DE102004054928B4 - Teststreifen zum störungsfreien Nachweis von Analyten - Google Patents

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Abstract

Teststreifen zum störungsfreien Erfassen von Analyten in Flüssigkeiten, bestehend aus einer Tragschicht mit darauf befestigter, mit einem Reagens oder mehreren Reagenzien imprägnierten saugfähigen Testschicht, dadurch gekennzeichnet, daß sich auf der saugfähigen Testschicht in flächenhafter Ausdehnung eine einheitliche, L-Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3. enthaltende Masse befindet

Description

  • Die Erfindung betrifft einen Teststreifen zum störungsfreien Erfassen von in einem flüssigen Medium befindlichen Analyten, dem eine Masse mit einem Antiinterferenzmittel flächenhaft aufgelagert ist.
  • In der klinischen Chemie können enzymatische Bestimmungsmethoden mit Oxidasen und Dehydrogenasen und andere Redoxreaktionen durch Reduktionsmittel wie Ascorbinsäure empfindlich gestört werden. Besondere Bedeutung kommt den Schnelldiagnostika zu, die nach Kontakt mit den Untersuchungsflüssigkeiten konzentrationsabhängige Färbungen ergeben, die visuell oder mit Reflexionsphotometern ausgewertet werden. So ist bekannt, daß beim Nachweis von Glucose mit Schnelldiagnostika, denen die Glucoseoxidase-Peroxidase-Redox-Reaktion zugrunde liegt, falsch erniedrigte oder falsch negative Befunde resultieren können (Kutter, D., Schnelltests in der klinischen Diagnostik, Urban-Schwarzenberg, München, Wien, Baltimore 1983, S. 33). Weiter ist bekannt, daß Schnelldiagnostika im hämoglobinkatalysierten Nachweis von Blut im Urin ebenfalls in Anwesenheit von Ascorbinsäure falsch negative Resultate ergeben können (Kutter, ebenda, S. 112). Im Nachweis von Bilirubin mit trockenchemischen Testsystemen hemmt Ascorbinsäure die Reaktion. Um Störquellen, die durch äußere Einflüsse wie durch Berührung mit der Hand, durch Auswascheffekte oder durch starke Benetzung hervorgerufen werden, auszuschalten, wird gemäß DE 2 118 455 A die Indikatorschicht mit einem feinmaschigen Netzwerk abgedeckt.
  • Zur Neutralisation von störenden Inhaltsstoffen des Urins wie Ascorbinsäure werden den Tränklösungen Eisenkomplexe ( EP-A 0123 115 ) zugesetzt, die aber wiederum ein weiteres Oxidationsmittel zur Autoxidation der vom Reduktionsmittel (zum Beispiel Ascorbinsäure) reduzierten Eisenverbindung erfordern ( EP-A 0 513 594 ). Anstelle des Reduktionsmittels ist nun ein lösliches Oxidationsmittel im Test, das in der Testreaktion Störungen ergeben kann. Zur Entstörung von diagnostischen Mitteln wird gemäß DE 30 12 368 A1 der Reagenzienzubereitung mit bekannten Rezepturen zusätzlich lösliches Jodat zugegeben. Befindet sich Jodat in den Reagenzienmischungen so kann es bei der industriellen Herstellung von bestimmten Testpapieren aufgrund der relativ langen Imprägnierzeiten schon zu einer partiellen Oxidation des Chromogens während der Fertigung kommen, und an die Auswahl der Oxidationsindikatoren werden besondere Anforderungen gestellt. Zur Herstellung von Teststreifen für Blutanalysen ( DE 39 22 495 A1 ) werden Fällungskoagulationsmembranen mit integral asymmetrischer Porenstruktur durch direktes Beschichten des Trägermaterials mit Polymergießlösungen oder durch nachträgliches Tränken gefertigt, wobei die Probe auf der großporigen Seite aufgetragen wird und die Farbreaktion und Auswertung auf der gegenüberliegenden Seite der Membranmatrix erfolgt.
  • In den Patentschriften DE 35 39 772 A1 und EP 0 728 843 A1 wird die Verwendung von schwerlöslichen Jodat- und Perjodatverbindungen beschrieben. Hierbei werden die schwerlöslichen Verbindungen direkt auf der Papierfaser erzeugt.
