JPH0672883B2 - 分析素子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係
り、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析する
ための分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてき
た。その分析方法は、主として免疫反応をその原理とす
るものである。上記原理を用いる測定法として、種々の
ものが開発されてきたが、最も精度の高いものとして、
免疫測定法が知られている。

免疫測定法は、1958年、ベルソン（Berson）とイアロウ
（Yallow）が、放射性ヨードで標識した、ウシインシユ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシユリン抗体を用い
て、血清中のインシユリンを測定することに成功して以
来、放射免疫測定法が広く用いられている。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種種開発がなされてきた。他の標識化合物としては例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテ
リオフアージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍光性分子等
が挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かつた物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下B/F分
離と略記する）がある。

従来、免疫測定法における問題点を解決するために各種
の方法が開発されてきた（例えば、特開昭53−38619
号、同53−79024号、同55−90859号、同57−67860号、
同57−200862号、同58−18167号、同59−77356号及び同
59−170768号各公報参照）。

しかし、これらの方法は、B/F分離が不完全である、ノ
イズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物質
が低分子物質に限られる等の欠点があつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、ウエツト・ケミストリーにおいて、固定相を用い
た競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特
開昭58−209994号及び同59−202064号各公報参照）。し
かし、それらの測定法では、両固定相を区別することな
く全体の酵素活性を測定しているため、バツクグラウン
ドやノイズの問題から、感度、精度及び再現性について
満足な結果が得られない。

他方、ドライ・ケミストリーにおいて、第２抗体を用い
る免疫測定法が開発されている（特開昭57−82766号及
び同57−82767号各公報参照）。しかし、これらは、操
作が煩雑であること、再現性の良い展開を行う技術が必
要であること等、改良の余地がある。更に、特開昭59−
34155号公報記載の発明では、未結合物収納シートを用
いる方法が開示されている。しかし、この方法でも、反
応用シートと未結合物収納シートとを密着させたままで
測定を行おうとすると前述した問題が生じ、また測定時
に両シートを分離するのは煩雑であり、特に測定を自動
化する際、障害となる。

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は、分析素子内で積極的なB/
F分離を行い、しかもバツクグラウンドやノイズが少な
く、感度、精度及び再現性に優れた、流体試料中の特定
成分を定量するための分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あつて、流体試料中の特定成分を、該特定成分と特異的
に結合し得る物質と、該特定成分又はその類縁体と標識
とが結合した標識物との競合反応によつて測定するため
の分析素子において、その構成員として、該特定成分と
特異的に結合し得る物質を不動化した担体を含有する層
状体（以下、反応層と略記する）と、該標識物中の標識
部分と特異的に結合することにより該標識に起因する信
号を少なくとも減ずることができる物質を不動化した担
体を含有する層状体（以下、吸収層と略記する）とを包
含してなることを特徴とする。

本発明に使用しうる流体試料としてはあらゆる形態の溶
液、コロイド溶液を挙げることができるが、好ましくは
生物由来の流体試料すなわち血液、血漿、血清、脳背髄
液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ、特に
好ましいのは血液及び血清である。

本発明が測定しうる流体試料中の特定成分とはその存在
又はその流体試料中での量が測定され、その成分に特異
的に結合する物質が得うる物質又は物質の群であり、下
記表１に挙げる物質又は物質の群を例に挙げることがで
きる。

本発明に使用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結
合する物質としては、測定対象により抗体、抗原、レク
チン、プロテインＡ、特定酵素の阻害物質などが挙げら
れるが、該特定成分と該結合物質の結合反応が抗原−抗
体反応である場合が特に好ましい。本発明で使用する抗
体は、その由来を特に限定されるものではなく、哺乳動
物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液を
そのままか、あるいは従来公知の方法である（右田俊介
編「免疫化学」中山書店第74〜88頁参照）、硫酸ナトリ
ウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、セフアデツクス
ゲルによるゲル過法、イオン交換セルロースクロマト
グラフイー法、電気泳動法等で精製して用いることがで
きる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）脾
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくつても
良い。

また、これらの抗体はIgG、IgM、IgA、IgD、IgE各分画
を用いることができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理
してFab又はFab′といつた活性抗体フラグメントにして
使用してもよい。更にこれらの抗体は単一で使用して
も、複数の抗体を組み合わせ使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質として抗
体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定原理は
免疫測定法に属する。本発明の分析素子は免疫測定法に
おいて特に好ましく使用できるので、以下免疫測定法を
例にとつて本発明の構成を説明するが、本発明はこの説
明に限定されるものではなく、種々の応用が可能である
ことは以上に述べてきた内容からも明らかである。

本発明に適用しうる標識としては、例えば、酵素、酵素
基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質（酵
素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を活性化
する物質など）、蛍光物質、化学及び生物発光物質、色
素、色素前駆体（ロコイ色素など）、などが挙げられ、
その代表的な例としては下記表２に示した物質を挙げる
ことができる。更に好ましくは表２に開示された酵素及
び蛍光物質が用いられる。

