DE3752230T2

DE3752230T2 - Teststreifen zur Bestimmung von Glukose in einer Vollblutprobe

Info

Publication number: DE3752230T2
Application number: DE3752230T
Authority: DE
Inventors: Frank San Mateo Ca 94402 Jurik; Geoffrey Scotts Valley Ca 95066 Mcgarraugh; Roger Palo Alto Ca 94303 Phillips; Ray Red Bluff Ca 96080 Underwood
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1987-08-07
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2007-08-08
Also published as: JPS63101757A; NO923399D0; DE3787851T3; ATE300620T1; US4935346A; EP0256806B1; ES2124490T3; FI873356A; US5304468A; FI93149B; EP0473241A3; ATE96179T1; FI93149C; CN1011919B; EP0816849A3; FI951491A; DE3752328D1; CN1050930A; EP0656423A1; DE3752386T2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen nicht verwischbaren Teststreifen zur kolorimetrischen Bestimmung der Glucosekonzentration in Vollblut.
Der mengenmäßige Nachweis von chemischen und biochemischen Komponenten in gefärbten wässrigen Flüssigkeiten, insbesondere gefärbten biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Vollblut und Urin und biologischen Fluidderivaten wie Blutserum und Blutplasma, ist von ständig wachsender Bedeutung. Wichtige Anwendungen bestehen in der medizinischen Diagnose und Behandlung und in der mengenmäßigen Bestimmung der Exposition durch therapeutische Arzneimittel, Rauschmittel, gefährliche Chemikalien und ähnlichem. In einigen Fällen sind die Mengen der zu bestimmenden Substanzen entweder so geringfügig - in der Größenordnung von Mikrogramm oder weniger pro Deziliter - oder so schwer exakt zu bestimmen, daß die verwendete Apparatur kompliziert und nur für ausgebildetes Laborpersonal sinnvoll ist. In solch einem Fall sind die Ergebnisse im allgemeinen nicht innerhalb einiger Stunden oder Tage nach der Probeentnahme verfügbar. In anderen Fällen liegt häufig ein Schwerpunkt in der Fähigkeit von Laienkräften, die Tests routinemäßig, schnell und reproduzierbar außerhalb einer Laboreinrichtung mit einer schnellen oder unverzüglichen Anzeige von Informationen durchzuführen.
Ein üblicher medizinischer Test ist die Messung des Blutzuckergehaltes von Diabetikern. Die momentane Lehre rät Diabetikpatienten, ihren Blutzuckergehalt zwei bis siebenmal pro Tag, abhängig von der Ursache und der Stärke ihrer individuellen Fälle, zu messen. Basierend auf der beobachteten Struktur der gemessenen Blutzuckerwerte regulieren der Patient und der Arzt gemeinsam die Nahrung, die körperliche Betätigung und die Insulineinnahme, um diese Krankheit besser zu bewältigen. Natürlich sollten diese Informationen dem Patienten unmittelbar zur Verfügung stehen.
Momentan verwendet ein Verfahren, daß in den Vereinigten Staaten in weitem Umfang eingesetzt wird, ein Nachweiselement desjenigen Typs, der in der am 17. Januar 1967 für Mast erteilten US-A-3,298,789, beschrieben ist. Bei diesem Verfahren wird eine Probe von frischem Vollblut (typischerweise 20 bis 40 ul) auf einer mit Ethylcellulose beschichteten Reagenzunterlage aufgebracht, die ein Enzymsystem enthält, das eine Glucoseoxidase und eine Peroxidaseaktivität aufweist. Das Enzym reagiert mit Zucker und setzt Wasserstoffperoxid frei. Die Unterlage enthält auch einen Indikator, der bei der Anwesenheit von Peroxidase mit dem Wasserstoffperoxid reagiert, um eine Farbe proportional zu der Intensität des Zuckergehaltes der Probe zu erzeugen.
Ein anderes, weit verbreitetes Blutzuckertestverfahren setzt ähnliche chemische Vorgänge ein, aber verwendet anstelle der mit Ethylcellulose beschichteten Unterlage einen wasserfesten Film, durch den die Enzyme und der Indikator dispergieren. Ein solches System ist in dem US-Patent 3,630,957, das am 28. Dezember 1971 für Rey et al. erteilt worden ist, offenbart.
In beiden Fällen darf die Probe für eine festgelegte Zeit (typischerweise eine Minute) mit der Regenzunterlage in Kontakt bleiben. Dann wird im ersten Fall die Blutprobe mit einem Wasserstrahl abgewaschen, während sie in dem zweiten Fall von dem Film abgewischt wird. Die Reagenzunterlage oder der Film wird dann abgetrocknet und ausgewertet. Die Auswertung wird entweder durch einen Vergleich der erzeugten Farbe mit einer Farbtafel durchgeführt oder indem die Unterlage oder der Film in eine Remissionsgradmeßvorrichtung eingebracht wird, um den Farbintensitätswert abzulesen.
Während die obigen Verfahren seit Jahren zur Glucoseüberwachung verwendet worden sind, besitzen sie gewisse Einschränkungen. Die erforderliche Probenmenge für einen Fingerstichtest ist ziemlich groß und ist für einige Menschen schwierig zu erreichen, deren Kapillarblut sich nicht bereitwillig ausdrücken läßt.
Zusätzlich haben diese Verfahren eine Einschränkung mit anderen einfachen kolorimetrischen Bestimmungen für Laien gemeinsam, daß ihr Ergebnis auf einer absoluten Farbmessung beruht, die wiederum bezogen ist auf den absoluten Grad der Reaktion zwischen der Probe und den Testreagenzien. Die Tatsache, daß die Probe nach dem zeitlich festgelegten Reaktionsintervall von der Reagenzunterlage abgewaschen oder abgewischt werden muß erfordert, daß der Anwender am Ende des zeitlich festgelegten Intervalls in der geforderten Zeit zu wischen oder einen Waschstrahl aufzubringen. Die Tatsache, daß die Reaktion durch Entfernen der Probe gestoppt wird, führt zu einiger Ungenauigkeit im Ergebnis, insbesondere in den Händen von In-Haus-Anwendern. Übermäßiges Waschen kann niedrige Ergebnisse und zu geringfügiges Waschen hohe Resultate ergeben.
Ein anderes Problem, das oft bei einfachen kolorimetrischen Bestimmungen für Laien auftritt, ist die Notwendigkeit, eine Zeitfolge auszulösen, wenn das Blut auf die Reagenzunterlage aufgebracht wird. Ein Benutzer wird typischerweise einen Fingerstich ausführen, um eine Blutprobe zu entnehmen, und er muß dann gleichzeitig das Blut von dem Finger auf die Reagenzunterlage aufbringen, während er eine Zeitgeberschaltung mit seiner oder ihrer anderen Hand auslösen muß, so daß die gleichzeitige Verwendung von beiden Händen erforderlich ist. Dies ist insbesondere schwierig, weil es oft notwendig ist sicherzustellen, daß die Zeitgeberschaltung nur dann gestartet wird, wenn Blut auf die Reagenzunterlage aufgebracht wird. Alle bekannten Verfahren erfordern zusätzliche Tätigkeiten oder einen zusätzlichen Schaltkreis, um dieses Ergebnis zu erzielen. Dementsprechend ist eine Vereinfachung dieses Aspekts der Reflexionsmessungsvorrichtungen wünschenswert.
Die Anwesenheit von roten Blutkörperchen oder anderen gefärbten Komponenten überlagert sich oft mit den Messungen dieser absoluten Werte, dadurch wird der Ausschluß der roten Blutkörperchen in diesen zwei älteren Verfahren, wie sie sehr häufig praktiziert werden, erforderlich. In der Vorrichtung des Patentes 3,298,789 hindert eine Ethylcellulosemembran die roten Blutkörperchen am Eintritt in die Reagenzunterlage. Ebenso hindert die wasserbeständige Folie des Patentes 3,630,957 die roten Blutkörperchen am Eintritt. In beiden Fällen bewirken das Spülen oder Abwischen ebenfalls, diese potentiell störenden rotem Blutkörperchen vor der Messung zu entfernen.
Die EP-A-0 140 337 offenbart einen Mehrschichtenobjektträger zur Verwendung in einem Laboranalysegerät, das Vollblut als Probe verwendet. Der Objektträger hat einen transparenten Träger, auf dem oben eine Registrierungsschicht ist, die aus nichtporöser vernetzter Gelatine besteht. Oben auf der Registrierungsschicht ist eine poröse Ausbreitungsschicht. Um eine Substanz wie z. B. Glucose in Gegenwart von Hämoglobin zu messen, wird ein Farbstoff ausgewählt, der spektroskopisch bei einer einzelnen Wellenlänge größer oder gleich 600 nm nachgewiesen werden kann.
Demgemäß besteht noch ein Bedarf für ein System zum Nachweis von Analyten in gefärbten Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, das nicht das Beseitigen überschüssiger Flüssigkeit von einem Reflexionsstreifen erfordert, von dem eine Reflexionsmessung erhalten werden soll.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen nicht verwischbaren Teststreifen zur Bestimmung von Glucose in Vollblut, wie in Anspruch 1 gekennzeichnet, zur Verfügung.
Bevorzugte Merkmale des Streifens werden in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
Die vorliegende Erfindung kann besser in bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung verstanden werden, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird. Es zeigen:
Fig. 1 eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Teststreifens;
Fig. 2 ein schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung, die zusammen mit den erfindungsgemäßen Teststreifen eingesetzt werden kann;
Fig. 3 ein schematisches Blockdiagramm einer anderen Vorrichtung, die zusammen mit dem erfindungsgemäßen Teststreifen eingesetzt werden kann.

