JPS62267667A - 免疫学的分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分計素子に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析するた
めの分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に極微虫含有される物質を検出する
方法として、各種分析法が開発されてきた。その分析法
は、主として免疫反応をその原理とする測定法であって
、種々のものが知られているが、最も精度の高いものと
して、免疫測定法がある。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標識
したウシインンユリンと糖尿病患者血清中の抗インシュ
リン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定するこ
とに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられてい
る。

これ以後標識化合物として、更に放射性同位元素以外の
ものが種種開発されてきた。他の標識化合物としては例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテ
リオファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が
挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、［Ｂ］と略記する）と起
さなかった物質（以下、［Ｆ］と略記する）の分Ｍ（以
下、［Ｂ　］／　［Ｆ　］分離と略記する）がある。

従来、免疫測定法における問題点を解決するために各種
の方法が開発されてきた（例えば、特開昭５３−３８６
１９号、同５３−７９０２４号、同５５−９０８５９号
、同５Ｔ−６７８６０号、同５７−２００８６２号、同
５１１−１８１６７号、同５９−７７３５６号及び同５
９−１７０７６８号各公報参照）。

しかし、これらの方法は、［Ｂ］／［Ｆ］分離が不完全
である、ノイズが多く信号の信頼度に問題がある、測定
可能な物質が低分子物質に限られる等の欠点があった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、ウェット・ケミストリーにおいて、固定相を用い
た競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特
開昭５８−２０９９９４号及び同５９−２０２０６４号
各公報参照）。

しかしそれらの測定法では、比較的多量の水溶液中にお
いて、担体に固定相を分離して固定した２種の物質と溶
液中の物質との競合反応を行っているため、意図とした
結合を起こすことなく溶液中に残存する物質が多く、し
かも両固定相を区別することなく全体の酵素活性を測定
しているため、バックグランドやノイズの問題から、感
度、精度及び再現性について満足な結果が得られない。

他方、ドライ・ケミストリーにおいて、第２抗体を用い
る免疫測定法が開発されている（特開昭５７−８２７７
８号及び同５７−８２７６７号各公報参照）。

しかし、これらは、操作が煩雑であること、再現性の良
い展開を行う技術が必要であること等改良の余地がある
。更に、特開昭５９−３４１５５号公報記載の発明では
、未結合物収納シートを用いる方法が開示されている。

しかし、この方法でも反応用シートと未結合物収納シー
トとを密着させたままで測定を行おうとすると前述した
問題が生じ、また測定時に両シートを分離するのは煩雑
であり、特に測定を自動化する際障害となる。

本発明は前述の従来技術の欠点を改良するためになされ
たものであり、その目的は分析素子内で積極的な［Ｂ　
］／　［Ｆ　］分離を行い、しかもバックグランドやノ
イズが少なく、感度、精度及び再現性に優れた、流体試
料中の特定成分を定量するための分析素子を提供するこ
とにある。

〔問題点を解決するための手段〕

前記した本発明の目的に沿って種々検討を重ねた結果、
流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａまたはその類
縁体と特異的に結合する物質Ｂを用いて測定するための
、少なくとも一層の多孔質反応層を有する分析素子に於
て、該物質Ｂと特異的に結合するが特定成分Ａとは結合
しない物質Ｃ並びに標識物質りと特異的に結合し且つ該
結合によって該標識物質りに起因する信号を変調させる
物質Ｅとを担体に固定して前記多孔質反応層の少なくと
も一層に含有したことを特徴とする免疫学的分析素子を
形成することによって本発明の目的は達成される。

更に構成の態様としては、特定成分Ａと特異的に結合す
る物質Ｂが多孔質反応層に含有されろことが利便であり
、更に流体試料中に存在せしめｌ、・標識物質りと特定
成分Ａまたはその類縁体とを結合させた標識体Ｆと前記
物質Ｂとの競合反応を行わせることにより所謂［Ｂ　］
／　［Ｆ’　］分離を簡便、確実且つ精密に行うことが
できる。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しろる流体試料中での特定成分Ａとは
、その存在又はその流体試料中での量″測定され、その
特定成分に特異的に結合する物質がありうる物質又は物
質群である。すなわち、ポリペプチド、タンパク質、複
合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモ
ン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられ
る。具体的には、下記の物質、または物質群を挙げるこ
とができるが、これらに限定されるものではない。

〈タンパク質、複合タンパク質〉 プレアルブミン、アルブミン、Ｃ１−酸性糖タンパク質
、Ｃ１−アンチトリプシン、Ｃ１−糖タンパク質、トラ
ンスコルチン、α、−アンチキモトリプシン、Ｃ１−リ
ポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セルロブラ
スミン、Ｚｎ−α、−糖タンパク質、Ｇｃ−グロブリン
、インター−α−トリプシンインヒビター、Ｃ１−マク
ログロブリン、α、−Ｈ９−糖タン（くり質、α、−マ
クログロブリン、ハプトグロビン、α、−リポタンパク
質、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタンパ
ク質、β、−糖タンパク質、β、−マクログロブリン、
Ｃ−反応性タンパク質、ミオグロビン、エリトロマイシ
ン、免疫グロブリン　（ＩｇＧ、ＩｇＭ。

ＩｇＡ　、　ＩｇＤ、ＩｇＥ　）、補体系成分（Ｃ＋ｑ
、Ｃ＋ｒｓＣＩＳＳＣｔ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ８、Ｃ
７、Ｃ８、Ｃ０、等）フィブリノーゲン、ヘモグロビン
、グリコヘモグロビン、血液凝固因子、ＨＢｓ抗原、Ｈ
Ｂｓ抗体、酵素（例えば、酸性ホスファターゼ、アルカ
リ性ホスファターゼ、アルカリ性ボスファターゼアイソ
エンザイム、α−アミラーゼ、アミラ、ゼアイソエンザ
イム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチン
ホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソエン
ザイム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）、乳酸
脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザイム、γ−Ｇ
ＴＰ、リパーゼモノアミンオキシダーゼ、ロイシンアミ
ノペプチダーゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素酵素等）等。

くホルモン及びホルモン様物質〉 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡｃＴＨ）、メラニン刺
激ホルモン（ＭＳＨ）、バリブレラシン、オキシトシン
、インシュリン、グルカゴン、アンギオテンシン１及び
■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セロトニ
ン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ４）、トリヨー
ドサイロニン（Ｔ　３）、ガストリン、コルチゾール、
アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン、プロゲ
ステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロピン、胎
盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子（ＴＲＨｌ
ＦＳＨ−ＲＨ，ＣＲＨ，ＬＨ−ＲＨ等）等。

〈ビタミン類〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１ビタミンＢ３、ビタ
ミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ１ビタミンＤ１
ビタミンＥ１　ビタミンに１葉酸等。

〈腫瘍マーカ〉 α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、臓癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、Ｍ
−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原（
ＣＡ　１９−９、ＣＡ　１２５等）、ガングリオサイズ
。

〈各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コディン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルク酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、カロイマイシン、クロラムフェニコール、ク
ロロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマ
イシン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミ
キシン８１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド
、フェノバルビタール、プリミドン、セコバルビタール
、アセタミノフエン、アミカシン、アミシリブチリン、
カルバマゼピン、ノボキノン、シソピラミド、リドカイ
ン、メソトレキセート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、
フェニトイン、プロカイナミド、プログラ１０−ル、デ
オフイリン、カナピノール、テトラヒドロカナピノール
、コリン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチ
ロフェノン、カフェイン、クロロブロマノン、エピネフ
リン、グリセオフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、
メペリジン、メブロバメート、メタトン、ナルセイン、
ノルトリブチリン、オキサゼパン、パパベリン、プロス
タグランジン、テグレトール、バルプロン酸等及びこれ
らの代謝産物。

〈微生物表面マーカ〉 バクテリア抗原、　　菌類抗原 寄生虫抗原、　　　　　ウィルス抗原。

〈農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

くその他〉 血液型物質、カルシオリピン、アレルゲン、本発明に使
用しうる流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合する物
質Ｂ及び該物質Ｂと特異的に結合する物質Ｃとしては、
抗体、抗原、レクチン、プロティンＡ、特定酵素の阻害
物質などが挙げられるが、測定対象によって種々選択さ
れる。該特定成分Ａと物質Ｂの特異的結合反応が抗原−
抗体反応である場合が好ましい。またこの場合物質Ｃと
しては、抗体、プロティンＡが好ましい。

本発明で使用する抗体は、その由来を特に限定されるも
のではなく、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られ
る抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知の方
法である（右田俊介編「免疫化学」中山書店第７４〜８
８頁参照）硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈
殿法、セファデックスゲルによるゲル濾過法、イオン交
換セルロールクロマトグラフィー法、電気泳動法等で精
製して用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウ、ス）
Ｉｌｆ！臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種
細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつ
くっても良い。

