JPS6333661A - クレアチニン定量用試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、クレアチニン定量用試薬組成物、詳しくは尿
を始めとする各種クレアチン及び／又はクレアチニン含
有物質中の該クレアチン又はクレアチニンの定量に好適
に利用できる試薬組成物に関する。

従　　来　　の　　技　　術 クレアチニンは、クレアチン代謝の老廃産物であり、そ
の測定は、腎機能の極めて有用な指標となっている。ま
た、その由来物質であるクレアチンは、筋肉崩壊の盛ん
な時、即ち、飢餓、進行性筋ジストロフィ、強直性筋ジ
ストロフィ、高度の二次的筋萎縮、妊娠、甲状腺機能几
進症、糖尿病、癌腫等の場合に、増量することが知られ
ており、殊に筋肉疾患の鑑別診断上で重要な意義が認め
られている。

上記測定法としては、例えばアルカリ性ピクリン酸溶液
、アルカリ性３．５−ジニトロ安息香酸溶液又は１，４
−ナフトキノン−２−ボタジウムスルホネート等を用い
た呈色反応によるクレアチニンの定温法が知られており
、またサンプル中のクレアチンをクレアチニンに転化す
ることにより、該転化操作前後のクレアチニンｊを測定
して、両者の差を求めることによりクレアチン量を求め
る方法等が知られている（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅ
ｍ、。

＜１９３６）：Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、３４．８５４（
１９，５２）　　；　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　　１５゜８７９　　（１９６９）　　等〕
　。

しかしながら上記公知の各種試薬は、いずれも液状を呈
しておりクレアチニンの定量のためにはサンプル液との
充分な混合が必須の要件となり、この混合操作の面で繁
雑さがあり、また得られる混合液は長期保存には適して
おらず、更に該液の１）Ｈによっては変色するおそれが
あった。また公知の各種試薬は、これを用いてクレアチ
ニンを含むサンプル液を定量する際、両者の混合状態に
より呈色度合がばらつき正確な定量が行ない難く、しか
もこの混合液は安定性に乏しく経時的にその呈色度合が
変化し、定量結果を保存できない欠点があるに加え、定
量の精度及び感度も尚、改善される余地があった。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記の如き従来技術の欠点を悉く解消
して、より簡便な操作で、より高精度、高感度をもって
クレアチニンの定量を行なうことができ、しかも定量結
果をそのまま長期に亘って保存できる手段をも提供でき
る新しい定量用試薬を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、（１）ピクリン酸又は３．５−ジニト
ロ安息香酸０．０３〜０．２０！＋　／ｄ　２、く２）
塩基性化合物０．０４〜４Ｎ及び（３）寒天１〜５重量
％を有効成分として含有することを特徴とするクレアチ
ニン定量用試薬組成物示提供される。

本発明者は、クレアチニンの呈色反応を利用したクレア
チニン定量用試薬につき鋭意研究を重ねた結果、呈色剤
としてピクリン酸及び３．５−ジニトロ安息香酸を選択
し、且つ上記特定の配合比率で該呈色剤の少なくとも１
種と塩基性化合物とを寒天ゲルと混合してゲル状組成物
とするときには、該ゲルはその表面にサンプルを微１ス
ポツトするのみで、ゲル中に含まれる呈色剤が該サンプ
ルに含まれるクレアチニンと結合して変色し、その呈色
度合はサンプルのクレアチニン濃度を正確に反映し、し
かもばらつきがなく、更にこの呈色したゲルは極めて安
定で経時的に上記呈色度合が変化することもなく、かく
して非常に簡便な操作で高精度、高感度をもってクレア
チニンの定量を行ない得ることを見出した。また上記組
成物はゲル状であるがための特徴として、その定量結果
を例えばニトロセルロース膜等に正確に転写することが
でき、而して該結果を半永久的に長期間保存できること
をも見出した。