Detaillierte Beschreibung

Das Reagenzelement

Der erfindungsgemäße Streifen kann in einer verfeinerten raschen und einfachen Methodik benutzt werden, die zuverlässige und leicht zu bedienende Geräte zur Bestimmung von Glucose verwendet, die ein Enzymsubstrat einschließt, das zur Herstellung von Wasserstoffperoxid als einem Enzymprodukt führt. Das Verfahren umfaßt das Aufbringen eines kleinen Volumens von Vollblut auf den Streifen, das ausreicht, um die Matrix zu sättigen. Gebunden an die Matrix sind eines oder mehrere Reagenzien eines signalerzeugenden Systems, das die Herstellung eines Produktes zur Folge hat, das zu einer anfänglichen Änderung im Reflexionsgrad der Matrix führt. Die Matrix befindet sich üblicherweise in einem Reflexionsablesegerät, wenn das Blut aufgebracht wird. Die flüssige Probe durchdringt die Matrix und hat eine Anfangsänderung der Reflexion an der Meßoberfläche zur Folge. Eine Ablesung wird dann bei einem oder mehreren Zeitpunkten nach der Reflexionsanfangsänderung vorgenommen, um die weitere Reflexionsänderung an der Meßoberfläche oder in der Matrix als Folge der Bildung des Reaktionsproduktes zur Menge des Analyten in der Probe in Beziehung zu setzen.
Für Glucosemessungen wird Vollblut als Testmedium verwendet. Die Matrix enthält ein Glucoseoxidaseenzym, das Wasserstoffperoxid erzeugt. Ebenfalls wird in der Matrix eine Peroxidase und ein Farbstoffsystem enthalten sein, das ein lichtabsorbierendes Produkt zusammen mit der Peroxidase erzeugt. Das lichtabsorbierende Produkt ändert das Reflexionssignal. Mit Vollblut werden bei zwei verschiedenen Wellenlängen Messungen vorgenommen, mit der Messung bei einer Wellenlänge, die verwendet wird, um das Hintergrundrauschen, das durch Hämatokrit, Blutoxigenation und andere Veränderliche hervorgerufen wird, die das Ergebnis beeinträchtigen können, abzuziehen.
Der erfindungsgemäße Streifen umfaßt die Matrix und die Bestandteile des signalerzeugenden Systems, das im Inneren die Matrix enthält. Der Streifen kann andere Komponenten für besondere Anwendungen einschließen. Das Verfahren erfordert das Aufbringen eines kleinen Blutvolumens auf die Matrix, das üblicherweise nicht einer vorherigen Behandlung unterzogen worden ist (außer der optionalen Behandlung mit einem Antikoagulans). Die Zeitsteuerung der Messung wird von der Vorrichtung aktiviert und eine Reflexionsänderung der Matrix automatisch erfaßt, wenn Flüssigkeit die Matrix durchdringt. Die Reflexionsänderung über eine vorherbestimmte Zeitdauer als Ergebnis der Bildung des Reaktionsproduktes wird dann zu der Menge des Analyten in einer Probe in Beziehung gesetzt.
Der erfindungsgemäße Streifen umfaßt eine inerte poröse Matrix und die Komponente oder Komponenten eines signalerzeugenden Systems, wobei das System mit Glucose reagieren kann, um ein lichtabsorbierendes Reaktionsprodukt zu erzeugen, das die Poren der porösen Matrix ausfüllt. Das signalerzeugende System behindert nicht wesentlich den Fluß der Flüssigkeit durch die Matrix.
Um das Ablesen der Reflexion zu unterstützen, wird bevorzugt, daß die Matrix mindestens eine Seite hat, die im wesentlichen glatt und flach ist. Typischerweise wird die Matrix zu einer dünnen Schicht mit mindestens einer glatten, flachen Seite ausgestaltet. Bei Gebrauch wird die zu analysierende flüssige Probe auf eine Seite der Schicht aufgebracht, wodurch jede vorhandene Testverbindung durch die Matrix mittels Kapillar-, Saug-, Gravitationsfließ- und/oder Diffusionsvorgängen fließen kann. Die Komponenten des in der Matrix vorhandenen signalerzeugenden Systems werden reagieren, um ein lichtabsorbierendes Reaktionsprodukt zu ergeben. Einfallendes Licht trifft auf den Streifen an einem anderen Ort als denjenigen Ort, auf den die Probe aufgebracht wird. Das Licht wird von der Oberfläche des Streifens als diffus reflektiertes Licht abgestrahlt. Dieses diffuse Licht wird gesammelt und gemessen, z. B. mit dem Detektor eines Reflexionsspektralphotometers. Der Anteil des reflektierten Lichtes wird zur Menge des Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt, die üblicherweise eine inverse Funktion der Menge des Analyten in der Probe ist.

Die Matrix

Jede der notwendigen Komponenten zur Herstellung des Streifens werden wiederum beschrieben. Die erste Komponente ist die Matrix selbst.
Die Matrix wird eine hydrophile poröse Matrix sein, an welche Reagenzien kovalent oder nichtkovalent gebunden sein können. Die Matrix wird das Fließen eines wässrigen Mediums durch die Matrix ermöglichen. Sie wird ebenfalls eine Bindung der Proteinzusammensetzungen an die Matrix ohne wesentliche nachteilige Beeinflussung der biologischen Aktivität des Proteins, z. B. der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, ermöglichen. In dem Ausmaß, in dem Proteine kovalent gebunden werden sollen, wird die Matrix aktive Stellen zur kovalenten Bindung haben oder oder mittels bekannter, zum Stand der Technik gehörender Mittel aktiviert werden können. Die Zusammensetzung der Matrix wird reflektierend sein und wird ausreichend dick sein, um die Bildung eines lichtabsorbierenden Farbstoffes in dem Hohlraum oder auf der Oberfläche zu ermöglichen, um das Reflexionsvermögen der Matrix im wesentlichen zu beeinflussen. Die Matrix kann von einer einheitlichen Zusammensetzung oder ein Beschichtung auf einem Substrat sein, die die notwendige Struktur und physikalischen Eigenschaften aufweist.
Die Matrix wird sich üblicherweise bei Benetzung nicht deformieren, somit ihre ursprüngliche Gestalt und Größe beibehalten. Die Matrix wird ein definiertes Absorptionsvermögen haben, so daß das Volumen, das absorbiert wird, innerhalb vernünftiger Grenzen kalibriert werden kann, Abweichungen werden typischerweise unter etwa 50%, vorzugsweise nicht größer als 10% gehalten. Die Matrix wird ausreichende Naßfestigkeit besitzen, um Serienfertigung zu ermöglichen. Die Matrix ermöglicht es, nicht kovalent gebundene Reagenzien, auf der Oberfläche der Matrix verhältnismäßig gleichförmig zu verteilen.
Die Matrixoberflächen sind Polyamide, insbesondere bei Proben, die Vollblut beinhalten. Die Polyamide sind vorteilhaft Kondensationspolymere von Monomeren von 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wobei die Monomeren Laktame oder Kombinationen von Diaminen und Dicarboxilsäuren sind. Die Polyamidzusammensetzungen können modifiziert sein, um andere funktionelle Gruppen einzuführen, die geladene Strukturen liefern, so daß die Oberflächen der Matrix neutral, positiv oder negativ sowie neutral, basisch oder sauer sein können. Bevorzugte Oberflächen sind positiv geladen.
Wenn Vollblut verwendet wird, hat die poröse Matrix vorzugsweise Poren mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 2 um, vorzugsweise 0,2 bis 1,0 und besonders bevorzugt von 0,6 bis 1,0 um.
Eine bevorzugte Art der Herstellung des porösen Materials ist, hydrophile Polyamide auf einen Kern von nichtgewebten Fasern zu gießen. Die Kernfasern können jedes faserhaltige Material sein, das die beschriebene Integrität und Stärke erzeugt, wie z. B. Polyester und Polyamide. Das Reagenz, das das lichtabsorbierende Reaktionsprodukt bilden wird, welches später im Einzelnen besprochen wird, ist innerhalb der Poren der Matrix vorhanden, aber blockiert die Matrix nicht, so daß der flüssige Teil des Testmediums, das heißt Blut, das analysiert werden soll, durch die Poren der Matrix fließen kann, während Teilchen, wie z. B. Erythrozyten auf der Oberfläche festgehalten werden.
Die Matrix ist im wesentlichen reflektierend, so daß sie eine diffuse Reflexion ergibt, ohne Verwendung einer reflektierenden Unterlage. Vorzugsweise mindestens 25%, besonders bevorzugt mindestens 50% des einfallenden Lichtes, das auf die Matrix auftrifft, wird als diffuse Reflexion reflektiert und emittiert. Eine Matrix von weniger als etwa 0,5 mm Dicke wird üblicherweise verwendet, die mit 0,01 bis 0,03 mm bevorzugt ist. Eine Dicke von 0,1 bis 0,2 mm ist besonders bevorzugt, insbesondere für eine Nylonmatrix.
Die Matrix wird typischerweise auf einen Träger befestigt werden, um ihr körperliche Form und Festigkeit zu geben, obwohl dies nicht notwendig sein muß. Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, in der eine dünne hydrophile Po lyamidmatrixunterlage 11 an einem Ende eines Plastikträgers 12 mittels eines Klebers 13 angeordnet ist, der unmittelbar und sicher die Matrix an dem Haltegriff befestigt. Ein Loch 14 ist in dem Plastikträger 12 in dem Bereich vorhanden, in dem die Matrix 11 befestigt wird, so daß die Probe auf einer Seite der Matrix aufgebracht und Licht auf der anderen Seite reflektiert werden kann.
Eine flüssige Probe, die getestet werden soll, wird auf die Matrix 11 aufgebracht. Im allgemeinen wird die Matrix bei zu testendem Blut einen Oberflächeninhalt in der Größenordnung von 10 mm² bis 100 mm² besitzen, insbesondere 10 mm² bis 50 mm², welches normalerweise ein Volumen ist, das 5 bis 10 ul der Probe mehr als sättigen wird.
Zum Stand der Technik gehörende Messungen der diffusen Reflexion wurden gewöhnlich unter Verwendung einer reflektierenden Unterlage vorgenommen, die an der Matrix befestigt oder hinter der Matrix angeordnet war. Keine solche Rückschicht wird benötigt oder wird gewöhnlich während der Verwendung des erfindungsgemäßen Streifens vorhanden sein, weder als Teil des Streifens noch der Reflexionsvorrichtung.
Wie in Fig. 1 ersichtlich ist, hält der Träger eine Matrix 11, so daß eine Probe auf einer Seite der Matrix aufgebracht werden kann, während die Lichtreflexion von der Seite der Matrix gemessen wird, die der Stelle, auf die die Probe aufgebracht wird, gegenüberliegt.
Fig. 2 zeigt ein System, bei dem die Probe auf die Seite mit dem Loch in dem Unterlagengriff aufgebracht ist, während Licht auf der anderen Seite der Matrix reflektiert und gemessen wird. Es können andere Konstruktionen als die abgebildete eingesetzt werden. Die Matrix kann verschiedene Formen und Gestalten im Rahmen der hier aufgezeigten Grenzen aufweisen. Die Matrix wird wenigstens an einer Seite und normalerweise an zwei Seiten zugänglich sein.
Die Matrix kann an dem Träger durch übliche Mittel, z. B. eine Halter, eine Klemme oder Klebstoffe, befestigt werden; bei dem bevorzugten Verfahren ist sie jedoch mit dem Träger verklebt. Die Verklebung kann durch jeden nicht-reaktiven Klebstoff mittels eines thermischen Verfahrens, bei dem die Trägeroberfläche ausreichend geschmolzen wird, um etwas für die Matrix verwendeten Material einzuschließen, oder mittels Mikrowellen- oder Ultraschall-Verbindungsverfahren, die die Matrix mit dem Träger in ähnlicher Weise verschmelzen. Es ist wichtig, daß die Verklebung so ausgeführt ist, daß sie sich nicht selbst die diffusen Reflexionsmessungen oder die zu messenden Reaktionen stört, obwohl dies unwahrscheinlich ist, weil kein Klebemittel an der Stelle erforderlich ist, wo die Ablesung stattfindet. Z. B. kann ein Kleber 13 auf den Träger 12 aufgebracht werden, woraufhin zuerst eine Öffnung 14 in den mit dem Kleber zusammengebrachten Träger gestanzt wird und dann die Matrix 11 in der Nähe der Öffnung 14 auf den Kleber aufgebracht wird, so daß der Randteil des Reagenzes an dem Träger angebracht ist.