また、これらの抗体はＩｇＧＳＩｇＭ、　ＩｇＡ　　Ｉ
ｇＤ、ＩｇＥ各分各企画いることができ、あるいはこれ
らの抗体を酵素処理してＦ　ａｂ、　Ｐ　ａｂ’又はＦ
（ａｂ’）といった活性抗体フラグメントにして使用し
てもよい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数
の抗体を組み合わせて使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合する物質Ｂとし
て抗体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定原
理は免疫測定法に属しその反応型式としては、競合法、
２抗体法、サンドイツチ法があげられる。本発明の分析
素子は免疫測定法において特に好ましく使用できるので
、以下免疫測定法を例にとって本発明の詳細な説明する
が、本発明はこの説明内容に限定されるものではなく、
種々の応用が可能であることは以上に述べてきた内容か
らも明らかである。

本発明に適用しうる標識物質りとしては、例えば、酵素
、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物
質（酵素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を
活性化する物質など）、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物
質などが挙げられ、その代表的な例としては下記に示し
た物質を挙げろことができる。好ましくは下記に開示さ
れた酵素及び蛍光物質が用いられる。更に好ましくは、
下記に開示された酵素である（これらの標識物質に起因
する信号については後述する。）標識物質の具体例： ！、酵素 ＥＣ１，１，１，１アルコールデヒドロゲナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ １．１．１．８　　　グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤ＋） １．１．１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．３７　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼＬ、１．１．
４０　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ”） Ｌ、１．１．４７　　　グルコースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４８　　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ １．１．１．４９　　　グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ １．１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム） １、ＩＪ、ｌ　　　グリコール酸オキンダーゼ１．１．
３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１．３．４　　　グ
ルコースオキシダーゼ１．１．３．６　　　コレステロ
ールオキシダーゼ１．１．３．９　　　ガラクトースオ
キシダーゼ１．１．３．１７　　　コリンオキシダーゼ
１．１．３．−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ １．２．１．１　　　ホルムアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ １．２．１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １．２．３．２　　　キサンチンオキシダーゼ１．２．
３．３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２．３．４　
　　オキサル酸オキシダーゼ１．３．３．−　　アシル
ＣｏＡオキシダーゼ１．４．１．１　　　アラニンデヒ
ドロゲナーゼ１．４．１．３　　　　グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（ｐ）”） １．４．１．４　　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ＮＡＤＰ”） １．４．３．２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．４
．３．３　　０−アミノ酸オキシダーゼ１．４．３．４
　　　アミンオキシダーゼ（フラビン含有） １．４．３．６　　７ミンオキシダーゼ（Ｍ　含有）１
．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ １．５．３．１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．６．
４．２　　　グルタチオンレダクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
（ｐ）Ｈ） １．６．４．３　　　ジヒドロリボアミドレダクターゼ
（ＮＡＤ”）（ノアホラーゼ） １．７．３．３　　　尿酸オキシダーゼ１．１１．１．
６　　カタラーゼ １．１１．１．７　　ペルオキシダーゼ１．１３．１２
．４　　乳酸−２−モノオキシゲナーゼ １．１３．１２．５　　Ｒｅｎｉｌｌａルシフェリン−
２−モノオキシゲナーゼ １．１３．１２．６　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリ
ン−２−モノオキシゲナーゼ １．１３．１２．７　　Ｐ　ｈｏｔｉｎｕｓルシフェリ
ン−４−モノオキシゲナーゼ （ＡＴＰ加水分解） １．１４．１３．２　４−ヒドロキシ安息香酸３−モノ
オキシゲナーゼ １．１４．９９．２１　　Ｌ　ａｔｉａルシフェリンモ
ノオキシゲナーゼ ２．１．３．１　　　メチルマロニルＣｏＡカルボキン
トランスフェラーゼ ２．３．２．２　　　　γ−グルタミルトランスフェラ
ーゼ ２．７．１．Ｌ　　　ヘキソキナーゼ ２．７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７．１．１５　　　リボキナーゼ ２．７．１．２８　　　トリオキナーゼ２．７．１．４
０　　　ピルビン酸キナーゼ２．７．５．１　　　ホス
ホグルコムターゼ３．１．１．３　　　アリルエステラ
ーゼ３．１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ。

３．１．１．７　　　アセチルコリンエステラーゼ３．
１．１．８　　　コリンエステラーゼ３．１．１．３　
　　アリルエステラーゼ３．１．１．４　　　ホスホリ
パーゼＡ。

３．１．１．７　　　アセチルコリンエステラーゼ３．
１．１．８　　　コリンエステラーゼ３．１．３．１　
　　アルカリホスファターゼ３．１．３．２　　　酸ホ
スファターゼ３．１．３．９　　　グルコース−６−ホ
スファターゼ ３．１．３．１１　　　フルクト−スジホスファターゼ ３．１，３．２１　　　グリセロール−１−ホスファタ
ーゼ ３．１．４．１　　　ホスホジェステラーゼＩ３．１．
４．３　　　ホスホリパーゼＣ３，２，１，１α−アミ
ラーゼ ３．２．１．２　　　　β−アミラーゼ３．２．１．１
７　　　ライゾザイム ３．２．１．１８　　　ノイラミニダーゼ３．２．１．
２０　　　α−Ｄ−グルコシダーゼ３．２．１．２１　
　　β−Ｄ−グルコングーゼ３．２．１．２３　　　β
−Ｄ−ガラクトノダーゼ３．２．１．３５　　　ヒアル
ロノグルコサミニダーゼ ３．４．１１．６　　　アルギニンアミノペプチダーゼ ３．４．２２．４　　　プロメライン ３．５．１．１　　　アスパラギナーゼ３．５．１．５
　　　ウレアーゼ ３．５．４．２　　　アデニンデアミナーゼ３．５．４
．４　　　アデノシンデアミナーゼ３．５．４．８　　
　ＡＭＰデアミナーゼ４．１．１．３　　　オキサロ酢
酸デカルボキシラーゼ ４．１．１．４１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ ４．１．２．１３　　　フルクトースニリン酸アルドラ
ーゼ ４．２．１．２０　　　トリブトファンシンセダーゼ５
．３．１．９　　　グルコースリン酸イソメラーゼ ６．３．４．１４　　　ビオチンカルボキシラーゼ６．
４．１．１　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４．
１．２　　　アセデル−ＣｏＡカルボキシラーゼ ６．４．ＩＪ　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ（ＡＴＰ−加水分 解） ６．４．１．４　　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ ６．４．１．５　　　ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ ２、　基質（発光物質を含む） ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドＯ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド４−メチルウンベリフ
ェロン−β−Ｄ−ガラクトシド ｐ−ニトロフェニルホスフェート コルチゾール−２１−ヘミスクシネート　ウンベリフェ
ロン　コンジュゲート ルミノール イソルミノール Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ルヘミスクシンアミド Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノー
ル Ｎ−（４−アミノブチル）＝Ｎ−エチルイソルミノール ルシゲニン アクリジニウム　フェニルカルボキシレートロフィン ピロガロール 没食子酸 シロキシン ビス（２，４，６−ドリクロロフエニル）オキサレート
及びその誘導体 ３、　酵素阻害物質 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルドファイア（ｗｉ　ｌｄｆ　１ｒｓ）ブルーデキ
ストラン ０−ジアニシジン−セルロース Ｏ−ジアニシジン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリシン アミノアセトニトリル ２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル −１，３’−カルボキシ−３′−アミノ−１′−プロペ
ニル−ｌエーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−トランス−３−ブテン
酸 エタノールアミン−〇−サルフェート アルビシイン アザセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソノアノルバリン Δ３−７−アミノセファロスポリン酸 ミモシン ２−アミノ−４−ペンチン酸 ２−アミノ−４−クロロ−４−ペンテン酸５−７ミノイ
ソ７タル酸 ３，３−ジクロロアラニン ３．３．３−トリクロロ７ラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 Ｎ、Ｎ−）ツメチル−２−プロピニルアミンβ−７ミノ
プロビオニトリル ２−ブロモエチルアミン ３−デシノイル−Ｎ−アセチルシステアミン２．３−デ
カシイノイル−Ｎ−７セチルンステアミン β−クロロ−し−アラニン Ｌ−セリン−〇−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン γバクリン ５−ニトロ−し−ノルバリン Ｎ−ペンシル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン３−
ツメチルアミノ−１−プロピン グリセロール シイソブロビルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフル第２イドク２プラン酸 アロプリノール ブチルチン ヨード酢酸 ヨード７セトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロ７ランとその誘導体 ニドａベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 キレート化剤 フェニル水銀とその誘導体 ４、　補＃素・補欠分子族 ＦＡＤ（７ラビン・アデニン・ジスクレオチド） Ｆ　Ｍ　Ｎ　（７ラビン、モノヌクレオチド）ヘム Ｓ−７デノシルメチオニン ＴＨＦ（テトラヒドロ葉Ｗ１） ＴＰＰ（チアミンニリン１Ｍり ＣｏＡ（補酵素　Ａ） ＵＤＰ−Ｇｌｃ（ウリノンニリン酸グルコース）ＰＬＰ
（ピリドキサールリン酸） ＡＴＰ（アデノシン三リン酸） ビオチン Ｃｏｔにコチンアミドアデニンシヌクレオチド） Ｃｏｉｌ　にコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸） アデノシルコバラミン メチルフパラミン ＣｏＭ（２，２’−ノチオノエタンスルホン酸）ＣｏＱ
（ユビキノン） ５、　アポ酵素 プａＪ　ｄ　ｎ−ａ番φすＳ亭晶讐専 ７ボチトクローム還元酵素 ７ボＮＡＤＰＨデヒドロデナーゼ アポグルコース・オキシダーゼ アポリボアミド・デハイドロデナーゼ アボピリドキシン・ホスフェート・オキシダーゼ アポペルオキシグーゼ アポチトクロームＣ アポキサンチンオキシグーゼ アポ酵母乳酸デヒドロゲナーゼ ７ボサルコシンオキシダーゼ ７ボｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ ７ボ７シルーＣｏＡデヒドロデナーゼ ７ボジヒドロリボ酸デヒドロデナーゼ ７ボコ八り酸デヒドロゲナーゼ ７ボホモシステインメチルトランス７エラーゼ ７ボグルタミン酸ホルミルトランス７エラーゼ アポトランスケトラーゼ ７ポコリンアセチルトランス７エラーゼアボグリコーデ
ンシンターゼ アボ７ラニンアミノトランス７エラーゼアポへキソキナ
ーゼ ６、　酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロペブチグーゼ ストレプトキナーゼ プロティンキナーゼ ＃素前駆体の各種プロテアーゼ ７、　酵素前駆体 トリプシノーゲン キモトリプシ／−デン プロコリパーゼ プロホスホリパーゼ プロレニン プロ力ルポキシペプチグーゼＡ プロ力ルポキシベプチグーゼ・Ｂ キニノーゲン プロエラスターゼ ７ンギオテンシノーデン プロインシュリン プロパラチロイドホルモン プログルカゴン プロコラーグン（可溶性） ｌＩｌ集因子　訂、立、χｍ プロエラスターゼ プロココーナーゼ プレカリクレイン ベプシノーデン プラスミノーダン フイブリノーゲン プロトロンビン ブラスミノーデンプロ７クチベータ プロ７クロジン ８、　を光物質 フルオレセイン　イソチオシアナート （ＦＩＴＣ） テトラメチルローダミン　インチオシアナ−）（ＴＲＩ
ＴＣ） ローダミンＢ　イソチオシアナート （ＲＢＩＴＣ） リサミンローダミン−Ｂ２００スルホリ！し　クロライ
ド（ＲＢ２００ＳＣ） ウンベリフェロン ４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）フルオレセイン
チオフルバミル（ＦＴＣ）フルオレセインチオカルバミ
ル−ジフェニルグリジン（ＦＴＣ−ＤＰＧ） テトラメチルローダミン（Ｔ　Ｍ　Ｒ）５−（（４，６
−ノクロロト１７７ジンー２−イル）−７ミノ〕フルオ
レセイン ツメチルアミツナ７タレンー５−スルホニルクロライド フルオラム ２−メＦキシー２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−７ラ
ノン（Ｍ　Ｄ　Ｐ　Ｆ　） ７−クロロ−４−二トロベン／−２−オキサ−１，３−
ジアゾール（ＮＢＤ−ＣＩ＞（Ａ　Ｎ　Ｓ　） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド（ＮＰＭ）Ｎ−（７−
ノメチル７ミノー４−メチル−２−オキシ−３−クロロ
メチル）−マレイミ　ド（ＤＡＣＭ） Ｎ−（　ｐ　−　２−ペンズイミグゾイルーフェニル）
−マレイミド（ＢＩＰＭ） アントラセンイソチオシアナート フルオロアンチルマレイミｌ’（ＦＡＭ）希土顕元素を
含む各種キレート及びそれらの誘導体 本発明の測定方法で使用される特定成分Ａまたはその類
縁体の標識物質りとの結合物、または物質Ｂとの結合物
は、前記物質のｖｆ５％的に結合する能力及び標識物質
の信号を発する能力を保持したまま化学的手段等で、直
接または間接的に両物質を結合することによって得られ
る。これらの結合物は、島業者間で良く知られでいる公
知の試薬と公知の方法で結合させることｌこより得るこ
とかで島、更に（　ｈ　ｌ−　（言テぼγ用学治．河へ
　虫−官井　点線「酵素免疫測定法（第２版）」（医学
書院、１９７８年刊）や日本臨床病理学会編「臨床病理
」臨時増刊待果第５３号「臨床検査のためのイムノアッ
セイ−技術と応用−」（臨床＃Ｉ埋刊行会、１９８３年
刊）などに記載された方法を参考にすることができる６
本発明の理解を助けるため以下に具体的方法例を挙げる
が、これは本発明を限定するものではない。