2. 基質（発光物質を含む） ｐ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド ４−メチルウンベリフエロン−β−Ｄ−ガラクトシド ｐ−ニトロフエニルホスフエート コルチゾール−21−ヘミスクシネート ウンベリフエロ
ン コンジユゲート フレミノール イソルミノール Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル イソルミノー
ル ヘミスクシンアミド Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチル イソルミノ
ール Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル イソルミノー
ル ルシゲニン アクリジニウム フエニル カルボキシレート ロフイン ピロガロール 没食子酸 シロキシン ビス（2,4,6−トリクロロフエニル）オキサレート 及びその誘導体 3. 酵素阻害物質 フイソスチグミン メチオニン スルホキシミン ワイルドフアイア（wildfirs） ブルーデキストラン ｏ−ジアニシジン−セルロース ｏ−ジアニシジン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フエニルグリシン ｐ−ニトロフエニルグリシン アミノアセトニトリル ２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル−1,3′−カルボ
キシ−３′−アミノ−１′−プロペニル−１エーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−トランス−３−ブテン
酸 エタノールアミン ｏ−サルフエート アルビジイン アゼセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソアノルルバリン △^３−７−アミノセフアロスポリン酸 ミモシン ２−アミノ−４−ペンチン酸 ２−アミノ−４−クロロ−４−ペンテン酸 3,3−ジクロロアラニン 3,3,3−トリクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 N,N−トリメチル−２−プロピルアミン β−アミノプロピオニトリル ２−プロモエチルアミン ３−デシノイル−Ｎ−アセチルシステアミン 2,3−デカジエノイル−Ｎ−アセチルシステアミン β−クロロ−Ｌ−アラニン Ｌ−セリン−ｏ−サルフエート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグルシン Ｄ−ビニルグリシン プロピルギルグリシン ガバクリン ５−ニトロ−Ｌ−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロビニルアミン ３−ジメチルアミノ−１−プロピン グリセロース ジイソプロピルホスホロフルオライド フエニルメタンスルホニルフルオライド クラブラン酸 アロプリノール 4. 補酵素・補欠分子族 FAD（フラビン・アデニン・ジヌクレオチド） FMN（フラビン・モノヌクレオチド） ヘム Ｓ−アデノシルメチオニン THF（テトラヒドロ葉酸） TPP（チアミン二リン酸） CoA（補酵素Ａ） UDP-Glc（ウリジン二リン酸グルコース） PLP（ピリドキサールリン酸） ATP（アデノシン三リン酸） ビオチン CoI（ニコチンアミドアデニンジネクレオチド） CoII（ニコチンアミドアデニシジヌクレオチドリン酸） アデノシルコバラミン メチルコバラミン CoM（2,2′−ジチオジエタンスルホン酸） CoQ（ユビキノン） 5. 酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロペプチダーゼ ストレプトキナーゼ プロテインキナーゼ 酵素前駆体の各種プロテアーゼ なお、酵素前駆体の例としては下記のものが挙げられ
る。

トリプシノーゲン キモトリプシノーゲン プロコリパーゼ プロホスホリパーゼ プロレニン プロカルボキシペプチドダーゼＡ プロカルボキシペプチドダーゼＢ キニノーゲン プロエラスターゼ アンギオテンシノーゲン プロインシユリン プロパラチロイドホルモン プログルカゴン プロコラーゲン（可溶性） 凝集因子 XI、XII、XIII プロコラゲナーゼ プロコココーナーゼ プレカリクレイン ペプシノーゲン プラスミノーゲン フイプリノーゲン プロトロンビン プラスミノーゲンプロアクチベータ プロアクロジン 6. 蛍光物質 フルオレセイン イソチオシアナート（FITC） テトラメチルローダミン イソチオシアノート（TRIT
C） ローダミンＢ イソチオシアナート（RBITC） リサミンローダミン−B200スルホリル クロライド（RB
200SC） ウンベリフエロン ４−メチルウンベリフエロン（4MU） フルオレセインチオフルバミル（FTC） フルオレセインチオカルバミル−ジフエニルグリシン
（FTC−DPG） テトラメチルローダミン（TMR） ５−〔（4,6−ジクロロトリアジン−２−イル）−アミ
ノ〕フルオレセイン ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロライド
（DNS−Cl） フルオラム ２−メトキシ−2,4−ジフエニル−３（2H）−フラノン
（MDPF） ７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジ
アゾール（NBD−Cl） １−アニリノ−８−ナフタレンフルホン酸（ANS） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド（NPM） Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキシ−
３−クロロメチル）−アレイミド（DACM） Ｎ−（ｐ−２−ベンズイミダゾイル−フエニル）−マレ
イミド（BIPM） アントラセンイソチオシアナート フルオロアンチルマレイミド（FAM） 希土類元素を含む各種キレート及びそれらの誘導体 特定成分又はその類縁体と標識とが結合した標識物（以
下「標識物」と略称する）とは、前述の特定成分に特異
的に結合し得る物質によつて該特定成分と同様若しくは
準じて特異結合され得、かつ前述の標識をその信号を発
する能力を保持したまま化学的手段等で直接又は間接的
に結合した物質の総称である。実際には該特定成分若し
くは該特定成分と共通の抗原決定基を有する物質に、公
知の方法で前述の標識を化学結合させることにより得る
ことができ、更にくわしく言えば石川栄治、河合 忠、
宮井 潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、
1978年刊）や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊
特集第53号「臨床検査のためのイムノアツセイ−−技術
と応用−−」（臨床病理刊行会、1983年刊）に記載され
た方法を参考にすることができる。これらの方法のうち
でもグルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸法（ナカネ
法）、マレイミド法は特に好ましく用いることができ
る。

