DE3922495A1 - Analyseverfahren fuer substanzen aus biologischen fluessigkeiten, insbesondere vollblut - Google Patents

Analyseverfahren fuer substanzen aus biologischen fluessigkeiten, insbesondere vollblut

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Description

Für die schnelle und einfache Analyse von Einzelproben oder kleinen Serien haben Teststreifen, bei denen die Reagenzien in einer Matrix aus Papier oder Kunststoff enthalten sind und die Probe direkt auf diese Matrix aufgebracht wird, eine überragende Bedeutung erlangt. Insbesondere mit Kunststoffmatrizen, die in hoher Gleichmäßigkeit hergestellt werden können, lassen sich in Kombination mit reflexionsphotometrischen Verfahren Meßergebnisse in der Qualität der naßchemischen Methoden erzielen.
Die bisher im Handel befindlichen Teststreifen zur Be­ stimmung der Inhaltsstoffe des Blutes haben aber oft folgende Nachteile:
Die meisten Verfahren werden durch die im Blut enthal­ tenen Erythrocyten gestört. Der Anwender muß deshalb vor der Analyse aus dem Vollblut das Serum oder Plasma durch Zentrifugen abtrennen. Dies ist jedoch besonders bei kleinen Probemengen problematisch. Bei neueren Testmitteln, bei denen die Reagenzschicht selbst (EP 00 64 710, DOS 34 07 395) oder eine vorgeschaltete Membran semipermeabel ist und die Erythrocyten zurück­ hält, können die Testsysteme direkt mit Vollblut beauf­ schlagt werden. Bei diesen Tests muß aber der rote Blut­ farbstoff von der reflexionsphotometrischen oder visu­ ellen Auswertung durch Abwischen oder Abwaschen entfernt werden. Bei der Analyse von großen Molekülen, z.B. be­ stimmten Enzymen, kann diese Methode nicht angewandt werden, da diese ebenfalls durch die semipermeable Schicht zurückgehalten werden. Außerdem ist der Abwisch­ prozeß eine potentielle Quelle gefährlicher Infektionen, da Blutproben bisweilen mit Hepatitisviren oder anderen Krankheitserregern kontaminiert sein können.
Im Hinblick auf die geforderte hohe Reproduzierbarkeit der Diagnose-Teststreifen sind Systeme mit einem mög­ lichst einfachen Aufbau sowie einer unkomplizierten Herstellung mit wenigen Produktionsschritten zu bevor­ zugen.
Bisweilen ist es auch wünschenswert, zwischen Probenauf­ gabe und Reaktionsbeginn eine Verzögerungsphase zu haben, damit die Probenflüssigkeit temperiert sowie ge­ gebenenfalls vorgeschaltete Reaktionen durchgeführt werden können.
Schließlich ist es erstrebenswert sowohl für Blut- als auch für Urinanalysen eine gemeinsame Matrix einsetzen zu können. Die bisher bekannten mikroporösen Blutma­ trizen können nämlich, wie in EP-A 64 710 und DE 38 09 523.8 näher beschrieben, nicht direkt ohne weitere Hilfsmittel für den "dip and read"-Test bei Urinanalysen eingesetzt werden.
Bisher gibt es noch kein Teststreifensystem, das alle diese Forderungen gleichzeitig erfüllt.
Es hat nicht an Bemühungen gefehlt, die darauf hin­ zielten, inbesondere Teststreifen für Blutanalysen zu entwickeln, bei denen die Abtrennung der Erythrocyten bzw. des Hämoglobins systemimmanent geschieht.
In der DE-AS 22 22 951 oder US-P 41 44 306 sind mehr­ schichtigte Testvorrichtungen für Blut beschrieben, bei denen eine oder mehrere dieser Schichten als Filter wirken, die die korpuskulären Bestandteile des Blutes zurückhalten. Für die Abtrennung der Erythrocyten werden Membranen mit Poren von 1-3 µm eingesetzt. Diese ver­ stopfen leicht und behindern den Durchtritt des Plasmas, welches dadurch langsam und ungleichmäßig in die Reaktionsschicht eintritt.
Ein Fortschritt wurde durch den Einsatz von speziellen Glasfaserfiltern erzielt, wie sie in DE-OS 30 29 579.5 beschrieben sind. Bei Blutaufgabe werden die partiku­ lären Blutbestandteile zurückgehalten, während das Plas­ ma zur Reagenzschicht transportiert wird, in der die Nachweisreaktion abläuft. Das Totvolumen dieser Erythro­ cytenrückhaltezone ist jedoch relativ hoch. Das Verhält­ nis von abgetrenntem Plasma zu dosiertem Blut ist daher noch verschlechtert. So kann es mitunter vorkommen, daß das Abtrennsystem die Menge der abzutrennenden Erythro­ cyten nicht bewältigt, so daß Blutfarbstoff zur Reak­ tionszone gelangt und dort Störungen hervorruft.
Zur weiteren Verbesserung dieses Glasfasersystems sind in der EP 01 33 895 spezielle Rückhaltesysteme be­ schrieben. Es handelt sich hierbei beispielsweise um Papiere, die mit polaren Verbindungen, z.B. speziellen Farbstoffen getränkt sind. Diese Substrate bewirken eine starke Gerinnung des Blutes, so daß die korpuskulären Bestandteile wirksamer vom Serum getrennt werden.
Wie in der EP 01 33 895 beschrieben ist, gibt es kein universelles Rückhaltesubstrat, das für jeden Test gleich gut geeignet ist. So bewirken manche Stoffe Hämolyse oder gehen unerwünschte Nebenreaktionen mit Enzymen ein. Es muß deshalb für jeden Test das ent­ sprechend günstigste Rückhaltesubstrat ermittelt wer­ den. Außerdem können bei der Gerinnung des Blutes die zu bestimmenden Analyten teilweise miteingeschlossen werden. Die in der EP 01 33 895 beschriebenen Systeme sind im Aufbau recht kompliziert. So besteht das System für den Glucosenachweis beispielsweise aus sieben Einzelelementen. Die Reaktion wird dadurch ausgelöst, daß die mit den Nachweisreagenzien versehene Polymer­ matrix auf das Plasma gefüllte Transportvlies gedrückt wird. Da im zusammengedrückten Zustand bei Oxidations­ reaktionen ein Sauerstoffmangelproblem entstehen würde, sind für dieses System spezielle Reagenzmatrizen ent­ wickelt worden, die in der EP 01 13 896 beschrieben sind. Es handelt sich hierbei um Reagenzien enthaltene Filmschichten auf einer multifilen Gewebe-Trägerschicht oder Vlies. Die Reagenzfilme werden, wie in dieser An­ meldung beschrieben, aus wäßrigen Polymerdispersionen in Gegenwart von Füllstoffen hergestellt. Da in der multifilen Gewebeschicht ein gewisser Teil Sauerstoff gespeichert ist, kann im obengenannten System auch im zusammengedrückten Zustand eine sauerstoffverbrauchende Reaktion ablaufen.
Nachteilig bei diesem System ist, daß der Sauerstoff­ gehalt limitiert ist und, wie in der EP 01 13 896 beschrieben, bei weitem nicht zur Deckung des für die Reaktion erforderlichen Sauerstoffbedarfs ausreicht. Die in dieser Schrift beschriebenen Reaktionsschichten auf multifilen Gewebeschichten werden in Kombination mit den oben erwähnten Erythrocytenrückhaltesubstraten einge­ setzt. Eine systemimmanente Erythrocytenabtrennung ist mit diesen Vlies- oder Gewebe-gestützten Reagenzschich­ ten offensichtlich nicht möglich. Wie dort ausgeführt, werden die Reagenzschichten nach den in DE-AS 15 98 153, DE-OS 29 10 134 und DE-OS 31 18 381 beschriebenen Ver­ fahren aus Polymerdispersionen in Gegenwart von Füll­ stoffen hergestellt. Die dabei entstehenden Porenstruk­ turen weisen sehr kleine Porendurchmesser, geringe Porositäten sowie keine durchgängigen Porenkanäle mit asymmetrischer Struktur auf und ermöglichen daher keine systemimmanente Erythrocytenabtrennung.
In den Europ. Patent Applications 01 10 173 und 02 56 806 der Fa. Lifescan sind Nachweiselemente mit einem wesentlich einfacheren und unkomplizierteren Aufbau beschrieben, die direkt für Vollblutanalysen eingesetzt werden können. Wie in der letztgenannten Schrift beschrieben, handelt es sich bei der Reagenz­ matrix um eine hydrophile Polyamidmembran (Nylon) , die mit den Nachweisreagenzen imprägniert wird.