  • Der Überschuß an Reaktanden muß durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Diese im Labor relativ einfach zu praktizierende Methode stößt in der industriellen Fertigung von mehreren hundert Meter umfassenden Testpapieren auf erhebliche Schwierigkeiten. Reste von nicht ausgewaschenen Reaktanden können mit den verwendeten Indikatorfarbstoffen zu falsch-positiver Farbanzeige führen.
  • Zur Vermeidung eines ungleichmäßigen Befeuchtens von Teststreifen mit der Probe z. B. durch ungenügendes Abstreifen von Probenüberschüssen wird nach DE 31 18 381 A1 die Reagenzschicht mit einer hydrophoben, die flüssige Probe verzögernd aufsaugenden Schicht unterlegt und über die saugfähige Reagenzschicht ein Netz gezogen. Die Herstellung von transparenten Teststreifen für die transmissionsphotometrische Bestimmung von Komponenten in Flüssigkeiten, vorzugsweise in Vollblut erfolgt gemäß EP 0 226 767 A2 durch Auftragen von Reagenzien und filmbildenden Komponenten enthaltenden Gießlösungen auf gut haftende transparente Kunststoff-Folien.
  • Masanobu Shiga et al. (Analyt. Comm. 34, 115–117 (1997)) führen mit einem Piperidinyloxy-Derivat eine zusätzliche Vorinkubation durch, um in kolorimetrischen klinischen Testen die Ascorbinsäure zu oxidieren. Für trockenchemische Tests fand dieses Verfahren noch keine Anwendung.
  • Ziel der Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik in der industriellen Fertigung von Testpapieren zu überwinden und Teststreifen bereitzustellen, bei deren Anwendung keine Störung durch interferierende Substanzen eintritt. Durch die räumliche Trennung von Testreagenzien und Entstörersubstanzen ist eine gute Langzeitstabilität der Teststreifen gegeben.
  • Bei dem Teststreifen zum störungsfreien Erfassen von Analyten in Flüssigkeiten, bestehend aus einer Tragschicht mit darauf befestigter, mit Reagenzien imprägnierten saugfähigen Testschicht, sieht die Erfindung vor, daß die saugfähige Testschicht mit einem dünnen Material überspannt ist, das Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3. enthält. Das zum Überspannen verwendete Material ist so dünn, daß es nach Benetzen mit der Untersuchungsflüssigkeit transparent wird und somit die Reaktionsfarbe, die sich in der Testschicht bildet, gut erkennbar und auswertbar ist.
  • Es kann ein Cellulose-Langfaserpapier, ein Kunststoffvlies oder ein Gemisch aus Cellulose und Kunststoff verwendet werden, das sich mit Kleber auf der Tragschicht anheften läßt. Es können auch siegelfähige Materialien, bevorzugt hitzesiegelfähige Materialien zum Einsatz kommen, zu deren Anheftung kein Kleber erforderlich ist.
  • Technologisch wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Schmelzkleber in einer breiten Bahn auf die Tragschicht aufgebracht wird.
  • Während der Schmelzkleber noch ausreichend heiß ist, um bindefähig zu sein, werden die saugfähige Testschicht und das dünne Material auf der Tragschicht angedrückt. Die Menge aufzutragenden Schmelzklebers und der Anpreßdruck sind unter Beachtung der Eigenschaften von beiden Materialien aufeinander abgestimmt, so daß der Kleber bei dem dünnen Material nicht durchschlägt. Dabei wird das dünne Material neben der saugfähigen Testschicht mittels Formrad auf der polymeren Tragschicht angeheftet. Es ist aber auch möglich, daß zuerst die saugfähige Testschicht auf die polymere Tragschicht geklebt wird, und nach dem Erkalten des Klebers wird das dünne, Ascorbat Oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3 enthaltene Material über die saugfähige Testschicht geführt und mittels Schweißrad oder einer regelbaren Heizspachtel partiell punktuell erhitzt und durch ein Formrad angedrückt und so mit der Tragschicht verbunden, daß das dünne Material neben der Testschicht auf der Tragschicht angeheftet ist.
  • Der Kleber kann aber auch mittels Heißluft erneut bindefähig gemacht werden.
  • Eine effektive Form des nachträglichen Auftragens von Kleber stellt ein System dar, bei dem dünne Kleberfäden gebildet werden, die zur Anheftung des dünnen Material dienen und so einem „Durchschlagen" des Klebers entgegen wirken.