本発明における反応層とは、流体試料中の特定成分を、
該特定成分と特異的に結合し得る物質及び標識物と競合
的に反応させる層であり、該物質は反応層の一部若しく
は全部に固定化されている必要がある。また、反応時間
中流体試料を保持するために、反応層の一部若しくは全
部に、流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙孔（矩
径５μｍ〜300μｍが好ましい）を有する多孔性構造が
存在していることが必要である。

このような多孔性構造媒体としては、特開昭57−101760
号、同57−101761号、同58−70163号各公報に記載され
ている自己結合型粒子結合体、あるいは特開昭57−1258
47号、同57−197466号公報に記載された繊維分散液を塗
布することにより形成した繊維構造が好ましい例として
挙げられ、他にも特開昭49−53888号、同55−90859号、
同57−67860号各公報に記載された素材、あるいは卑近
な例としては吸水性の洋紙、和紙、紙、ブラツシユポ
リマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維（石綿な
ど）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど）、動物性繊
維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロ
ン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレンな
ど）、再成繊維（レーヨン、セルロースエステルなど）
などを単独あるいは混合して製造した織物、不織布、合
成紙などが使用できる。該特定成分と特異的に結合し得
る物質はこの多孔質媒体内の一部若しくは全部に不動化
されていることが好ましいが、この多孔質媒体層と隣接
して流体試料を添加する側と反対側にゼラチン、アクリ
ルアミド、アガロース、デキストランなどの多孔性の媒
体層を設けて、そこに不動化することも可能である。

該特定成分と特異的に結合し得る物質の不動化は、種々
の公知の方法により、該物質を該多孔質媒体の表面に物
理的に吸着させるか、化学反応により直接あるいは間接
的に結合させることにより達成される。その際、該物質
の該特定成分に対する特異的結合性が失われないように
留意する必要があり、例えば石川栄治、河合 忠、宮井
潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、1978
年刊）や千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著「実験と応用
アフイニテイクロマトグラフイー」（講談社、1976年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例として
挙げることができる。

また、該特定成分と特異的に結合し得る物質を不動化し
た後に、必要に応じて免疫反応における非特異的反応を
排除する目的で、測定すべき免疫反応に関与しないタン
パク質を担持することが可能である。それらの代表的な
例としては、哺乳動物の正常血清タンパク質、アルブミ
ン、ゼラチン及びその分解物等が挙げられる。

本発明における吸収層とは、前記標識物中の標識部分と
特異的に結合して、その結果として該標識に起因する信
号を少なくとも減ずることができる物質（標識吸収物
質）が、該層内の一部又は全部に不動化されている層で
ある。ここで、信号を少なくとも減じるとは、 A.該標識が特異的に結合した、その結合に起因して該標
識のもたらす信号が減じるか、消滅する場合、及び B.該標識が、特異的な結合により不動化された層の分子
的環境に起因して該標識のもたらす信号が減じるか消滅
する場合 を意味する。

具体例を挙げて説明する。Ａに属する例としては、例え
ば該標識が酵素である際、該標識物と特異的に結合する
物質としてその酵素の阻害剤を用いることにより、該標
識物を不動化し、かつその酵素の活性を消滅するか著し
く低下させる場合が挙げられる。

このような目的で使用しうる酵素と阻害剤の組合わせと
しては、ビオチン酵素（ピルビン酸カルボキシラーゼ、
アセチルCo−Ａカルボキシラーゼ、プロピオニル−CoA
カルボキシラーゼ、メチルマロニル−CoAカルボキシラ
ーゼなど）とアジピン、ペンオキシダーゼとｏ−ジアニ
ジン−デキストラン、乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキ
シル−３−ブチン酸、モノアミンオキシダーゼとN,N−
トリメチル−２−プロピニルアミン又はβ−アミノプロ
ピオニトリルなどが挙げられ、更にジヤーナル オブ
ジ アメリカン ケミカル ソサイエテイ（J.Am.Chem.
Soc.）第80巻第456頁（1958）；同第82巻第596頁（196
0）；アカウンツ ケミカル リサーチ（Aoc.Chem.Re
s.）第９巻第313頁（1976）；サイエンス（Science）第
185巻第320頁（1974）；化学工業、第1985巻第21頁（19
85）などに記載された若しくは引用された酵素・阻害剤
の組合わせても好ましく用いることができる。また、酵
素と結合することによりその酵素活性を阻害する性質を
もつ、該酵素に対する抗体も好ましく用いることができ
る。

