CN104568926B - 一种肌酐的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肌酐的检测方法为：将钴离子溶液、过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及待测肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，检测得到反应产物的发光强度；根据预定的标准曲线，得到待测肌酐溶液中的肌酐含量。本发明利用钴离子催化过氧化氢氧化肌酐，导致发光。由于该方法的发光物为肌酐本身反应的产物，而且没有肌酐存在时钴离子和过氧化氢反应产生的背景信号较低，因此，本发明检测方法的灵敏度高。其次，本发明利用了流动注射分析装置，保证了混合过程与反应时间的高度重现性，在非平衡状态下高效的完成了试样的在线处理与测定，从而使得检测快捷方便。
Description
技术领域
本发明涉及化学发光检测领域，特别涉及肌酐的检测方法。
背景技术
肌酐是肌酸代谢的最终产物，每20克肌肉带血肌酸可产生1毫克肌酐。肌酐主要由肾小球滤过排出体外，临床上检测肌酐是常用的了解肾功能的主要方法之一，其是评估肾小球率过率、糖尿病性肾病、肾衰竭以及肾病综合症不可或缺的指标。并且，肌酐还可以在急性心肌梗塞、慢性心力衰竭、结肠直肠癌和肌肉萎缩症的临床诊断中作为生物标记物。因此，建立新的快速、高效、低成本的肌酐分析方法是很有意义的。
常规的肌酐检测方法有Jaffé法和酶催化法。常规使用的Jaffé法是以非特异性光谱光度测量法为基础的，该方法利用分光光度计对肌酐进行检测，该仪器会导致测量结果偏高；而酶催化法具有较低的检测灵敏度和较窄的线性范围；近年来还建立了一些检测方法，如生物传感分析、离子对色谱法、阳离子交换色谱法、毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术以及反相高效液相色谱法等。但这些方法大部分具有耗时、仪器昂贵、操作复杂、成本高等缺点，且一些方法也仅仅局限于实验室中的检测分析
化学发光分析是一种常用的分析检测方法，具有高灵敏度、线性范围宽、所用仪器设备简单、操作方便、分析速度快、背景噪声小、价廉等优点。并常与流动注射、电化学、毛细管电泳等方法联用，已广泛应用于化学、药学、生命科学、环境科学、食品科学和临床医学等诸多领域。本发明希望研究一种利用化学发光体系检测肌酐的方法。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种肌酐的检测方法，灵敏度高，方法简便。
本发明公开了一种肌酐的检测方法，包括以下步骤：
将钴离子溶液、过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及待测肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，检测得到反应产物的发光强度；
根据预定的标准曲线和所述反应产物的发光强度，得到待测肌酐溶液中的肌酐含量。
优选的，所述预定的标准曲线的获得方法为：
将钴离子溶液，过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及系列浓度的标准肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，分别检测得到系列反应产物的发光强度；
根据标准肌酐溶液的浓度与发光强度，得到标准曲线。
优选的，所述待测肌酐溶液中的肌酐浓度为1×10-7～3×10-5M。
优选的，所述钴离子溶液中的钴离子浓度为0.005～0.2mM。
优选的，所述过氧化氢溶液的浓度为0.1mM～5.0mM。
优选的，所述缓冲液的pH值为7.4～12.5。
优选的，所述钴离子溶液中钴离子浓度为0.02mM，过氧化氢溶液的浓度为1mM，碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液pH9.5。
与现有技术相比，本发明肌酐的检测方法为：将钴离子溶液、过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及待测肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，检测得到反应产物的发光强度；根据预定的标准曲线，得到待测肌酐溶液中的肌酐含量。本发明利用钴离子催化过氧化氢氧化肌酐，导致发光。由于该方法的发光物为肌酐本身反应的产物，而且没有肌酐存在时钴离子和过氧化氢反应产生的背景信号较低，因此，本发明检测方法的灵敏度高。其次，本发明利用了流动注射分析装置，保证了混合过程与反应时间的高度重现性，在非平衡状态下高效的完成率试样的在线处理与测定，从而使得检测快捷方便。
附图说明
图1为流动注射-化学发光分析平台的结构示意图；
图2为化学发光强度-过氧化氢溶液浓度曲线图；
图3为化学发光强度-钴离子溶液浓度曲线图；
图4为化学发光强度-pH曲线图；
图5为实施例1得到的标准曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种肌酐的检测方法，包括以下步骤：
将钴离子溶液、过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及待测肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，检测得到反应产物的发光强度；
根据预定的标准曲线和所述反应产物的发光强度，得到待测肌酐溶液中的肌酐含量。
本发明采用流动注射与化学发光相结合，构建了肌酐的检测方法。本发明发灵敏度高，选择性好，仪器设备简单，操作简单，分析速度快。本发明采用的流动注射分析装置，保证了混合过程与反应时间的高度重现性，在非平衡状态下高效的完成率试样的在线处理与测定，从而使得检测快捷方便。所述流动注射装置包括：样品流通通管路A、B、C，A处添加过氧化氢溶液及缓冲液，B处添加钴离子溶液，C处添加水；D为流动注射泵，E为进样阀；F为化学发光检测仪；G为废液池；H为计算机控制系统。钴离子溶液，过氧化氢溶液和待测肌酐溶液在F处反应，发光，检测得到反应产物的发光强度。所述钴离子溶液中的钴离子浓度优选为0.005～0.2mM，更优选为0.01～0.1mM。所述过氧化氢溶液的浓度优选为0.1mM～5.0mM，更优选为0.9mM～3.0mM。所述缓冲液的pH值优选为7.4～12.5，更优选为8～11。