Auffallend bei diesem System, das sich bereits auf dem Markt befindet, ist, daß die roten Blutfarbstoffe nicht separiert werden. Bei Blutaufgabe färbt sich die gesamte Reagenzmatrix rot. Die Auswertung der Glucose-Farbreak­ tion erfolgt mit einem Gerät, dessen Wellenlänge mit dem roten Blutfarbstoff nicht interferiert, die Chromogen­ reaktion jedoch detektiert. Diese Systeme können aber für visuelle Auswertungen nicht verwendet werden. Wie die elektronenmikroskopischen Analysen dieser Reagenz­ matrix zeigen, handelt es sich um hochporöse Membran­ schichten, die sich beidseitig auf einem Polymervlies befinden. Die Porenstruktur ist symmetrisch und weist Durchmesser von 2 bis 12 µm auf. Eine Erythrocytenab­ trennung kann nicht erfolgen. Dagegen ist in derselben Anmeldung (EP-A 02 56 806) beschrieben, daß für Blut­ analysen vorzugsweise Membranen mit mittleren Poren­ durchmessern von 0,1 bis 2,0 µm eingesetzt werden. Anscheinend treten auch bei diesem System die oben er­ wähnten Schwierigkeiten auf, daß poröse Systeme mit Porendurchmessern von weniger als 3 µm zwar die Ery­ throcyten abtrennen, jedoch von hochmolekularen Ver­ bindungen blockiert werden und auch hochmolekulare Analyten nicht passieren lassen, während es bei Mem­ branen mit deutlich größeren Poren genau umgekehrt ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es nun, ein Test­ streifensystem und ein zugehöriges Analysenverfahren zu entwickeln, das im Aufbau und in der Handhabung ähnlich unkompliziert wie das zuletzt beschriebene "one touch"- System ist, gleichzeitig jedoch auch die Abtrennung der roten Blutfarbstoffe ohne zusätzliche Hilfsmittel (Koa­ gulantien) systemimmanent ermöglicht. Außerdem sollten der eigentlichen Nachweisreaktion gegebenenfalls be­ stimmte Vorreaktionen, beispielsweise zum Entfernen von Störkomponenten, vorgeschaltet werden können, wobei Nachweis- und Vorreaktion durch Verzögerungseffekte ge­ gebenenfalls zeitlich separiert werden können. Schließ­ lich sollten die zu entwickelnden Nachweiselemente mög­ lichst auch für den "dip and read"-Test bei Urinanalysen eingesetzt werden können.
Es wurde nun vollkommen überraschend gefunden, daß Mem­ branen mit einer asymmetrischen Porenstruktur, in die die entsprechenden Nachweisreagenzien eingearbeitet werden, zur Lösung der gestellten Aufgabe in hervor­ ragender Weise eingesetzt werden können. Der Begriff asymmetrische Porenstruktur ist dem Membranfachmann geläufig und ist in einer Großzahl von Publikationen, von denen hier nur zwei erwähnt werden sollen (H. Strathmann, "Trennung von molekularen Mischung mit Hilfe synthetischer Membranen", Steinkopf-Verlag, Darmstadt 1979 und D.R. Lloyd, "Materials Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269, Washington D.C. 1985), näher erläutert. Dort ist auch die wichtigste Methode zur Herstellung derartiger Membranen, nämlich die Fäl­ lungskoagulationsmethode (auch Phaseninversion genannt) erwähnt. Typisch für derartige Membranen ist die inte­ gral asymmetrische Porenstruktur mit einer dichten Poly­ merstruktur, auch Polymerhaut oder aktive Trennschicht genannt, an der Membranoberseite und größeren Poren sowie einer höheren Porosität in der darunter liegenden hochporösen Stützschicht. Während die Dicke der aktiven Trennschicht ca. 0,2-0,5 µm beträgt, ist die darunter liegende hochporöse Stützschicht je nach Naßauftrag bei der Membranherstellung in der Regel ca. 20 bis 100 µm dick. Die Struktur der hochporösen Stützschicht kann je nach Polymer und Herstellverfahren eine schaumartige oder eine fingerartige oder auch eine Mischstruktur aus diesen beiden besitzen.
Die nachträgliche Modifizierung oder Herstellung mit einer weiteren z.B. noch dichteren, aktiven Trennschicht auf der ursprünglichen aktiven Trennschicht nach dem sogenannten Composite-Verfahren (J.E. Cadotte, ACS Sym­ posium Ser. 153 (1981), 305-326) kommt für die Herstel­ lung der erfindungsgemäßen Nachweiselemente ebenfalls in Frage, ist aber weniger bevorzugt.
Die Herstellung von Diagnoseteststreifen auf der Basis von koagulierten Membranen mit asymmetrischer Poren­ struktur ist zwar in der DOS 34 07 359 schon beschrie­ ben. Dort handelt es sich jedoch um Membransysteme, die mit der großporigen Seite auf einem undurchlässigen Trägermaterial haften.
Derartige Nachweissysteme sind für den erfindungsgemäßen Anwendungszweck nicht gegeignet, sondern nur für "wipe off"-Systeme, bei denen das Blut abgewischt werden muß.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nachweisele­ mente verwendeten Membranen können entweder trägerfrei oder mit der Membranunterseite auf einem für technische Membranen üblichen durchlässigen Trägermaterial, wie Polymervlies oder multifilem Gewebe, haften. Werden in derartige Membransysteme geeignete Nachweisreagenzien eingearbeitet und auf der Membranunterseite mit Vollblut beaufschlagt, so kommt es in der Membran zur Abtrennung der roten Blutfarbstoffe, während auf der gegenüber­ liegenden Membranseite eine durch Erythrocyten unge­ störte Farbreaktion beobachtet werden kann.
Die Porengröße auf der Membranunterseite (Aufgabenseite) soll mindestens 3 µm, bevorzugt 5 bis 10 µm betragen. Auf der gegenüberliegenden Membranoberseite sollen die Poren nicht größer als 1 µm sein. Bevorzugt sind Poren mit 0,1 bis 0,5 µm Durchmesser.
Offensichtlich ist die spezielle Porenstruktur dieser Membranmatrizen für die erfindungsgemäßen Nachweisele­ mente von entscheidender Bedeutung. Wie die REM-Auf­ nahmen zeigen, können die Funktionsmechanismen dieser Systeme folgendermaßen gedeutet werden. Durch die großen Poren (< 5 µm) auf der Membranunterseite (Aufgabenseite) kann Vollblut ungehindert einströmen, während durch die zunehmenden Porenverengungen sowie die aktive Trenn­ schicht die Plasmaseparation erfolgt.
Niedermokulare Verbindungen inclusive die bei der Nach­ weisreaktion entstehenden niedermolekurlaren Umsetzungs­ produkte, wie Wasserstoffperoxid, können dagegen die mikroporöse aktive Trennschicht passieren.
Wird nun in die aktive Trennschicht oder an deren Ober­ fläche ein chromogenes Nachweissystem gebracht, so ist nach Blutaufgabe auf die Membranrückseite eine durch Erythrocyten ungestörte Nachweisreaktion an der Membran­ oberfläche zu beobachten.
Anstelle eines chromogenen Nachweissystems können auch andere, beispielsweise elektrochemische Nachweismethoden eingesetzt werden, da Membranen, wie in DE-OS 36 15 831 beschrieben, leicht metallisiert und daher elektrisch leitend gemacht werden können.
Ein wichtiger Vorteil der hier beschriebenen Nachweis­ elemente ist die relativ einfache Herstellbarkeit. So lassen sich die in den Abb. 1 dargestellten Membransys­ teme nach dem heutigen Stand der Technik in einem ein­ zigen Arbeitsprozeß (Beschichten eines Trägermaterials mit Polymergießlösung, Koagulieren, Trocknen) herstel­ len. Bei der schematischen Darstellung einer Membran mit der Abb. 1 bedeutet (A) die aktive Trennschicht, die üb­ licherweise eine Dicke von 0,2 m hat. (B) ist die ingetral asymmetrische Polymermembran, die normalerweise 50 µm dick ist. (C) ist das Membranträgermaterial, welches ein Gewebe oder Vlies sein kann. Die Dicke beträgt hier ca. 150 µm.
Die für die Nachweisreaktion erforderlichen Reagenzien können, wie in DOS 34 07 359 näher beschrieben, sowohl über die Polymergießlösung direkt in die Membran oder durch nachträgliches Tränken, was bei wasserlöslichen Reagenzien bevorzugt wird, eingearbeitet werden. In vielen Fällen wird eine Kombination dieser beiden Methoden an­ gewandt, wobei organisch lösliche Reagenzien über die Polymergießlösung und wasserlösliche Substanzen, wie Enzyme, durch Tränkung eingebracht werden. Zur Tränkung wird vorzugsweise die in der EP-A 2 46 505 beschriebene Extruder- bzw. Kaskadenmethode angewandt.
Ein weiterer Vorteil der hier beschriebenen Nachweisele­ mente ist die breite Auswahl an möglichen Polymeren. Für die Membranherstellung nach der Fällungskoagulation, auch Phaseninversion genannt, kommen praktisch alle lös­ lichen Polymeren in Frage. Somit besteht eine Auswahl an hydrophilen, hydrophoben, neutralen, kationischen und anionischen Polymeren, die eine Anpassung an das jewei­ lige Nachweissystem ermöglichen.
Als Beispiele seien genannt:
Polyvinylidenfluorid, Polysulfon, Polyhydantoine, Sty­ rol/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyamide, Cellulose­ acetate, Polyether-Polycarbonate, Polyurethane, gegebe­ nenfalls in Kombination mit ionischen Polyurethandisper­ sionen, Polyacrylnitril sowie seine Copolymerisate. Be­ vorzugt sind Acrylnitrilcopolymere mit ionischen, insbe­ sondere kationischen Gruppen.