  • Es kann als dünnes Material auch ein siegelfähiges Material verwendet werden, für dessen Anheftung auf der Tragschicht kein Kleber erforderlich ist.
  • Als Schmelzkleber können handelsübliche Produkte, wie zum Beispiel Ethylen-Vinylacetat-Copolymere, Polyester oder Polyamide verwendet werden. Derartige Schmelzkleber werden bereits bei der Fertigung von diagnostischen Teststreifen verwendet.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die saugfähige Testschicht mit einer dünnen Schicht versehen, die Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3. enthält. Die Lösung mit der Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3 wird räumlich getrennt von den anderen Testreagenzien auf das trockne funktionstüchtige Testpapier in dünner Schicht aufgetragen. Das Auftragen der Lösung kann im Sprühverfahren bei einem Druck von 0,1 bis 0,4 bar in einer Menge von 5 bis 200 g/m2, vorzugsweise von 10 bis 100 g/m2 erfolgen. Eine homogenen Beschichtung wird auch mit dem Extrusionsverfahren erzielt.
  • Besonders bevorzugt ist ein Auftragsystem mit schnell rotierenden Walzen, die einen Auftrag von 5 bis 100 g/m2 ermöglichen. Falls es erforderlich ist, die Viskosität und damit die Auftragsmenge zu erhöhen, können der Lösung Hydrogelbildner zugesetzt werden. Als Hydrogelbildner werden besonders organische Stoffe wie wasserlösliche Celluloseether – bevorzugt hydroxysubstituierte Celluloseether – in Konzentrationen von 0,1 bis 4% ausgewählt. Aber auch Alginate, Traganth, Pektin, Polyvinylalkohole oder hochpolmere Polyvinylpyrrolidone und Polyethylenglykole sind geeignet.
  • Beispiele
  • Beispiel 1:
  • Ein Teststreifen wird unter Einsatz folgender Materialien gefertigt:
    Tragschicht: Marnot X (Coloprint GmbH, Bundesrepublik Deutschland)
    Montageschmelzkleber: Kömelt 65, weiß, Offenzeit: 40–120 Sekunden, Dichte: 0,95 g/cm3
    Schmelzkleberauftragstemperatur: 160°C, Schmelzkleberspur: 7,5 mm breit, Anpreßdruck: 2 bar
    Bahngeschwindigkeit: 5 m/min, Andruck mit Formrad, das eine Gravur für die Vertiefung von 300 μm aufweist;
    saugfähige Schicht: Reaktionsschicht auf Cellulosebasis, imprägniert mit Reagenzien zum Nachweis von Blut im Harn,
    dünnes Material: Dynapore, Long fibre, naßfest, Dicke: 55 μm, getränkt und getrocknet mit Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3.
  • Auf dem Teststreifen sind weitere saugfähige Testschichten zum Nachweis von Bilirubin, Urobilinogen, Nitrit, Glucose, Protein, pH, Keton, spezifischem Gewicht, Leukozyten, Ascorbinsäure im Harn aufgebracht.
  • Der Teststreifen wird der Prüfung gemäß Beispiel 3 unterzogen, als Vergleich dient ein Streifen mit dünnem Material ohne Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3.
  • Beispiel 2:
  • Das saugfähige Testpapier auf Cellulosebasis, imprägniert mit Reagenzien zum Nachweis von Glucose im Harn, wird mit einer Lösung Ascorbat oxygen Oxidoreduktase EC 1.10.3.3 (150 U/ml) und Hydroxypropylcellulose (1 mg/ml) in 1 Teil Ethanol und 9 Teilen Wasser besprüht (20 g Lösung/m2 Druck 0,3 bar). Das Papier wird bei 50°C getrocknet, in 5 mm breite Streifen geschnitten und in einer Größe von 5 × 5 mm auf den Träger geklebt.
  • Auf dem Teststreifen sind weitere saugfähige Testschichten zum Nachweis von Bilirubin, Urobilinogen, Nitrit, Blut, Protein, pH, Keton, spezifischem Gewicht, Leukozyten im Harn aufgebracht. Der Teststreifen wird der Prüfung gemäß Beispiel 3 unterzogen, als Vergleich dient ein Streifen ohne Ascorbat oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.3.