（１）互に結合させようとする物質を下記のような架橋
剤と反応させる方法。

■　２．４．６−）リクロロ−１，３，５−）リアジン
■　４，４′−ジフルオロ−３，３′−ジニトロジフェ
ニルスルホン ■　トルエン−２，４−ジイソシアナート■Ｎ、Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド■　１−（３−ツメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボッイミド ■ビスシタシー０−ジアニンジン ■グルタルアルデヒドなど （２）互いに結合させようとする物質のうち少なくとも
どちらかが糖鎖を有している時、該糖鎖を過ヨウ素酸で
処理し、生じたアルデヒド基を結合すべき相手物質のア
ミノ基と反応させる方法。（必要に応じて、過ヨウ素酸
処理の際の不要な結合の形成を阻止するために１−フル
オロ−２，４−ジニトロベンゼン等で互いに結合させよ
うとする物質の一方を前処理しておくか過ヨウ素酸処理
反応のｌ）Ｈを４〜５に制御する、あるいは互いに結合
させようとする物質の間で形成されたシッフ塩基による
結合を、水素化硼素ナトリウムやエタノールアミン等で
処理し安定化する、といった処置をとってもよい。）（
３）互いに結合させようとする物質がチオール基を有し
ているか、あるいは還元等によりチオール基を生ずるあ
るいは適当な化合物で処理することによりチオール基を
導入できる場合、マレイミド試薬として知られている種
々の架橋剤と該チオール基と反応させる方法。（ここで
チオール基を導入する化合物としては次のような例が挙
げられる。

■　無水　Ｓ−アセチルメルカプトスクシン酸■　メチ
ル−３−メルカプトプロビオンイミダート ■　メチル−４−メルカブトブチルイミダート■　２−
イミノチオラン ■　３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル■　メチル３−（４’
−ジチオピリジル）プロピオンイミダートなど また、前述のマレイミド試薬としては次のような例が挙
げられる。

■　Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ
’−１）−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ’　　　
ｍ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ’−オキシジメ
チレンシマレイミド■　Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−マ
レイミドアセタート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ’−マレイミド）
ブチラード ■　Ｎ−スクシンイミジル−５−（Ｎ−マレイミド）へ
ブタノアート ＯＮ−スクシンイミジル−８−（Ｎ−マレイミド）ヘキ
サノアート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード ［株］　Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド
）ベンゾアート ■　Ｎ−スクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフェ
ニル）−４−ブチラード ｏ　Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード ［相］　Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレ
イミド）ベンゾアート ■　Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ　　（Ｎ−マレイ
ミドフェニル）−４−ブチラード６Ｎ−スクシンイミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）ベンゼン−１−カル
ボキシラード など （４）互にい結合させようとする物質にピリジル・ジス
ルフィド基を導入し結合すべき相手化合物に導入した、
あるいはもともと存在するチオール基と反応させる方法
。（チオール基のピリジル・ジスルフィド基への変換は
、４．４’−ジチオジピリジンなどにより行うことがで
きる。）（５）互いに結合させようとする物質に存在す
るまたは導入したアミノ基又はチオール基と、ｐ−ベン
ゾキノリンを反応させろ方法。

（６）　モノヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを、互いに結合させようとする物質に存在する
または導入したチオール基に反応させる方法。

本発明に使用する標識物質りと特異的に結合して、該標
識物質に起因する信号を変調させる物質Ｅは、使用する
標識物質に対応して選ばれるべきものであり、下記のよ
うな物質を例に挙げることができる。

１、標識物質が「酵素」である場合 ・標識物質に起因する信号 該酵素活性による基質の減少、生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該酵素に対する阻害剤（前述した阻害物質から該酵素に
対応するものを選んで使用できる。） 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの。

２１．標識物質が「酵素基質」である場合・標識物質に
起因する信号 該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。

該基質を不可逆的阻害剤として取り込む酵素。

該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの。

３、標識物質が「補酵素」又は「補欠分子族」である場
合 ・標識物質に起因する信号 分析素子中に添加された該標識物質を必要とする酵素の
反応による基質の減少、生成物の増加、及びそれらに起
因する変化、・好ましい物質Ｅ 該標識物質に対する抗体で、該標識物質に結合してその
活性に影響を与えるもの、該標識物質を吸収又は消費す
るが、その活性により本来検出しよう゛としている信号
を発しないもの。

４、標識物質が「アポ酵素」である場合・標識物質に起
因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の吸収
物質と結合して酵素活性を発現し、その活性に上る基質
の減少、生成物の増加及びそれらに起因する変化を測定
できる。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質の酵素活性を発現させる補欠分子族（匍述し
た補欠分子族から該標識物質に対応するものを選んで使
用できる）。