Die chemischen Reagenzien

Das verwendete signalerzeugende System ist in der Lage, in der Probe mit Glucose zu reagieren, um (entweder direkt oder indirekt) eine Verbindung zu erzeugen, die bei einer anderen Wellenlänge charakteristisch absorbierend ist, als eine Wellenlänge, bei der das Testmedium im wesentlichen absorbiert.
Polyamidmatrizen sind besonders brauchbar zur Durchführung von Reaktionen, in denen ein Substrat (Analyt) mit einem Sauerstoff verwendenden Oxidaseenzym derart reagiert, daß ein Produkt erzeugt wird, das weiterhin mit einem Zwischenfarbstoff reagiert, um einen Farbstoff entweder direkt oder indirekt zu bilden, der in einem vorbestimmten Wellenlängenbereich absorbiert. Z. B. kann ein Oxidaseenzym ein Substrat oxidieren und Wasserstoffperoxid als ein Reaktionsprodukt erzeugen. Das Wasserstoffperoxid kann dann mit einem Farbstoffzwischenprodukt oder Vorläufer in einer katalysierten oder unkatalysierten Reaktion reagieren, um eine oxidierte Form des Zwischenproduktes oder Vorläufers herzustellen. Dieses oxidierte Material kann das gefärbte Produkt erzeugen oder mit einem zweiten Vorläufer reagieren, um den Endfarbstoff zu bilden. Im erfindungsgemäßen Streifen sind die verwendeten Reagenzien Glucoseoxidase, Peroxidase und 3-Methyl-2-Benzothiazolinonhydrazon plus 3-(Dimethylamino)benzoesäure (siehe Anal. Biochem., 105, (1980), 389-397.

Das Analyseverfahren

Das Analyseverfahren, bei dem der erfindungsgemäße Streifen verwendet wird, beruht auf einer durch diffuse Reflexion gemessenen Absorptionsänderung, die abhängig von der Menge des in der Probe vorhandenen Analyten ist, der untersucht wird. Diese Änderung kann durch Messung der Änderung in der Absorptionsfähigkeit der Testprobe zwischen zwei oder mehr Zeitpunkten bestimmt werden.
Der erste zu beachtende Schritt bei der Probe ist das Aufbringen der Probe auf die Matrix. In der Praxis könnte eine Analyse wie folgt ausgeführt werden: zuerst wird eine Probe einer wässrigen Flüssigkeit, die ein Analyt enthält, beschafft. Blut kann z. B. durch einen Stich in einen Finger erhalten werden. Ein Überschuß dieser Flüssigkeit in dem Bereich, wo die Reflexion gemessen wird (d. h. etwa 5 bis 10 ul), wird auf die Matrix des Teststreifens aufgebracht. Ein gleichzeitiges Starten des Zeitgebers ist nicht erforderlich (wie es üblicherweise im Stand der Technik erforderlich ist), wie es weiter unten verdeutlicht wird. Überschüssige Flüssigkeit kann entfernt werden, wie z. B. durch Lichttrocknung, jedoch ist ein solches Entfernen ebenfalls nicht erforderlich. Der Teststreifen ist typischerweise an einem Instrument zur Messung der Lichtabsorption befestigt; z. B. Farbintensität durch Reflexion, vor dem Aufbringen der Probe. Die Absorption wird zu bestimmten Zeitpunkten nach dem Aufbringen der Probe gemessen. Die Absorption bezieht sich bei dieser Anwendung nicht nur auf Licht innerhalb des sichtbaren Wellenlängenbereiches, sondern auch außerhalb des sichtbaren Wellenlängenbereiches, wie z. B. infrarote oder ultraviolette Strahlung. Aus diesen Absorptionsmessungen kann eine Farbentwicklungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit des Analytpegels kalibriert werden.

Die Meßvorrichtung

Eine geeignete Vorrichtung, wie z. B. ein Remissionsgrad-Spektrophotometer mit geeigneter Software kann so hergestellt sein, daß es zu bestimmten Zeitpunkten automatisch die Reflexion mißt, die Geschwindigkeit der Reflexionsänderung berechnet und, unter Verwendung von Kalibrationsfaktoren, den Analytspiegel in der wässrigen Flüssigkeit ausgibt. Solch eine Vorrichtung wird schematisch in der Fig. 2 dargestellt, in der ein erfindungsgemäßer Teststreifen einen Träger 12 umfaßt, an dem eine Matrix 11 als befestigt gezeigt ist. Eine Lichtquelle 5, z. B. eine lichtemittierende Diode (LED) hoher Intensität projeziert einen Lichtstrahl auf die Matrix. Ein wesentlicher Anteil (mindestens 25%, bevorzugt mindestens 35% und weiter bevorzugt mindestens 50% in der Abwesenheit eines Reaktionsprodukts) dieses Lichts wird diffus von der Matrix reflektiert und von dem Lichtdetektor 6, z. B. ein Phototransistor, der einen Ausgabestrom proportional zu dem empfangenen Licht ausgibt, festgestellt. Die Lichtquelle 5 und/oder der Detektor 6 können so ausgelegt sein, daß nur Licht einer speziellen Wellenlänge erzeugt oder auf Licht einer speziellen Wellenlänge reagiert wird, falls gewünscht. Das Ausgangssignal des Detektors 6 wird an einen Verstärker 7 angelegt, z. B. an einen linear integrierten Schaltkreis, der den Phototransistorstrom in eine Spannung konvertiert. Das Ausgangssignal des Verstärkers 7 kann einem Nachführ- und Haltestromkreis 8 zugeführt werden. Dies ist eine Kombination eines linear/digital integrierten Schaltkreises, der der analogen Spannung des Verstärkers 7 nachsteuert oder dieser folgt und auf einen Befehl des Mikroprozessors 20 die Spannung auf ihrem Niveau zu dieser Zeit festsetzt oder hält. Ein Analog/Digitalwandler 19 nimmt die analoge Spannung von dem Nachführ- und Halteschaltkreis 8 auf und wandelt sie z. B. auf den Befehl eines Mikroprozessors 20 hin in eine 12-Bit binäre digitale Zahl um. Der Mikroprozessor 20 kann ein digitaler integrierter Schaltkreis sein. Er führt die folgenden Steuerungsfunktionen aus: 1) Zeitabstimmung des gesamten Systems; 2) Ablesen der Ausgabe des Analog/Digitalumwandlers 19; 3) Abspeichern der Daten, die der gemessenen Reflexion zu bestimmten Zeitintervallen entsprechen, zusammen mit dem Programm- und Datenspeicher 21; 4) Berechnen des Analytspiegels aus den abgespeicherten Reflexionswerten; und 5) Ausgabe der Analytspiegeldaten an die Anzeige 22. Der Speicher 21 kann ein digitaler integrierter Schaltkreis sein, der die Daten und das Mikroprozessor-Betriebsprogramm speichert. Die Ausgabevorrichtung 22 kann verschiedene Hard-Copy und Soft-Copyformate ausgeben. Normalerweise ist sie ein optisches Anzeigegerät, wie ein Flüssigkristall- oder LED-Bildschirm, aber sie kann auch ein Streifendrucker, ein akkustisches Signal oder ähnliches sein. Die Vorrichtung kann auch einen Start-Stop-Schalter umfassen und kann, falls gewünscht, eine akkustische oder optische Zeitausgabe zur Verfügung stellen, um die Zeiten für das Aufbringen von Proben, das Aufnehmen von Messungen etc. anzuzeigen.

Reflexionsschaltung

Der Reflexionsschaltkreis selbst kann verwendet werden, um die Zeitabstimmung durch Messung eines Reflexionsabfalls einzuleiten, der auftritt, wenn der wässrige Teil des Blutes zu der Seite wandert, an der die Reflexion gemessen wird. Gewöhnlich wird die Meßvorrichtung in einem "Bereitschafts"-Modus eingeschaltet, in dem die Reflexionsablesungen automatisch in eng benachbarten Zeitintervallen (gewöhnlich etwa 0,2 Sekunden) von der üblicherweise gebrochen weißen, im wesentlichen trocknen, unreagierten Matrix vorgenommen werden. Die Anfangsmessung wird normalerweise vor dem Eindringen der zu analysierenden Flüssigkeit in die Matrix vorgenommen, aber sie kann auch stattfinden, nachdem die Flüssigkeit an einer Stelle auf die Matrix aufgebracht worden ist, an der die Reflexion nicht gemessen wird. Der Reflexionswert wird durch den Mikroprozessor berechnet, gewöhnlich durch Speichern aufeinanderfolgender Werte im Speicher und anschließendes Vergleichen jedes Wertes mit dem anfänglichen Wert vor der Reaktion. Wenn die wässrige Lösung die Reagenzmatrix eindringt, zeigt der Abfall in der Reflexion den Beginn des Meßzeitintervalles an. Es kann Reflexionsabnahmen von 5 bis 50%, typischerweise ein Abfall von etwa 10%, verwendet werden, um die Zeitmessung auszulösen. Auf diese einfache Weise erreicht man eine exakte Synchronisation des Probenmediums das die Seite erreicht, an der die Messungen und die Einleitung der Ablesefolgen ohne das Erfordernis einer Aktivität einer Bedienungsperson vorgenommen werden.