あるいは前述Ａに属する別の例としては該標識が蛍光物
質である時に、該標識物が抗体と結合するとその蛍光が
減退するような性質がある場合、該標識物と特異的に結
合する物質としてその標識物の抗体を使用することによ
り、該標識物を不動化しかつその蛍光を消滅するか減じ
る場合が挙げられる。このような目的で使用する蛍光標
識としては表２の「6.蛍光物質」に示した物質が好まし
い。

前述のＢに属する例としては該標識が酵素である際に、
その酵素と基質が共通でありかつその反応が該標識酵素
の活性測定に用いる発色系を発色させない競合酵素（例
えば標識酵素がベルオキシダーゼの時、競合酵素として
カタラーゼが相当）を過剰に吸収層に不動化しておき、
また該標識酵素に対する抗体も同じ吸収層に不動化して
おいて、これと該標識酵素を結合させた場合が挙げられ
る。

上記の例からもわかるように本発明の吸収層にあらかじ
め不動化しておくべき、「標識物と特異的に結合する物
質」としては標識の種類により種々の物質が考えられ、
例えば標識を抗原とする抗体、標識が糖鎖を含む場合の
レクチン（コンカナバリンＡなど）、標識が酵素である
場合の阻害剤や基質類似物質（ビオチン酵素に対するア
ビジンなど）、などが例に挙げられる。これらの物質の
標識に対する結合定数は、反応層に不動化された物質の
流体試料中特定成分に対する結合定数より小さいことが
望ましいが、もし両者の結合定数が同程度であつたり大
小関係が逆であつたりした場合でも、各層に不動化する
物質の量比を適当に定めることにより、本発明の吸収層
の目的を充分果すことができる。

更に、本発明の効果を有効に発揮するために、必要に応
じてTiO₂やBaSO₄、マイカなどの白色顔料、あるいは水
不溶性の無機あるいは有機有色化合物粒子からなる着色
顔料、あるいはカーボンブラツクのような光吸収性粒子
を前述の吸収層に混入して光反射性あるいは遮光性を与
えることができる。あるいは別の態様として、これらの
物質を含む反射層あるいは遮光層を前述の反応層と吸収
層の間に設けることも可能である。こうした手段で、吸
収層に不動化された標識に起因する信号が多少存在して
も、それをほとんどさえぎることができ、測定のバツク
グランドを著しく下げることができる。

また、本発明の吸収層は、反応層と同様に、層の一部若
しくは全部に流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙
孔を有する多孔性構造が存在することが好ましい。この
ような多孔性媒体としては前述の反応層に使用しうる多
孔性媒体として開示された媒体群から適当なものを選ぶ
ことができる。

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるものであれば
よく、特に制限されるものではないが、製造上及び操作
・測定上、フイルム状・あるいはシート状であることが
好ましい。

本発明の分析素子の理解を助けるために、以下図面に基
づいて具体的に説明する。

第１図に、本発明の分析素子の基本的な構成の一例を示
す。第１図において符号１は多孔性反応層、２は光反射
性吸収層を意味し、→はサンプル滴下側、⇒は測定側で
ある。流体試料の一定量をはかりとり、前述の標識物の
一定量と混合し、第１図の分析素子の多孔性反応層１に
滴下する。

１に不動化された「特定成分に特異的に結合し得る物
質」に対して、流体試料中の特定部分と標識物が競合的
に反応した結果、該標識物のうち一部は１に不動化され
る。前記反応にあずからなかつた標識物は光反射性吸収
層２に不動化された標識吸収物質に結合することにより
２に不動化される。ここで１に不動化された標識物の標
識に起因する信号の強度を測定する。例えば標識が酵素
であるなら、素子の上面（１側）から酵素基質及び適当
な発色系を含む溶液を加え、一定時間イキユベートした
後に素子の上面から適当な波長の光の反射濃度を測定す
る。この際、２に不動化された酵素はその活性が低下し
ている上、２が光反射性を有しているために入射がほと
んど届かないのでここに不動化された酵素に起因する色
素は測定に実質上影響を及ぼさない。したがつて、この
反射濃度は１に不動化された標識量と関数関係にあり、
なおかつこの標識量は最初に流体試料中に存在した特定
成分の濃度と関数関係にある。そこで、あらかじめ特定
成分の濃度がわかつている流体試料（標準試料）を数種
類用いて検量線を作成しておけば、該反射濃度より該流
体中の特定成分濃度を知ることができる。