５、標識物質が「酵素前駆体を活性化させろ物質」であ
る場合 ・標識物質に起因する信号 該標識物質が、分析素子中に添加された酵素前駆体を活
性化し、その活性による基質の減少、生成物の増加、及
びそれらに起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該物質に対する抗体で、該物質に結合し。

てその活性に影響を与えるもの。

該物質が酵素である場合、その阻害剤。

６、標識物質が「酵素前駆体」である場合・標識物質に
起因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の吸収
物質にいったん結合後分子の一部が切断され酵素活性を
発現し、その活性による基質の減少、生成物の増加及び
それらに起因する変化を測定できる。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質の酵素活性を発現さ物質。

７、標識物質が「蛍光物質」である場合・標識物質に起
因する信号 該蛍光物質に励起光をあ・てた際に発する蛍光。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質に対する抗体及びその誘導体で、該標識物質
の蛍光波長・強度を変化させるもの。

上記の各種物質の具体例はいずれも当業者によく知られ
ており、あらためて開示するまでもないが本発明に理解
を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
フェニル水銀誘導体とＳ　Ｈ酵素（グノノコースオキシ
ダーゼ、コリンオキシダーゼ、グリコール酸オキシグー
ゼ、グリセロール−３−リン酸ジヒドロゲナーゼ、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタル酸デヒドロゲナーゼ、
乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、など）、イソフタル酸誘導体とグルタル酸
デヒドロゲナーゼ、α−アミラーゼとアミラーゼインヒ
ビター、エステラーゼとベスタチン、ビオチン酵素（ピ
ルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルＧｏ−Ａカルボキ
シラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メ
チルマロニル−ＣｏＡカルボキシラーゼなど）とアビジ
ン、ペルオキシダーゼとＯ−シアニジン−デキストラン
、乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキシル−３−ブチン酸
、モノアミンオキシダーゼとＮ、Ｎ−１リメチル−２−
プロピニルアミン又はβ−アミノプロピオニトリルなど
が挙げられ、更にジャーナルオブ　ジ　アメリカンケミ
カルソサイティー（Ｊ　、Ａ　ｍ、ｃ　ｈｅｍ、　Ｓ　
ｏｃ）第８０巻、第４５６頁（１９５８年）：同第８２
巻、第５９６頁（１９８０年）：アカウンツ　オブケミ
カル　リサーチ（Ａ　ｃｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ）第
９巻、３１３頁（１９７６年）：サイエンス（Ｓ　ｃｉ
ｅｎｃｅ）第１８５巻３２０頁（１９７４年）：化学工
業１９８５第２１頁（１９８５年）などに記載された、
若しくは引用された酵素・阻害剤の組合せも好ましく用
いることができる。

本発明における多孔質反応層とは、該特定成分Ａと物質
Ｂとの特異的結合反応、該反応によって生成した結合物
と物質Ｃとの特異的結合反応及び標識物質りと物質Ｅと
の特異的結合反応を行なう層であり、標識物質と特異的
に結合し該標識物質に起因する信号を変調させる物質Ｅ
および物質Ｂと特異的に結合する物質Ｃは、少なくとも
一層からなる多孔質反応層の少なくとも一層に固定化さ
れている必要がある。また、反応時間中流体試料を保持
するために、反応層には、流体試料と自由に接触し得る
相互連絡空隙孔（短径５μｍ〜３００μｍが好ましい）
を有する多孔性構造が存在していることが必要である。

上記の条件を満たしていれば、該多孔質反応層の素材は
特に限定されない。

好ましい例としてはサイズ１０万至３５０ミクロンの粒
状体あるいは４０万至４００メツシユの繊維から１つ以
上選ばれた素材により構成される構造体が挙げられる。

該粒状体の材料としては、ケイソウ土、二酸化チタン、
硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、
ケイ砂、ガラス、ンリカゲル、架橋デキストラン、架橋
ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロース、各
種合成樹脂（ポリスチレンなど）などの他、次の・よう
な反応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げ
られる。

例示化合物 （１）ポリ（スチレン−コーグリシジルメタクリレート
）　（９０／１０　）。

（２）ポリ（スチレンーコーメヂルアクリレートーコー
グリンノルメタクリレート） （８Ｇ／１５１５　）。

（３）ポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルメタクリレート
−コーグリシジルメタクリレート）（７５／１５／１０
　）。

（４）ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロライド
ーコーグリシジルメタクリレート）（８０／ＩＱ／ＩＱ
　）。

（５）ポリ（スチレンーコージビニルベンゼンーコーグ
リシジルアクリレート） （９０／２／８　）。

（６）ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コーグリシジルメタ
クリレート）　（９０／１０　）。

（７）ポリ（メタクリレート−コーグリシジルメタクリ
レート）　（８０／２０　）。

（８）ポリ（スチレンーコ＝Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエ
チルメタクリレート）（９５１５）。

（９）ポリ（スチレンーコーアジリジルエチルメチクリ
レート）（９５１５）。

（ｌＯ）ポリ（スチレンーコーメチルアクリレートーコ
ーアクロレイン）（９０１５１５）。

（１１）ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（９５
１５）（１２）ポリ（スチレンーコービニルチオール）
（９５１５）（１３）ポリ（スチレンーコーメチロール
化アクリルアミ　ド）（９５１５）。

（１４）ポリ（スチレン−ツーｔ−ブチルアクリレート
−グリシジルメタクリレート）　（９０１５１５）（１
５）ポリ（スチレンーコービニルイソシアネート）（９
５１５）。

（１６）ポリ（メチルアクリレートーコースチレンーコ
ーＮ−メチロールアクリルアミド）（５Ｑ／３５／１５
　）。

（１７）ポリ（スチレンーコーグリシジルメタクリレー
トーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエヂルメチクリレート
）　（９０１５１５）。

（１８）ポリ（スチレンーコーメタクリル酸−コーアク
リルアミド’）　（９５／２／３　）。

（１９）ポリ（スチレンーコーＮ−メチロールアクリル
アミドーコーアクリル酸メトキンエチル）　（９０１５
１５）。

（２０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーＮ−メチロー
ルアクリルアミドーコーアクリル酸）（９０／８／２　
）。

（２１）ポリ（メチルメタクリレートーコーグリシノル
メタクリレートーコーｔ−ブチルアクリレート）　（８
０／１Ｇ／１０　）。

（２２）ポリ（スチレンーコーｐ−ビニルベンジルクロ
ライドーコーアクリル酸−コーアクリル酸ウレイドエチ
ル）　（７５／１Ｇ１５／ｌｏ　）。

（２３）ポリ（スチレンーコーメタクロレインーコーα
−ヒドロキシエチルメタクリレート） Ｃ９０１５１５）　。

（２４）ポリ（スチレンーコーアクロレインーコーアセ
トアセトキシエチルメチクリレート） （８５１５／１０　）。

（２５）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミン
エヂルアクリレートーコ〜ビニルスルホニルエチルメタ
クリレート）　（９Ｇ１５１５　）。

（２６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミノスチレ
ンーコービニルスルホニルエチルメタクリレート’Ｉ　
Ｃ３５／１０１５　）　。

（２７）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノ
エチルメタクリレート）　（９０／１０　）。

（２８）ポリ（スヂレンーコーアクリル酸）（９７／３
）。

（２９）ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）　［９
７／３３゜（３０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコー　
ｔ−ブチルアクリレート）〔９５１５〕。

（３１）ポリ（メチルアクリレートーコーメタクリルア
ミ　ド）　（９５１５）。

（３２）ポリ（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリル
アミ　ド）（９５１５）。

（３３）ポリ（ｐ−ビニルベンジルクロライドーコーＮ
−メチロールアクリルアミド）１１９６／４］。

（３４）　　ポリ（スチレンーコーイタコン酸’）　（
９８／２　）。

（３５）　　ポリ（スチレン−コーヒーブチルアクリレ
ート）（９２／８）。

（３６）　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーアクロレイン）’（３０／６５１５　）。

（３７）ポリ（メチルメタクリレートーコースチレンー
コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレ−）　）　［２５
／７０１５　）。

（３８）　　ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエ
チルアクリレート）〔８０／２０〕。

（３９）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルア
ミノエチルアクリレート）　（９０／１０　）。

（４０）　　ポリ（スチレンメチルアクリレートーコー
アセトアセトキシエチルアクリレート）（９０１５１５
）。

（４１）ポリ（スチレンーコーメタクリル酸＞［９５１
５］。

各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることらで
きる。

また、本発明に係る多孔質反応層に用いる繊維としては
、パルプ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キト
サン、セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅ア
ンモ゛ニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６ロ
ーナイロン、６１０−ナイロンなど）、ポリエステル（
ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオレフィン（
ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿な
どの植物性、動物性、鉱物性１合成、半合成、再生繊維
を用いることができ、あるいはこれらを混合して用いて
も良い。あるいは別の態様としては吸水性の洋紙、和紙
、濾紙、プラッシュポリマーあるいはガラス繊維、鉱物
性繊維（石綿など）、植物性繊維（木綿。