上記ゲルはまたこれを例えば適当な平板状とすれば該平
板上に多数のサンプルをスポットでき、これにより上記
多数のサンプルの定理を同時に行なうことができ、更に
上記ゲルはこれを紙、プラスチックス等の適当な材質の
テープの一端に付着させれば、蛋白定石用テストテープ
として利用でき、該テープはこれをサンプル液に浸すか
、これにサンプル液を注ぐ等のサンプル液との簡単な接
触操作により容易に変色して所望の高精度の定量が行な
い得る。

本発明のクレアチニン定量用試薬組成物は、（１）ピク
リン酸又は３．５−ジニトロ安息香酸０．０３〜０．２
０ｇ／ｄ　Ｑ　（終濃度、以下同じ）、好ましくは約０
．１０／ｄＱ前後、（２）塩基性化合物０．０４〜４Ｏ
Ｎ、好ましくは約０．２Ｎ＠Ｉ及び＜３）寒天１〜５重
ｆｆｉ％、好ましくは約１．５重は％前後を有効成分と
して含有することが重要である。

ここで（１）の呈色剤としては、ピクリン酸を採用する
のがより好ましい。また（２）の塩基性化合物としては
、特に制限はないが、（１）の呈色剤として用いるクレ
アチニン測定に常用される塩基性化合物、例えば通常の
各種の無機塩基が好ましく使用でき、特に水酸化ナトリ
ウムは最適である。

本発明者の研究によれば、本発明組成物をゲル状とする
ために利用される寒天と呈色剤として利用されるピクリ
ン酸又は３．５−ジニトロ安息香酸との組合せは、殊に
該組成物の特性に重大な影響を与えることが確認されて
いる。而して、上記寒天以外のゲル、例えばアクリルア
ミドゲル等では、これを上記呈色剤と組合せてゲル状組
成物を収得できても、該組成物はクレアチニン定量用試
薬としての本発明所期の効果を発揮できない。また上記
ピクリン酸及び３．５−ジニトロ安息香酸以外の呈色剤
は、これを寒天と組合せて利用しても、クレアチニン定
量用試薬としての本発明所期の効果を発揮できない。即
ち、上記いずれの組成物も、調製された組成物自体に既
に呈色が強く認められ、クレアチニン定量に際しては、
そのバックグラウンドが高すぎ、側底所望の効果を奏し
得ない。

本発明組成物は、上記〈１）〜（３）成分の所定量を配
合することにより調製され、そのｖＡ調製法は特に限定
的ではないが、通常好ましくは、（３）成分である寒天
を蒸留水に加えて加温溶解した溶液に、〈１）成分及び
（２）成分の混合物を添加混合して所望の形状、大きさ
のゲル状物とすればよい。

また本発明の組成物には、必要に応じて通常の緩衝液、
例えば０．２Ｍ塩化カリウム１０．２Ｎ塩酸、０．２Ｍ
フタル酸水素カリウム１０．２Ｎ塩酸等のクラーク−ラ
プス援衝液、０．１Ｍグリシン１０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム１０．１Ｎ塩酸、０．１Ｍクエン酸ナトリウム１０．
１Ｎ塩酸等のセーレンセン緩衝液、０．１Ｍクエン酸二
水素カリウム１０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍクエン酸二
水素カリウム１０．１Ｎ塩酸等のコルトン緩衝液、０．
１Ｎ酒石酸１０．１Ｍ酒石酸ナトリウム等のミバエリス
緩衝液、１Ｍ酢酸ナトリウム／１Ｎ塩酸等のワルボール
緩衝液、０．４Ｍ（リン酸−氷酢酸一硼ｉ！ｌり混合液
１０．２Ｎ水酸化ナトリウム等のブリトン−〇ビンソン
広域緩衝液等や、適当な溶媒、例えばメタノール、エタ
ノール等の低級アルコール類、ジメチルスルホキシド、
ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミド
等を添加することもできる。

本発明組成物は、適当な支持体上に該組成物のｉｎを形
成させた形態でクレアチニン定量用試薬として実用され
る。上記支持体は、例えば適当な凹部を有する基板等の
容器であってもよく、また紙、プラスチックス等の適当
な材質のテープ等で−あってもよく、２等支持体の形状
、大きさ等は該支持体が本発明組成物を支持でき、且つ
得られる試薬がサンプルと接触反応して呈色できる限り
任意である。