ここに挙げた例からも明らかなように、本発明の分析素
子の特徴は反応層で特異結合反応にあずからなかつた標
識物を、標識に体する特異結合反応を利用して吸収層へ
分離し、更に吸収層に不動化された該標識に起因する信
号を消滅するか減じることにある。また、必要に応じ該
吸収層に光反射性又は遮光性を持たせるか、反射層ある
いは遮光層を別に設けることにより前述の吸収層に不動
化された標識がわずかに信号を発してもそれが反応層に
存在する標識に起因する信号を測定する際の障害になら
ないようにすることができる。したがつて測定の際のバ
ツクグラウンドやノイズが著しく減少し、感度、精度、
再現性に優れた測定が可能となる。

この技術は乾燥系の化学を用いる分析系において新規な
ものであり、分析素子内の限られた空間の中でこのよう
な積極的B/F分離が可能であることは、全く予想のでき
ない驚嘆すべき効果である。

本発明の分析素子は前述の反応層及び吸収層が最近必要
構成要素であるが、発明の効果をより一層発揮するため
に、種々の補助層を設けてもよい。

第２図に示した本発明の素子の１例は、支持体３の上に
光反射性吸収層２、多孔性反応層１が順に積層されてお
り、支持体の存在により素子の取扱い性が向上してい
る。

第３図に示した本発明の別の実施の態様では、光透過性
支持体４の上に多孔性反応層１、多孔質光反射性吸収層
６が順に積層されており、素子全体はマウント５で覆わ
れている。マウント上部にあけられた試料注入孔より流
体試料と標識物の一定量の混合物を滴下すると、該滴下
物は多孔質光反射性吸収層及び多孔性反応層に拡散す
る。反応層及び吸収層におけるそれぞれ所定の反応は同
時進行しながら平衡化し、反応層に不動化された標識に
起因する信号はマウント下部の測定孔から光透過性支持
体を通して光学的に測定することができる。

上記２例のようにして用いる支持体は、水不透過性であ
れば特に素材に限定はなく、例えば酢酸セルロース、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及びポリ
ビニル化合物（例えばポリスチレン）のようなポリマー
材料あるいはガラスを挙げることができ、更に第２図の
場合のように、光透過性が必要とされない場合はセラミ
ツクス、金属、あるいは樹脂被覆等で防水処理を施した
紙等も使用することができる。

第４図に示した１実施の態様では、光透過性支持体の上
に発色試薬層７が設けられ、素子の最上部には標識物含
有層８が設けられている。標識物含有層は多孔性媒体
（反応層に用いうる媒体として前述したもの）に面積濃
度が一定となるように標識物を含有させた層であり、流
体試料の一定量を滴下すると一定量の標識物が溶出さ
れ、反応層及び吸収層に試料と共に拡散するものであ
る。また、発色試薬層は特に標識に起因する信号が酵素
反応による発生する場合に有効な層であり、ゼラチン、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アガロ
ース、アルギン酸ナトリウム、ポリアクリルアミド、ポ
リアクリル酸ナトリウムといつた親水性ポリマーに、酵
素活性測定に必要な基質、発色試薬を含有させた層であ
る。これらの層を設けることにより、この実施の態様で
は流体試料を滴下し、インキユベートするのみで測定が
可能となる。

酵素活性測定に必要な基質、発色試薬は、標識酵素ごと
に異なり、各酵素について多くの公知の試薬を用いるこ
とができる。これらは標識酵素に触媒される化学反応に
より、分光特性の変化を生じる成分を含んでいる。分光
特性の変化とは、可視光に対する吸光度の変化のみなら
ず、紫外光、赤外光に対する吸光度の変化も意味する
し、蛍光等吸収波長と異なる光の発光、吸光を伴わない
発光も意味する。更には消光も意味する。また、これら
の分光特性変化は該酵素が触媒する化学反応により直接
的に生じるもののみではなくて、該酵素反応の生成物が
更に他の触媒、酵素により別の化学反応を起こし、その
結果該分光特性が変化するような場合も含む。本発明に
おける基質、発色試薬とは、こうした分光特性変化を生
じるために必要な、標識と異なる触媒、酵素や反応系に
必要な種々の基質、補酵素、緩衝剤といつたものをも含
む混合物を意味する。

その具体的な構成を、標識酵素がペルオキシダーゼであ
る場合を例にとつて説明する。この場合は基質として過
酸化水素と適当な還元物質が必要である。このうち、前
者は揮発性であり、そのまま素子の中に含有させるのは
困難であるので、流体試料が滴下された時点で過酸化水
素を発生させるのが好ましい。このことは、例えばグル
コースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミンオキシ
ダーゼに代表される参加酵素（反応生成物として過酸化
水素を生じるタイプのもの）と、その酵素の基質を乾燥
状態で発色試薬層に含有させるか、あるいは該酸化酵素
及び基質のうち片方を発色試薬層に片方をそれと異なる
層に含有させることにより達成することができる。

一方、還元物質はペルオキダーゼにより過酸化水素で酸
化されることで分光特性が変化することが好ましい。こ
うした化合物の例としては表３に示した化合物が挙げら
れる。