得到所述反应物的发光强度后，根据预定的标准曲线和所述反应产物的发光强度，得到待测肌酐溶液中的肌酐含量。
所述预定的标准曲线的获得方法为：
将钴离子水溶液，过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及系列浓度的标准肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，分别检测得到系列反应产物的发光强度；
根据标准肌酐溶液的浓度与发光强度，得到标准曲线。
在所述方法中，所述钴离子溶液中的钴离子浓度优选为0.005～0.2mM，更优选为0.01～0.1mM。所述过氧化氢溶液的浓度优选为0.1mM～5.0mM，更优选为0.9mM～3.0mM。所述缓冲液的pH值优选为7.4～12.5，更优选为8～11。
优选的对钴离子溶液的浓度，过氧化氢溶液浓度及碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的pH进行筛选。具体为：将过氧化氢溶液浓度、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的pH值及肌酐溶液的浓度确定为固定值，将钴离子溶液的浓度在0.005～0.6mM范围内取值，根据钴离子浓度和发光强度的关系，确定发光强度最强处的钴离子浓度为最佳值。
将钴离子溶液的浓度、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的pH值及肌酐溶液的浓度确定为固定值，将过氧化氢溶液浓度在0.1mM～5.0mM范围内取值，根据过氧化氢溶液浓度和发光强度的关系，确定发光强度最强处的过氧化氢溶液浓度为最佳值。
将钴离子溶液的浓度、过氧化氢溶液浓度及肌酐溶液的浓度确定为固定值，将碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的pH值在7.4～12.5范围内取值，根据碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的pH值和发光强度的关系，确定发光强度最强处的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的pH值为最佳值。
经过筛选后，得到的钴离子水溶液中钴离子浓度为0.02mM，过氧化氢溶液的浓度为1mM，碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液pH9.5。
将筛选后的最佳浓度的钴离子水溶液，过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及标准浓度的肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，检测得到反应产物的发光强度；根据标准肌酐溶液的浓度与发光强度，得到标准曲线。按照本发明，所述待测肌酐溶液中的肌酐浓度优选为1×10-7～3×10-5M。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的肌酐的检测方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
流动注射-化学发光分析平台，参见图1，图1为流动注射-化学发光分析平台的结构示意图：包括样品流通通管路A、B、C，A处添加过氧化氢溶液及缓冲液，B处添加钴离子溶液，C处添加水；D为流动注射泵，E为进样阀；F为化学发光检测仪；G为废液池；H为计算机控制系统。
0.03mM钴离子的水溶液、0.1M pH9.5的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和0.01mM的肌酐溶液在流动注射分析装置中混合，分别添加浓度为0.1mM、0.5mM、1mM、2.5mM、5mM的过氧化氢溶液反应，检测得到反应产物的发光强度。化学发光强度-过氧化氢溶液浓度曲线如图2所示。由图2可知，在低浓度处随着过氧化氢浓度的增长化学发光强度增强，但当到一定浓度后随着浓度继续增加化学发光强度反而降低，可能是因为一些副反应的发生对化学发光强度产生抑制作用。因此最佳过氧化氢浓度为1mM。
1mM过氧化氢溶液、0.1M pH9.5的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液和0.01mM的肌酐溶液在流动注射分析装置中混合，分别添加浓度为0.005mM、0.01mM、0.025mM、0.03mM、0.05mM、0.08mM、0.1mM、0.2mM钴离子的水溶液反应，检测得到反应产物的发光强度。化学发光强度-钴离子溶液浓度曲线如图3所示。由图3可知，检测的钴离子浓度是从0.005mM～0.2mM,当钴离子浓度达到0.02mM时化学发光强度不再增加，可能是因为在较高pH条件下钴离子会形成氢氧化物，降低自由离子的浓度。最佳钴离子浓度为0.02mM。
2.5mM过氧化氢溶液、0.03mM钴离子溶液和0.01mM的肌酐溶液在流动注射分析装置中混合，分别添加pH7.5、pH8、pH9.5、pH10.5、pH11.5、pH12.5的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液反应，检测得到反应产物的发光强度。化学发光强度-pH曲线如图4所示。由图4可知，检测的pH范围为7.4-12.5，在pH7.4～9.5时化学发光强度是随着pH增加而增加的，pH 9.5以后则是随着pH增加而降低的。因此最佳pH为9.5。