Es können auch Acrylnitrilcopolymere mit anionischen Funktionen, Betainstrukturen oder Gemische von kat­ ionisch und anionisch modifizierten Copolymerisaten eingesetzt werden. In Beispiel 1 ist die chemische Struktur eines bevorzugt eingesetzten kationischen Acrylnitrilpolymerisats dargestellt.
Die Acrylnitrilcopolymerisate enthalten mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 80 Gew.-% Acrylnitril.
An einpolymerisierten Comonomeren kommen sowohl neutrale als auch - wie angegeben - solche mit mit anionischen, kationischen oder betainischen Funktionen infrage.
Neutrale Comonomere, die alleine oder im Kombination untereinander in Mengen von 0,5 bis 50 Gew.-% im Polymer enthalten sein können, sind u.a. Methacrylnitril; (Meth-)acrylsäureester wie z.B. Methyl-, Ethyl-, Butyl-, Hexyl-, 2-Ethylhexyl-, Cyclohexyl-, Hydroxiethyl-, Hydroxipropyl-, Ethoxiethyl-, Butoxyethyl-, Methoxi­ ethyl-, Phenyl-, Phenylethyl-, Phenylpropyl-, Furfuryl-, Tetrahydrofurfuryl-, Polyalkylenether(meth)acrylat; Vinylester wie Vinylformiat, Vinylacetat, Vinylpropio­ nat, Vinylbutyrat, Vinylbenzoat; (Meth-)acrylamid und seine N-Mono- oder N.N-Dialkyl- bzw. Hydroxy- und Alk­ oxyalkylderivate wie z.B. Dimethyl(meth)acrylamid, N- Hydroximethyl-, N-Methoximethyl(meth)acrylamid; Malein­ säureamid; Itaconsäureamid; ungesättigte Ketone wie Methylvinylketon, Phenylvinylketon, Methylisopropenyl­ keton; Diacetonacrylamid; Vinylether wie Vinylmethyl­ ether, Vinylethylether; N-Vinylcarbonsäureamide wie N- Vinylformamid, N-Vinylacetamid, N-Vinyl-N-methylforma­ mid, N-Vinyl-N-methylacetamid; N-Vinyllaktame wie N- Vinylpyrrolidon, N-Vinylcaprolaktam; Styrol; α-Methyl­ styrol; Diisobuten.
An anionischen Comonomeren, welche allein oder in Kombi­ nation mit den neutralen Comonomeren mit Acrylnitril polymerisiert sein können, kommen ungesättigte Carbon­ säuren wie z.B. (Meth-)acrylsäure, Itaconsäure, Malein-, Fumarsäure und die entsprechenden Salze zum Einsatz. Der Gehalt an freier Carbonsäure im Polymer kann dabei maxi­ mal 2100 mVal/kg Polymer betragen. Weitere anionische Comonomere sind ungesättigte Sulfonsäuren und ihre Salze wie z.B. Vinylsulfonsäure, (Meth)allylsulfonsäure, Styrolsulfonsäure, 2-Acrylamido-2-methylpropansulfon­ säure, Kalium-3-Sulfopropyl(meth)acrylat, Di-Kalium-Bis­ (3-sulfopropyl)itaconat, (Meth) allyloxibenzolsulfon­ säure, Natrium-2-sulfoethyl-α-methylacrylat, Kalium­ monolaurylitaconoxipropansulfonat, Natriumsulfopropylal­ kylmaleinat. Der Gehalt an freien Sulfonsäurefunktionen im Polymer kann maximal 1400 mVal/kg Polymer betragen.
Kationische Comonomere sind hier besonders solche, die eine Amin- oder Ammoniumstruktur enthalten. Sie können ebenfalls allein oder in Verbindung mit neutralen Como­ nomeren im Polymer incorporiert sein. Beispielhaft seien u.a. genannt: Vinylpyridin; 2-Methyl-5-vinylpyridin; N- Mono- oder N.N-Dialkylaminoalkyl(meth)acrylate wie z.B. N-tert.-Butylaminoethyl(meth)acrylat, N.N-Dimethyl-, N.N-Diethyl-, N.N-Dipropylaminoethyl(meth)acrylat, N.N- Dimethylaminopropyl-, -butyl-, -pentyl-, neopentyl-, -hexyl(meth)acrylat; N-Monoalkyl- bzw. N.N-Dialkyl-ami­ noalkyl(meth)acrylamide, wie z.B. N.N-Dimethylaminopro­ pyl(meth)acrylamid; N-Vinylimidazol und Derivate wie z.B. N-Vinyl-2-methyl-, N-Vinyl-2-ethyl-, N-Vinyl-2- propyl-, N-Vinyl-2-isopropyl-, N-Vinyl-4-methyl-, N- Vinyl-5-methylimidazol, N-Vinylimidazolin und Abkömm­ linge wie z.B. N-Vinyl-2-Methyl-N-Vinyl-2-ethyl-, N- Vinyl-2-(i)propyl-, N-Vinyl-2-phenyl-imidazolin; 1-(β- Methacryloxialkyl)-imidazole wie 1-(β-Methacryloxi­ ethyl)-2-methyl-imidazol, 1-(β-Methacryloxipropyl)-2­ methylimidazol, 1-(β-Methacryloxibutyl)-2-methylimida­ zol.
Diese aminischen Comonomeren können im Polymer entweder in freier Aminform vorliegen oder in ihrer durch Säuren protonierten bzw. durch Alkylierungsagenzien quaternier­ ten Ammoniumform. Bezogen auf freies Amin kann das Poly­ mer maximal 1600 m Val/kg Polymer basische Gruppen auf­ weisen.
Eine weitere Gruppe der funktionellen Comonomeren, die im Acrylnitrilcopolymerisat bis zu 15 Gew.-% enthalten sein können, tragen Betainstrukturen, d.h. sie sind innere Salze. Beispielhaft seien genannt: N-(3-Sulfopro­ pyl)-N-methacryloxiethyl-N.N-dimethylammonium-betain, N-(3-Sulfopropyl)-N-methacrylamidopropyl-N.N-dimethyl­ ammonium-betain, 1-(3-Sulfopropyl)-2-vinylpyridinium­ betain.
Die Herstellung der angeführten Acrylnitrilcopolymeri­ sate erfolgt nach bekannten Methoden der Fällungs-, Emulsions- oder Lösungspolymerisation mit Hilfe Radikale bildender Initiatoren wie z.B. Azoverbindungen, Peroxi­ den, Redoxsystemen wie Persulfat/Sulfit, Persulfat/Sul­ fit, Persulfat/Thiosulfat, Persulfat/Chlorat, ferner Wasserstoffperoxid/Sulfinsäure.
Für die Synthese derjenigen Polymerisate, welche katio­ nische oder auch betainische Comonomere enthalten, wird, wenn man in wäßrigem Medium nach der Fällungspolymeri­ sation arbeitet, bevorzugt Wasserstoffperoxid/Mercaptan als Startersystem eingesetzt, wie es in DP 20 46 086 beschrieben wird.
Die Molekulargewichte der Acrylnitril(Co)polymerisate, ausgedrückt als K-Wert (nach Fikentscher, Cellulose­ chemie 13, 58 (1932), liegen bei 70 bis 130.
Zur Herstellung der Gießlösung werden je nach Polymer beispielsweise die folgenden Lösungsmittel verwendet:
Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Formamid, Glykolcarbonat, Aceton sowie Gemische derselben. Geeignete Lösungsmittel für die be­ vorzugten Polyacrylnitrile sind neben den bekannten or­ ganischen Lösungsmitteln und anorganischen Säuren und wäßrigen Salzlösungen besonders Dimethylformamid, Dime­ thylsulfoxid und Formamid beziehungsweise deren Ge­ mische.
Den Polymergießlösungen können gegebenenfalls noch geringe Anteile an Nichtlösungsmittel beispielsweise Alkohole oder Wasser zugegeben werden.
Als Koagulationsflüssigkeit dienen vorzugsweise wäßrige Systeme insbesondere reines Wasser oder Wasser mit einem geringen Anteil an Lösungsmittel, beispielsweise 95 Gew.-% Wasser, 5 Gew.-% Dimethylformamid. Vor dem Trock­ nen wird die Membran vorteilhafterweise mit reinem Wasser gewaschen.
Wie erwähnt und allgemein bekannt, bestehen die zur Mem­ branherstellung eingesetzten Gießlösungen üblicherweise aus einem Polymer bzw. Polymergemisch und einem Lösungs­ mittel bzw. Lösungsmittelgemisch. Zur Stabilisierung der Membranstruktur sowie zur Einstellung bestimmter Re­ flexionseigenschaften können gegebenenfalls noch Füll­ stoffe zugesetzt werden, so daß füllstoffhaltige Membra­ nen erhalten werden.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß derarti­ ge, nach den Standardrezepturen hergestellte Membranen zur Herstellung der erfindungsgemäßen nowipe Blutglucose Teststreifen mit Tetramethylbenzidin als Oxidationsindi­ kator nicht geeignet sind.
Wie im Vergleichsbeispiel näher beschrieben, wurde in eine Polyacrylnitril-Membran das für den Glucosenachweis übliche TMB/GOD/POD-System eingearbeitet und mit wäßri­ gen Glucose Standardlösungen sowie Vollblut über die Membranträgerseite getestet.