Anordnung für Glucosenachweisverfahren

In bezug auf den Nachweis von Glucose bei Anwesenheit von roten Blutkörpern wird nun ein Beispiel angegeben, um besser Details und einen besonderen Vorteil herauszustellen.
Die Verwendung von Polyamidoberflächen zur Bildung einer Matrix ermöglicht eine Anzahl von wünschenswerten Eigenschaften in der vorliegenden Erfindung. Diese bestehen darin, daß die Matrix hydrophil ist (d. h. daß sie das Reagenz und die Probe einfach aufnimmt), daß sie sich beim Benetzen nicht deformiert (so daß eine ebene Oberfläche für die Reflexionsmessungen zur Verfügung steht), sie mit Enzymen kompatibel ist (um eine gute Lagerstabilität zu erreichen), ein beschränktes Probenvolumen pro Volumeneinheit der Matrix aufnimmt (notwendig, um einen ausgedehnten dynamischen Meßbereich zu zeigen) und eine ausreichende Naßfestigkeit aufweist, um eine standardmäßige Herstellung zu ermöglichen.
Bei einer typischen Ausgestaltung besteht der Streifen aus einem Kunststoffträger und der Matrix mit dem darin enthaltenen signalerzeugenden System. Die bevorzugte Matrix ist eine Nylonmikrofiltrationsmembran, insbesondere Membranen, die aus Nylon-66, das auf einen Kern von nichtgewebten Polyesterfasern gegossen ist, hergestellt sind. Zahlreiche Nylonmikrofiltrationsmembranen dieser Klasse werden von der Pall Ultrafine Corporation kommerziell hergestellt, die mittlere Porengrößen von 0,1 bis 3, 0 um besitzen. Die Materialien besitzen mechanische Festigkeit und Flexibilität, Formbeständigkeit bei Einwirkung von Wasser und rasche Benetzbarkeit.
Viele Variationen in der spezifischen chemischen Struktur des Nylons sind möglich. Diese beinhalten unfunktionalisiertes Nylon-66 mit geladenen Endgruppen (vertrieben unter der Marke Ultipore von Pall Ultrafine Filtration Corporation; "Pall"). Positive Ladungen überwiegen unter pH 6, während negative Ladungen über pH 6 vorherrschen. In anderen Membranen wird das Nylon funktionalisiert, bevor die Membran gebildet wird, um Membranen mit unterschiedlichen Eigenschaften zu erhalten. Mit Carboxigruppen funktionalisierte Nylons sind über einen weiten pH- Bereich negativ geladen (vertrieben als Carboxidyne von Pall). Nylons können ebenfalls mit einer hohen Dichte von positiv geladenen Gruppen an ihrer Oberfläche funktionalisiert sein, typischerweise quarternärer Aminogruppen, so daß sie kleine Ladungsschwankungen über einen großen pH-Bereich sichtbar machen (vertrieben als Posidyne von Pall). Solche Materialien sind besonders gut für die Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet. Es ist ebenfalls möglich, Membranen zu verwenden, die reaktive funktionelle Gruppen haben, die zur kovalenten Immobilisierung der Proteine bestimmt sind (vertrieben als Biodyne Immunoaffinitätsmembranen von Pall). Solche Materialien können verwendet werden, um Proteine kovalent zu befestigen, z. B. Enzyme, die als Reagenzien gebraucht werden. Obwohl sämtliche dieser Materialien verwendbar sind, liefert Nylon, das eine hohe Dichte an positiv geladenen Gruppen an seiner Oberfläche besitzt, die beste Stabilität der Reagenzien, wenn es in eine trockene Reagenzunterlage konfektioniert wird. Unfunktionalisiertes Nylon ergibt die nächstbeste Stabilität gefolgt von carboxilierten Nylons.
Erwünschte Ergebnisse werden mit Porengrößen erhalten, die im Bereich von 0,2-2,0 um, vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,2 um und besonders bevorzugt bei etwa 0,8 um liegen, wenn Vollblut verwendet wird.
Die Form des Trägers auf dem das Reagenzelement montiert wird, ist relativ unwichtig, solange der Träger den Zugang zu einer Seite der Matrix durch die Probe und zur anderen Seite der Matrix durch das auftreffende Licht ermöglicht, dessen Reflexion gemessen wird. Der Träger ist ebenfalls behilflich beim Einsetzen der Matrix in die Extinktionsmeßvorrichtung, so daß sie sich mit dem optischen System deckt. Ein Beispiel eines geeigneten Trägers ist ein Mylar- oder anderer Kunststoffstreifen, auf den ein Kontaktkleber wie z. B. 3M 465 oder Y9460 Kontaktkleber aufgebracht worden ist. Ein Loch wird durch den Kontaktkleber in den Kunststoff gestanzt. Eine Matrix gewöhnlich in Form eines dünnen Pads, das entweder Reagenzien enthält oder auf das Reagenzien später aufgebracht werden, wird dann mittels Kontaktkleber auf den Träger aufgebracht, so daß sie an dem Träger im Umgebungsbereich des Loches, das durch den Träger und den Kontaktkleber gestanzt worden ist, fest angebracht ist. Solch eine Vorrichtung ist in Fig. 1 dargestellt, die die Matrix 11, die an einem Mylarträger 12 mittels Kleber 13 befestigt ist, zeigt. Das Loch 14 gestattet den Zugang der Probe oder des einfallenden Lichtes auf eine Seite 15 der Matrix 11, während der Zugang zur anderen Seite 16 der Matrix ungehindert ist. Sämtliche Dimensionen der Matrix und des Trägers können gewählt werden, so daß die Matrix sicher in eine Reflexionsablesevorrichtung in proximaler Lage zu einer Lichtquelle und einem reflektierenden Lichtdetektor paßt.
Wenn eine Nylonmatrix zur Bildung des Reagenzpads ausgewählt wird und wenn die angegebenen Dicken verwendet werden, wird es bevorzugt, die Matrix in einer Weise zu stützen, daß nicht mehr als 6 mm, gemessen in jeder Richtung von dem Träger, an der Stelle nicht abgestützt wird, wo die Probe aufgebracht und die Lichtreflexion gemessen werden. Größere ungestützte Bereiche neigen dazu, der Membran eine unzureichende Formstabilität zu verleihen, so daß die Reflexionsmessung von der Oberfläche nachteilig beeinflußt wird. Ein 5 mm Lochdurchmesser 14 in dem Träger, der in Fig. 1 gezeigt ist, arbeitet sehr zufriedenstellend. Es gibt keine besondere Grenze für den Mindestdurchmesser von eines solchen Loches, obwohl Durchmesser von mindestens 2 mm wegen leichterer Herstellung, Probenaufbringung und Lichtreflexionsablesung bevorzugt werden.
Es ist notwendig, einen Farbstoff mit einer Absorptionsfähigkeit bei einer Wellenlänge auszuwählen, die von der Wellenlänge verschieden ist, bei der rote Blutkörperchen Licht absorbieren, wobei Vollblut das Probenmedium ist, oder andere Verunreinigungen in der Lösung mit anderen Probenmedien analysiert werden. Das MBTH-DMAB Farbstoffpaar (3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid und 3-Dimethylaminobenzoesäure) ist niemals in einem kommerziellen Glucosebestimmungsreagenz verwendet worden, obwohl es zuvor als geeignet zur Farbgebung für Peroxidasemarkierung in Enzymimmunoproben beschrieben worden ist. Dieses Farbstoffpaar ergibt einen größeren dynamischen Bereich und weist verbesserte enzymatische Stabilität im Vergleich zu üblichen Farbstoffen auf, die zur Glucosebestimmung verwendet werden, wie z. B. Benzidinderivate. Außerdem ist das MBTH-DMAB Farbstoffpaar nicht karcinogen, ein Charakteristikum der meisten Benzidinderivate.
Die Verwendung des MBTH-DMAB Paars gestattet die Korrektur von Hämatokrit und dem Oxigenationsgrad von Blut mit einem einzigen Korrekturfaktor. Die üblicherweise mehr verwendeten Benzidinfarbstoffe lassen eine solche Korrektur nicht zu. Der Farbstoff bildet ein Chromophor, das bei ungefähr 635 nm absorbiert, aber in keinem wesentlichen Umfang bei 700 nm. Geringfügige Abweichungen beim Ausmessen der Wellenlängen (± 10 nm) sind zulässig. Bei 700 nm können sowohl Hämatokrit als auch der Oxigenationsgrad durch Messung der Blutfarbe gemessen werden. Außerdem sind lichtemittierende Dioden (LED) sowohl für 635 nm als auch 700 nm Messungen kommerziell erhältlich, wodurch die Massenproduktion einer Vorrichtung vereinfacht wird. Durch Verwendung der oben beschriebenen bevorzugten Membranporengrößen und der Versuchsreagenzformulierung können sowohl das Hämatokrit- als auch das Oxigenationsverhalten durch Messung bei der einzigen 700 nm Wellenlänge korrigiert werden.
Zwei zusätzliche Bedingungen wurden gefunden, um eine besondere Stabilität und lange Lagerfähigkeit für eine Glucoseoxidase/Peroxidaseformulierung auf einer Polyamidmatrix zu erzielen. Diese verwenden einen pH im Bereich von 3,8 bis 5,0, vorzugsweise etwa 3,8 bis 4,3, besonders bevorzugt etwa 4,0 und verwenden ein konzentriertes Puffersystem zum Auftragen des Reagenzes auf die Matrix. Als effektivster Puffer stellte sich ein 10 Gew.-%iger Zitratpuffer mit wirksamen Konzentrationen von 5-15% heraus. Dieses sind Gewicht/Volumenprozente der Lösung, in der die Reagenzien auf die Matrix aufgebracht werden. Andere Puffer können auf der gleichen molaren Basis verwendet werden. Die größte Stabilität wurde bei Verwendung eines niedrigen pH, vorzugsweise etwa pH 4, eines MBTH-DMAB Farbstoffsystems und einer hohen Enzymkonzentration von ungefähr 500 bis 1000 U/ml der Auftragungslösung erreicht.
Bei Herstellung des MBTH-DMAB Reagenzes und des Enzymsystems, das den Rest des signalerzeugenden Systems bildet, ist es nicht notwendig, exakt Volumen und Verhältnisse beizubehalten, obwohl die unten vorgeschlagenen Werte gute Resultate ergeben. Die Reagenzien werden sofort von der Matrix absorbiert, wenn die Glucoseoxidase in einer Lösung von 27-54 Vol.-% vorhanden ist, die Peroxidase bei einer Konzentration von 2,7-5,4 mg/ml vorliegt, MBTH eine Konzentration von 4 - 8 mg/ml hat und DMAB eine Konzentration von 8-16 mg/ml aufweist. Das DMAB-MBTH Gewichtsverhältnis wird vorzugsweise im Bereich von (1-4) : 1, vorzugsweise etwa (1,5-2,5) : 1, besonders bevorzugt etwa 2 : 1 gehalten.
Die grundsätzlichen Herstellungstechniken für die Teststreifen sind, wenn sie einmal festliegen, einfach. Die Matrix selbst ist fest und stabil, insbesondere wenn eine Nylonmatrix der bevorzugten Ausführungsform gewählt wird. Nur zwei Lösungen sind notwendig zum Auftragen des Reagenzes und diese Lösungen sind sowohl einfach formuliert als auch beständig. Die erste enthält üblicherweise die Farbstoffkomponenten und die zweite enthält im allgemeinen die Enzyme. Wenn das MBTH-DMAB Farbstoffpaar verwendet wird, werden die einzelnen Farbstoffe in einem wässrigen organischen Lösungsmittel, üblicherweise eine 1. 1 Mischung von Acetonitril und Wasser gelöst. Die Matrix wird in die Lösung getaucht, überschüssige Flüssigkeit wird durch Abtupfen entfernt und die Matrix dann üblicherweise bei 50-60ºC in 10-20 Minuten getrocknet. Die Matrix, die die Farbstoffe enthält, wird dann in eine wässrige Lösung getaucht, die die Enzyme enthält. Eine typische Formulierung würde die Peroxidase- und Glucoseoxidase-Enzyme sowie irgendeinen gewünschten Puffer, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel o. dgl. enthalten. Die Matrix wird dann abgetupft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und wie zuvor getrocknet. Eine typische Formulierung für das Glucosereagenz ist das folgende:

Farbstoffbad

Vermische:
40 mg MBTH,
80 mg DMAB,
5 ml Acetonitril und
5 ml Wasser.
Rühren, bis alle Feststoffe gelöst sind und diese auf eine Glasplatte oder eine andere ebene Fläche gießen. Eintauchen eines Stücks einer Posidynmembran (Pall Co.), Abtupfen überschüssiger Flüssigkeit und Trocknen bei 56ºC in 15 Minuten.

Enzymbad

Vermische:
6 ml Wasser,
10 mg EDTA, Dinatriumsalz,
200 mg Poly Pep, niedrige Viskosität (Sigma),
0,669 g Natriumcitrat,
0,523 g Zitronensäure,
2,0 ml 6 Gew.-% Gantrez AN-139, gelöst in Wasser (GAF)
30 mg Meerettichperoxidase, 100 Einheiten/mg, und
3,0 ml Glucoseoxidase, 2000 Einheiten/ml.
Rühren, bis sämtliche Feststoffe gelöst sind und diese auf eine Glasplatte oder eine andere ebene Fläche gießen. Eintauchen eines Stücks der vorher mit Farbstoffen imprägnierten Membran, Abtupfen überschüssiger Flüssigkeit und Trocknen bei 56ºC in 15 Minuten.
Die elektronische Vorrichtung, die verwendet wird, um die Reflexionsmessungen durchzuführen, besteht wenigstens aus einer Lichtquelle, einem Reflexionslichtdetektor, einem Verstärker, einem Analog/Digitalwandler, einem Mikroprozessor mit Speicher und Programm und einer Anzeigevorrichtung.
Die Lichtquelle besteht typischerweise aus einer lichtemittierenden Diode (LED). Obwohl es möglich ist, eine polychromatische Lichtquelle und einen Lichtdetektor zu verwenden, der in der Lage ist, zwei unterschiedliche Wellenlängen zu messen, würde eine bevorzugte Vorrichtung zwei LED-Quellen oder eine einzelne Diode enthalten, die Licht mit zwei bestimmten Wellenlängen aussenden können. Kommerziell erhältliche LEDs, die die beschriebenen Lichtwellenlängen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung bevorzugt sind, erzeugen, umfassen eine Hewlett Packard HLMP-1340 mit einem Emissionsmaximum bei 635 nm und eine Hewlett Packard QEMT-1045 mit einem Schmalbandemissionsmaximum bei 700 nm. Geeignete kommerziell erhältliche Lichtdetektoren sind ein Hammamatsu 5874-18K und ein Litronix BPX-65.
Obwohl andere Verfahren zur Aufnahme von Messungen möglich sind, hat das folgende Verfahren die gewünschten Ergebnisse geliefert. Messungen werden von dem Photodetektor in festgelegten Intervallen durchgeführt, nachdem die Zeitmessung ausgelöst worden ist. Die 635 nm LED wird nur während des kurzen Meßzeitraums betrieben, der etwa 20 Sekunden nach der Startzeit beginnt, wie sie durch die Reflexionsschaltung angezeigt wird. Wenn diese Messung anzeigt, daß ein hoher Gehalt an Glucose in der Probe vorhanden ist, wird eine 30 Sekunden-Messung vorgenommen und bei der abschließenden Berechnung verwendet, um die Genauigkeit zu verbessern. Gewöhnlich werden hohe Spiegel in Betracht gezogen, die bei 250 mg/dl beginnen. Der Hintergrund wird mit einer 700 nm Messung, die etwa 15 Sekunden nach dem Start der Meßperiode vorgenommen wird, korrigiert. Das Meßergebnis des Photodetektors wird über das Intervall integriert, bei dem die zweckentsprechende LED aktiviert wird, was üblicherweise weniger als eine Sekunde dauert. Die unverarbeiteten Reflexionsmeßwerte werden dann für Berechnungen verwendet, die von dem Mikroprozessor ausgeführt werden, nachdem das Signal verstärkt und in ein digitales Signal umgewandelt worden ist. Es können verschiedene Mikroprozessoren verwendet werden, um die Berechnung auszuführen. Es hat sich gezeigt, daß ein AIM 65 Ein-Platinen-Mikroprozessor, hergestellt von Rockwell International, zufriedenstellende Ergebnisse liefert.
Die vorliegenden Verfahren und Vorrichtungen erlauben einen sehr einfachen Ablauf mit einem Minimum an Betriebsschritten auf seiten der Bedienungsperson. Bei der Verwendung wird der Teststreifen in dem Detektor so angeordnet, daß das Loch in dem Streifen mit der optischen Anordnung des Detektionssystems übereinstimmt. Eine abnehmbare Kappe oder eine andere Abdeckung wird über die optische Anordnung und den Streifen angeordnet, um die Anordnung vom Umgebungslicht abzuschirmen. Die Meßsequenz wird dann gestartet, indem ein Knopf auf der Meßvorrichtung gedrückt wird, der den Mikrocomputer aktiviert, um eine Messung des reflektierten Lichts von der Matrix im unreagierten Zustand vorzunehmen, was Messung genannt wird. Die Abdeckung wird dann entfernt und es wird ein Tropfen Blut auf die Matrix aufgebracht, gewöhnlich, während die Matrix auf die optische Anordnung und die Meßvorrichtung ausgerichtet ist. Es wird bevorzugt, daß der Teststreifen in Ausrichtung mit der optischen Anordnung belassen wird, um die Handhabung zu vereinfachen. Die Vorrichtung kann das Aufbringen des Blutes durch eine Abnahme der Reflexion abtasten, wenn die Probe durch die Matrix läuft und reflektiertes Licht auf der gegenüberliegenden Seite gemessen wird. Die Abnahme der Reflexion löst eine Zeitsequenz aus, die detailliert an anderen Stellen in dieser Beschreibung erläutert ist. Die Abdeckung sollte innerhalb von 15 Sekunden nach dem Aufbringen der Probe wieder angebracht werden, obwohl diese Zeit abhängig von der Art der zu messenden Probe variieren kann. Ergebnisse werden gewöhnlich in ungefähr 30 Sekunden nach dem Aufbringen von Blut angezeigt, wenn eine Blutzuckerprobe gemessen wird, obwohl eine 20-Sekunden Reaktion für Glucoseproben, mit einer Glucosekonzentration von weniger als 250 mg/dl aufweisen, möglich ist.
Eine besonders genaue Berechnung des Zuckerspiegels kann unter Verwendung des Hintergrundstromes durchgeführt werden, das heißt des Stromes von dem eingeschalteten Photodetektor aber ohne von der Matrix reflektiertem Licht, um eine Hintergrundkorrektur durchzuführen. Es wurde gezeigt, daß sich dieser Wert für eine spezielle Vorrichtung, die gemäß der bevorzugten Ausführungsformen dieser Beschreibung hergestellt wurde, über einen Zeitraum von 2 bis 3 Monaten nicht verändert, und es ist möglich, diese Hintergrundmessung als eine Konstante in den Computerspeicher einzugeben. Mit einer leichten Änderung dieser Vorgehensweise kann jedoch dieser Wert für noch exaktere Ergebnisse für jede Analyse gemessen werden. Bei diesem abgeänderten Verfahren würde die Meßvorrichtung mit geschlossener Abschirmung eingeschaltet werden, bevor der Teststreifen in seiner Position ist und der Hintergrundstrom würde gemessen werden. Der Teststreifen würde dann in die Meßvorrichtung geschlossener Abdeckung eingesetzt und eine Rdry-Messung würde dann durchgeführt und das Verfahren wie oben beschrieben fortgesetzt. Mit diesem geänderten Verfahren muß der Hintergrundstrom nicht notwendigerweise über die gesamte Lebenszeit der Meßanordnung stabil sein, wodurch exaktere Ergebnisse erhalten werden.
Die Rohdaten, die zur Berechnung eines Ergebnisses in einer Glucoseprobe notwendig sind, sind ein Hintergrundstrom, der der Hintergrundreflexion entspricht, Rb, wie oben beschrieben; eine Ablesung des Teststreifens in unreagiertem Zustand, Rdry, ebenfalls oben beschrieben; und eine Abschlußmessung. Bei der Verwendung der hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist der Abschlußpunkt nicht besonders stabil und muß zeitlich exakt von dem anfänglichen Aufbringen des Bluts bestimmt werden. Das hierin beschriebene Meßgerät jedoch führt diese zeitlich richtige Einteilung automatisch durch. Für Glucosekonzentrationen unter 250 mg/dl wird ein geeigneter stabiler Endzustand innerhalb von 20 Sekunden erreicht und eine Endreflexion R&sub2;&sub0; wird abgenommen. Für Glucosekonzentrationen bis 450 mg/dl ist eine 30 Sekunden Reflexionsmessung R&sub3;&sub0; angemessen. Obwohl das hierin beschriebene System bis zu 800 mg/dl Glucose eine gute Differentiation zeigt, ist die Messung oberhalb von 450 mg/dl etwas verrauscht und ungenau, obwohl dies nicht so groß ist, um ein merkliches Problem hervorzurufen. Längere Reaktionszeiten sollten geeignetere Messungen für die Probenniveaus der Glucosekonzentration liefern.
Die 700 nm Reflexionsmessung für die Messung mit zwei Wellenlängen wird gewöhnlich in 15 Sekunden durchgeführt (R&sub1;&sub5;). In dieser Zeit hat sich die Matrix vollständig mit Blut gesättigt. Die Farbstoffreaktion wird über 15 Sekunden weiter fortgesetzt und wird mittels einer 700 nm Ablesung abgetastet. Da eine Farbstoffabsorption mittels dem 700 nm Signal ein Nachteil ist, werden dementsprechend die Messungen nach 15 Sekunden in der Berechnung nicht beachtet.