  • Beispiel 3:
  • Einfluß von interferierenden Substanzen auf den Nachweis von Glucose und Blut mit und ohne Ascorbat oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.3.
  • Die nach Beispiel 1 und 2 hergestellten Teststreifen wurden in Urine getaucht, denen die in der Tabelle aufgeführten Konzentrationen der nachzuweisenden Analyten (interferierende Substanz: 0 mg/dl) zugemischt waren bzw. die zusätzlich die interferierende Substanz (L-threo-Hex-2-enonsäure-gamma-lacton) enthielten. Mittels Combi-Scan (Analyticon Biotechnologies AG) wurden die Remissionswerte ermittelt.
  • Aus dem Vergleich der Versuche ohne Ascorbat oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.3. und der Versuche mit Ascorbat oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.3. läßt sich aus Tabelle „Einfluß von interferierenden Substanzen" die Wirkung der mit Ascorbat oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.3. behandelten Teststreifen erkennen.
  • Tabelle: Einfluß der interferierenden Substanzen L-threo-Hex-2-enonsäure-gamma-lacton (HSL)
  • Auf den Nachweis von Glucose und Blut – mit und ohne Ascorbat oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.3. (AOO) Beispiel 3a: Nachweis von Glucose
    Reflexionsphotometrische Auswertung mit Combi-Scan (Analyticon Biotechnologies AG) Remissionswerte
    Glucose mg/dl negativ 50 100 250 500 mg/dl
    Ohne AOO
    HSL: 0 mg/dl 66,6 51,1 39,5 29,6 22,5
    HSL: 40 mg/dl 67,2 66,8 48,5 32,3 23,4
    HSL: 80 mg/dl 67,5 66,1 65,2 58,3 35,2
    Mit AOO;
    HSL: 0 mg/dl 67,5 50,4 37,5 27,8 20,8
    HSL: 40 mg/dl 68,4 51,2 38,5 28,6 23,3
    HSL: 80 mg/dl 68,9 55,2 39,9 30,4 26,5
    Beispiel 3b: Nachweis von Blut
    Remissionswerte
    Blut (Bl) negativ 0,2 mg/dl Bl (10 Ery/μl) 1,3 mg/dl Bl (50 Ery/μl) 6,0 mg/dl Bl (300 Ery/μl)
    Ohne AOO
    HSL: 0 mg/dl 85,8 51,2 8,9 3,2
    HSL: 40 mg/dl 85,5 86,7 81,1 8,2
    HSL: 80 mg/dl 85,3 86,2 85,5 12,5
    Mit AOO
    HSL: 0 mg/dl 85,1 52,3 9,3 3,3
    HSL: 40 mg/dl 86,1 55,8 10,5 3,9
    HSL: 80 mg/dl 85,9 59,5 11,2 4,9

Claims (6)

  1. Teststreifen zum störungsfreien Erfassen von Analyten in Flüssigkeiten, bestehend aus einer Tragschicht mit darauf befestigter, mit einem Reagens oder mehreren Reagenzien imprägnierten saugfähigen Testschicht, dadurch gekennzeichnet, daß sich auf der saugfähigen Testschicht in flächenhafter Ausdehnung eine einheitliche, L-Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3. enthaltende Masse befindet
  2. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3. enthaltende Masse ein dünnes Material ist, das die Testschicht überspannt und seitlich neben der Testschicht auf der Tragschicht befestigt ist und im feuchten Zustand transparent ist.
  3. Teststreifen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das dünne Material aus Cellulose-Papier, Cellulose-Kunststoff-Vlies, Kunststoff-Fasern oder aus Kunststoffvlies besteht.
  4. Teststreifen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Cellulose-Papier ein Langfaser-Papier oder das Cellulose-Kunststoffvlies ein Langfaser-Papier-Kunststoff-Gemisch ist.
  5. Teststreifen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Material siegelfähig ist.
  6. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Ascorbat oxygen oxidoreductase EC Nr. 1.10.3.3. enthaltende Masse eine mittels Sprühauftragssystem oder Extrusionsverfahren oder vorzugsweise mit einem Walzensystem bei Linienkontakt des Substrates zur Antragswalze auf die Oberfläche der Testschicht aufgetragene und räumlich von der Testschicht getrennte, festhaftende Reagenzlage ist.
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