Dabei wurden sehr schwache, lila-graue Färbungen erhal­ ten, die kaum eine Differenzierbarkeit ermöglichen und eine sehr schlechte Farbstabilität zeigten.
Durch Zugabe von bestimmten anionischen Tensiden, bei­ spielsweise Natriumdodecylbenzolsulfonat zur Polymer­ gießlösung konnten diese Mängel überraschenderweise vollständig beseitigt werden, wobei Blaufärbungen mit guter Farbabstufung und hervorragende Farbstabilität erhalten wurden. Neben Natriumdodecylbenzolsulfonat be­ währten sich auch Natriumdodecylsulfat, Lithiumdodecyl­ sulfat, Tris(hydroxymethyl)aminomethanlaurylsulfat, Natriumdioctylsulfosuccinat sowie Dodecansulfonsäure- Natriumsalz. Dagegen ergaben Membranen, zu deren Gieß­ lösungen die Natriumsalze der Pentansulfonsäure, der Heptansulfonsäure oder der Octansulfonsäure zugesetzt wurden sowie nichtionische Tenside wie Triton X 100 (ethoxyliertes Nonylphenol) ähnliche schlechte Ergeb­ nisse wie Membranen ohne Tensidzusatz.
Neben der Art des verwendeten Tensids spielt auch die Menge eine wichtige Rolle. So ergab ein Zusatz von 4,3 Gew.-% Natriumdodecylbenzolsulfonat bzgl. Polymerfest­ stoff in der Gießlösung gegenüber der tensidfreien Rezeptur zwar eine Verbesserung in der Farbabstufung, die Farbstabilität war jedoch nicht zufriedenstellend. Mit steigender Menge des anionischen Tensids wurden zunehmend bessere Farbabstufungen und Farbstabilitäten erhalten, wobei das Optimum bei ca. 8 bis 25 Gew.-% bzgl. Polymerfeststoff lag, was einem Tensidzusatz von ca. 1 bis 4 Gew.-% bzgl. Polymergießlösung entspricht.
Für reflektometrische Auswertungen ist es häufig gün­ stig, wie in DOS 34 07 359 beschrieben, die Reflexions­ eigenschaften der Reagenzmembran durch Einarbeiten von Füllstoffen, wie TiO2, BaSO4, SiO2, Talk, CaCO3, Zeo­ lithe, Bentonite, Diatoneenerde oder mikrokristalline Cellulose zu verbessern. Mit Hilfe farbiger Pigmente können Nachweiselemente mit definierten Grundfarben er­ halten werden. Beim Herstellen von füllstoffhaltigen Nachweiselementen für den erfindungsgemäßen Anwendungs­ bereich wurde überraschenderweise gefunden, daß der ki­ netische Verlauf der Nachweisreaktion in empfindlicher Weise vom Füllstoffgehalt in der Membran abhängt. So zeigten füllstofffreie Membranen am Beispiel des Gluco­ se-Nachweises einen typischen "kinetischen" Reaktions­ verlauf, während Membranen mit bestimmten Füllstoffge­ halten eine Endpunktreaktion ergaben. Beim Vergleich der Beispiele 1 und 3 wird dieses überraschende Ergebnis deutlich.
Zur kontinuierlichen Herstellung sowie hinsichtlich besserer Handhabung werden Fällungskoagulationsmembranen vorzugsweise auf Membranträgermaterialien gegossen. Die fertige Membran stellt dann einen Verbund aus semiper­ meabler Membran mit dem Trägermaterial dar. Geeignete Trägermaterialien sind dem Membranfachmann bekannt und bestehen beispielsweise aus Polymervliesen, multifilen Polymergeweben oder multifilen Glasfasergeweben. Wegen der besseren Homogenität sind Gewebe für die erfindungs­ gemäßen Nachweiselemente bevorzugt, beispielsweise Poly­ estergewebe PES 1973 oder Polyamidgewebe PA 1153 (Fa. Verseidag, Krefeld), Schweiz. Seidengazefabrik, Thal, Schweiz) sowie Glasfasergewebe Typ 03249 (Fa. Interglas, Ulm). Im Gegensatz zu den in der Europ. Patentschrift 01 13 896 beschriebenen "Teststreifen auf multifilen Gewebe-Trägerschichten" sind die in dieser Anmeldeschrift beschriebenen Nachweiselemente auch ohne Trägermaterial bezüglich Erythrocytenabtrennung und Farbreaktion voll funktionsfähig. Die Träger dienen in erster Linie der verbesserten kontinuierlichen Herstell­ barkeit sowie der leichteren Handhabung bei der Konfek­ tionierung zu den fertigen Teststreifen. Wie Beispiel 2 zeigt, sind auch die erfindungsgemäßen, trägerfreien Nachweiselemente voll funktionsfähig.
Die Konfektionierung der erfindungsgemäßen Nachweisele­ mente zu fertigen Teststreifen kann im einfachsten Falle nach der in Abb. 2 beschriebenen Weise erfolgen. Auf eine vorzugsweise weiße, durchlochte Polymerfolie (1), beispielsweise Polystyrolfolie Tricyte®, wird mit Hilfe eines durchlochten Doppelklebebandes (3) die Reagenzma­ trix an ihrer Trägerseite aufgeklebt. (1) dient als Teststreifenhalterung, über deren runde Öffnung das Vollblut aufgegeben wird. Die Farbreaktion und deren Auswertung erfolgt auf der gegenüberliegenden Seite der Membranmatrix (Membranoberfläche), die dem direkten Zutritt von Sauerstoff zur Verfügung steht und daher keine zusätzlichen Hilfsmittel wie Sauerstoffspeicher benötigt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß durch einen neuartigen, in der Abb. 3 dargestellten Test­ streifenauffbau die Nachweiselemente mit weiteren Vor­ teilen im Vergleich zum konventionellen System ausge­ stattet werden können. Abb. 3 zeigt die einfachste Version dieses erfindungsgemäßen Teststreifenaufbaus, dessen Herstellung in Abb. 4 schrittweise beschrieben ist:
Auf eine transparente Polymerfolie (4) wird mit Hilfe eines durchlochten, weißen Doppelklebebandes (3) die Reagenzmatrix (2) mit ihrer aktiven Trennschicht (Rea­ genzschicht) befestigt. Nach Aufgabe der Probenflüssig­ keit kann die Farbreaktion durch die transparente Poly­ merfolie (4), die zugleich als Teststreifenhalterung und Sichtfenster dient, beobachtet werden. Im freien Luft­ raum (6) ist der für die Reaktion erforderliche Luft­ sauerstoff gespeichert. Wie in Abb. 5 dargestellt, kann die transparente Teststreifenhalterung (4) auch durch eine nichttransparente Polymerfolie (1) mit einem trans­ parenten Sichtfenster (4) ersetzt werden. Wesentlich für die Erfindung des neuartigen Teststreifenaufbaus sind dementsprechend das transparente "Sichtfenster" sowie der zwischen Sichtfenster und Reagenzmatrix bestehende freie Luftraum (6). Das Volumen des freien Luftraumes (6) richtet sich nach der für die Reaktion benötigten Sauerstoffmenge und kann durch die Dicke der Doppelkle­ bebänder bzw. der Polymerfolien variabel gestaltet wer­ den. Wie sich leicht berechnen läßt, ist bei Verwendung konventioneller Doppelklebebänder bzw. Folien der Sauer­ stoffbedarf für Diagnosereaktionen in den üblichen Sub­ stratkonzentrationen ausreichend.
Es wurde gefunden, daß bei Teststreifen mit einem derar­ tigen Aufbau die durch Luft und Licht katalysierte Autoxidationsreaktion des Oxidationsindikators sehr viel langsamer verläuft als bei Teststreifen mit einem kon­ ventionellen Aufbau. Durch transparente Sichtfenster mit UV-Absorbern kann dieser positive Effekt noch verstärkt werden.
Wie in Abb. 6 dargestellt, können in oder unterhalb des transparenten Sichtfensters gegebenenfalls nach den je­ weiligen Substratkonzentrationen entsprechende Farbzonen (Colour blocks) integriert werden, die eine verbesserte visuelle Auswertung erlauben.
Zur besseren Verteilung und Adsorption der Blutprobe können, wie in Abb. 3b dargestellt, über der Rückseite der Reagenzmatrix noch eine oder mehrere permeable Schichten (5), wie Vliese aus Polymer oder Glas, Papiere und Gewebe aus Polymer oder Glas sowie Membranen ange­ bracht werden, die ihrerseits gegebenenfalls mit durch­ lochten Polymerfolien (1) überdeckt werden können. Auf diese Weise lassen sich auch Teststreifensysteme mit mehreren Reagenzmatrizen herstellen, die gegebenenfalls über eine Öffnung mit Blut appliziert werden können (Abb. 3c).
Die Befestigung der einzelnen Schichten kann bei den erfindungsgemäßen mehrschichtigen Nachweiselementen ent­ weder über Doppelklebebänder, über flüssige Klebestoffe oder über Schmelzkleber beispielsweise EVA-Schmelzkleber der 3M Company erfolgen. Schmelzkleber sind insbesondere bei Verbindungen von Polymernetzen mit der Teststreifen­ halterung zu bevorzugen.