Die oben beschriebenen Rohdaten werden verwendet, um Parameter, proportional zur Glucosekonzentration zu berechnen, die einfacher sichtbar gemacht werden können als die Reflexionsmessungen. Eine logarithmische Transformation der Reflexion analog zu dem Verhältnis zwischen dem Absorptionsvermögen und der Analytkonzentration, die bei der Transmissionsspektroskopie (Beer'sches Gesetz) beobachtet wurde, kann, falls gewünscht, verwendet werden. Eine Vereinfachung der Kubelka- Monk-Gleichungen, die speziell für Reflexionsspektroskopie hergeleitet wurde, hat sich als nützlich herausgestellt. Bei dieser Herleitung bezieht sich K/S auf die Analytkonzentration, wobei K/S durch die Gleichung 1 definiert ist.
K/ S-t = (1 - R*t)²/(2 · R*t) (1)
R*t ist das Reflexionsvermögen, das zu einer bestimmten Endpunktzeit t aufgenommen worden ist und ist der absorbierte Anteil des einfallenden Lichtstrahles, der durch die Gleichung 2 beschrieben ist, wobei R1 das Endpunktreflexionsvermögen, Rm oder Res, ist.
R*t = (R1 - Rb)/(Rdry - Rb) (2)
R*t variiert von 0 für kein reflektiertes Licht (Rb) bis 1 für vollständig reflektiertes Licht (Rdry). Die Verwendung des Reflexionsvermögens in der Berechnung vereinfacht in hohem Maße die Meßgerätekonstruktion, weil eine hochstabile Quelle und ein Detektionsschaltkreis unnötig werden, da diese Komponenten mit jeder Res, und Rb Messung überwacht werden.
Für eine Einzelwellenlängenmessung kann K/S nach 20 Sekunden (K/S-20) oder nach 30 Sekunden (K/S-30) berechnet werden. Die Kalibrierungskurven, die diese Parameter auf YSI (Yellow Springs Instruments) Glucosemessungen beziehen, können exakt durch eine Polynomgleichung dritten Grades beschrieben werden, wie sie in Gleichung 3 dargestellt ist.
YSI = a&sub0; + a&sub1;(K/S) + as(K/S)² + a(K/S)³ (3)
Die Koeffizienten für diese Polynome sind in der Tabelle 1 aufgeführt. TABELLE 1 Koeffizienten für eine Polynom-Anpassung dritten Grades von Einzelwellenlängen-Kalibrierungskurven
Die einzelne chemische Spezies, die gemessen wird, ist der MBTH- DMAB Indamin-Farbstoff und die Komplexmatrix, die analysiert wird, ist Vollblut, das auf einer 0,8 u Posidyne-Membran verteilt wird. Eine Veröffentlichung mit dem Titel "Application of Near Infra Red Spectrophotometry to the Nondestructive Ana lysis of Foods: A Review of Experimental Results", CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 18(3) 203 - 30 (1983), beschreibt die Verwendung von Vorrichtungen, die auf der Messung von optischen Dichteunterschieden ΔOD (λa - λb), wobei ODλa, die optische Dichte der Wellenlänge ist, die sich dem Absorptionsmaximum einer zu bestimmenden Komponente entspricht und ODλb die optische Dichte bei einer Wellenlänge ist, bei der die gleiche Komponente nicht wesentlich absorbiert.
Der Algorithmus für Dual-Wellenlängen-Messungen ist notwendigerweise komplexer als der für Messungen mit einer Wellenlänge, aber er ist leistungsstärker. Die Korrektur erster Ordnung, die durch die 700 nm Messung durchgeführt wird, ist eine einfache Subtraktion der durch das Blut hervorgerufenen Hintergrundfarbe. Um diese Korrekturen durchzuführen, kann und wurde durch eine Messung von Blutproben mit 0 mg/dl Glucose über einen weiten Bereich von Blutfarben eine Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit bei 635 nm und bei 700 nm aufgrund der Blutfarbe bestimmt. Der Farbbereich wurde durch eine Variation von Hämatokrit hergestellt und es wurde eine im wesentlichen lineare Beziehung beobachtet. Von diesen Linien wurde der K/S-15 Wert bei 700 nm normiert, um die Äquivalenz zu dem K/S-30 Wert bei 635 nm zu erhalten. Diese Beziehung ist in Gleichung 4 gezeigt, bei der K/S-15n der normierte K/S-15 Wert bei 700 nm ist.
K/S-15n = (K/S-15 · 1,54) - 0,133 (4)
Es ist zu beachten, daß die Äquivalenz des normierten 700 nm Signals und des 635 nm Signals nur bei einem Glucosegehalt von Null korrekt ist. Die Ausdrücke, von denen die Kalibrierkurven hergeleitet wurden, sind durch die Gleichungen 5 und 6 definiert.
K/S-20/15 = (K/S-20) - (K/S-15n) (5)
K/S-30/15 = (K/S-30) - (K/S-15n) (6)
Diese Kurven werden am besten durch eine Polynomgleichung vierter Ordnung, ähnlich wie Gleichung 3, zu denen ein Term vierter Ordnung in K/S hinzugefügt wird, angepaßt. Die Koeffizienten der Computeranpassung für diese Gleichungen sind in Tabelle 2 aufgeführt. TABELLE 2 Koeffizienten für die Polynom-Anpassung vierter Ordnung von Kalibrierkurven für zwei Wellenlängen
Eine Korrektur zweiter Ordnung, um Fehler aufgrund chromatographischer Effekte zu vermeiden, ist auch entwickelt worden. Proben mit niedrigem Hämatokrit haben charakteristischerweise niedrige 700 nm Messungen, verglichen mit Proben hoher Hämatokritwerte mit derselben 635 nm Messung. Wenn das Verhältnis von (K/S- 30)/(K/S-15) gegenüber K/S-30 über einen weiten Bereich von Hämatokritwerten und Glucosekonzentrationen aufgetragen wird, zeigt die resultierende Linie in der Graphik die Grenze zwischen Proben, die chromatographische Effekte (oberhalb der Kurve) aufweisen und solchen, die das nicht tun (unterhalb der Kurve). Der K/S-30 Wert für die Proben oberhalb der Kurve wird durch ein Erhöhen der Messungen korrigiert, damit sie einem Punkt auf der Kurve mit dem gleichen (K/S-30)/(K/S-15) Wert entsprechen.
Die oben erwähnten Korrekturfaktoren sind speziell angepaßt, um für eine einzelne Vorrichtung und eine begrenzte Anzahl von Reagenzpräparaten geeignet zu sein. Der Algorithmus kann für eine einzelne Vorrichtung und ein Reagenz in der gleichen Art und Weise wie oben beschrieben optimiert werden.
Zusammenfassend minimiert das oben beschriebene System die Arbeit der Bedienungsperson und bietet zahlreiche Vorteile gegenüber bekannten Reflexionsmeßverfahren. Im Vergleich mit bekannten Verfahren zur Blutzuckerbestimmung werden einige Vorteile deutlich. Erstens, ist die erforderliche Probenmenge, zur Sättigung der dünnen Matrix gering (gewöhnlich 5 bis 10 ul). Zweitens, ist die erforderliche Bedienungszeit nur die, die notwendig ist, um die Probe auf die dünne hydrophile Matrix aufzubringen und die Abdeckung zu schließen (gewöhnlich 4 bis 7 Sekunden). Drittens, ist kein gleichzeitiger Start der Zeitabstimmung erforderlich. Viertens, kann Vollblut verwendet werden. Das Verfahren erfordert keine Separierung oder Verwendung von Proben, die frei von roten Blutkörpern sind, und kann gleichermaßen mit anderen, stark gefärbten Proben verwendet werden.
Mehrere nicht offensichtliche Vorteile entstehen als Folge der Arbeitsweise nach dem oben beschriebenen Verfahren mit Vollblut. Wässrige Lösungen (wie Blut) werden normalerweise eine hydrophile Membran durchdringen, um eine flüssige Schicht auf der gegenüberliegenden Seite der Membran zu ergeben, eine Oberfläche, die dann für eine Reflexionsmessung nicht geeignet ist. Es ist jedoch beobachtet worden, daß Blut, augenscheinlich wegen der Wechselwirkung der roten Blutkörperchen und Proteinen im Blut mit der Matrix, die Polyamidmatrix benetzen werden, ohne daß eine überschüssige Flüssigkeit die poröse Matrix durchdringt, um die Reflexionsmessung auf der gegenüberliegenden Seite der Matrix zu stören.
Weiterhin würde erwartet werden, daß die dünnen Membranen, die in den erfindungsgemäßen Teststreifen verwendet werden, wenn sie benetzt sind, Licht durchlassen und nur ein schwaches Signal an die Reflexionsmeßvorrichtung zurückleiten werden. Ältere Lehren haben im allgemeinen angegeben, daß eine reflektierende Schicht hinter der Matrix notwendig ist, um ausreichend Licht zu reflektieren. In anderen Fällen wurde ein weißes Pad hinter dem Reagenzpad vor der Farbmessung angebracht. Im vorliegenden Fall ist weder eine reflektierende Schicht noch ein weißes Pad erforderlich. Tatsächlich wird die Erfindung üblicherweise mit einer lichtabsorbierenden Oberfläche hinter dem Teststreifen ausgeführt, wenn einfallendes Licht auf die Matrix auftrifft. Die Verwendung einer lichtabsorbierenden Fläche hinter dem Teststreifen in Verbindung mit der Reflexionsmessung bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen, ermöglicht akzeptable Reflexionsmessungen, die ohne Entfernung überschüssiger Flüssigkeit von der Matrix erhalten werden, wodurch ein Schritt eliminiert wird, der bei früheren Verfahren gewöhnlich notwendig war.
Nachdem die Erfindung nunmehr allgemein beschrieben wurde, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele besser verstanden werden, die nur zum Zwecke der Verdeutlichung beschrieben werden und nicht als eine Beschränkung der Erfindung angesehen werden, soweit nichts anderes erwähnt ist.