麻、バルブなど）、動物性繊維（羊毛、絹など）、合成
繊維（各種ナイロン、ビニロン、ポリエチレンテレフタ
レート、ポリプロピレンなど）、再生繊維（レーヨン、
セルロースエステルなど）などを単独あるいは混合して
製造した織物、不織布、合成紙などを該多孔質反応層に
用いることもできる。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は製膜することにより、流体試料と自
由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が存
在する多孔質反応層を形成する。自己結合性を有しない
粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で
製膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８号
、同５５−９−０８５９号、同５７−６７８６０号各公
報の方法を適用することができる。自己結合性を有する
有機ポリマー粒子は特開昭５７−１０１７６０号、同５
７−１０１７６１号、同５８−７０１６３号各公報に記
載の方法により同様に製膜できる。繊維又は繊維及び粒
子の混合物については特開昭５７−１２５８４７号、同
５７−１９７４６６号公報に記載された繊維分散液を塗
布することにより多孔質反応層を形成できる。また特開
昭６０−１７３４７１号公報で行なわれている方法のよ
うにゼラチンやポリビニルピロリドンのような水溶性バ
インダーを使用した繊維分散液を塗布することも可′能
である。このような分散液を製造するためには、多くの
方法を単独または組合わせて用いることが可能である。

例えば有用な方法の一つとして界面活性剤を液体キャリ
ヤーへ添加し粒状体および／又は、繊維の分散液中にお
ける分布および安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、１、イ８
．■ｘ　−１００（。−エアアト２、−８社製１オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール）サーファクタン
トＬＯＧ☆オリーン社製；ニルフェノキンポリグリシド
ール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、粒状体および／又は繊維の重量に対して１
０重量パーセント乃至０．００５重量パーセント好まし
くは６重量パーセント乃至０．０５重量パーセント用い
ることができる。更に別の方法として該粒子単位と液体
キャリーの音波処理、物理的混合、および物理的撹拌処
理、ｐＨｇ整がある。これらは前記の方法と組合わせる
ことにより、さらに有用である。

また物−質Ｂと特異的に結合する物質Ｃ及び標識物質り
と特異的に結合し該標識物質に起因する信号を変調させ
る物質Ｅが繊維や粒状体等に固定化された固定化物や特
定成分Ａまたはその類縁体と標識物質りの結合物の特異
的に結合する能力及び標識物質りの信号を発する能力を
保持し多孔質反応層または後述の層中に含有させるため
に、特願昭６０−１９３２４号に記載されている方法を
用いろことができる。前記物質Ｃおよび物質Ｅの多孔質
反応層への固定化は、種々の公知の方法により、該物質
を該多孔質の反応層の表面に物理的に吸着させるか、化
学反応により直接あるいは間接的に結合させることによ
り達成される。その際、該物質の該特定成分に対する特
異的結合性か失われないように留意する必要があり、例
えば石川栄冶、河合忠、宮井　点線［酵素免疫測定法（
第２版）］（医学書院、■９７８年刊）や千畑一部、土
佐四組、松尾雄志著「実験と応用　アフィニテイクロマ
トグラフィー」（講談社：１９７６年刊）に記載されて
いる方法を、好ましい方法の例として挙げることかでき
る。

また多孔質反応層へのこれらの物質の固定化は、特異結
合部位が保持されており、かつ流体試料中に遊離、溶解
した状態でなければよく、流体試料中に不溶の状態で分
散されていてもよい。またカラー写真で用いられるカプ
ラーの分散に用いられる方法（例えば日本写真学会編「
写真工学の基礎、銀塩編」（コロナ社１９７８年刊）、
脂質二分子膜中に含有させる方法等も使用できる。また
、該特定成分と特異的に結合し得る物質を不動化後に、
必要に応じて免疫反応における非特異的反応を排除する
目的で、測定すべき特異的反応に関与しないタンパク質
を担持することが可能である。それらの代表的な例とし
ては、哺乳動物の正常血清タンパク質、ア′ルブミン、
ゼラチン及びそれらの分解物等が挙げられる。

これらの固定化操作は、前述の粒状体あろいは繊維にあ
らかしめ行っそおいた後、多孔質反応層を形成しても良
く、あるいは多孔質反応層を形成した後に該固定化操作
を行う二とも可能である。

前者の場合、前記物質を固定化した粒状体またはｌａｍ
の他に前述の特異的反応に関与しないタンパク質のみを
固定化した粒状体または繊維を調節のために加えること
も可能である。

二種の固定化物の混合比は、各々に固定化された特異結
合物質の量と結合定数に応じて定められ、必要に応じて
は更に、特異的結合物質を固定化しない粒状体又は繊維
を調整のために加えてもよい。

このように二つの固定化物を用いるのは、溶液中で［Ｂ
　］／［Ｆ　］０分を行うためと、標識物質に起因する
信号を変調させるためである。

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるむのであれば
よく、特に制限されるものではないが、製造上及び４作
・測定上、フィルム状あるいはシー）状であることが好
ましい。

本発明の態様は、二種の固定化物が多孔質、２応層の同
一層に固定されて含有されている場合およ１該二種の固
定化物が二層以上の多孔質反応層に固定化されて含有さ
れている場合を含む。

本発明の分析素子の理解を助けるために、−例を挙げて
原理を説明する。

第１図は本発明による分析素子の最も単純な態様の断面
図の一例である。この場合は多孔質反応層０のみで分析
素子が構成されており、該二種の固定化物が固定化され
て多孔質反応層中に含有されている。

ｆｊ＆２図は第１図の部分拡大図である。第２図におい
て符号Ｐは物質Ｂと特異的に結合する物ｌＩ！１Ｃが担
体ｐに固定化された粒状体、Ｑは！Ｓ織物ＩＤと特異的
に結合し該標識物質りに起因する信号をｔ調させる物質
Ｅが担体ｑｔこ固定化された粒状体、モしてＲは調整た
めに添加された担体ｒからなる粒状体である。

第２図は粒状体Ｐ、Ｑ、ｌゾＲが均一に混合され、点接
着することにより多孔質反応層が構成されてぃスー）ｉ
、景１ｆいス− 第３図は本発明の測定原理を説明するだめの模式図であ
り、反応型式を競合法に例にとって説明する。

第３図において、まづ前記した各物質即ち流体試料中の
特定物質Ａ及び分析試薬として用いる物質Ｂ、Ｃ，標識
物質Ｄ、物質Ｅ及び標識体Ｆを夫々特定した図形によっ
て表示した（同図（ａ））。

また前記各物質の液相系または固液相系に於ろ結合反応
で生成した結合物または反応成分を括弧に括って表示し
た。尚結合手２本で特異的結合を結合手１本で非特異的
結合を表わした。また矢印線は反応の方向を示す。

図に於てｐ及びｑは夫々物質Ｃ及びＥを固定化する担体
であって、物質Ｃ，Ｅを固定化することによって夫々粒
状体（固定化物）Ｐ及びＱを構成する。

このように構成された本発明の分析素子に流体試料の一
定量、標識体Ｆを含有する溶液、流体試料中の特定成分
Ａと特異的に結合する物質Ｂとの結合物を含有する溶液
を順次滴下する　（滴下順序は特に問わない）。

表面反応性を付与された前記粒状体ＰＳＱ及び特定成分
Ａ及び分析試薬として加えられる物質Ｂ及び標識体Ｆを
含む流体試料と分析素子の構成する系に於ては、粒状体
Ｐ及びＱには実質上流体試料中での液相系反応終了後の
固液相系反応しか許されない。即ち反応成分の衝突確率
の高い液相系反応が固液相系反応より十分に速く優先し
て起るので流体試料中の特定成分Ａと物質Ｂ及び標識体
Ｆと物質Ｂの特異的結合が起り、夫々に結合物（Ａ　＝
　Ｂ　）及び（Ｂ＝Ｆ）が生成し、固液相系反応で生成
すべき結合物（Ｂ＝Ｃ）或は（Ｄ＝Ｅ）の生成は液相系
反応が終了するまでは保留される。

液相系反応が終了し流体試料中に存在する結合物（Ａ＝
Ｂ）及び（Ｂ＝Ｆ）及び標識体Ｆは粒状体Ｐ及びＱ上の
物質ＣまたはＥとの固液相反応を開始する。

この場合結合物（Ｂ　＝　Ｆ　）は粒状体Ｐ及びＱのい
づれに対しても結合しうるが、物質Ｂと物質Ｃとの結合
力を標識物質りと物質Ｅとの結合力より強い組合せを選
択することにより前記（Ｂ　＝　Ｆ　’）を粒状体Ｐに
優先的に結合させることが可能である。

このようにして物質Ｂが関与する結合物（Ａ＝Ｂ）及び
（Ｂ＝Ｆ）は粒状体Ｐへ、また標識体ＦはＱへ夫々分離
（即ち前記［Ｂ　］／　［Ｆ　］分離）することができ
る。

標識体Ｆの標識物質りは、粒状体Ｑと物質Ｅとの結合に
より標識物質に起因する信号が変調されるので、流体試
料中の特定成分Ａの濃度と標識物質全体の信号強度の間
には、関数関係が成立する。