Desweiteren wurde vollkommen überraschend gefunden, daß die erfindungsgemäßen Nachweissysteme mit dem eben ge­ schilderten Teststreifenaufbau auch in hervorragender Weise für "dip and read"-Tests bei der Untersuchung von Urin oder anderen wäßrigen Proben eingesetzt werden können. Wie in EP-A 64 710 und der DE-OS 38 09 523.8 näher beschrieben, können nämlich die bisher bekannten mikroporösen Polymermatrizen nicht direkt ohne weitere Hilfsmittel für "dip and read"-Tests eingesetzt werden, da deren Oberflächen ungleichmäßig benetzen und die Flüssigkeit zu langsam adsorbieren. Mit dem in der vor­ liegenden Anmeldung beschriebenen Teststreifenaufbau ist dagegen der Zutritt der Flüssigkeit über die mikroporöse aktive Trennschicht (Reagenzzone) nicht möglich. Die Reagenzmatrix kann nur über die makroporöse Rückseite bzw. Trägerseite in die Reagenzmembran strömen, die sehr saugfähig und problemlos benetzbar ist. Bei Urin-Test­ streifen fehlt vorzugsweise die bei Blut-Teststreifen bevorzugte obere Abdeckung (1) in Abb. 3b. Ein Vorschlag für den schrittweisen Aufbau von Urin-Teststreifen ist in Abb. 7 dargestellt.
Die Benennung der Bestandteile in der Abb. 7 ist wie folgt:
(1) weiße Polymerfolie (Bspw. Tricyte®) durchlocht,
(2) Reagenz-Matrix,
(3) weißes Doppelklebeband durchlocht,
(4) transparente Polymerfolie,
(5) Polymernetz bzw. saugfähiges Material und
(6) freier Luftraum.
Im Hinblick auf Flüssigkeitsreste, die nach dem Eintau­ chen am Teststreifen haften bleiben (Tropfenproblem), ist es häufig günstig, die Teststreifenhalterung nicht ganz bis zum unteren Ende mit dem Klebeband zu versehen. Dadurch entsteht, wie in der Querschnittsdarstellung von Abb. 7 zu sehen ist, noch eine zusätzliche Saugkapa­ zität. Gegebenenfalls können auch die linken und rechten Ränder der Teststreifenhalterung (4) vom Doppelklebeband ausgespart werden.
Die Reagenzmatrix der "dip and read"-Teststreifen mit dem hier gezeigten Teststreifenaufbau kann gegebenen­ falls auch aus Papier bestehen, obwohl Kunststoffmatri­ zen bevorzugt sind.
Da in derartige Nachweiselemente die für die Reaktion erforderlichen Reagenzien in verschiedene Schichten (aktive Trennschicht, Matrix-Polymer, Membranträger- Material und darüber liegende saugfähige Schicht bzw. Schichten) eingearbeitet werden können, ergeben sich für den Fachmann eine Reihe von weiteren Kombinations­ möglichkeiten.
Diagnose-Teststreifen mit überdeckenden Netzschichten sind zwar in der DE-OS 31 18 381 schon beschrieben; dort befindet sich die überdeckende Netzschicht jedoch direkt über der Reagenzschicht. Derartige Teststreifen zeigen beim Eintauchen in Urin zwar den Vorteil der gleich­ mäßigen Benetzung und können ebenfalls Hilfsreagenzien, beispielsweise Jodate, im Hinblick auf Ascorbinsäure- Interferenz enthalten.
Im Vergleich zu den in dieser Schrift beschriebenen Systemen stehen die Hilfsreagenzien dort in direktem Kontakt mit der Reagenzschicht und werden bei Proben­ aufgabe leicht in die direkt darunter liegende Reak­ tionszone verschleppt. Es können daher, wie in DE-OS 30 12 368 beschrieben, nur solche Reagenzien ein­ gearbeitet werden, die mit dem Reagenzsystem in der Reagenzmatrix keine unerwünschten Nebenreaktionen eingehen können. Beispielsweise können zur Lösung des Ascorbinsäure-Interferenz-Problems nur solche Oxida­ tionsmittel verwendet werden, die mit dem Oxidations­ indikator (meist Tetramethylbenzidin) keine Reaktion eingehen können.
Da bei den in DE-OS 31 18 381 beschriebenen Systemen die Farbreaktion nur über Netzabdeckungen hindurch ausge­ wertet werden kann, müssen an diese besondere , in der Auswahl sehr limitierende Anforderungen gestellt wer­ den.
So können nur transparente Polymergewebe verwendet werden und bei der Einlagerung von Hilfsreagenzien in diese Gewebe ist man auf nichtfarbige Produkte be­ schränkt. Ein weiterer Nachteil von Nachweissystemen mit Netzen auf der Auswerteseite ist die Schwierigkeit bei reflektometrischen Auswertungen, die durch die Re­ flexionseigenschaften des Polymernetzes oft verfälscht werden.
Die Einschränkung bezüglich Material und Art der einge­ arbeiteten Reagenzien gelten bei den hier beschriebenen permeablen Schichten (5) nicht. Vielmehr lassen sich die entsprechenden Materialien auf die jeweilige Aufgaben­ stellung abstimmen. Beispielsweise werden bei Blut-Test­ streifen insbesondere mit mehreren Testzonen (Abb. 3c) dünne Gewebe oder Vliese mit einer guten Verteilerfunk­ tion für Blut (beispielsweise Polyamidgewebe Nytal® und Nytal XXX® der Schweizerischen Seidengazefabrik oder Paratex® Vliesstoffe der Fa. Lohmenn) bevorzugt. Da­ gegen eignen sich bei Teststreifen, die nach dem "dip and read"-Verfahren angewendet werden sollen, Materia­ lien mit höherem Saugvermögen, beispielsweise Viledon Filter FFM 2687®, Paraprint Vliesstoffe®, Glasfaser­ papiere oder Polyester- bzw. Polyamidgewebe mit Flachge­ wichten von ca. 50-100 g/m2 besser. Als weitere geeig­ nete Materialien für die permeablen Schichten (5) kommen Filterpapiere mit Flächengewichten von 9,5 g/m2 bis 27,5 g/m2 in Frage, die bspw. von der Fa. Schoeller und Hoesch für verschiedene Filtrationszwecke hergestellt werden.
Bei Teststreifen für "dip and read"-Tests ist es bis­ weilen von Vorteil, zwischen Polymernetz (5) und Rück­ seite der Reagenzmatrix eine Schicht mit saugfähigem Material einfügen, die definierte Flüssigkeitsmengen zu absorbieren im Stande ist. Bevorzugte Materialien hier­ für sind Vliese oder Gewebe mit definierten Absorptions­ kapazitäten für Flüssigkeiten, besonders bevorzugt sind Laminate mit Wasser absorbierenden Polymeren, beispiels­ weise Laminate der Fa. Gelok Int. Corp.
Bei Reagenzieneinarbeitung in eine oder mehrere dieser Schichten müssen die erwähnten Beschränkungen bezüglich Wechselwirkung mit den Reagenzien der Reagenzschicht nicht gemacht werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Teststreifenaufbau für Blutanalysen ist in Abb. 8 dargestellt (Benennung der Bestandteile wie Abb. 7). Diese Teststreifen entsprechen denen in Abb. 3, wobei die transparente Trägerfolie (4) durch eine weiße, durchlochte Polymerfolie ersetzt ist. Der Vergleich mit Abb. 2 zeigt, daß bei Abb. 8 die Auf­ klebung über die Membranmatrix-Oberseite erfolgt ist. Diese Teststreifenkonfiguration ist bei Blutanalysen der in Abb. 3 dargestellten dann vorzuziehen, wenn das ent­ sprechende Indikatorsystem nicht lichtempfindlich ist.
Die für den Aufbau der Teststreifen ausgewählte Vlies-, Gewebe- und Folienmaterialien sind wesentlich für den optimalen Ablauf der Nachweisreaktion und sollen etwas näher beschrieben werden.
Vliese
Für die Herstellung von Membranen bietet die Fa. Freu­ denberg spezielle Vliese aus Polypropylen und Polyester in unterschiedlichen Dicken und Flächengewichten an. Diese Vliese haben sich beispielsweise als Membran­ trägermaterial (C in Abb. 1b, 1c) bewährt. Interes­ sant ist auch das Sortiment, "Vliesstoffe für die Flüs­ sigfiltration" der Fa. Freudenberg.
Es handelt sich hierbei überwiegend um Vliese aus Cellu­ lose mit Kunstharzpolymer als Bindemittel, die sich als saugfähige Schicht (5 in Abb. 3 und 7) bewährt haben. Die Fa. Lohman bietet Vliesstoffe auf der Basis Zell­ wolle überwiegend für hygienische und medizinische An­ wendungen an. Diese Artikel haben sich ebenfalls als saugfähige Schicht (5 in Abb. 3 und 7) bewährt. Laminate von Vliesen mit wasserabsorbierenden Polymeren, die de­ finierte Flüssigkeitsmengen aufnehmen, werden beispiels­ weise von der Fa. Gelok angeboten. Derartige Laminate haben sich vor allem bei "dip and read"-Tests als auch bei Blut-Diagnose-Tests (Schicht 5 in Abb. 7 bzw. Abb. 3) im Hinblick auf Flüssigkeitsdosierung bewährt. Ähnliche Eigenschaften konnten mit Glasfaservliesen (Fa. Binzer) als Schicht 5 erzielt werden. Teststreifen mit flüssigkeitsdosierenden Schichten sind häufig im Hin­ blick auf Endpunktreaktionen von Vorteil.
