JPS62249062A - 分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分全分析するた
めの分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に極微量含有される物質？検出する
方法として、各種分析法の開発がなされてきた。その分
析方法は、主として免疫反応をその原理とするものであ
る。上記原理？用いる測定法として、種々の４のが開発
されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫測定法
（イムノアッセイ）が知られている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂｅｒ−ｓｏｎ
　）とイア口Ｉ７（Ｙａｌｌｏｗ　）　　が、放射性ヨ
ードで標識した、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中
の抗インシュリン抗体？用いて、血清中のインシュリン
？測定することに成功して以来、放射免疫測定法が広く
用いられている。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種々開発がなされてきた。他の標識化合物として＃−
ｊ：例えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、
バクテリオファージ、循環反応体、金属及び有機金属の
錯体、有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍光性
分子等が挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｐと略記する）の分離（以下Ｂ　／
　Ｆ分離と略記する）がある。

従来、免疫測定法における問題点全解決するために各種
の方法が開発されてきた（例えば、特開昭５３−３８６
１９号、同５３−７９０２４号、同５５−９０８５９号
、同５７−６７８６０号、同５７−２００８６２号、同
５８−１８１６７号、同５９−７７５５６号及び同５９
−１７０７６８号各公報参照〕。

しかし、これらの方法は、Ｂ／Ｆ分離が不完全である、
ノイズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物
質が低分子物質に限られる等の欠点があった。

一方、ウェット・ケミストリーにおいて、固定相を用い
た競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特
開昭５８−２０９９９４号及び同５９−２０２０６４号
各公報参照）。しかし、それらの測定法では、比較的多
量の水溶液中において、担体に固定相を分離して固定し
た２種の物質と溶液中の物質との競合反応２行っている
ため、意図した結合を起すことなく溶液中に残存する物
質が多く、しかも両固定相を区別することなく全体の酵
素活性？測定しているため、バックグランドやノイズの
問題から、感度、精度及び再現性について満足な結果が
得られているとは言い稚い。

他方、ドライ・ケミストリーにおいて、第２抗体？用い
る免疫測定法が開発されている（特開昭５７−８２７６
６号及び同５７−８２７６７号各公報参照）。しかし、
これらは、操作が煩雑であること、再現性の良い展開を
行う技術が必要であること等、改良の余地がある。更に
、特開昭５９−３４１５５号公報記載の発明では、未結
合物収納シートを用いる方法が開示されている。しかし
、この方法でも、反応用シートと未結合物収納シートと
を密着させたままで測定を行おうとすると前述した問題
が生じ、また測定時に両シートを分離するのは煩雑であ
り、特に測定を自動化する際、障害となる。

〔発明が解決しようとする問題点］ 本発明者等は、特願昭６０−１３１９５５号、同６０−
２２９７９９号及び同６０−２２９７９９号発明におい
て、上記のような従来技術における欠点が、分析素子内
で積極的なり／ＩＰ分離を行うこと、そのためには分析
素子が特定の構成を有することによって解消することを
見出した。すなわち、流体試料中の特定成分Ａ全、該特
定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｂ１特定成分Ａ、特
定成分Ａの類縁体及び特定成分ムと特異的に結合するが
該物質Ｂとは異なる物質よりなる群から選ばれた物質と
標識とが結合した標識物０１及び該標識物Ｃの標識部位
に特異的に結合して該標識に起因する信号を変調させる
物質ＤＱ用いて該標識に起因する信号によって測定する
方法で使用する、該物質Ｂ及びＤが担体に固定化された
形でそれぞれ多孔質反応層の一部及び／又は全部に含有
されている分析素子により、積極的なり／ＩＦ分離を分
析素子内で実現することができた。

本発明者らはその後頁に検討を重ねた結果、前述の分析
素子においては、該物質Ｂ及びＤの含有量が極めて重要
であり、この含有量の変化に伴って分析素子の測定可能
領域、感度、再現性、等が大きく変動することを発見し
た。