なお、発色試薬層を設けていない本発明の態様では、標
識の検出に酵素反応を用いる場合、酵素基質及び発色系
を含む溶液を素子に滴下することを既に述べた。この場
合でかつ標識がベルオキシダーゼである時、表３に開示
した化合物を該発色系として好ましく用いることができ
る。この場合、基質として該溶液に過酸化水素を0.01〜
30.0％含ませておくことが好ましい。

表 ３ （１） ｏ−ジアニジン （２） ｏ−トリジン又はその酸塩 （３） ｏ−フエニレンジアミン又はその酸塩 （４） グアヤク （５） アドレナリン （６） フエノールフタレイン （７） フエロシアン化物 （８） ４−アミノアンチピリン、及びその誘導体又は
それらの酸塩とフエノール又はナフトール又はそれらの
誘導体との組合わせ （９） アニリン及びその誘導体 （10） ｏ−トルイジン、ｐ−トルイジン等のモノアミ
ン類 （11） ｏ−フエニレンジアミン、N,N′−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、N,N′−ジエチルフエニレン
ジアミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類 （12） フエノール、チモール、ｏ−、ｍ−、及びｐ−
クレゾール、α−ナフトール、β−ナフトール等のフエ
ノール類 （13） カテコール、グアヤコール、オルシノール、ピ
ロガロール、p,p−ジヒドロキシジフエニル、フロログ
ルシノールのようなポリフエノール類 （14） サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のよう
な芳香族の酸 （15） ロイコマラカイトグリーン、ロイコフエノール
フタレインのようなロイコ染料 （16） 2,6−ジクロロフエノールインドフエノールの
ような着色染料 （17） エピネフリン、フラボン類、チロシン、ジヒド
ロキシフエニルアラニン、トリブトフアンのような種々
の生化学物質 （18） 2,2′−アジノジ（３−エチル−６−スルホベ
ンゾチアゾリン）又はその塩、及び3,3′−ジアミノベ
ンジジンのような特殊染料 （19） その他、グアヤゴム、グアヤコン酸、ヨウ化カ
リウム、ヨウ化ナトリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並
びにビリルピンのような物質 なお、こうした発色試薬層、標識物含有層の反応層、吸
着層に対する位置関係は第４図に限定されるものではな
く、反応層における信号の測定の障害にならない限り、
任意の位置に設けることができる。第５図は発色試薬層
７、標識物含有層８を含む本発明の分析素子の別の好ま
しい１実施の態様の例である。

第６図に示した本発明の１実施の態様では、多孔性反応
層１と多孔質光反射性吸収層６の間にタイミング層９が
設けられている。この素子の上部に流体試料を適用する
と、標識物含有層８から溶出した標識物と、流体試料中
の特定成分が競合的に該反応層に不動化された特異的結
合物質と反応する。充分に該反応が完結した時点でタイ
ミング層が溶解することにより、流体試料は多孔質光反
射性吸収層に拡散し、該反応にあずからなかつた標識物
は該吸収層に不動化される。このようにタイミング層を
用いて反応層における競合反応を充分に行わせるのは分
析素子の感度を高める意味で好ましい１実施の態様であ
る。

第７図に示した本発明の１実施の態様も、同様の趣旨に
基づくものである。分析素子はａ、b2つの素子から構成
されている。流体試料をａの上面に添加して充分に反応
させた後、ｂの多孔質光反射性吸収層を密着させること
により該反応にあずからなかつた標識物を吸収するもの
である。

その他、反応層と吸収層とを、測定時にひきはがして用
いてもよい。すなわち、反応層と吸収層とを、流体試料
の適用前には、一体又は別離しておき、適用時には両者
を接触させて反応を完結させ、測定時に両者を別離して
測定を行つてもよい。

本発明の分析素子は更に、流体試料を素子に適用した際
にその展開を補助する展開層、流体試料が血液（全血）
の際に必要となることがある血球分離層、必要に応じて
設ける接着層、保護層といつた補助層を設けることがで
きる。これらの補助層及び前述の発色試薬層、標識物含
有層、タイミング層は独立して設けても良く、あるいは
複数の機能を併わせもつた層として設けても良い。これ
らの層はその機能に応じて設けられるべき位置が容易に
決定できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によつて更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１） 紙への反応性基の導入 紙No.5C〔東洋紙（株）製〕を2cm×2cmの正方形に
切り、その11gを200mlの2.5Mリン酸カリウム緩衝液（pH
12.1）に浸漬し、５゜〜10℃に冷してスターラーでかく
はんしながら100mlの臭化シアン溶液（0.05g/ml）を徐
々に加える。10分間反応させた後に該紙を取出して、
氷冷した蒸留水、0.1M炭酸水素ナトリウムで順に洗浄し
た。