以下、特に好ましい上記試薬の実施態様を添附図面によ
り説明する。

第１図は、透明な支持体（１）の四部（１ａ）に本発明
組成物の薄層（２）を形成させたプレート状形態のクレ
アチニン定量用試薬の斜視図であり、該支持体の凹部（
１ａ）は約６５１１１１１１×８５■ｘ２ｍｍ（厚さ）
の大きさを有している。該図では、四部（１ａ）の中央
に横軸方向に５個のサンプルく各約２０ｕＱづつ）がス
ポットされているがこのスポット数はサンプル渭に応じ
て、各スポットが重ならない限り任意に選択でき、また
当然に支持体の凹部の大きざに応じて適宜選択できる。

第１図に示す大きさのプレート状試薬の場合、通常縦Ｉ
　Ｃ１、横４．５ｃｍの間隔で５列５行に合計２５個の
サンプルが滴下できる。後述するデンシトメーターによ
る定量の際には、各列に１個の標準液（通常２０１Ｉ１
ｇ／ｄＱ）を滴下するのが好ましい。

上記支持体（１）には、更にその周縁部に突起（３）と
孔（４）とが形成されており、之等を利用して、該支持
体（１）と同形の支持体により蓋をすることができ、こ
れによりサンプルのスポットを保存することができる。

上記保存はまた、サンプルのスポットを、例えばニトロ
セルロース膜等の薄膜に転写することにより一層確実な
ものとすることができる。かかる手段によるサンプルの
スポットの半永久的保存は、従来の液状試薬では勿論不
可能である。尚、上記支持体（１）及びその有する凹部
（１ａ）の形状及び大きさは、図示されたものに限定さ
れず、任意に変更できる。かかるプレートの利用によれ
ば同時に多数のサンプルを処理することができる。

第２図には、テープ状支持体（１）の一端に本発明組成
物（２）を付着させたテープ状形態の本発明試薬が示さ
れている。この試薬は本発明組成物の加温液に適当な大
きさの支持体の一端を浸漬して、該端部に組成物を付着
乃至含浸させて膜を形成させた債、これを支持体（１）
のテープ状形状に切断するか、又は既に所定のテープ状
形状に成形した支持体（１）の一端に同様にして膜を形
成させることにより容易に調製できる。また上記調製に
当っては、支持体と本発明組成物との密着性を確保する
ために適当な接着剤を利用することもできる。このテー
プ状試薬はサンプル液中に浸すのみで非常に簡便にサン
プル中のクレアチニンの定量を行なうことができる。

上記のごとくして得られる本発明試薬により定量できる
クレアチン及び／又はクレアチニンを含むサンプルとし
ては、例えば尿及び血清等を例示できる。殊に本発明の
クレアチニン定母用試薬は、クレアチニンに対して高感
度であり、その定ω、分析を極少借の試薬により実施で
き、またサンプルも少量でよく、更にサンプル中のクレ
アチニン濃度がかなり低い場合にも正確にこれを測定す
ることができる。サンプル凶は前述した通り特に制限さ
れるものではないが、例えば前記プレート状形態の本発
明試薬の場合は、約１０〜５０μＱ、通常２０μＱ程度
とするのが適当である。尚、上記サンプルは、事前にク
レアチニンの測定において常用される通常の精製ステッ
プに付すこともできる。該精製ステップとしては、例え
ば通常の除蛋白剤又は膜透析による除蛋白操作、揮発に
よるケトン体除去操作、硫酸第二セリウムによるピルビ
ン酸分解操作、沃素によるアスコルビン酸、アセトン、
アセト酢酸の除去操作、エーテル抽出、ｐＨ差、エルロ
イド（Ｌ　１ｏｙｄ）試薬及び陽イオン交換レジンによ
る処理操作等を例示できる〔ブラットウェル、臨床計査
学第１巻、臨床化学、第５５８〜５７１頁、１９５６年
、医学書院〕。