Gewebe:
Von verschiedenen Firmen (beispielsweise Verseidag, Züricher Beuteltuchfabrik AG (ZBF), Interglas, Schwei­ zerische Seidengazefabrik) werden Gewebe aus Polyamiden, Polyester, Polyacrylnitril, Fluorpolymere, Baumwolle und Glasfasern in unterschiedlichen Webarten, Fadendicken, freien Lochflächen und Flächengewichten angeboten. Je nach Beschaffenheit können diese Gewebe entweder als Membranträgermaterial (C in Abb. 1b, 1c) oder als per­ meable Schicht (5) eingesetzt werden. Als Membranträger­ material haben sich beispielsweise Gewebe mit Flächen­ gewichten von ca. 100 bis 350 g/m2 (beispielsweise PES 1973 der Fa. Verseidag, Polyester 2F/777 der Schwei­ zerische Seidengazefabrik oder das Glasfasergewebe 03249 der Fa. Interglas) bewährt. Als Schicht 5 in Blutdiagno­ se-Teststreifen, insbesondere mit mehreren Reagenzfel­ dern (Abb. 3c), zeigten Gewebe mit Flächengewichten von ca. 100 bis 20 g/m2 eine gute Verteilerfunktion für Blut. Von der Firma Schweizerische Seidengazefabrik wer­ den auch metallisierte Gewebe angeboten, die als oberste Schicht (5) über die Messung der Ionenleitfähigkeit ge­ gebenenfalls den Startpunkt der Probenaufgabe detektie­ ren können.
Folien
Zur Herstellung von Teststreifenhalterungen werden vor­ zugsweise weißpigmentierte Folien (beispielsweise Tricyte® Polystyrolfolie) eingesetzt. Bei transparenten Polymerfolien, die auch die Funktion des Sichtfensters erfüllen sollen, werden Folien mit einer möglichst per­ fekten Transparenz bevorzugt, beispielsweise Folien aus Celluloseacetat (Ultraphan®), Polycarbonat (Makrofol®) , Polyethylenterephthalat (Melinex®) oder aus Fluorpoly­ meren (PVDF, Fa. Lonza). Dabei werden für "dip and read"-Tests hydrophobe bzw. hydrophobierte Folien (z.B. silikonisierte Folien der Fa. Laufenberg, Krefeld) be­ vorzugt.
Als weitere Materialien, die als permeable Schichten (5) eingesetzt werden können, kommen auch Mikrofiltermembra­ nen, beispielsweise Polyamidmebranen der Fa. Pall oder Membranen aus Fluorpolymeren der Fa. Millipore, in Frage.
Die erfindungsgemäßen Membranmatrizen mit asymmetrischer Porenstruktur, die vorzugsweise auf Vliesen oder Gewebe­ trägern haften, erlauben insbesondere in Kombination mit den beschriebenen erfindungsgemäßen Teststreifenkonfigu­ rationen die gezielte Einstellung bestimmter Systemei­ genschaften, die in dieser Variationsbreite und Kombina­ tionsmöglichkeiten bei bisher bekannten Teststreifen- Systemen noch nicht bekannt sind. Die dafür entschei­ denden Einflußgrößen sollen hier zunächst kurz erläutert und in den späteren Beispielen näher beschrieben wer­ den.
Systemimmanente Plasmaseparation
Die entscheidende Einflußgröße ist die bereits erwähnte asymmetrische Porenstruktur. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, erfolgt die Plasmaseparation an der Grenzschicht hochporöse Stützmembran/aktive Trennschicht.
Vorgelagerte Teilreaktion
Die dafür erforderlichen Reagenzien werden auf die Mem­ branrückseite, bevorzugt in das Membranträgermaterial (C in Abb. 1b, 1c), besonders bevorzugt in das darüber liegende Polymernetz bzw. saugfähige Material (5) einge­ arbeitet.
Beispiel: Ascorbinsäure-Interferenz
Es wird ein Teststreifen nach Abb. 7 hergestellt, wobei die Reagenzmatrix (2) die für den Glucosenachweis erfor­ derlichen Reagenzien enthält. Das Membranträgermaterial oder das über der Matrix befindliche Polymernetz bzw. saugfähige Material wird mit den für die Ascorbinsäure selektiven Reagenzien versehen. Es kann sich hierbei, wie in DE-AS 15 98 008 beschrieben, um Verbindungen mit Anionenaustauscherfunktionen handeln oder bevorzugt um Verbindungen mit Oxidationseigenschaften, wie sie bei­ spielsweise in DE-OS 30 12 368 beschrieben sind. Dabei müssen jedoch die in der letztgenannten Anmeldeschrift beschriebenen Einschränkungen in der Reagenzienauswahl bezüglich Wechselwirkung von Oxidationsmittel mit dem Indiaktor nicht gemacht werden, da die erfindungsgemäßen Nachweiselemente eine räumliche Trennung zur Reagenz­ schicht erlauben. Durch den speziellen Aufbau der Nach­ weiselemente ist es auch möglich, zur Entfernung von Störkomponenten Verbindungen mit unterschiedlichen Funk­ tionsprinzipien, beispielsweise mit Anionenaustauscher­ und Oxidationsfunktion in eine oder mehrere Schichten vor der Reagenzmatrix zu integrieren. Als mögliche Rea­ genzien zur selektiven Reaktion mit Ascorbinsäure seien genannt: Na5IO6 und Pb(OAc)2 (DE-OS 35 39 772); p-Diazo­ benzolsulfonsäure, H3PO3 und NaIO4 oder CuSO4 (EP 1 60 239); Eisenkomplexe oder Hydroperoxide (Europ. Pat. Appl. 1 23 115) oder Ascorbinsäureoxidase (DE 29 07 628).
Beeinflussung der Reaktionskinetik
Es wurde vollkommen überraschend gefunden, daß sich die erfindungsgemäßen Nachweiselemente durch eine einfache Modifizierung der zur Membranherstellung eingesetzten Polymergießlösung sowohl für Endpunkt- als auch für kinetische Bestimmungen einsetzen lassen. Wie über­ raschenderweise gefunden wurde und in den Beispielen 1 und 3 näher beschrieben ist, führen füllstofffreie Mem­ branenmatrizen zu einem kinetischen Reaktionsablauf, während füllstoffhaltige Membranen eine typische Endpunktreaktion zeigen.
Desweiteren wurde überraschenderweise gefunden, daß bei den erfindungsgemäßen Nachweiselementen ein verzögerter Reaktionsbeginn eingestellt werden kann. Ein derartiger Reaktionsverlauf (Beginn nicht unmittelbar nach Proben­ aufgabe) ist bisweilen von Vorteil, beispielsweise im Falle von vorgeschalteten Reaktionen oder im Hinblick auf das exakte Timing zwischen Probenaufgabe und Mes­ sung. Dieses überraschende Ergebnis wurde bei der Her­ stellung von Glucose-Teststreifen beobachtet, bei denen die Reagenzschicht aus einer wäßrigen TMB, GOD, POD und Citratpuffer enthaltenden Emulsion bestand. Als Emulga­ tor wurde Polyvinylpyrrolidon verwendet. Weitere wasser­ lösliche Polymere, die für diesen Zweck in Frage kommen, sind Polyether, Polyacryl- und Polyvinylverbindungen so­ wie natürliche wasserlösliche Polymere wie Gelatine, Agarose oder Cellulosederivate, gegebenenfalls in Kombi­ nation mit ionischen oder nichtionischen Tensiden. Die Herstellung von derartigen wäßrigen TMB-Emulsionen ist in Beispiel 6 beschrieben. Die Verwendung von wäßrigen TMB-Emulsionen für die Herstellung von Reagenzschichten ist bisher noch nicht bekannt.
Durch die Absorptionseigenschaften der Zusatzschicht (5) lassen sich auch die Empfindlichkeiten der Chromogen­ reaktion beeinflussen. So konnten mit Papieren zu­ nehmender Flächengewichte (im Bereich von 9,5 g/m2 bis 27,5 g/m2) zunehmende Farbintensitäten beobachtet werden.
