DE3118381A1

DE3118381A1 - Mehrschichtiges testmittel zum nachweis einer komponente einer fluessigen probe

Info

Publication number: DE3118381A1
Application number: DE19813118381
Authority: DE
Inventors: Anselm Dr.Rer.Nat. Rothe; Adolf Karl 6943 Birkenau Selle; Bernward Karl Dr.rer.nat. 6804 Viernheim Sojka
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1981-05-09
Filing date: 1981-05-09
Publication date: 1982-11-25
Also published as: US4587099A; JPS57187656A; DD202473A5; EP0064710B2; SU1391506A3; JPH0547780B2; EP0064710A1; DE3266137D1; ATE15545T1; EP0064710B1

Description

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BOEHRINGER MANNHEIM GMBH ^2 - 2427

Mehrschichtiges Testmittel zum Nachweis einer Komponente einer flüssigen Probe

Die vorliegende Erfindung betrifft Teststreifen zum Nachweis einer Komponente in einer flüssigen Probe, insbesondere in einer Körperflüssigkeit.

Teststreifen sind bereits seit langer Zeit im Gebrauch, haben jedoch in letzter Zeit insbesondere in der ' klinischen Chemie stark an Bedeutung gewonnen. Sie erlauben eine schnelle, einfache, halbquantitative oder quantitative Bestimmung der Komponenten einer flüssigen Probe, beispielsweise von Glucose, Eiweiß und ähnlichen in Körperflüssigkeiten wie Urin, Serum und anderen. In zunehmendem-Maße werden solche Teststreifen auch von Nicht-Fachleuten verwendet, so daß es notwendig geworden ist, die Handhabung möglichst zu vereinfachen und sicherer zu gestalten.

Ein außerordentlich häufiger Fehler bei der Handhabung von solchen Teststreifen, ist das ungleichmäßige Befeuchten des Teststreifens mit der Probe durch ungenügendes Abstreifen von Probenüberschüssen nach dem Eintauchen des Teststreifens in die Probe. Auf dem Testfeld zurückbleibende Flüssigkeitstropfen führen zu einer ungleichmäßigen Verfärbung, weil entweder eine erhöhte Substanzkonzentration vorgetäuscht wird, oder durch die Flüssigkeitsreste der Zutritt von Luftsauerstoff, der als Reaktionsteilnehmer beispielsweise für alle enzymatischen Oxidationsreaktionen benötigt wird, verhindert wird, so daß zu geringe Substanzkonzentration vorgetäuscht wird. Darüberhinaus führen Flüssigkeitsreste die bei Mehrfachtesten zwischen verschiedenen Testfeldern eine Flüssigkeits-

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brücke ausbilden, zu" einer Übertragung von Reagenzien von einem Testfeld zum anderen, wodurch insbesondere im Randbereich der Testfelder Störreaktionen hervorgerufen werden können, die die Ablesung erschweren oder unmöglich machen. Tn der DE-AS 21 18 455 ist deshalb vorgeschlagen worden, die aus wirtschaftlichen Gründen relativ kleinen Testbezirke, die auf einem wasserfesten Handgriff, normalerweise an einem Kunststoffstäbchen befestigt sind, mit einem hydrophobierten Papier zu unterlegen, durch welches ein Überschuß der Testflüssigkeit, der nach kurzem Eintauchen der Testvorrichtung in die Testflüssigkeit und Abstreifen der Flüssigkeit zurückbleibt, abgesaugt wird. Ein so hydrophobiertes Papier saugt über die weniger hydrophobierten Schnittkanten eventuelle Flüssigkeitsbrücken zu Nachbarbezirken relativ rasch ab und ist darüberhinaus imstande einen Flüssigkeitsüberschuß aus dem Testpapicr abzusaufen, ohne jedoch die Tür die Reaktion notwendige Flüssigkeit zu entfernen. In der DE-OS 28 54 342 sind weiterhin Teststreifen beschrieben, bei denen das Hydrophobpapier gegenüber dem Reagenzbezirk durch eine flüssigkeitsundurchlässige Schicht abgegrenzt wird, so daß lediglich Flüssigkeitsbrücken zwischen benachbarten Testbezirken aufgesaugt werden, jedoch die in und auf dem Testbezirk befindliche Flüssigkeitsmenge nicht beeinflußt wird. In den beiden vorstehenden Patenten wird als bevorzugtes Trägermaterial für das Reagenzfeld Papier verwendet, das eine relativ hohe Wasseraufnahmefähigkeit hat, so daß geringe Schwankungen der Testflüssigkeitsmenge tolerierbar sind.