（２） 反応層の作成 ヤギ抗IgG（米国カツペル社製）IgG留分0.5mg（抗体タ
ンパク量換算）を20mlの0.1M NaHCO₃−0.5M NaCl溶液に
溶解し、（１）で作成した紙10枚を加え室温で３時間
振とうする。その後紙を取出し、1Mトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0）と室温で２時間振とうする。水、0.5M酢酸
緩衝液（pH4.0）、0.5M NaHCO₃、50mMリン酸緩衝化生理
食塩水（pH7.2）で順次洗浄する。これを２％牛血清ア
ルブミン（BSA）含有50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に
一晩浸漬し、蒸留水で洗浄し、BSAのシヨ糖の水溶液を
少量含有させてから凍結乾燥した。

（３） 吸収層の作成 ヤギ抗ペルオキシダーゼ（米国カツペル社製）IgG留分
1.0mg（抗体タンパク量換算）を20mlの0.1M NaHCO₃−0.
5M NaCl溶液に溶解し、（１）で作成した紙10枚を加
え室温で２時間振とうする。その後紙を取出し、カタ
ラーゼ（米国シグマ社製）10.0mgを20mlの0.1M NaHCO₃
−0.5M NaCl溶液に溶解した溶液に浸漬し更に３時間振
とうする。その後紙を取出し、以下（２）と同様にト
リス−塩酸処理、洗浄、乾燥を行つた。

（４） 分析素子の組立て 下塗り済みポリエチレンテレフタレートのフイルム上に
前述の吸収層、反応層をこの順に１枚ずつ積層し、分析
素子を作成した。

（５） ヒトIgGの測定 ヒトIgG（米国カツペル社製）の640μg/mlから０μg/ml
の各種濃度の0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）を
用意する。別にペルオキシダーゼ標識ヒトIgG（米国カ
ツペル社製）を40μg/mlの濃度で0.01Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.6）に溶解した。

各濃度のヒトIgG液10μを（４）で作成した分析素子
各１枚の上に滴下し、続いて標識IgG液10μを同じと
ころに滴下する。37℃で20分保温した後に、ｏ−フエニ
レンジアミンを2.5mg/ml H₂O₂を0.05％含む50mMクエン
酸−リン酸２ナトリウム緩衝液（pH5.0）40μを滴下
し、10分間保温した後に492nmの反射濃度を素子上面か
ら測定した。その結果を下記表４に示す。

比較例として、１−（３）で作成した吸収層の代りに、
同じ紙を２％BSA処理〔１−（２）参照〕のみを行つ
たものを用いて、同様の分析素子を作成し、同様の方法
を用いてIgG濃度を測定しようとしたところ、ヒトIgGの
濃度変化にかかわらず、反射濃度はほとんど変化がな
く、満足な結果を与えなかつた。

実施例２ （１） ウサギ抗FITC抗体の作製 BSA50mgを5mlの0.1モル炭酸ナトリウム溶液（pH9.0）に
溶解し、2mgのフルオレセインイソチオシアナート（米
国リサーチオルガニツクス社製）を500μのジメチル
ホルムアミドに溶解して加え、遮光室温下３時間かくは
んし、セフアデツクスＧ−25カラム（フアルマシア社
製）で精製、凍結乾燥した。

これをフロイントの完全アジユバント（初回のみ）及び
不完全アジユバントと混合し、ウサギに免疫した。

得られた抗血清より硫酸アンモニウム法でグロブリン分
画を分離し、アフイニテイークロマトグラフイーでBSA
に吸着する抗体を除いた後に透析、凍結乾燥した。

（２） 着色紙への反応性基の導入 市販の染料で、紙No.5C〔東洋紙（株）製〕を黒色
に染めた後に2cm×2cmの正方形に切断し実施例１−
（１）と同様の処理を行つた。

（３） 吸収層の作成 実施例２−（１）で得た抗体を実施例２−（２）で得た
紙に、実施例１−（２）と同様の方法で不動化し、乾
燥した。

（４） 反応層の作成 実施例１−（２）と同じ方法で作成した。

（５） 標識物含有層の作成 紙No.7〔東洋紙（株）製〕を2cm×2cmの正方形に裁
断した。３％BSA含有50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）
に浸漬し、一晩放置後蒸留水で洗浄し、35℃で乾燥し
た。

FITC標識ヒトIgG（米国カツペル社製）を0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.6）に42μg/mlの濃度で溶解し、
上記紙１枚ずつにそれぞれ25μを滴下し、直ちに凍
結乾燥した。

（６） 分析素子の組立て 下塗り済ポリエチレンテレフタレートのフイルム上に前
述の反応層、吸収層、標識物含有層をこの順に１枚ずつ
積層し、分析素子を作成した。

（７） ヒトIgGの測定 ヒトIgG（米国カツペル社製）を各種濃度で含有する0.0
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）を用意する。

各濃度のヒトIgG液10μを（６）で作成した分析素子
各１枚の上に滴下し、37℃で30分保温した後に支持体側
から蛍光測定（励起波長490nm、蛍光波長520nm）したと
ころ下記表５に示す結果を得た。