本発明の目的は、前記発明の分析素子において、該物質
Ｂ及び該物質りの含有量？好ましく設定することによシ
、パックグランドやノイズが少なく、感度、精度及び再
現性に優れた、流体試料中の特定成分を定量するための
分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明？概説すれば、本発明は、分析素子に関する発明
であって、流体試料中の特定成分Ａ？、該特定成分Ａと
特異的に結合し得る物質Ｂと、特定成分Ａ又はその類縁
体と標識とが結合した標識物Ｃとの競合反応によって測
定し分析するための分析素子であって、該物質Ｂに結合
していない該標識物Ｃの標識部位に特異的に結合して該
標識に起因する信号全変調させる物質ＤＱ用い、該物質
Ｂ及び該物質りが、担体に固定化された形でそれぞれ多
孔質反応層の一部及び／又は全部に含有されている分析
素子において、該特定成分Ａを実質上含有しない流体試
料？用いて所定の分析操作を終了した時点で、分析素子
内の反応に関与した該標識物Ｃの総量のうち３〜７０チ
が該物質Ｂと結合し、かつ［１１〜１０％が該物質Ｂ及
び該物質りと結合していないように、該物質Ｂ及び該物
質りの含有量が設定されていることを特徴とする。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の浴
液、コロイド溶液が使用しうるが、好櫨しくは生物由来
のｍ１体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾
液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分Ａとは
、その存在又は、その流体試料中での量が測定され、そ
の特定成分Ａに特異的に結合する物質が得うる物質又は
物質群である。す々わち、ポリペプチド、タンパク質、
複合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホル
モン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げら
れる。具体的には、下記の物質又は物質群？挙げること
ができるが、これらに限定されるものではない。

（タンパク質、複合タンパク質） プレアルブミン、アルブミン、α！−酸性糖タンパク質
、α、−アンチトリプシン、αｉ−糖タンパク質、トラ
ンスコルチン、αビアンチキモトリズシン、α！−リポ
タンパク質、チロキクン結合グロブリン、セルロプラス
ミン、ｚｎ−Ｃ２−糖タンパク質、Ｇｃ−グロブリン、
インター−α−トリズシンインヒビター、α！−マクロ
グプロリ／、Ｃ２−Ｈ３−糖タンパク質、Ｃ２−Ｔクロ
グロブリン、ハプトグロビン、町−リボタンバク質、ヘ
モベキシン、トランスフェリン、β−リホタンパク′ｕ
１β２−糖タ／バク質、β、−マクログロブリン、Ｃ−
反応性タンパク質、ミオグロビン、エリスロボイエチン
、免疫グロブリン（工ｇｏ。

工ＦＥＭｐ　ＩｇＡ　ｐ　工ｇＤ、ＩｇＥ）、補体系成
分（ｃ、ｑ。

ｃａｒ　Ｐ　　ＣＲ２＃　　Ｃ２＋　ａｓ　ｌ　Ｃ４１
（３，＃　ｃ、　Ｉ　ａ、　ｌ　ｃ、　ＩＣ９等）、フ
ィブリノーゲン、ヘモグロビン、グリコヘモグロビン、
血液凝固因子、ＨＢａ抗原、１１Ｂｅ抗体、酵素（例え
ば、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、
アルカリ性ボス７アターゼアイソエ／ザイム、α−アミ
ラーゼ、アミラーゼアイソエンザイム、アルドラーゼ、
コリンエステ２−ゼ、タレアチンホスホキナーゼ、クレ
アチンホスホキナーゼアイソエンザイム、トランスアミ
ナーゼ（ＧＯＴ　、　ＧＰＴ　）、乳酸脱水素酵素、乳
酸脱水素酵素アイソエンザイム、１−−　ＧＴＰ　、　
　リパーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ロイシンアミノ
ベプチダ・−・ゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素酵素等）等
。

（ホルモン及びホルモン様物質） 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）　、黄体刺αｒホルモｙ（
ＬＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（
ＴＳＨ）　、にＩＩ　腎１１　質ｉｌｌ　ｍホルモン（
Ａ、Ｃ！Ｔｌ（）、メラニン刺激ホルモ７　（Ｍｆ３Ｈ
）、パンプレツシン、オキシトシン、インシュリン、グ
ルカゴン、アンギオテンシンＩ及び１１　、プロラクチ
ン、セクレチン、ドーパミン、セロトニン、ソマトスタ
チン、サイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（
Ｔ３）、ガストリン、コルチゾール、アルドステロン、
カテコラミン、エストロゲン、フロゲステロン、テスト
ステロン、胎盤性ゴナドトロピン、胎盤性ラクトーゲン
、下垂体ホルモン放出因子（ＴＲＨ、ＦＳＨ−ＲＨ。

ＯＲＨ、ＬＨ−ＲＨ等）等。

（ビタミン類） ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１　ビタミンＢ８、ビ
タミンＢ６　　、ビタミン１３ｔｚｓ　　ビタミンＣ１
ビタミンＤ１　ビタミンＥ５　ビタミンに１葉酸等。