BEISPIEL I

Reproduzierbarkeit

Eine männliche Blutprobe (JG, Hämatrokrit = 45) wurde verwendet, um die Daten für die Reproduzierbarkeit, die in den Tabellen 3 bis 5 dargestellt sind, zu sammeln. TABELLE 3 Reproduzierbarkeit eines Ein-Wellenlängen-MPX-Systems TABELLE 4 Reproduzierbarkeit eines Dual-Wellenlänge-MPX-Systems TABELLE 5 Reproduzierbarkeit einer Blende mit 3,0 mm Durchmesser
Das Blut wurde in Aliquote unterteilt und es wurde ihm Glucose über einen Bereich von 25 bis 300 mg/dl zugegeben. Zwanzig Bestimmungen wurden bei jedem Glucosetestniveau von Streifen durchgeführt, die zufällig aus 500 Teststreifen (Lot FJ4-49B) entnommen worden sind. Die Ergebnisse dieser Studie führen zu den folgenden Schlußfolgerungen:
1. Einfach- gegen Dual-Wellenlänge: Der durchschnittliche C. V. Wert für das 30 Sekunden Ergebnis mit zwei Wellenlängen war 3,7% gegenüber 4, 8% für das 30 Sekunden Ergebnis mit einer Wellenlänge, eine Verbesserung von 23% über einen Glucosebereich von 25 bis 810 mg/dl. Es gab eine Verbesserung von 33% für den C. V. Wert in dem Glucosebereich von 25 bis 326 mg/dl. Hier sank der C. V. Wert von 5,4% auf 3,6%, eine bemerkenswerte Verbesserung in dem am meisten verwendeten Bereich. Die 20 Sekunden-Dual-Wellenlängen- Messung ergab ähnliche Verbesserungen für den C. V. Wert verglichen mit der Messung mit einer Wellenlänge in dem 25-325 mg/dl Bereich (Tabelle 3 und 4).
2. Dual-Wellenlänge, 20 gegen 30 Sekunden Ergebnis: Der durchschnittliche C. V. Wert für ein 20 Sekunden Ergebnis in dem Bereich von 25 bis 100 mg/dl ist nahezu identisch mit der 30 Sekunden Messung, 4,2% gegenüber 4,1%. Jedoch hat die 30 Sekunden Messung bei 326 mg/dl einen C. V. Wert von 2,1% und das 20 Sekunden Ergebnis einen C. V. Wert von 4, 5%. Wie in der K/S-20 Reaktionskurve zu sehen war, beginnt die Kurve oberhalb von 250 mg/dl stark abzufallen. Das führt zu einer schlechten Reproduzierbarkeit für das 20 Sekunden Ergebnis bei Glucosegehalten, die größer sind als 300. Von diesen Reproduzierbarkeitsdaten schließt man, daß die Abschlußgrenze für das 20 Sekunden Ergebnis irgendwo zwischen 100 und 326 mg/dl liegt. Eine Abschlußgrenze von 250 mg/dl wurde später aus den Ergebnissen der Recovery-Studie, die in Beispiel II ausgeführt ist, bestimmt.
3. Blendengröße: Eine kleinere optische Blendengröße, 3,0 mm gegen 5,0 mm, wurde untersucht. Anfängliche Versuche, die eine zehnfache, handgetauchte Scheibenprobe verwendeten, zeigten verbesserte C. V. Werte mit der 3,0 mm Blende, offensichtlich wegen der einfacheren Lageanpassung an die optischen Einrichtungen des Systems. Wenn jedoch eine maschinell hergestellte Rollmembran verwendet wurde, lag der durchschnittliche C. V. Wert (Tabelle 5) der größeren Blende, 4,7 mm, bei 3,9 mm gegenüber einen durchschnittlichen C. V. Wert für die 3,0 mm Blende von 5,1%. Diese Erhöhung um 30% des C. V. Wertes wurde wahrscheinlich durch die unebene Oberfläche des Rollmembranlots verursacht, wie weiter unten diskutiert.

BEISPIEL II

Recovery:

Für einen Vergleich des vorliegenden Verfahrens (MPX) gegenüber einem typischen bekannten Verfahren, das einen Yellow Springs Instrument Modell 23A Glucoseanalysator verwendet, der von Yellow Springs Instrument Co., Yellow Springs, Ohio (YSI) hergestellt worden ist, wurde Blut von 36 Spendern geprüft. Die Spender wurden gleichmäßig zwischen Männern und Frauen getrennt und waren in einem Hämatokritbereich von 35 bis 55%. Die Blutproben wurden innerhalb von 30 Stunden nach der Entnahme verwendet, mit Lithiumheparin als Antikoagulans. Jede Blutprobe wurde in Aliquote unterteilt, und es wurde Glucose hinzugegeben, um 152 Proben in dem Bereich von 0-700 mg/dl Glucose zu erhalten. Jede Probe wurde für eine Gesamtzahl von 304 Datenpunkten doppelt getestet.
Aus diesen Daten wurden Reaktionskurven ermittelt und die Glucosewerte wurden mit den geeigneten Gleichungen (Tabelle 1 und 2) berechnet. Diese MPX- Glucosewerte wurden dann über die YSI-Werte aufgetragen, um ein Streuungsdiagramm zu erhalten.
Vergleich von MPX-Systemen: Sowohl für die 20 Sekunden als auch für die 30 Sekunden Meßzeiten gab es eine sichtbar größere Streuung in den Streuungsdiagrammen für eine einzelne Wellenlänge als in den Dual-Wellenlängen-Streuungsdiagrammen. Die 20 Sekunden Messung streute oberhalb 250 mg/dl, aber die 30 Sekunden Messung weist bis zu einem Glucosegehalt von > 500 mg/dl keine breite Streuung auf.
Diese Streuungsdiagramme wurden quantitativ durch die Bestimmung der Abweichungen von dem YSI-Wert in verschiedenen Glucosebereichen untersucht. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt. TABELLE 6 Genauigkeit von MPX aus Recovery-Daten
Anmerkung: Dies sind C. V. Werte innerhalb eines Verfahrens.
a. Das Dual-Wellenlängensystem ergibt C. V. Werte, die 30% niedriger liegen als die des Einfach-Wellenlängensystems.
Wert von ± 6-7 mg/dl, wobei der S. D. Wert für eine Dual-Wellenlängenmessung nur bei ± 2,2 mg/dl lag.
c. Die Grenze für eine 30 Sekunden MPX Messung liegt bei 250 mg/dl. In dem Bereich von 50-250 mg/dl haben sowohl die 20 als auch die 30 Sekunden Messungen ähnliche C.V.-Werte (etwa 7% für Einfach- Wellenlänge, 5, 5% für Dual-Wellenlänge) innerhalb des Verfahrens. In dem Bereich von 250-450 mg/dl gehen die C. V. Werte innerhalb des Verfahrens jedoch auf mehr als den doppelten Wert bei der 20 Sekunden Messung, auf 14,5% für die Einfach- und 12,8% für die Dual-Wellenlängen.
d. Die 30 Sekunden Messung war sowohl für die Einfach- als auch für die Dual-Wellenlängen-Messung (C.V.-Werte von 10,2 und 8,4%) oberhalb von 450 mg/dl unbrauchbar.
Zusammenfassend ergaben 2 MPX-Systeme optimale Mengenbestimmungen in dem Bereich von 0 bis 450 mg/dl.
1. MPX 30 Dual: Dieses Dual-Wellenlängen-System ermöglicht eine 30 Sekunden Meßzeit mit einer Zuverlässigkeitsgrenze von 95% (definiert als die Wahrscheinlichkeit, daß eine Messung innerhalb von 2 S. D. des YSI liegt) bei 11,3% (C.V.-Wert) für den Bereich von 50 bis 450 mg/dl (Tabelle 7) und ± 4,4 mg/dl (S. D.) bei 0-50 mg/dl.
2. MPX 320 Dual: Dieses Dual-Wellenlängen-System ermöglicht eine 20 Sekunden Meßzeit in dem Bereich von 0 bis 250 mg/dl und eine 30 Sekunden Meßzeit für den Bereich von 250 bis 450. Die 95% -Zuverlässigkeitsgrenzen sind nahezu identisch mit dem MPX 30 Dualsystem (Tabelle 7), 11,1% (C. V.) bei 50-450 mg/dl und ± 4,6 mg/dl (S.D. bei 0-50 mg/dl). TABELLE 7 Vergleich der 95%-Zuverlässigkeitsgrenzen für MPX, GlucoScan Plus und Accu-Chek bG* Reagenzstreifen
* Zuverlässigkeitsgrenzen für MPX sind von YSI. Die Zuverlässigkeitsgrenzen für GlucoScan Plus und Accu-Chek bG sind aus der Regressionsgleichung gegen YSi, was aufgrund der kleinen Unterschiede in der Kalibrierung einen Überhang ausschließt.