そこであらかじめ特定成分Ａの濃度がわかっている流体
試料（標準試料）を数種類用いて検量線を作成しておけ
ば、未知の液体試料中の特定成分Ａの濃度を知ることが
できる。

変調される信号の測定方法は標識物質の種類により異な
る。

例えば標識物質りが蛍光物質であれば、分析素子に励起
光を当て、蛍光強度を測定すれば良い。標識物質が酵素
であれば適当な基質、必要ならば酵素や発色系を含む溶
液を添加し一定時間インキユヘートした後に、該発色系
に適合した波長の先の反射濃度（基質の種類によっては
蛍光強度、発光強度）を測定することにより信号強度を
測定できる。このような目的で用いられる基質・発色系
は標識酵素の種類に従って公知の方法から適当なものを
選択できる。

標識物質りとして酵素を用いる場合、過酸化水素及びＮ
ＡＤＨ，ＮＡＤ）（Ｐが関与する酵素反応系の酵素、発
色系が好ましく用いられる。過酸化水素が関与する酵素
反応系の酵素は次のようなものがあげられる。

ＥＣ１，１，３，１グリコール酸オキシダーゼ１．１．
３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１．３．４　　　グ
ルコースオキシダーゼ１．１．３．６　　　コレステロ
ールオキシダーゼ１．１．３．９　　　ガラクトースオ
キンダーゼ１．１．３．１７　　コリンオキシダーゼ１
．１．３．−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ １．１１．１．１７　　ペルオキシダーゼ１．２゜３．
２　　　キサンチンオキンダーゼ１．２．３．３　　　
ピルビン酸オキンダーゼ１．２．３．４　　　シュウ酸
オキシダーゼ１．３．３．−　アシルＣｏＡオキシダー
ゼ１．４．３．２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．
４．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．３
．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１．５．３．
１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．７．３．３　　　
尿酸オキシダーゼ等 ペルオキシダーゼ以外の酵素は、過酸化水素発生酵素な
ので、発生した過酸化水素を検出可能な形（例えば、比
色、蛍光、発光等で検出）に変換する物質、例えば白金
、銀、鉄等の金属、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の
酵素等が挙げられる。

特にペルオキシダーゼを用い、比色で測定することが好
ましく、この場合次のような基質か挙げられ、それらの
物質のうち１種もしくは数種選んで用いられる。

１）　　ｏ−ジアニシジン又はその塩 ２）０−トリジン又はその塩 ３）　グアヤク ４）　アドレナリン ５）フェノールフタレン ６）　フェロシアン化物 ７）　４−アミノアンチピリン及びその誘導体又はそれ
らの塩と、フェノール又はナフトール又はそれらの誘導
体との組み合わせ ８）アニリン及びその誘導体 ９）ｏ−トルイジン、ｐ−トルイジン等のモノアミン類 １０）　　ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−ｐ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジエチルフェニレ
ンジアミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類 １１）　　フェノール、チモール、Ｑ−１ｍ−及びｐ−
クレゾール、α−ナフトール、β−ナフトール等のフェ
ノール類 １２）カテコール、グアヤコール、オルシノール、ピロ
ガロール、ｐ、ｐ−ジヒドロキシジフェニル、クロログ
ルシノールのよう奮ポリフェノール類１３）ザリチル酸
、ピロカテキン酸、没食子酸のような芳容族のような酸 ＋４）　　ロイコマカライドグリーン、ロイコフェノー
ルフタレンのようなロイコ染料 １５）　　２．６−シクロロフエノールインドフエノー
ルのような着色染料 １６）　　エピネフリン、フラボン類、ヂロンン、ジヒ
ドロキシフェニルアラニン、トリプトファンのような種
々の生化学物質 １７）　　２．２’−アジノジ（３−エチル−６−スル
ホベンゾチアゾリン）又はその塩及び３．３’　−ジア
ミノベンジジンのような特殊染料 １１１）　　２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェ
ノール）−４，５−ビス（ｐ−ジメトキシアミノフェニ
ル）イミダゾール １９）　　ｐ−アニシジンと８−ヒドロキシアニリンの
組み合わせ ２０）３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾンと
Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンの組み合わせ２１）その他、
グアヤコム、グアヤコン酸、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナ
トリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並びにビリルビンの
ような物質等 ＮＡＤＩ−１，ＮＡＤＰＨが関与する酵素反応系の酵素
としては、次のようなものがあげられる。

ＥＣ１，１，１，１アルコールデヒドロゲナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ １．１．１．２７　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．１
．３７　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１．１．４０
　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（オキサロ酢酸−説炭素
） （Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．１．１．４７　　グルコースデヒドロゲナーゼ１．
１．１．４ｇ　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ １．１．１．４９　　グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ １．２．１．１　　　ホルムアルデヒドデヒドロゲ１．
２．Ｌ、Ｌ２　　グリセルアルデヒドリン酸テヒドロゲ
ナーゼ １．４．１．Ｌ　　　アラニンデヒドロゲナーゼ１．４
．１．３　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｎ　Ａ
　Ｄ　（ｐ　）”） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋） １．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナー
ゼ Ｎ　Ａ　Ｄ　）ｌあるいはＮＡＤＰＨの定量は、Ｎ　Ａ
　ＤＩ−ＩあるいはＮＡＤｒ’Ｈを直接ａ４Ｑｎｍで比
色定量してもよいし、または、適当な物質を用いてＮ　
Ａ　ＤＨあるいはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを発色色原体、蛍
光面駆体、発光体等と作用させ、比色、蛍光、発光等で
定量してもよい。ここでの適当な物質とはＮ　Ａ　Ｄ　
［１あるいはＮＡＤＰＨを酸化し、発色色原体、蛍光面
駆体、発光体等を還元する反応を触媒する物質をさし、
具体的には、５−メチルツェナジニウムメチルサルフェ
ート、（１−メトキシ）−５−メチルｐＭＳと略記する
）、メルトラブル−（すなわち、９−ジメチルアミノベ
ンゾ−α−フエナゾキトニウムクロライド）などの化合
物や、ジヒドロリボアミドレダクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
”）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨデヒドロ
ゲナーゼ（キノン）、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（キ
ノン）などの酵素を用いることができる。

この場合好ましい発色色原体の例として３−（ｐ−ヨー
ドフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェ
ニル−２水素テトラゾリウムクロライド、３−（４，５
−ジメチル−２−チオアゾリル）−２゜５−ジフェニル
−２水素テトラゾリウムブロマイド、３．３　’　−（
４，４’−ビフェニレン）−ビス（２゜５−ジフェニル
−２水素テトラゾリウムクロライド）（Ｎ　ｅｏ−Ｔ　
Ｂ　）、３．３’　−（３，３’−ジメトキシ−４，４
’−ビフェニリレン）−ビス（２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−２水素テトラゾリウムクロライド
）　（Ｎ　１ｔｒｏ　−Ｔ　Ｂ　）、３．３’　−（３
，３’−ジメトキシ−４，４′−ビフェニリレン）−ビ
ス（２，５−ジフェニル−２水素テトラゾリウムクロラ
イド）（Ｔ　Ｂ　）、３．３’−（３，３’　−ジメト
キシ−４，４′−ビフエニリレン）−ビス〔２，５−ビ
ス（ｐ−ニトロフェニル）−２水素テトラゾリウムクロ
ライド）（ＴＮＴＢ）等が挙げられる。

標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光
法または、発光法で検出することができ、測定法として
は信号の経時的変化を測定するレート測定法または一定
時間後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定す
ることができる。吸光度法（比色法）では、紫外光、可
視光、近赤外光を利用することができ、例えば流体試料
として血清を用いる場合には、血清による吸光の影響を
小さくするために緑色光、赤色光または、近赤外光を利
用するのが好ましい。

第４図は、多孔質反応層が二層であり、物質Ｂと特異的
に結合する物質Ｃ１および標識物質りと特異的に結合し
該標識物質に起因する信号を変調させる物質Ｅは、それ
ぞれ別々の層に固定化されて含有されている。これらの
層は、同様又は別の多孔質反応層に用いられる素材を塗
布、製膜または、貼付けにによって得られる。

本発明の分析素子は前述の多孔′質反応層が最低必要構
成要素であるが、発明の効果をより一層発揮するために
種々の補助層を設けることができる。

第４図〜第９図に本発明に分析素子の実施の態様を表す
断面概略図を示す。

第５図に示した本発明の分析素子は光透過性支持体１１
の上に多孔質反応層Ｏが積層されており、支持体の存在
により素子の取扱い性が向上している。このような目的
で使用し得る支持体は、例えば酢酸セルロース、ポリエ
チレンテレフタレート、ポリカーボネート及びポリビニ
ル化合物（例えばボリスヂレン）のような高分子化合物
、あるいはガラスのような透明無機化合物が挙げられろ
。該多孔質反応層はこのような支持体の上で直接塗布及
び／又は製膜するか、あるいはいったん多孔質反応層を
別に形成した後に前述の支持体に貼りつけても良い。第
５図に示した態様の場合、流体状測定は両側から行うこ
とが可能である。