（ｌｉｔ！瘍マーカマ− カーフェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、腺癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、Ｍ
−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原（
ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５等）、ガングリオサイズ （各種の薬剤及び代謝産物） ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コディン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチンマ
イセチン、カナマイシン、クロラムフェニコール、クロ
ロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイ
シン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミキ
シンＢ１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプト
マイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド、
フエノバルビタール、フリミドン、セコバルビタール、
アセタミノフエン、アミトリブチリン、カルバマゼピン
、ジゴキシン、ジンピラミド、リドカイン、メントレキ
セート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、フェニトイン、
プロカイナミド、プロプラノロール、テオフィリン、カ
ナピノール、テトラヒドロカナピノール、コリン抑制薬
剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチロフェノン、カ
フェイン、クロロプロマシン、エヒネフリン、グリセオ
フルビン、イミダ２ミン、Ｌ−ドーパ、メペリジン、メ
プロバメート、メタトン、ナルセイン、ノルトリブチリ
ン、オキサゼパム、ババベリン、フロスタグランジン、
テグレトール、バルプロン酸等及びこれらの代謝産物。

（微生物表面マーカー） バクテリア抗原、菌類抗原、寄生虫抗原、ウィルス抗原
。

（農薬） ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

（その他） 血液型物質、カルシオリビン、アレルゲン等。

本発明に使用しうる流体試料中の特定成分ムと特異的に
結合する物質Ｂとしては、測定対象により抗体、抗原、
レクチン、プロティンＡ１特定酵素の阻害物質などが挙
げられるが、該特定成分ムと該結合物質Ｂの結合反応が
抗原−抗体反応である場合が特に好ましい。本発明で使
用する抗体は、その由来を特に限定されるものではなく
、補乳動物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、
腹水液とそのままか、あるいは従来公知の方法である（
右田俊介編「免疫化学」中山書店第７４〜８８頁参照）
硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、セフ
ァデックスゲルによるゲル濾過法、イオン交換セルロー
スクロマトグラフィー法、電気泳動法等で精製して用い
ることができる。

あるいは抗原で感作した哨乳動物等（ｍｌえばマウス）
牌＃Ｉ細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞
（ハイプリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっ
ても良い。

また、これらの抗体は工ｇＧ　、　工ｇＭ　、　ＩｇＡ
　。

工ｇＤ、工ｇＩｃ各分画を用いることができ、あるいは
これらの抗体を酵素処理してＦａｂ　％　Ｐａｂ’又は
　　−ＩＦ　（ａｂ”ｈといった活性抗体フラグメント
にして使用してもよい。更にこれらの抗体は単一で使用
しても、複数の抗体を組合せ使用してもよい。

流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合する物質Ｂとし
て抗体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定原
理は免疫測定法に属する。

本発明の分析素子は免疫測定法において特に好ましく使
用できるので、以下免疫測定法を例にとって本発明の詳
細な説明するが、本発明はこの説明に限定されるもので
はなく、種々の応用が可能であることは以上に述べてき
た内容からも明らかである。