また実施例２−（３）で作成した吸収層の代りに同様の
着色紙を用いて、同様の分析素子を作成し、同様の方
法を用いてIgG濃度を測定して、下記表６に示す結果を
得た。

この結果を比較すると、流体試料中のヒトIgG濃度が高
い場合、すなわち反応層において抗ヒトIgG抗体と反応
し得なかつたフリーの標識物の量が多い場合に、比較例
では反応層に残存したフリーの標識物に起因する信号
（バツクグラウンド）が大きいため、検量線の傾きが極
めてゆるやかであるのに対して、本発明の分析素子では
フリーの標識物が吸収層にスカベンジされ、更にその信
号能力を失つているため、極めて良好な検量線を与えて
いることがわかる。

実施例３ （１） 発色試薬層の作成 下引済ポリエチレンテレフタレートのフイルム上に、下
記のような組成の発色試薬層を水系塗布、乾燥により作
成した。

（２） 吸収層の作成 紙粉末Ｄ（東洋紙製）に実施例１−（１）と同様の
方法で反応性基を導入し、実施例１−（３）と同様の処
理を行つた。この紙粉末を用いて次のような組成の繊
維分散液を調製し、実施例３−（１）で作成した発色試
薬層の上に塗布乾燥した。

（３） 標識物含有層の作成 実施例２−（５）の同様の方法でベルオキシダーゼ標識
ヒトIgGを含有する標識物含有層を作成し、実施例３−
（２）で作成した吸収層の上に積層し、分析素子とし
た。

（４） 反応層の作成 平均粒径２μｍのポリ（スチレン−コ−ｎ−ブチルメタ
クリレート−コ−グリシジルメタクリレート）〔75/15/
10〕の高分子重合体粒子単位表面にヤギ抗ヒトIgG（米
国カツペル社製）グルコースオキシダーゼ及びBSAを物
理的に吸着させ、５重量％のトライトンＸ−100（ロー
ムアンドハース社製）と共に乾燥膜厚約350μｍになる
ようにポリエレンテレフレート支持体上に塗布し、42
℃、30分間乾燥を行い、成膜後、支持体からはく離し、
実施例３−（３）で作成した標識物含有層の上に接着し
た。

（５） ヒトIgGの測定 ヒトIgG（米国カツペル社製）を各種濃度で含有する0.0
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）を用意する。各濃
度のヒトIgG液10μを（４）で作成した分析素子各１
枚の上に滴下し、37℃で30分保温した後に、素子上面か
ら、492nmの反射濃度を測定した。その結果を下記表７
に示す。

実施例４ （１） 反応層の作成 実施例３−（４）と同様の粒子を、下引済光透過性ポリ
エチレンテレフタレート支持体上に塗布、乾燥した。

（２） 吸収層の作成 実施例２−（３）で作成した吸収層を実施例４−（１）
で作成した反応層の上に積層した。

（３） 標識物含有層の作成 実施例２−（５）で作成した標識物含有層を実施例４−
（２）で作成した吸収層の上に積層した。

（４） ヒトIgGの測定 実施例２−（７）と同様の方法で測定したところ下記表
８に示す結果を得た。

実施例５ （１） 吸収層の作成 実施例１−（１）と同様の方法で活性化した紙とｏ−
ジアニシジンをpH9、暗所室温で１晩反応させた。紙
を取出し、1M 1−アミノ−２−プロパノールで処理し、
水洗後乾燥した。

（２） 分析素子の組立て 実施例３−（１）で作成した発色試薬層上に実施例５−
（１）で作成した吸収層、実施例３−（３）で作成した
標識物含有層、実施例３−（４）で作成した反応層をこ
の順に積層し、分析素子とした。

（３） ヒトIgGの測定 実施例３−（５）と同様の方法で測定を行つたところ、
下記表９に示す結果を得た。

〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明の分析素子によれば、分析
素子内でB/F分離を行い、しかもバツクグラウンドやノ
イズが少なく、感度、精度及び再現性良く流体試料中の
特定成分を定量分析することができるという顕著な効果
が奏せられる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第７図は、いずれも本発明の分析素子の１実施
の態様を示す断面概略図である。 1:多孔性反応層、2:光反射性吸収層、3:支持体、4:光透
過性支持体、5:マウント、6:多孔質光反射性吸収層、7:
発色試薬層、8:標識物含有層、9:タイミング層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石川 匡代 東京都日野市さくら町１番地 小西六写真 工業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭58−18167（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】流体試料中の特定部分を、該特定成分と特
   異的に結合し得る物質と、該特定成分又はその類縁体と
   標識とが結合した標識物との競合反応によつて測定する
   ための分析素子において、その構成員として、該特定成
   分と特異的に結合し得る物質を不動化した担体を含有す
   る層状体と、該標識物中の標識部分と特異的に結合する
   ことにより該標識に起因する信号を少なくとも減ずるこ
   とができる物質を不動化した担体を含有する層状体とを
   包含してなることを特徴とする分析素子。