In neuerer Zeit werden zunehmend als Reagenzträger dünne Polymerfilme verwendet, in die die Reagenzien eingebettet sind, da diese gegenüber Papier oder anderen faserigen Trägermaterialien eine wesentlich homogenere Struktur besitzen und somit eine gleichmäßigere Färbung im Mikrobereich und vor allem auch eine gleichmäßigere Oberfläche aufweisen, so daß die zunehmend durchgeführten photometrischen Auswertungen einer Verfärbung mit entsprechenden kleinen Remissionsphotometern durchgeführt werden können. Filme dieser Art sind beispielsweise in der DE-PS 15 98 153 und der DE-AS 23 32 76o beschrieben. Bei der ersten Ausführungsweise wird die Flüssigkeitsmenge dadurch reguliert, daß man einen Überschuß der Flüssigkeit aufbringt, eine definierte Zeit in den dünnen Polymerfilm eindringen läßt und einen eventuellen Überschuß gleichzeitig mit eventuellen Trübungen die nicht in den Film eindringen zusammen abwischt oder abwäscht. Die Beobachtung der Verfärbung kann dann von oben in gewohnter Weise erfolgen. Bei der zweiten Patentschrift wird das Problem so gelöst, daß die Flüssigkeit zunächst in eine erste hydrophile Schicht aufgesaugt wird und von dieser langsamer in einer der Saugfähigkeit der eigentlichen Reagenzschichten entsprechenden Menge an diese abgegeben wird. Die Beobachtung der Reaktion erfolgt bei dieser Vorrichtung von der Rückseite, wobei zwischen der Reagenzschicht und dem Vorratsvolumen strahlungsundurchlässige Schichten und Filterschichten dafür sorgen, daß lediglich das Reaktionsprodukt in der

^o Reagenzschicht ausgewertet wird. Obwohl solche mehr-

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schichtigen Vorrichtungen geringe Dosierungschwank-" ungen ausgleichen können, darf eine solche Vorrichtung jedoch nicht in die Testflüssigkeit eingetaucht werden, da die damit applizierte Menge "ertrinken ifürde". Die beiden Vorrichtungen weisen somit gegenüber den HOrIUaICn₇ Papier verwendenden Teststreifen einen zusätzlichen "Dosierungsschritt" auf, der ihre Benutzung verkompliziert

Es stellte sich deshalb die Aufgabe, einen Teststreifen zu entwickeln, der so einfach gehandhabt werden kann wie ein Reagenzpapiere enthaltender Streifen, jedoch die Vorteile eines Filmteststreifens aufweist, daß heißt eine homogene, nicht durch die Struktur gestörte Reaktion aufweist.

Bei Versuchen, die Vorrichtung geiä." DE-OS 28 Ξ4 342 mit einem Reagenzfilm, der aus Stabil itätsfründer,. auf einem wasserundurchlässigen dünnen Trägerfilm befestigt ist, aufzubauen, mißlingen erwartungsgemäß, da zwar Flüssigkeitsbrücken neben dem Testbezirk in gewohnter Weise abgesaugt werden, jedoch Flüssigkeitstropfen oder-Filme auf dem Testbezirk stehen bleiben und hier zu einer ungleichmäßigen Reaktion und Färbung führen. Überraschenderweise läßt sich die auf der Oberseite des Testfilms befindliche Flüssigkeitsschicht jedoch rasch und reproduzierbar durch das untergelegte Hydrophobpapier absaugen, wenn man über das Testfeld und das Hydrophobpapier ein dünnes Netz spannt, das auf beiden Seiten des Testbezirks an dem Handgriff befestigt ist. Offensichtlich wird durch Kapi1larkrüFte, die zwischen den Netzfäden und der l^;i Imober Π flehe wirksam werden, ein Flüssigkeitsüberschuß rasch und zuverlässig über die Kante abgeleitet und vom Hydrophobpapier aufgesaugt.