本発明に適用し得る標識としては、例えば酵素、蛍光物
質などが挙げられる。更に好ましくは下記に開示された
酵素及び蛍光物質が用いられる。（これらの標識に起因
する信号については後述する） １、　酵素 ＥＣ，１，ｔ　１．１　　　アルコールデヒドロゲナー
ゼ１、１１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ １、１．１．８　　　グリセロール−５−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤ） １、　ｔ　１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１
．１．ｓ７　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼｔ　ｔ　１
．４０　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ　） １、１．　ｔ　４７　　　グルコースデヒドロゲナーゼ
１、ｔ　ｔ　４８　　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ １、　ｔ　ｔ　４９　　　グルコース−６−リン醗デヒ
ドロゲナーゼ １、１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム） １、１．１１　　　グリコール酸オキシダーゼ１．１．
５．２　　　乳酸オキシダーゼ１、ｊ、　ｉ　４　　　
グルコースオキシダーゼ１、　ｔ　ｉ　６　　　コレス
テロールオキシダーゼ１．１．五９　　ガラクトースオ
キシダーゼ１．１．五１７　　　コリンオキシダーゼ１
．１．五−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ １、２．　ｊ、　１　　　ホルムアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ ｔ　２．１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １、２．　＆　２　　　キサンチンオキシダーゼ１、２
．　ｉ　３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１、２．　Ａ
　４　　　オキサル酸オキシダーゼ１、ム五−アシルＣ
ｏＡオキシダーゼ ｔ　４．１．１　　　アラニンデヒドロゲナーゼ１、４
．　ｔ　５　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡ
Ｄω）″）） １、４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
ＮＡＤＰ”） １．４．工２　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．五
３　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１、４．　Ｘ　４　　
　アミンオキシダーゼ（フラビン含有） １、４．　ｉ　６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）
１、５．１．５　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナー
ゼ １、５．　！Ｌ１　　　サルコシンオキシダーゼ１、６
．４２　　　グルタチオンレダクターゼ（ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ） １、６．４．３　　　ジヒドロリボアミドレダクターゼ
（ＮＡＤ”）（ジアホラー ゼ） １、Ｚ五３　　尿酸オキシダーゼ １、１１．１．６　　　カタラーゼ ｊ、　１１．１．７　　　ペルオキシダーゼ１、　ｊ３
．１２．４　　乳酸２−モノオキシゲナーゼ１、１３．
１２．５　　レニラルシフェリンー２−モノオキシゲナ
ーゼ １、１Ｘ１２．６　　シプリジナルシフエリンー２−モ
ノオキシゲナーゼ １、１．％　１２．７　７オチヌスルシフエリンー４−
モノオキシゲナーゼ（ＡＴＰ 加水分解） １、１４．１五２４−ヒドロキシ安息香酸６−モノオキ
シゲナーゼ ｔ　１４．９９．２１　　ラチアルシフエリンモノオキ
シゲナーゼ ２．１．３１１　　　メチルマロニルＣｏＡカルホキシ
トランスフェラーゼ ２．１２．２　　７−グルタミルトランスフェラーゼ ２、７．１．１　　　へキソキナーゼ ２、７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７．１．１５　　　リフｔ！牛ナーゼ２．７．１．
２８　　　）リオキナーゼ２、７．１．４０　　　ピル
ビン酸キナーゼ２、７．５．１　　　ホスホグルコムタ
ーゼ五１．　ｔ　３　　　リバーゼ 五１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ。

五１．　ｔ　７　　　アセチルコリンエステラーゼ五１
，１．８　　コリンエステラーゼ ５．１．　ｉ　１　　　アルカリホスファターゼ工１．
五２　　！２ホスファターゼ ３．１．五９　　グルコース−６−ホスファターゼ Ａｔ３．１１　　　フルクト−スジホスファターゼ ｉ　１．　ｉ　２１　　　α−グルセロールホスファタ
ーゼ 五１．４．１　　　ホスホジェステラーゼ■３ｗ　１．
４．３　　ホスホリパーゼＣ五２．１．１　　　α−ア
ミラーゼ ｉ　２．　ｔ　２　　　β−アミラーゼ五２．１．１７
　　　ライノザイム 五２．１．１８　　　ノイラミニダーゼ３、２．１．２
０　　　α−Ｄ−グルコシダーゼ！Ｌ　２．　ｔ　２１
　　　β−Ｄ−グルコシダーゼ＆２．１．２３　　　β
−Ｄ−ガラクトシダーゼＡ　２．１．５５　　　ヒアル
ロノグルコサミニダーゼ Ａ４．１１．６　　　アルギニンアミノペプチダーゼ 五４．２２．４　　　プロメライン 工！ＩＬ　１．１　　　アスパラギナーゼ五ａ　ｔ　５
　　　ウレアーゼ 五５．４．２　　７デニンデアミナーゼ３、５．４．４
　　　アデノシンデアミナーゼ五ａ４．６　　　ＡＭＰ
デアミナーゼ ４、１１．３　　　オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ ４、１．１．１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ ４、１．２．１３　　　フルクトースニリン酸アルドラ
ーゼ ４、２．１．２０　　　トリプトファンシンセターゼｃ
Ｊ、Ａ　１．９　　　グルコースリン酸インメラーゼ ６、！Ｌ４．１４　　　ピオチンカルボキシラーゼ＆　
４．１．１　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６、４．
１．２　　　アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ ＆　４．１．３　　　プロピオニルーＣｏＡカルボキシ
ラーゼ（ＡＴＰ−加水分解） ＆　４．１．４　　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ ＆　４．１．５　　　ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ　　　　　　　　等 Ｚ　蛍光物質 フルオレセイン　イソチオシアナート（Ｆ’ＩＴＣ）テ
トラメチルローダミン　インチオシアネート　（ＴＲ工
ＴＣ） ローダミンＢ　インチオシアネート（ＲＢ工ＴＯ）リサ
ミンローダミン−Ｂ２００スルホリルクロライド（ＲＢ
２００ＳＣ） ウンベリフェロン ４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ　）フルオレセイ
ンチオフルバミル（ＦＴ（３）フルオレセインチオカル
バミル−ジフェニルグリシン（ＰＴＯ−ＤＰＧ　） テトラメチルローダミン（ＴＭＲ） ５−　（（ａ、　６−シクロロトリアジンー２−イル）
−アミノコフルオレセイン ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロライド
（ＤＮＢ−ＣＬ　） フルオラム ２−メトキシ−２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−７２
ノン（ＭＤＰＦ　） ７−クロロ−４−二トロペンゾ−２−オキサ−１，３−
ジアゾール（ｕＢＤ−ａｔ　）１−アニリノ−８−ナフ
タレンスルホン酸（Ａｌ１） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド（ＮＰＭ　）Ｎ−（７
−シメチルアミノー４−メチル−２−オキシ−３−クロ
ロメチル）−マレイミ　　ド　（ＤＡＯＭ　　　） Ｎ−（ｐ−２−ベンズイミダゾイル−フェニル）−マレ
イミド（Ｂ工ＰＭ　） アントラセンインチオシアネート フルオロアンチルマレイミド（ｂｏＡＭ）希土類元素？
含む各種キレート 及びこれらの誘導体 特定成分Ａ及び特定成分Ａの類縁体よりなる群から選ば
れた物質（以下［物質ＬＪと略称する）と標識とが結合
した標識物Ｃとは、該物質Ｅと、特定成分Ａと特異的に
結合する物質Ｂ又は特定成分Ａとの間の特異結合能力？
保持し、かつ前述の標ａｔその信号を発する能力全保持
したｉま化学的手段等で、該物質Ｅと該標識を直接又は
間接的に結合した物質の総称である。