Beispiel III

Stabilität:

Das meiste der Arbeit im Labormaßstab, die während der Optimierung der Stabilität durchgeführt wurde, wurde unter Verwendung von handgetauchten 0,8 u Posidyne-Membranscheiben abgeschlossen. Die spezielle Farbstoff/Enzym-Zusammensetzung ist zuvor beschrieben worden.
1. Raumtemperaturstabilität: Diese Studie versuchte, jegliche Änderung der Reaktion eines 0,8 u Posidyne Membranreagenz, das bei 18 bis 20ºC über Silicagel-Trocknungsmittel gelagert worden ist, zu erfassen. Nach 2,5 Monaten gab es keine erkennbare Änderung bei der gemessenen Reaktion einer Raumtemperaturprobe gegenüber der Reaktion einer Probe, die bei 5ºC gelagert worden ist. Jedes Streuungsdiagramm stellt einen Glucosebereich von 0 bis 450 mg/dl dar.
2. Stabilität bei 37ºC: Es wurde eine 37 W Stabilitätsstudie durchgeführt, bei der das gleiche Reagenz verwendete, wie die RT-Studie. Die Unterschiede bei den Glucosewerten des Reagenz, das bei 37ºC beansprucht wurde, im Vergleich zu dem RT-Reagenz, für Strei fen, die mit oder ohne Klebstoff beansprucht wurden, wurde über die Zeit aufgetragen. Obwohl die Daten aufgrund der schlechten Reproduzierbarkeit der handgemachten Streifen verrauscht waren, war die Stabilität der Streifen exzellent, gleichgültig, ob sie mit oder ohne Klebstoff belastet worden sind.
3. Stabilität bei 56ºC: Es wurden acht 5-6-Tage Stabilitätsstudien durchgeführt, bei denen unterschiedliche Aufbereitung einer ähnlichen Zusammensetzung auf einer Scheibenmembran verwendet wurden (Tabelle 8). Bei dem niedrigen Glucosetestniveau (80-100 mg/dl) fiel der durchschnittliche Glucosewert unter der Beanspruchung um 3,4%, wobei der höchste Abfall 9,55% betrug. Bei dem höchsten Testniveau (280-320 mg/dl) fiel die Glucosemessung um einen Durchschnitt von 3,4%, der größte Abfall betrug 10,0%. TABELLE 8 Stabilität eines pH = 4,0, 0,8 Posidyne Scheibenreagenz Zusammensetzung für 5 bis 6 Tage bei 56ºC beansprucht
* Diese beiden Proben enthielten das Doppelte der normalen Konzentration von Enzym und Farbstoff.
Eine Studie der 56ºC-Belastung dieser Membran über einen Zeitraum von 19 Tagen zeigte keine wesentlichen Unterschiede für Streifen, die mit oder ohne Kleber belastet worden sind. In beiden Fällen betrug der Abfall des Glucosewertes über 19 Tage < 15% bei den niedrigen Testniveaus (80-100) und bei 300 mg/dl.
Es wurde eine andere 56ºC-Studie durchgeführt, bei der eine handgetauchte 0,8 u Posidyne-Membran mit der doppelten der normalen Konzentration an Enzym und Farbstoff verwendet wurde. Zwei getrennte Aufbereitungen derselben Zusammen setzung wurden hergestellt und die Stabilität über einen Zeitraum von 14 Tagen gemessen. Die durchschnittlichen Ergebnisse der zwei Studien wurden aufgetragen. Die Änderungen lagen innerhalb von ± 10% über den Zeitraum von 14 Tagen sowohl für das hohe als auch für das niedrige Glucosetestniveau. Diese Daten bestätigen, daß diese Zusammensetzung besonders stabil ist.

Beispiel IV

Probengröße: Die Anforderungen an die Probengröße bei MPX sind in Tabelle 9 dargestellt. TABELLE 9 Auswirkungen der Probengröße auf die MPX-Messungen
Die in der Tabelle gezeigten Mengen wurden mit einer Mikropipette auf die in Fig. 1 gezeigte Matrix aufgebracht. Wenn Blut von einem Stich in den Finger auf den Streifen aufgebracht wird, kann nicht die gesamte Probe aufgebracht werden, deshalb stellen die hier genannten Mengen nicht die Größe der Gesamtprobe, die für die Analyse aus dem Finger gedrückt werden muß, dar. Eine 3 ul-Probe ist das Minimum, das notwendig ist, um den Matrixkreis vollständig zu bedecken. Dies stellt nicht eine ausreichende Probenmenge zur Verfügung, um die Matrix vollständig zu sättigen und MPX führt zu schlechten Ergebnissen. Eine 4 ul-Probe sättigt die Reagenzunterlage kaum, wohingegen eine 5 ul-Probe eindeutig ausreichend ist. Eine 10 ul-Probe ist ein großer glänzender Tropfen und eine 20 ul- Probe ist ein sehr großer Tropfen und wird wahrscheinlich nur verwendet, wenn Blut von einer Pipette für die Probenentnahme verwendet wird.
Bei einer niedrigen Glucosekonzentration zeigt das Einfach-Wellenlängen- Ergebnis eine gewisse Abhängigkeit von der Probengröße, die bei der Verwendung der Dual-Wellenlängen-Messung vollständig eliminiert wird. Obwohl diese Abhängigkeit bei der Einfach-Wellenlänge als akzeptabel angesehen werden könnte, ist sie eindeutig nicht erwünscht.

Beispiel V

Reproduzierbarkeit:

Die oben beschriebenen experimentellen Messungen sind immer wiederholt durchgeführt worden, normalerweise 2, 3 oder 4 Bestimmungen pro Datenpunkt. Diese Bestimmungen haben immer eine enge Übereinstimmung, auch für Proben mit extremen Hämatokrit- oder extremen Sauerstoffpegeln gezeigt. C.V-Werte waren deutlich unter S %. Es zeigte sich deshalb, daß die Reproduzierbarkeit sehr gut bis exzellent ist.
Die vorliegende Erfindung liefert viele Vorteile gegenüber Systemen, die gegenwärtig kommerziell erhältlich sind oder in der Literatur beschrieben worden sind. Die Bedienungsanleitungen sind einfach und erfordern wenig technisches Geschick und sind verhältnismäßig frei von Bedienungsfehlern. Die Tests können rasch ausgeführt werden und verwenden preisgünstige und verhältnismäßig unschädliche Reagenzien, wichtige Gesichtspunkte für Materialien, die im Haushalt verwendet werden. Der Anwender erhält Ergebnisse, die verstanden werden können und in Verbindung mit Pflegetherapien verwendet werden. Zusätzlich besitzen die Reagenzien lange Lagerfähigkeit, so daß die erhaltenen Ergebnisse für eine lange Zeitdauer zuverlässig sein werden. Die Ausstattung ist einfach und zuverlässig und im wesentlichen automatisch.

Claims

1. Nichtverwischbarer Teststreifen zur Bestimmung von Glucose in einer ungemessenen Vollblutprobe, wobei der Teststreifen, der angepaßt ist für den Gebrauch in einem Reflexionsablesegerät, das zur Messung der Reflexion bei einer ersten und zweiten Wellenlänge geeignet ist, umfaßt:

1) eine poröse hydrophile Polyamidmatrix, die auf einer Seite eine probenaufnehmende Oberfläche hat, die angepaßt ist, um die Vollblutprobe aufzunehmen und auf der anderen Seite eine Testoberfläche hat, an welcher diffus reflektiertes Licht meßbar ist, in welcher

die Testoberfläche gegenüber der probenaufnehmenden Oberfläche ist;

die Matrix bei Fehlen der aufzubringenden Probe im wesentlichen reflektierend ist;

die Matrix Öffnungen von ausreichender Größe enthält, um das Fließen eines flüssigen Teils der Vollblutprobe in die Matrix von der probenaufnehmenden Oberfläche zur Testoberfläche und durch die Matrix von der probenaufnehmenden Oberfläche zu der Testoberfläche zu ermöglichen und

2) Reagenzmittel zum chemischen Reagieren mit Glucose enthält, um eine Änderung der Reflexion bei Anwesenheit von optisch sichtbarem Hämoglobin zu erzeugen, die an der Testoberfläche wahrnehmbar ist, wobei die Änderung ein Hinweis auf die Konzentration in der Vollblutprobe der vorhandenen Glucose ist, in welchem:

das Reagenzmittel 3-Dimethylaminobenzoesäure und 3-Methyl-2-Benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid als Farbstoffvorläufer, der zur Bildung eines Chromophoren geeignet ist, das bei der ersten Wellenlänge Absorptionsvermögen zeigt, das proportional zur Konzentration der Glucose ist und im wesentlichen kein Absorptionsvermögen bei der zweiten Wellenlänge zeigt, bei welcher Hämoglobin Licht absorbiert, und eine Glucoseoxidase und eine Peroxidase aufweist.

2. Teststreifen nach Anspruch 1, in welchem die Matrix Öffnungen von einer ausreichenden Größe enthält, um rote Blutzellen dergestalt herauszufiltern, daß keine bedeutende Anzahl von roten Blutzellen die Testoberfläche erreicht.

3. Teststreifen nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Matrix eine mittlere Porengröße von 0,2 bis 2,0 um, vorzugsweise von 0,5 bis 1,2 um und besonders bevorzugt von 0,8 um hat.

4. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem 3-Dimethylaminobenzoesäure und 3-Methyl-2-Benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 bis 4 : 1 vorhanden sind.

5. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem das Reagenz einen pH-Wert von 3, 8 bis 5, vorzugsweise von 3, 8 bis 4, 3 und besonders bevorzugt von etwa 4 aufweist.

6. Teststreifen nach Anspruch 5, in welchem das Reagenz weiter einen Puffer aufweist, der vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt etwa 10 Gew.-%, einen Citratpuffer zur Erzeugung des pH-Wertes aufweist.

7. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Matrix ein Nylon aufweist.

8. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in welchem die Matrix Nylon aufweist, das auf einen Kern von nichtverwobenen Fasern aufgegossen ist.

9. Teststreifen nach Anspruch 8, in welchem die Kernfasern Polyesterfasern sind.

10. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in welchem die Matrix eine Membran aufweist.

11. Teststreifen nach Anspruch 10, in welchem die Membran eine Mikrofiltrationsmembran aufweist.

12. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in welchem die Oberfläche der Matrix positiv geladen ist.

13. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, in welchem die Oberfläche der Matrix mit quartären Amingruppen funktionalisiert ist.

14. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in welchem die Matrix einschichtig ist.

15. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, in welchem die Matrix bei Fehlen der aufzubringenden Probe im wesentlichen gleichförmig reflektierend ist.

16. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, in welchem der Reflexionsgrad der Matrix dergestalt ist, daß mindestens 50% des auftreffenden Lichtes bei Fehlen der aufzubringenden Probe reflektiert wird.

17. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 16, in welchem die Matrix eine Dicke von 0,01 mm bis 0,3 mm hat.

18. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 17, in welchem die erste Wellenlänge etwa 635 nm beträgt.

19. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 18, in welchem die zweite Wellenlänge etwa 700 nm beträgt.

20. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 19, in welchem die hydrophile Matrix sowohl von der probenaufnehmenden Oberfläche als auch der Testoberfläche zugänglich ist.

21. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 20, der weiter einen Träger aufweist, der zur Handhabung des Teststreifens an der porösen Matrix angebracht ist, in welchem der Träger den Zugang der Probe zu einer Seite der Matrix und auftreffenden Lichtes zur anderen Seite der Matrix, dessen Reflexionsgrad gemessen wird, zuläßt, der Träger weiter eine Öffnung zur Aufbringung der Vollblutprobe zur probenaufnehmenden Oberfläche aufweist.

22. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 21, in welchem der flüssige Teil der Vollblutprobe Hämoglobin enthält.