根据上述条件的优化，确定制作标准曲线的条件为：钴离子浓度为0.02mM，过氧化氢浓度为1mM，pH为9.5碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液。
1mM过氧化氢溶液、0.02mM钴离子溶液、0.1M pH9.5的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液在流动注射分析装置中混合，分别添加是1×10-7M，3×10-7M，1×10-6M，3×10-6M,1×10-5M,3×10-6M的肌酐溶液反应，检测得到反应产物的发光强度。根据肌酐溶液的浓度及发光强度制作标准曲线。图5为实施例1得到的标准曲线。
化学发光强度与肌酐浓度的对数呈现线性关系，其线性范围为1×10-7-3×10-5M，线性相关系数为0.996，线性方程为化学发光强度y＝28060.95461+3924.53225(log conc.(molL-1))，进行7次平行实验所得相对标准偏差为1.2％(n＝7)，检测限(S/N＝3)为84.39214×10-7M。
实施例2
制备实际样品：
将尿液稀释1000倍，将肌酐加入到尿液中，制备得到肌酐浓度为10μmol/L的样品。
利用图1所示的流动注射-化学发光分析平台进行检测。A、B处分别进样1mM过氧化氢/pH 9.5的0.1M碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液和0.02mM钴离子水溶液，C处进二次水，再由进样阀E加入200uL不同浓度肌酐样品，F处记录发光强度信号，通过得到的发光强度，根据线性方程得到实际样品的浓度。结果参见表1。
实施例3
制备实际样品：
将尿液稀释1000倍，将肌酐加入到尿液中，制备得到肌酐浓度为20μmol/L的样品。
利用图1所示的流动注射-化学发光分析平台进行检测。A、B处分别进样1mM过氧化氢/pH 9.5的0.1M碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液和0.02mM钴离子水溶液，C处进二次水，再由进样阀E加入200uL不同浓度肌酐样品，F处记录发光强度信号，通过得到的发光强度，根据线性方程得到实际样品的浓度。结果参见表1。
实施例4
制备实际样品：
将尿液稀释1000倍，将肌酐加入到尿液中，制备得到肌酐浓度为30μmol/L的样品。
利用图1所示的流动注射-化学发光分析平台进行检测。A、B处分别进样1mM过氧化氢/pH 9.5的0.1M碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液和0.02mM钴离子水溶液，C处进二次水，再由进样阀E加入200uL不同浓度肌酐样品，F处记录发光强度信号，通过得到的发光强度，根据线性方程得到实际样品的浓度。结果参见表1。
表1本发明实施例2～4得到的检测结果
样品加标回收：相同的样品取4份，其中3份加入定量的待测成分标准物质，1份为空白对照，空白对照为稀释1000倍的尿液，其中不加肌酐；4份同时按相同的分析步骤分析，加标的3份所得的结果减去空白对照所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。
加标回收率＝(加标试样测定值－空白测定值)÷加标量×100％.
由表1可以看出，本方的检测方法得到的肌酐的检测值与真实值接近，回收率较高，灵敏度高。另外，提供的检测方法操作简单，具有良好的选择性。
将实际尿液中存在的其他物质与3uM的肌酐相混合进行了发光检测，结果参加表2。
表2干扰测试结果
表2中，左侧第一列为实际尿液中干扰物质，第二列为实际尿液中干扰物质的含量，第三列为实际进行干扰检测时使用的干扰物质浓度及肌酐浓度，第四列为所测得的相对强度，根据实验可知尿液中的干扰物质对该方法检测肌酐不会产生干扰，说明该方法选择性很好。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种肌酐的检测方法，包括以下步骤：
将钴离子溶液、过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及待测肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，检测得到反应产物的发光强度；
根据预定的标准曲线和所述反应产物的发光强度，得到待测肌酐溶液中的肌酐含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述预定的标准曲线的获得方法为：
将钴离子溶液，过氧化氢溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及系列浓度的标准肌酐溶液在流动注射分析装置中混合反应，分别检测得到系列反应产物的发光强度；
根据标准肌酐溶液的浓度与发光强度，得到标准曲线。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测肌酐溶液中的肌酐浓度为1×10-7～3×10-5M。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述钴离子溶液中的钴离子浓度为0.005～0.2mM。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述过氧化氢溶液的浓度为0.1mM～5.0mM。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为7.4～12.5。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述钴离子溶液中钴离子浓度为0.02mM，过氧化氢溶液的浓度为1mM，碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液pH 9.5。
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