Das erfindungsgemäß mehrschichtige Testmittel zum Nachweis einer Komponente einer flüssigen Probe besteht demgemäß aus einem Träger, einer darauf befestigten , die flüssige Probe verzögernde aufsaugenden Schicht, einer darüber befestigten saugfähigen Reagenzschicht und einer diese überdeckenden Netzschicht, welche neben der aufsaugenden Schicht an dem Träger befestigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht aus einer polymeren Filmschicht, in die die Reagenzien eingebettet sind besteht und gegen die aufsaugende Schicht flüssigkeitsundurchlässig abgegrenzt ist.

Der Aufbau der erfindungsgemäßen Testmittel ist beispielhaft in der Figur 1 dargestellt. Die Figur' zeigt das Trägerelement 1, auf dem eine saugfähige Schicht 2, einen wasserunlöslichen Filmträger 3 und den Reagenzfilm 4, wobei die beiden letzteren aus zeichnerischen Gründen wesentlich dicker gezeichnet worden sind als dies der Natur entspricht und das Abdecknetz 5.

Als Trägerfolie 1 wird normalerweise eine der im Handel befindlichen Kunststoff-Folien benutzt, jedoch kann auch ein wasserfester Kartor>,Metallstreifenoder ähnliches in gleicher Weise benutzt werden. Wichtig ist lediglich, daß dieser eine genügende Festigkeit besitzt um die Handhabung zu ermöglichen, gegen die Testflüssigkeit und die verwendeten Reagenzien inert ist und eine einfache Befestigung der überdeckenden Netzschicht erlaubt.

λο Als aufsaugende Schicht wird vorteilhaft ein etwas hydrophobiertes Papier verwendet, jedoch können auch andere

saugfähige Materialien wie offenporige Kunststoffschäume, Blush-Polymere, flüssigkeitsfeste Gele etc. verwendet werden. Anorganische Materialien wie beispielsweise Gips werden weniger bevorzugt, da sie normalerweise keine ausreichende Stabilität besitzen. Die Saugfähigkeit dieser Materialien sollte so bemessen sein, daß sie beim kurzzeitigen Eintauchen in die flüssige Probe [I bis 2 Sekunden) nur äußerlich benetzt werden, jedoch Flüssigkeitsbrücken neben den Testbezirken, sowie die überschüssige Probe auf dem Testbezirk innerhalb von 2 bis 1o Sekunden absaugen, wobei eine normale Reaktionszeit des Testes von 1 bis 2 Minuten zugrunde gelegt wird. Sollte die Testzeit wesentlich langer sein, kann selbstverständlich auch die Absaugzeit, in der auf dem Testfeld noch keine idealen Bedingungen herrschen, sich entsprechend verlängern.

Als Testfilme können aus Kunststoffdispers ionen hergestellte Indikatorfolien gemäß DE-PS 15 98 153, "offene' Indikatorfolien gemäß DE-OS 29 10.134, Blush-Polymere gemäß US-PS 3 555 129 ödere andere,die flüssige Probe im beschränktem Maße aufnehmende, dünne^acroskopischhomogene Schichten, verwendet werden. Da solche dünnen Schichten üblicherweise nicht genügend stabil sind, so daß man sie mit den übrigen Komponenten zusammen zu dem Testmittel verarbeiten kann, empfiehlt es sich, diese Filme auf einer stabilen,dünnen, biegsamen Hilfsfolie, die normalerweise aus einem festen Kunststoff besteht, zu befestigen, oder direkt darauf zu erzeugen und beides zusammen zu verarbeiten. Da wässrige Flüssigkeiten normalerweise jedoch nur sehr langsam in solche Polymerfilme eindringen, ist es jedoch auch möglich, den Film in einer dickeren Schicht herzustellen, so daß er einerseits genügend stabil ist um auf eine Trägerfolie verzichten