第６図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
１２の上に反応層が設けられている。この態様では、試
料等の滴下、信号測定とも多孔質反応層側から行い、信
号を反射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれを容
易にしている（信号を蛍光強度で測定する際は黒色の吸
光性支持体を同じように用いることで同様な効果を得る
ことができる）。

このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミックス、金属、あるいは
樹脂被覆等で防水処理を施した紙等が挙げられ、これら
の材質に必要ならば’Ｉ’１０ｔ、Ｂ　ａｓｏいマイカ
などの白色顔料等を塗布するか含有させることにより目
的を果たすことができる。

第７図の態様ら同様な目的によるしので、光透過性支持
体１１の上に多孔質反応層Ｏ１光反射層１３が順に積層
されている。この態様では試料等は光反射層側から滴下
され、信号測定は光透過性支持体側から行われる。光反
射層は公知の分＋ｆｒ　＊子及１その［１品に用いられ
ていたものをいずれも使用できるが、好ましくは多孔質
反応層に用いられるのと同様な粒子及び繊維に前述の白
色顔料等を含有させたものを塗布又は製膜するか貼りつ
けることができろ。更に好ましくは内部に白色顔料を含
有する粒子の表面に多孔質反応層に用いる時と同様に物
質Ｃおよび物質Ｅを固定化し、下層の多孔質反応層と同
様の８１能を持たせた光反射層を設けることができる。

このような特殊な光反射層を用いると、光反射層内に多
くの未反応標識物質が残ることを防止できる。

第８図の態様では、光透過性支持体１１上に、発色試薬
層１５が設けられておりその上に特定成分Ａと特異的に
結合する物質Ｂの含有ＮＪ１４、多孔質反応／Ｉ！ｊＯ
の順に積層されている。該物質Ｂ含有層は多孔性媒体に
面積濃度が一定となるように物質Ｂを含有させた層であ
り、流体試料の一定量及び標識体Ｆを含有した溶液を滴
下すると一定量の物質Ｂが溶出され、多孔質反応層に試
料と共に拡散するものである。

素材としては多孔質反応層と同様のものを塗布、製膜貼
付しても良く、あるいは吸水性の洋紙、和紙、濾紙、プ
ラッシュポリマー、あるいはグラス繊維、鉱物性繊維（
石綿など）、植物性繊ｍ（木綿、麻、パルプなど）、動
物性繊維（羊毛、絹など）、合成ａｍ（各種ナイロン、
ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレ
ンなど）、再成繊ｍ（レーヨン、セルロースエステルな
ど）などを単独あるいは混合して製造した織物、不織布
、合成紙などでイヤ成した物質Ｂ含有層を貼付しても良
い。

物質Ｂ含有層の位置は、必要に応じて種々選択でき本態
様のように物質Ｂ含有層が最上層以外の部分にある場合
、物質Ｂ含有層に用いる素材としては前述のものの他に
ゼラチン、ゼラチン誘導本、多糖類（アブロースなど）
、カルボキンメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロースなどの親水性高分子物質、あるいはビニルピロリ
ドン、アクリル酸誘導体！、メタクリルａ誘導体、ビニ
ルアルフール、スルホニルスチレンなどをモノマーとし
たホモポリマーあるいはコポリマーといった連続バイン
ダーを塗布して用いる方法がある。発色試薬層は、酵素
活性測定に必要な基質、発色試薬を含有させた少なくと
も一層の親水性コロイドから成る。

基質や発色試薬は親水性コロイドから成るバインダー中
に溶解、あるいは分散し塗布液とすることができる。特
に疎水性化合物の分散には写真業界で多用されているオ
イルプロテクト分散法、直接分散法等種々の公知の分散
法を用いることができる。

更に本発明に係る発色試薬層に用いられる親水性コロイ
ドは、ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
、ポリビニルアル６−ル、ポリビニルピロリドン、ポリ
ビニルイミダゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリ
ル酸ナトリウム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等９
セルロース誘導体の多糖類等が挙げられる。そして好ま
誘導体が挙げられる。

更に本発明に係る発色試薬層のバインダーは、その膜物
性、例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のために一部
を他の水分散性高分子重合体。即ち高分子ラティックス
と置換することができる。

好ましい高分子ラテックスの例としては、例えば待闇昭
５７−１１６２５８号、同５８−９９７５２号記載のも
のが有用である。これらの高分子ラテ・／クスは、親水
性コロイドバイングーの最大７０パーセントを置換する
ことが可能であるが、好ましくは約５５パーセント以下
の置換である訊発色試薬層には池の添加剤、例えば緩衝
剤、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加
することができる。また、その膜厚は約３乃至約５０ミ
クロン、好ましくは約５乃至３０ミクロンである。

緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適
したｐ）Ｔにするために含有される。

用いることがでさる緩衝剤としては日本化字会扁「化学
便覧基礎編」（東京、人害（株）１９６６）ＰＰ１３１
２〜ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　５，４６７（１９６
６）、今村、斉藤；化学の領域３０（２）７９（１９７
６）、Ｗ、　Ｊファーギュソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）等
；　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０４，３００（１
９８０）等の文献に記載されているものを°あげること
ができる。

具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リスバルビッール、グリシン、グツド緩衝剤等があげら
れる。これらの緩衝剤は必要に応じて発色試薬層以外の
層に含有させてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のために含有され
、酸化防止剤などがある。また二種の固定化物や物質Ｂ
および標識体を層中に含有させる場合の活性保持のため
に、固定化酵素、アフィニテイクロマトグラフィの吸着
体、固定化抗体及びタンパク質や酵素等の保存に用いら
れる保恒剤を含有される。その物質としては、日本生化
学会編［生化学実験講座１．タンパク質の化学ＩＪ（東
京化学同人（株）１９７６）ＰＰ８６〜６７、前述の実
験と応用「アフィニテイクロマトグラフィＪＰＰ１０３
〜１０４、特開昭６０−１４９９２７号等に記載されて
いるものがあげられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン　ＢＳＡ、シクロデキストリン類、非還元糖類（
シュクロース、トレハロース）、ポリエチレングリコー
ル、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられ
る。これらの保恒剤は二種類固定化物や物質Ｂ及び標識
体Ｆの近傍に存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用い
ることができ、Ｔ」ジエイムス（Ｔ、１１．Ｊａｍｅｓ
）編「ザ・セオリー・オブ・ザ・フォトグラフィックプ
ロセスＪ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｐ
ｏｔｏｇｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ）（第４版）ＰＰ
７７〜８７に記載されているものをあげることができる
。具体的な例としては、アルデヒド類、活性オレフィン
類、活性エステル類等があげられる。

界面活性剤としては、前述のものがあげられる。

その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカ−試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応
じて適当量添加する。

媒染剤は、酵素活性測定のための検出物質を、発色試薬
層に集中的に集めたり、検出物質が色素の場合吸光度係
数を高めたり、波長をシフトさせる物質であり、検出物
質と強い相互作用を示めすカチオン性ポリマー、アニオ
ン性ポリマー及びこれらのポリマーのラテックスが用い
られる。

第９図は、標識体Ｆも分析素子中に含有されている例で
ある。層ｈ１成としては、第８図と同様であるが、多孔
質反応Ｎｏに標識体が含有されている。この多孔質反応
層には、標識体の標識物質と特異的に結合し該標識物質
に起因する信号を変調させる物質Ｅの固定化物が含有さ
れているため、分析素子の製造や保存中に標識体との結
合反応を生じさせないために、例えばクリニカル　ケミ
スト　リ　−（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　ＣＩ＋ｅｍｉｓｔ
ｒｙ）　第２７９　１４９９　頁（１９８１年）記載の
方法等を用いることができる。

物質Ｂ及び標識体Ｆを分析素子中に含有させる他の態様
としては、多孔質反応層に物質Ｂを、物質Ｂ含有層に入
換えた標識体Ｆを含有させる方法がある。標識体含有層
は、物質Ｂ含有層と同様な仕る場合も標識体の場合と同
じ方法が用いられる。

更に他の態様としては、多孔質反応層に、物質Ｂ及び標
識体Ｆを含有させる場合があげられる。

第１０図及び第１１図は、本発明の好ましい態様の１例
について断面図、斜視図を示したものである。

分析素子の取扱いが容易になるよう、全体がプラスチッ
ク製のマウント１７で覆われており、マウント上部に試
料注入孔、下部に信号測定孔が開いている。

本発明の分析素子は更に、流体試料中を素子に適用した
際にその展開を補助する展開層、流体試料が血液（全血
）の際に必要となることがある血球分離層、必要に応じ
て設ける接着層、保護層、タイミング層といった補助層
を設けることができる。

これらの補助層及び前述の発色試薬層、物質Ｂ及び／ま
たは標識体含有層、タイミング層は独立して設けても良
く、あるいは複数の機能を併わせもった層として設けて
も良い。これらの層はその機能に応じて設けられるべき
位置が容易に決定できる。