Einsatz für "dip and read"-Methoden
Durch den bereits beschriebenen und in Abb. 1 dargestel­ lten Teststreifenaufbau lassen sich die erfindungsge­ mäßen Nachweiselemente auch für "dip and read"-Methoden anwenden. Durch Einsatz spezieller Laminate, Vliese oder Gewebe auf der Matrix-Rückseite lassen sich das Problem der überstehenden Restflüssigkeit lösen sowie die Mengen der absorbierten Flüssigkeit steuern.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Nachweiselemente für Teststreifen, bei den die Probenflüssigkeit auf die Reagenzschichtseite aufgegeben und der Überschuß abge­ wischt wird, ist bei konventionellem Teststreifenaufbau natürlich ebenfalls möglich.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Nachweisele­ mente im Vergleich zu Teststreifen mit Glasfaservliesen zur Erythrocytenabtrennung ist die sehr kleine für den Test benötigte Flüssigkeitsmenge. Einerseits ist das im Falle von Blutanalysen vorteilhaft für die Patienten, andererseits kann man mit relativ kleinen Probenmengen mehrere Testfelder applizieren. Daraus ergibt sich bei­ spielsweise die in Abb. 3 dargestellte Möglichkeit, daß durch Aufgabe einer relativ kleinen Probenmenge auf eine Stelle im Nachweissystem mehrere Testfelder bedient werden können. Es können somit gleichzeitig mehrere Metaboliten nachgewiesen werden oder durch Modifikation des Reagenzsystems innerhalb eines Metaboliten (z.B. Glucose) Farbreaktionen in unterschiedlichen Farbtönen und abgestuften Empfindlichkeiten im Hinblick auf bessere Farbdifferenzierbarkeit erzeugt werden. Zur weiteren Verdeutlichung sollen die folgenden Beispiele dienen.
Beispiel 1 Herstellung eines Glucose-Nachweissystems (Reaktionsfarbe: blau) a) Herstellung der Polymer-Gießlösung
Aus
146,9 g eine kation. Acrylnitrilcopolymerisats
 37,4 g Dodecylbenzolsulfonat (DBS)
803,4 g Dimethylformamid (DMF) und
 12,3 g 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)
wurden durch Rühren eine homogene Lösung herge­ stellt. Nach Filtrieren (Seitz Filter KO OO) und Entgasen wurde mit Hilfe eines Rakels ein Poly­ estergewebe beschichtet, in reinem Wasser koagu­ liert und anschließend mit Warmluft getrocknet.
Versuchsbedingungen:
Naßauftrag der Rakelbeschichtung: 150 µm
Polyestergewebe: PES 1973 (Fa. Verseidag),
120 g/m2, 170 µm dick
Koagulationsbedingungen: reines Wasser,
Wassertemperatur: 45°C, 3 Minuten
Trocknung: Warmluft, 3 Minuten 65°C
b) Enzymtränkung
Es wurde eine wäßrige Lösung aus Glucoseoxidase (GOD), Peroxidase (POD), Triton X 100, Polyvinyl­ pyrrolidon (PVPK 30) und Citratpuffer (pH 5.5) her­ gestellt. Bezeichnung der Tränklösung (TL 2), genaue Rezeptur: siehe Anhang.
Die in Beispiel 1a) beschriebene TMB-haltige Mem­ branmatrix wurde mit Hilfe eines Rakels (10 µm) auf der Membranvorderseite mit der Tränklösung TL 2 be­ aufschlagt und im Umlufttrockenschrank 3 Minuten bei 50°C getrocknet.
Chemische Struktur eines kation. Acrylnitrilcopoly­ merisats
K-Wert: 84
Aminfunktionen: 229 mVal/kg Polymer
Testresultate
  • a) mit Vollblut
    Auf der Membranrückseite (Polyestergewebe) wurde ein Tropfen frischen Vollbluts gegeben. Nach etwa 20 sec konnte auf der gegenüberliegenden Seite (Membranvorderseite) eine homogene Blaufärbung beobachtet werden.
  • b) mit Glucose-Standardlösungen (50, 100, 250, 400, 600 mg/dl) ca. 10 sec nach Probenaufgabe konnte eine der zunehmenden Glucosekonzentrationen ent­ sprechende zunehmende Intensität in der Blaufärbung beobachtet werden.
  • c) Auswertung der Reaktionskinetik mit Hilfe eines Reflektometers zeigt eine sehr gute Konzentrations­ abhängigkeit.
Vergleichsbeispiel 1 (Reagenzmembran ohne anionisches Tensid)
Polymergießlösung:
146,9 g des kationischen Acrylnitrilcopolymerisats,
803,4 g Dimethylformamid (DMF) und
 12,3 g 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)
Die weitere Verarbeitung (Membranherstellung, Enzymträn­ kung) erfolgte analog Beispiel 1.
Testresultate:
Mit den wäßrigen Standardglucoselösungen wurden sehr geringe lila-graue Verfärbungen festgestellt, die kaum eine der Glucosekonzentration entsprechende Farbdiffe­ renzierbarkeit ermöglichten. Die Reaktionsfarben ver­ blaßten schon nach einigen Minuten. Mit Vollblut konnte keine Farbreaktion beobachtet werden.
Beispiel 2 Herstellung des in Beispiel 1 beschriebenen Systems in trägerfreier Form
Alle Versuchsbedingungen und Testresultate waren iden­ tisch mit Ausnahme der Beschichtungsunterlage. Anstelle des Polyestergewebes wurde eine Glasplatte be­ schichtet und in Wasser getaucht (koaguliert). Während des Koagulationsprozesses löste sich die Membran von der Glasplatte (trägerfreie Membran). Nach Trocknen und En­ zymtränkung wurde in Analogie zu Beispiel 1 mit Vollblut und wäßrigen Standardlösungen getestet.
Bei Vollblut konnte auf der Membranvorderseite eine durch Erythrocyten ungestörte Farbreaktion beobachtet werden. Mit steigenden Glucosekonzentrationen ergaben sich zunehmende Farbintensitäten.
Beispiel 3 Herstellung eines Glucose-Nachweissystems mit Endpunkt­ reaktion (Reaktionsfarbe: grün)
Aus
115,3 g des kation. Acrylnitrilcopolymeriats aus Beispiel 1
163,3 g Bariumsulfat (Blanc fixe mikron)
 29,3 g DBS
682,3 g DMF
  0,1 g Makrolex Gelb G und
  0,7 g TMB
wurde mit Hilfe eines schnell drehenden Rührers eine homogene Dispersion hergestellt. Nach Filtration (Maschenweite 25 µm) und Entgasen erfolgten die weiteren Herstellungsschritte wie in Beispiel 1.
Beim Test mit Vollblut wurde ca. 10 sec nach Proben­ applikation eine homogene Grünfärbung beobachtet.
Bei der Auswertung der Membranvorderseite mit Hilfe eines Reflektometers wurde das Erreichen des Endpunktes nach ca. 2 Minuten festgestellt.
Beispiel 4 Herstellung eines Glucose-Nachweissystems (Reaktionsfarbe: rot)
Aus
146,9 g des kation. Acrylnitrilcopolymerisats aus Beispiel 1
 37,4 g DBS
803,4 g DMF und
 12,3 g 2,4,6-Tribormphenol
wurde durch Rühren eine homogene Lösung hergestellt. Die weiteren Schritte bis zur Herstellung der trockenen, Tribromphenol-haltigen Membran erfolgte analog zu Bei­ spiel 1.
Zur Enzymtränkung auf der Membranvorderseite wurde eine wäßrige Lösung aus GOD, POD, Saponin, 4-Aminoantipyrin (4-AAP), Phosphatpuffer (pH 5.5) und PVPK 30 eingesetzt (TL 4, exakte Rezeptur: siehe Anhang).
Nach Aufgabe von Vollblut auf die Membranrückseite konnte auf der Membranvorderseite eine durch Erythro­ cyten ungestörte Farbreaktion festgestellt werden. Die Testlösungen mit steigenden Glucosekonzentrationen er­ gaben zunehmende Intensitäten in den Reaktionsfarben.
Beispiel 5 Herstellung eines Glucose-Nachweissystems mit redu­ zierter Reaktivität im niedrigen Glucosebereich
Das im Beispiel 4 beschriebene Glucose-Nachweissystem wurde zusätzlich auf der Membranrückseite (Polyesterge­ webe) mit einer Tränklösung aus GOD, POD, Saponin, 4-AAP und Phosphatpuffer TL 3) imprägniert und getrocknet.
Beim Test mit den wäßrigen Standardlösungen (Probenauf­ gabe auf Membranrückseite) konnte erst ab 400 mg/dl Glucose eine Farbreaktion beobachtet werden, die mit höherer Glucosekonzentration zunehmend intensiver wurde.
Beispiel 6 Herstellung eines Glucose-Nachweissystems mit verzögertem Reaktionsbeginn
Aus
146,9 g des kation. Acrylnitrilcopolymerisats
 37,4 gDBS und
803,4 g DMF
 12,3 g 2,4,6-Tribromphenol
wurde in Analogie zum Beispiel 1 eine reagenzfreie Mem­ bran hergestellt.
Zur Tränkung wurde mit Hilfe einer Perlmühle eine wäß­ rige TMB-Emulsion nach den folgenden Bedingungen herge­ stellt:
300,0 g einer 20%igen PVP-Lösung in Citratpuffer (0,2 m, pH 5,5)
 15,0 g TMB und
  0,75 g NaBH₄
wurden mit Hilfe von 900 g Glasperlen 25 Min. gemahlen und dann abfiltriert.
Zu 50 ml dieser Suspension werden
 180 mg GOD (180 U/mg)
1440 mg POD (50 U/mg) sowie
  30 ml Citratpuffer (0,2 m, pH 5,5)
mit Hilfe eines Magnetrührers eingearbeitet.
Nach Entgasen wird diese Reagenzemulsion auf die Ober­ seite der reagenzfreien Membran beschichtet und getrock­ net.