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zu können und andererseits ein Durchtritt der Flüssigkeit, innerhalb der für die Testreaktion notx\rendigen Zeit, zu der aufsaugenden Schicht,durch den Film selbst verhindert wird.
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Als Netzschicht können die in der DE-AS 21 18 455 bereits beschriebenen Abdecknetze Verwendung finden, die üblicherweise aus Kunststoffen wie Polyamid-,Polyester-oder auch Cellulosederivaten bestehen können. Aus optischen Gründen empfiehlt es sich, relativ dünne Netze mit Fadenstärken von 2o bis 2oo ,u und einer offenen Lochfläche von 4o bis 8o % zu verwenden, wobei selbstverständlich das Fadenmaterial für die zur Analyse des Reaktionsproduktes benutzte Strahlung durchlässig sein muß, da die Auswertung dieser Elemente von oben her erfolgt.

Anhand der folgenden Beispiele, sollen die Vorteile der erfindungsgemäßen Testmittel näher gezeigt werden, ohne daß dadurch die Anmeldung in irgendeiner Weise beschränkt ^o werden soll.

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Beispiel 1

Herstellung eines glucose-empfindlichen Testfilms

2o	KU	Glucoseoxidase
80	KU	Peroxidase
5	ml	1m Citratpuffer pH 5
0,	13 g	Na-Alginat
13	g	Polyvinylpropionat-Dispersion, 5o % ig
0,	375 g	Tetramethylbenzidin (3,3', 5,5')
0,	1g	1-Phenylsemicarbazid
•1	g	Dioctylnatriurasulfosuccinat
5	ml	Methoxyäthanol
1o	g	Kieselgel
12	; ml	Wasser

werden zu einer homogenen Masse verarbeitet und mit o,1 mm Spaltbreite auf eine I00 ju dicke Polycarbonatfolie beschichtet. Die so erhaltene Folie wird in 6 mm breite Streifen zerschnitten, die mit einem doppelseitigen Klebeband in der Nähe der einen Längskante eines 6 cm breiten Streifens aus einer etwa o,5 mm starken PVC-Folie aufgeklebt wurde. Diese wurde danach quer zu dem aufgeklebten Streifen in 6 mm breite Stücke zerteilt.

Werden die so erhaltenen Teststreifen in glucosehaltigen Harn kurz eingetaucht, so erhält man nach einer Reaktionszeit von 1 Minute,je nach Glucosekonzentration abgestufte, grün bis blaugrüne Verfärbungen. Trotz sorgfältigem Abstreifen der Teststreifen am Rand des Probengefäßes, ist das Testfeld jedoch durch die ungleichmäßige Dicke des zurückbleibenden Flüssigkeitsfilms ungleichmäßig gefärbt,

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wobei durch die Verhinderung des Luftzutrittes an Stellen auf denen sich ein dickerer Flüssigkeitsfilm befindet, die Reaktion schwächer ist. Nach einer Reaktionszeit von 5 Minuten, in der der Flüssigkeitsfilm vollständig abgetrocknet ist, zeigen sich diese Stellen aufgrund der höheren Substratkonzentration dagegen stärker verfärbt.

Cine gleichmäßige Färbung kann erreicht werden, wenn man den Teststreifen ca. 3o bis 6o Sekunden in die Probelösung eintaucht, nach dem Herausnehmen sorgfältig durch Abwischen mit weicher Watte trocknet und die Reaktion nach einer Minute abliest'.
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Beispiel 2

Herstellung der hydrophobierten Schicht

Filterpapier Schleicher & Schüll 23 SL wird mit folgender Lösung imprägniert und bei 1 T)O getrocknet:
5o ml Siliconharz HK 15a (Wacker) 5 mJ Härter (1ο°_Λ Aluminium-acctylucetonat in Toluol) 1 1 Essigsäurc-n-butylester

Das so erhaltene hydrophobierte Papier wird in Analogie zu Beispiel 1 in 6 mm breite Streifen geschnitten und auf eine Poiyvinylchloridfolie aufgeklebt. Mit einem weiteren Klebeband wird eine Indikator folie gemäß Beispiel 1 auf dem hydrophobieren Papier befestigt und wiederum quer zu diesen Bändern in 6 mm breite Streifen geschnitten.