本発明試薬によるサンプル中のクレアチニン濃度の定量
は、試薬とサンプルとを接触させることにより生ずる呈
色度合を測定することにより行なわれる。この呈色度合
の測定は、例えば通常利用されているデンシトメーター
（ミクロホトメーター）、分光光度計、比色計等の光学
機器を用いる測定によることもでき、また裸眼比色法に
よることもできる。上記機器測定による場合、より具体
的には、予め所定濃度のクレアチニンを含有する標準サ
ンプルにつきその濃度と出力値との関係を求めて検量線
を作成し、サンプルの出力値からそのクレアチニン濃度
を上記検量線より読み取ればよい。また本発明試薬は、
呈色性に優れ、クレアチニン濃度が高い程、呈色度合が
濃くなり、よく赤褐色乃至赤紫色に染まるものであるた
め、裸眼比色法による測定を容易に且つ正確に行ない得
る利点がある。この場合は、サンプルの呈色度合を、標
準サンプルのそれと対比することにより、サンプル中の
クレアチニン濃度が定量できる。尚、上記において、サ
ンプル中に含まれるクレアチンを、例えば加熱脱水によ
り、クレアチニンに転化させ、これをサンプルとして本
発明試薬により、クレアチニン量を測定し、この転化操
作前後のクレアチニン量の差を求めることにより、サン
プル中のクレアチンの測定を行なうこともできる。

発　　明　　の　　効　　果 本発明のクレアチニン定量用試薬組成物の利用によれば
、各種サンプル中のクレアチン又はクレアチニン濃度を
、簡便な操作で、高＠度、高精度でしかも迅速に定量す
ることができ、また多数のサンプルをも一度に処理でき
、更に定量結果を長期に亘って半永久的に保存しておく
ことができる。

従って、本発明試薬は、クレアチン及びクレアチニン検
査薬として、医薬分野等で非常に有用である。

実　　　施　　　例 以下、本発明を実施例を挙げて説明する。

実施例１ （１）ピクリン酸　　　　　　約０．１ｇ／ｄ（２（０
，１２５） （２）水酸化ナトリウム　　　約０．２Ｎ（０，１８８
） （３）寒天 （片山化学社製、１級）　約１．５重量％有効成分が上
記組成となるように試薬を調製した。即ち、寒天を蒸留
水に加えて加温溶解して、３重量％濃度の寒天溶液を得
、これを７０℃前後に保持した（以下「Ａ液」という）
。

一方、０．５ｇ／ｄ　Ｑピクリン酸水溶液とＱ、７５Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液とを等量混合して、混合液（以
下「Ｂ液」という）を得た。

Ａ液とＢ液との等量をよく混合して、本発明のゲル状り
レアチニン定量用試薬組成物を得た。

実施例２ 実施例１で得た本発明ゲル状クレアチニン定量用試薬組
成物を、第１図に示すプレートの凹部に厚さ１〜２ｆｆ
ｌＩｌｌとなるように注入後、その表面を充分乾燥（酊
卵器−乾燥）させて、プレート状形態の本発明クレアチ
ニン定惜用試薬試料を得た。

実施例３ 実施例１で得た本発明ゲル状りレアチニン定邑用試薬組
成物を、フィルム（［ゲルボンド５３７４６Ｊ　、ＦＭ
Ｃコーポレーション社製）の一端に載せ（幅約５１１ｍ
）、乾燥後、約５ｍｍ幅に切断して、第２図に示すステ
ィック状形態の本発明クレアチニン定量用試薬試料を得
た。

くクレアチニンの定世試験〉 エ　デンシトメーターによる測定法 予めクレアチニンを１０ｍｑ／ｄ　（１〜１００＋１１
＋Ｊ／ｄＱの各濃度となるように蒸留水に溶解させて作
成した標準サンプルの各々２０μＱを、マイクロピペッ
ト（ギルソン社製）にて、上記実施例２で得た試薬試料
にスポットし、自然乾燥させた。