Test mit Vollblut und wäßrigen Glucose-Standard- Lösungen:
Beim Test mit Vollblut konnte nach ca. 40 sec eine durch Erythrocyten ungestörte Farbreaktion beobachtet werden.
Mit den wäßrigen Glucose-Standardlösungen wurden ca. 30 sec nach der Probenapplikation der Konzentration ent­ sprechende zunehmende Farbintensitäten beobachtet.
In weiteren Vergleichsbeispielen wurden anstelle der kation. Acrylnitrilcopolymerisat-Membran die folgenden Membranen eingesetzt:
a) PolyamidyTiO₂-Membran
Aus
100,0 g Polyamid (Durethan T 40®)
650,0 g DMF und
566,7 g TiO₂
wurde mit Hilfe eines Dissolvers eine Polymer/Füll­ stoff-Dispersion hergestellt. Die Membranherstel­ lung erfolgte analog zu Beispiel 1.
b) Polyhydantoin/TiO2-Membran
Aus
100,0 g Polyhydantoin
 88,90 g NMP und
566,7 g TiO₂
wurde eine Dispersion und anschließend in Analogie zum Beispiel 1 eine Membran hergestellt.
c) Polyether-Polycarbonat-Membran
Aus
83,0 g Dioxolan und
17,0 g Polyethercarbonat (KU 1-1013, Bayer AG)
wurde eine homogene Gießlösung und anschließend in Analogie zu Beispiel 1 eine Membran hergestellt.
d) Polysulfon-Membran (TU-AN 48 40 420, Fa. Kalle)
Die Membranen wurden in Analogie zu der beschrie­ benen kation. Acrylnitrilcopolymerisat-Membran mit der o.g. Reagenzemulsion beschichtet, getrocknet und mit Vollblut sowie wäßrigen Glucose-Standard­ lösungen getestet.
Die Testresultate (Farbreaktion) entsprachen denen mit der o.g. Acrylnitrilcopolymerisat-Membran.
Beispiel 7 Teststreifen für den Nachweis von Glucose in Urin
Es wurde ein Teststreifen nach Abb. 7 hergestellt, wobei die in Beispiel 1 beschriebene Reagenzmatrix verwendet wurde. Als permeable Schicht (5) wurde ein Polyamidge­ webe (PA 15/10, Nybolt, Fa. Schweizerische Seidengaze­ fabrik AG, Zürich) verwendet. Nach Eintauchen in Glu­ cose-haltigen Urin und Herausziehen war der Teststreifen frei von überschüssigem Urin. Durch das tansparente Sichtfenster konnte eine homogene Blaufärbung beabachtet werden. Steigende Glucosekonzentrationen führten zu zu­ nehmenden Farbintensitäten.
Beispiel 8 Teststreifen für den Nachweis von Keton in Urin
Die in Beispiel 6 beschriebene reagenzfreie Membran wurde mit der folgenden Lösung auf ihrer Rückseite getränkt und getrocknet:
 4,0 g Nitroprussid-Natrium
20,0 mg Wasser
16,4 g Magnesiumsulfat (mgSO₄ 7 H₂O).
Der pH-Wert wurde mit konz. Natronlauge auf 9,4 einge­ stellt. Zum Testen wurden Acetessigsäurelösungen (5, 15, 40, 80 und 160 mg/dl) eingesetzt, die der Konzentration entsprechend zu zunehmenden Farbintensitäten führten.
Beispiel 9 Urin-Teststreifen mit reduzierter Ascorbinsäure- Interferenz
Es wurde in Analogie zu Beispiel 8 ein Glucose-Test­ streifen hergestellt, wobei die permeable Schicht (5) zuvor mit einer 3 %igen Natriumperiodat (NaIO4)-Lösung getränkt wurde. Zum Testen wurde eine Lösung aus 200 mg/dl Glucose mit 100 mg/dl Ascorbinsäure herge­ stellt. Nach dem Eintauchen konnte durch das transpa­ rente Sichtfenster eine homogene Farbreaktion beobachtet werden, die eine der Ascorbinsäure-freien Vergleichslö­ sung entsprechende Intensität besaß.
Beim Vergleichsteststreifen ohne Periodat-Tränkung konnte keine Farbreaktion beobachtet werden.
Beispiel 10 Kaliumnachweis im Blut
Aus
100,0 g des beschriebenen Acrylnitrilcopolymerisats
 25,5 g Lithiumdodecylsulfat
692,6 g Dimethylsulfoxid
  0,4 g 7-(n-Decyl)-2-methyl-4-(3,5-dichlorphen-4- on)-indonaphthol (7-Decyl MEDPIN)
  0,1 g Nitrophenyloctylether und
  1,0 g 2,3-Naphtho-15-krone 5
wurde durch Rühren eine homogene Lösung hergestellt. Nach Filtration und Entgasen wurde in Analogie zu Bei­ spiel 1 eine Membran auf Polyestergewebe hergestellt.
Zum Testen wurde Vollblut mit steigenden Mengen an KCl- Konzentrationen (0, 4, 8 und 12 mMol) verwendet. Auf der Membranoberseite wurden Blaufärbungen mit zunehmenden Farbintensitäten beobachtet.
Beispiel 11 Proteinnachweis im Urin
Die in Beispiel 6 beschriebene reagenzfreie Membran wurde mit der folgenden Lösung getränkt:
 0,024 g Tetrabromphenolblau
40 ml Ethanol
50 ml Citratpuffer (0,5 m, pH 3,3)
auffüllen mit Wasser auf 100 ml. Nach Trocknen wurde analog Beispiel 7 Teststreifen hergestellt und in Albumin-haltige Standardlösungen (0 bis 500 mg/dl) getaucht. Dabei wurden bei protein-haltigen Lösungen entsprechend der Konzentration zunehmende Grünfärbungen beobachtet.
Beispiel 12 Nachweis von Harnstoff im Blut
Aus
20,0 g Polyvinylidenfluorid (PVDF) und
100,0 g N-Methylpyrrolidon (NMP)
wurde durch Rühren in der Wärme eine homogene Polymerlösung hergestellt.
Durch Beschichten eines Polymervlieses und Koagulieren in Wasser wurde in Analogie zu Beispiel 1 eine hydro­ phobe Membran hergestellt. Nach Trocknen wurde mit den folgenden Lösungen getränkt:
Membranrückseite
Urease S
250 U/ml, Fa. Boehringer, Mannheim
Hepes 2,38 mg/ml, Fa. Boehringer, Mannheim
DuPont Zonyl FSN 5 µl/ml, nichtionisches Fluortensid
b) Membranvorderseite
Bromphenolblau
20 mg/ml
Citronensäure 2,1 mg/ml (0,01 m, ph 2.9)
DuPont Zonyl FSN 5 µl/ml
Nach dem Trocknen wurde mit harnstoffhaltigem Blut gestestet. Es wurde eine homogene Blaufärbung beob­ achtet, die mit steigender Harnstoffmenge intensiver wurde.
Beispiel 13 Herstellung eines Gluscose-Teststreifens mit roter Reaktionsfarbe in niedrigen und blauer Reaktionsfarbe im höheren Glucose-Konzentrationsbereich
Die in Beispiel 4 beschriebene Tribromphenol-haltige Membran wurde von der Rückseite mit der Tränklösung TL 3 (GOD, POD, Saponin, 4-AAP) und von der Vorderseite mit der in Beispiel 6 beschriebenen TMB-PVP-Emulsion ge­ tränkt und getrocknet.
Beim Test mit wäßrigen Standardlösungen wurde bis 110 mg/dl Glucose eine rote Reaktionsfarbe, bei höheren Glucosekonzentrationen eine blaue Reaktionsfarbe beob­ achtet.
Herstellen der Tränklösungen
Zum Herstellen der Lösungen wurden jeweils ein 50-cm- Meßkolben eingesetzt.
GOD (180 U/mg)
POD (149 U/mg)
TL 1
119 mg GOD
335 mg POD
500 mg Triton X 10
Citratpuffer (pH 5,5, 0,2 m) bis zur Eichmarke
TL 2 2000 mg PVP K 30 zusätzlich zu TL 1
TL 1C 408 mg 4-Aminoantipyrin zusätzlich zu TL 1
TL 2C 153 mg 4-Aminoantipyren zusätzlich zu TL 2
TL 3 119 mg GOD
335 mg POD
50 mg Saponin
102 mg 4-Aminoantipyren
TL 4 2000 mg PVP K30 zusätzlich zu TL 3
TL 5 1326 mg 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure-Na-Salz (DCHBS) zusätzlich zu TL 3
TL 6 2000 mg PVP K 30 zusätzlich zu TL 5
TL 7 TL 2 ohne POD
TL 8 TL 2 ohne GOD

Claims (3)

1. Verfahren zur Analyse von Substanzen aus biologischen Flüssigkeiten mit Teststreifen bestehend aus eine porösen Membran mit asym­ metrischer Porenstruktur, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe auf die großporige Seite der Membran aufgetragen wird und die Ablesung auf der gegen­ überliegenden feinporigen Seite erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Membran auf der großporigen Seite Poren mit einem Durchmesser von mindestens 3 µm hat.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die Membran auf der feinporigen Seite Poren mit einem Durchmesser von höchstens 1 µm hat.
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