Taucht man so erhaltene Streifen in glucosehaltigen Urin kurz ein, dann kann beobachtet werden, daß eine neben dem Testbezirk befindliche Harnbrücke rasch durch das Hydrophobpapier aufgesaugt und entfernt wird, während ein eventueller ungleichmäßiger Flussigkeitsfilm auf dem Testfilm wie in Beispiel 1 zurückbleibt und langsam eintrocknet. Die Reaktion mit verschiedenen (11 ticosekonzentrat ionen und die ungleichmäßige Verf ä rbuni¹,, entsprochen vollständig den Beobachtungen gemäß Beispiel I.

Beispiel 3
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Herstellung eines erfindungsgemäßen Glucosetestes

Eine Polyvinylchloridfolie gemäß Beispiel 1 wird an einer Seite mit einem Schmelzkleber beschichtet, auf den ein Hydrophobpapierstreifen gemäß Beispiel 2, ein Glucosetestfilmstreifen gemäß Beispiel 1 und ein ca. 12 mm breites Nylonnetz ,■ (Padend icke 6o u, 'IS" freie Loehflüche) übereinander {',eloyt werden. Mit einer erhitzten Walze, die an der Stelle des Testfilmes eine mm tiefe Ausnehmung besitzt, xvird das Nylonnetz auf beiden Seiten des Testfilms in den Schmelzkleber gedrückt und befestigt. Danach wird wiederum wie bei

Beispiel 1 und 2 in 6 mm breite Streifen geschnitten. Testfilm und Hydrophobpapier x^erden in der zwischen dem Nylonnetz und der Trägerfolie gebildeten Tasche straff gehalten, können jedoch mittels einer Pinzette mit einiger Mühe herausgezogen werden.

Taucht man die so erhaltenen Teststreifen etwa eine Sekunde in Urin und streift sie leicht am Rand des Probengefäßes ab, dann kann man feststellen, daß die neben dem Testbezirk befindlichen Flüssigkeitsbrücken rasch aufgesaugt werden und die anfangs durch den zwischen den Netzmaschen befindlichen Flüssigkeitsfilm glänzende Oberfläche der Vorrichtung nach 2 bis 5 Sekunden matt wird, was daraufhin deutet, daß die Flüssigkeitsüberschüsse auch auf der Testoberfläche durch das Ilydrophobpapier abgesaugt sind. Im Ge-gensatz zu den Testen gemäß Beispiel 1 und 2, ist die gesamte Oberfläche dos Testfilmes in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration mehr oder weniger stark, jedoch gleichmäßig gefärbt.

Claims

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-rf- Patentansprüche

Mehrschichtiges Testmittel zum Nachweis einer Komponente einer flüssigen Probe, bestehend aus einem Träger, einer darauf befestigten, die flüssige Probe verzögernd aufsaugenden Schicht, einer darüber befestigten saugfähigen Reagenzschicht und einer diese überdeckenden Netzschicht, welche neben der aufsaugenden Schicht an dem Träger befestigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht aus einer polymeren Filmschicht, in die die Reagenzien eingebettet sind besteht und gegen die aufsaugende Schicht flüssigkeitsundurchlässig abgegrenzt ist.
2. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aufsaugende Schicht aus einem hydrophobieren Papier besteht.
3. Testmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Netzschicht aus einem optisch durchlässigen Material, wie Kunststoff besteht.
4. Testmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzschicht auf einem flüssigkeitsundurchlässigen Träger befestigt ist