上記各スポットの呈色度合を、デンシトメーター（ＡＤ
Ｃ−２０ＥＸ、萱垣医理科工業株式会社製）を用いて測
定し、検量線を作成した。

得られた結果を第３図に示す。図において横軸はサンプ
ル中のクレアチニン濃度（ｕ／ｄ　Ｑ　）を、また縦軸
はデンシトメーターによるピーク面積比（％）をそれぞ
れ示し、結果は平均上標準偏差（Ｓ、Ｄ、）（ｎ　＝１
０）で示される。

検体のクレアチニン濃度は、該検体を上記と同様に処理
することにより、上記検量線から定理される。

■　裸眼比色法による測定法 上記工と同様にして、所定のクレアチニン濃度の標準サ
ンプルを調製し、上記実施例２で得た本発明試薬試料に
各々２０ｕＱづつスポットした。

その結果を参考写真１に示す。参考写真１に示される通
り、サンプルのクレアチニン濃度１０＋１１（＋／ｄ　
Ｑ程度より呈色が認められ、該クレアチニン濃度に応じ
てスポットの呈色は次第に濃くなり、従って、被検試料
の呈色度合により、そのクレアチニン金回を定量できる
ことが判る。

また上記実施例３で得られた本発明試薬試料を用いて、
これを上記サンプル液に浸漬した場合も、同様の呈色が
認められた。

以上のことから本発明試薬の利用によれば、裸眼比色法
による定量を行ない得ることが明らかである。

■　尿クレアチニンの定量 健常成人の尿１０−を蒸留水で１００−に希釈してサン
プルとした。

また、このサンプルの０．２−に、０．４２ＮＨ２ＳＯ
ム１．６喧及び５％タングステン酸ナトリウム０．２−
を加え、室温で１０分間放置後、遠心分離（２５００ｒ
ｐｍ　、１０分間）して上清を採取し、除蛋白処理を施
したサンプル（除蛋白サンプル）を得た。

上記サンプル及び除蛋白サンプルを用いて、上記工と同
様にして、クレアチニン量を測定した。

その結果を第１表に示す。

第　　１　　表 １　　　９３．１　８２．１ ２　　　９１．６　９３．５ ３　　　３９．４　５０．９ ４　　　８６．２　９３．９ ５　　　４８．０　４５．２ ６　　　１０３．２　９２．０ ７　　　５２．５　４７．２ ８　　　９５．１　８４．６ ９　　　９７．３　８４．６ １０　　　９１．４　７８．８ １１　　　９１．４　７７．４ １２　　　９８．０　８４．０ １３　　　８９．７　８８．９ １４　　　７７．３　６６．８ （平均）　　　　　　（８２，４）　　　（７６，４）
除蛋白サンプル及びサンプルの両者において、クレアチ
ニン量は、よい相関性が得られ（相関係数ｒ−Ｑ、９１
７）、原尿当りのクレアチニン量（僧ｇ／ｄ＋２尿）は
、平均（ｎ＝１４．男）７６．４　（サンプル）及び８
２．４＜除蛋白サンプル）であった。

尚、クレアチン量の測定のための、該クレアチンのクレ
アチニンへの転化操作は、サンプルを例えば沸騰水浴中
９０分間程度の加熱操作に付すことにより行なうことが
できる。また該操作の前後のクレアチニン量を上記に従
い測定し、その差を求めることにより、容易にクレアチ
ン量を求めることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明組成物を利用したクレアチ
ニン定量用試薬の好ましい実施態様を示す斜視図であり
、図中各記号は以下の通りである。 また第３図は、上記試薬を用いて測定された標準サンプ
ルのクレアチニン含量とデンシトメーターによるピーク
面積との関係を示すグラフ〈検１線）である。 （１）・・・・・・支持体、（１ａ）・・・・・・支持
体の凹部（２）・・・・・・本発明組成物 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］（１）ピクリン酸又は３，５−ジニトロ安息香酸
   ０．０３〜０．２０ｇ／ｄｌ、 （２）塩基性化合物０．０４〜０．４Ｎ及び（３）寒天
   １〜５重量％ を有効成分として含有することを特徴とするクレアチニ
   ン定量用試薬組成物。