された、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムを含むクレアチニン定量用試薬と、
    前記尿を収容するための第２の試料収容室と、
    前記第２の試料収容室と連通し、前記第２の試料収容室内に前記尿を導入するための第２の試料導入口と、
    前記第２の試料収容室内に配置された２つ以上の電極と、を備える塩分量測定デバイスを取付けるための測定デバイス取付け部、
    前記第１の試料収容室内において、前記クレアチニンによって還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量を、電気化学的または光学的に測定する第１の測定部、
    前記第２の試料収容室内において、前記尿の電気特性を測定する第２の測定部、及び
    前記第１の測定部において測定された前記還元された１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの量と、前記第２の測定部において測定された前記電気特性とに基づき、前記尿中への塩分の排泄量を反映する値を求める演算部、を備える塩分量測定装置。

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