〔実施例〕

以下本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。

実施例　１ （１）試薬層の作成 厚さ１８０μＩの透明な下引き済みポリエチレンテレフ
タレートフィルムの上に、下記の組成の発色試薬層を、
塗布・乾燥により作成した。

し脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　２２．０ｇ／ｍ
”＊　　Ｎ１ｔｒｏ−ＴＢ；　３，３’−（３Ｊ’−ジ
メトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス［２−（Ｐ
−ニトロフェニル）−５−フヱニルテトラゾリウムクロ
リドコ （２）　標識物質（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識
ヒトＩｇＧ）の作成 グルタミン酸デヒドロゲナーゼｔｏｍｇを、１．２５％
グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，８）Ｏ，’２ｍ１２に加え、室温にて１０時間ゆる
やかに撹拌して反応させた。これをあらかじめ０．１５
〜丁塩°化ナトリウム溶液で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラム（１，ＯＸ　５５ｃｍ）に通し、グルタ
ルアルデヒド活性化グルタミン酸デヒドロゲナーゼ画分
を回収した。この両分１．０ｍ１２にヒトＩｇＧ（米国
カッペル社製）を５１１１９含む０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液１　、０１ｍ１２及び１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（１）Ｉ（９，５）０．１＋ｎ４を加え、４℃にて２
４時間反応させた。この溶液に０．２Ｍリジンを０．１
ｍ１２加え、さらに４℃にて２時間反応させた後、０．
１５Ｍ塩化ナトリウムを含むＱ、（ＩＩＭＩＪ：／酸緩
衝液（ｐＨ７，６）テ平衡化したｔｉｌｔ−ｒｏｇｅｌ
　ＡｃＡ−３４カラム（１，５ｘ　１００ｃｍ）に通し
、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトＴｇＧを得た
。

（３）標識物質含有層の作成 １−（２）で得た標識物質を１−（１）の試薬層の上に
下記の処方でブタノール塗布・乾燥し、５識物質含有層
を作成した。

Ｌ　　　　　　ピロリドン）［４０／６０１　　１．２
ｇ／＋ａ２（４）抗ヤＶ　ｒｇＧ抗体のセルロースａＩ
ｎへの固定化粉末濾紙Ｄ（東洋濾紙社製）１００りを、
ブタンシオールノグリシノルエーテル（米国アルドリッ
チ社製）２５０ｍｌ！と、２ｍｇ／ＬＩＩｌｌの水素化
ホウ素ナトリウムを含む０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶
ｆｉ２５０ｍｆｆｉとの混合液中に懸濁し、４０’Ｃに
て５０間半振１攪拌した後、純水約５１で洗浄し、乾燥
させた。

この官能基を持つ粉末濾紙Ｄ　１０ｇを、１００　＋ａ
　ｇのウサギ抗ヤギｒｇｃ　（米国カッベル社９Ｉ）を
含む０．５Ｍ１０．０）１００ｍｆに懸濁し、４０℃１
．：テ１２１１１？間振盪撹件した。これを１過し、ベ
レットを純水５００ｍ１．０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍ炭素水素ナトリクム溶［５００ｍ１．０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，１）　５００＋ｏｆにて交互に洗浄した後、
１Ｍ）リス−塩酸緩衝ＷＬ（ｐＨ８，５）　３００社に
懸濁し、２５℃２４時間振盪撹拌して未反応基をブロッ
クした。これを濾過し、ベレットを純水約２１で洗浄し
、抗ヤギＩｇＧ抗体固定化粉末濾紙りを得た。

（５）多孔質反応層の作成 １−（４）で作成した抗ヤギＩｇＧ抗体固定化粉末濾紙
Ｄ、ヤギ抗ヒ）　ＩｇＧ抗体（米国カッペル社製）、及
びアフィゲル−５ｏｌ（ｐ−クロロマーキュリ−アニリ
ン固定化７〃ロース：バイオラッド社製）を、１−（３
）で作成した標識物質含有層の上に、下記の組成の分散
液にて塗布・乾燥させ多孔質反応層を作成した。

Ｌキシレン　　　　　　　　　　　　　　１０＋ｎ＋２
これを２　Ｘ　２　ｃｍの大きさに裁断し、分析素子と
した。

（６）ヒトＩｇＧの測定 ヒトＩｇＧ溶′ＫｊＬ（０〜６４０μｇ／ｍＱ、　Ｏ，
０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，６）ｌＯＩＩ
Ｑを、１−（５）で作成した分析素子に滴下し、３７℃
１０分間密閉状態でインキエベートした後、支持体側か
ら５８０ｎｍの反射濃度を測定した。その結果を表１に
示す。

表　　１ 表１よりあきらかなように、ヒト１ｇ０２１度Ｏ〜６４
０μｇ／ｍ１の範囲で良好な検量線を得ることができ、
本分析素子を用いることにより、煩雑な孫作の［Ｂ］／
［Ｆ］分離を行うことな（、且精度のよい流体試料中の
成分の測定ができた。

実施例　２ （１）　試薬層の作成 実施例１−（１）と同様の方法で発色試薬層を生成した
。

（２）抗ヤギＩｇＧ抗体固定化物及びアフィゲル−５０
１含有多孔質反応層の作成 実施例１−（４）で作成した抗ヤギＩｇＧ抗体固定化粉
末瀘紙り及びアフィゲル−５０１を下記の処方で分散し
、２−（１）の試薬層の上に塗布・乾燥した。

「抗ヤギＩｇＧ抗体固定化粉末濾紙Ｄ　　　３．０Ｏｇ
Ｌキシレン　　　　　　　　　　　　　１０ＩＩＩＱ（
３）ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体含有 多孔質反応層の作成 ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を下記の処方で分散し、塗布・
乾燥させた後、２−（２）の多孔質反応層の上に接着し
た。

「抗ヒトＩｇＧ抗体　　　　　　　　　　　２０ｍｇＬ
キシレン　　　　　　　　　　　　　　３．５ｍＱ。

（４）標識物質（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒ
トＩｇＧ　）含有層の作成 １−（２）で作成したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ標
識ヒトＩｇＧを下記の処方で塗布・乾燥させた後、２−
（３）の多孔質反応層の上に接着した。

「グルタミン酸デヒドロ　　　　　　　５５ｍｇ／ｍ２
Ｌ　　　　メタクリレート）　（９０／ｌｏ　）　　２
ｇ／ｍ’（５）ヒトＩｇＧの測定 １−（６）と同様の方法でヒトＩｇＧの測定を行なった
。その結果を表２に示した。

表　　２ 表２より明らかな様に、本測定方法を用いることによっ
て、煩雑なり／Ｆ分離を行なうことなく、かつ精度よく
、流体試料中の成分を測定することができた。

本実施例では、検量線の範囲は、ヒトＩｇＧＯ〜６４０
μ９／ｆｆ１Ｑであったが、これは該物質Ｂ１該物質Ｃ
及び標識物質りの量比及びアフィニティを調節すること
により、いか様にも測定範囲を設定することができる。

【図面の簡単な説明】

！＠１図及びｙ＆４図乃至第９図は本発明の分析素子の
Ｍ構成の態様例を示す断面図である。 第２図は多孔質反応層の一部拡大図である。 第３図は本発明の分析素子の測定原理の模式説明図であ
る。 第１０図及び第１１図は夫々本発明の分析素子の断面図
及び斜視図である。 Ａ・・・特定成分、 Ｄ・・・標識物質、 Ｆ・・・標識体（特定成分Ａと標識物質りの結合物）Ｂ
・・・特定成分Ａと特異的に結合する物質、Ｅ・・・標
識物質と特異的に結合し、標識物質に起因する信号を変
調させる物質、 Ｐ・・・物質Ｃを固定化した粒状体、 Ｑ・・・物質Ｅを固定化した粒状体。 特許出願人　小西六写真工業株式会社 第３図 （ａ）ｅ）＋　二　Ｃチ針Ｃ Ａ　　　　Ｂ　　　ＣＤ　　　Ｅ　　　Ｆ：（Ａ−Ｄ）
（ｂ）　　　、や、〕〔回仙永〕 第４図 第６図 第８図 第１０図 第５図 第７図 第９図 第１１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａまたは
   その類縁体と特異的に結合する物質Ｂを用いて測定する
   ための、少なくとも一層の多孔質反応層を有する分析素
   子に於て、該物質Ｂと特異的に結合するが特定成分Ａと
   は結合しない物質Ｃ並びに標識物質Ｄと特異的に結合し
   且つ該結合によって該標識物質Ｄに起因する信号を変調
   させる物質Ｅとを担体に固定して前記多孔質反応層の少
   なくとも一層に含有したことを特徴とする免疫学的分析
   素子。
2. （２）前記物質Ｂを少なくとも一層の多孔質反応層に含
   有したことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免
   疫学的分析素子。
3. （３）前記流体試料中の特定成分Ａを、前記標識物質Ｄ
   と特定成分Ａまたはその類縁体とが結合して成る標識体
   Ｆと前記物質Ｂとを用いた競合反応によって測定するた
   めの素子であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   または第２項記載の免疫学的分析素子。