実際には該物質Ｅと核種ｍを当業者間で良く知られてい
る公知の試薬と公知の方法で結合させることにより得る
ことができる。更に拝しく述べると、石川栄治、回合忠
、宮井゛潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院
、１９８２年刊）及び日本臨床病理学金輪「臨床病理」
臨時増刊特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセ
イ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８５年刊）
などに記載された方法を参考にすることができる。本発
明の理解全助けるため以下に具体列？挙げて説明するが
、これは本発明？限定するものではない。

（］）該物質Ｅ及び該標識を下記のような架橋剤と反応
させる方法 ■　２．４．　ｂ　−トリクロロ−１，３，５−ｈリア
ジン ■　４．４′−ジフルオロ−４５′−ジニトロジフェニ
ルスルホン ■　トルエン−２，４−ジインシアネート■　Ｎｌ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド■　１−（５−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド ■　ビスジアゾ−〇−ジアニシジン ■　グルタルアルデヒド　など （２）該物質Ｅと該標識のうち少なくともどちらかが糖
鎖を有している時、該糖鎖を過ヨウ素酸で処理し、生じ
たアルデヒド基を結合すべき相手物質のアミノ基と反応
させる方法。

（必要に応じて、過ヨウ素酸処理の際の不要な結合の形
成を阻止するために１−フルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン等で該物質Ｅ若しくは該標識を前処理しておくか
過ヨタ素酸処理反応のｐＨを４〜５に制御する、あるい
は該物質Ｅと該標識間で形成されたシック塩基による結
合を水素化ホウ素ナトリウムやエタノールアミン等で処
理し安定化する、といった処置全とってもよい） （３）該物質Ｅ及び該標識がチオール基を有しているか
、あるいは還元等（よりチオール基を生ずる、あるいけ
適当な化合物で処理することによりチオール基？導入で
きる場合、マレイミド試薬として知られている種々の架
橋剤と該チオール基と反応させる方法。

〔ここでチオール基を導入する化合物としては次のよう
な例が挙げられる。

■　無水８−アセチルメルカプトスクシン酸■　メチル
−５−メルカプトプロビオンイミデート （リ　メチル−４−メルカプトブチルイミデーート ■　２−イミノチオラン ■　３−（″２′−ジチオピリジル）プロピオ／ｒ１！
Ｎ−ヒドロ″キシスクシンイミドエステル■　メチルｓ
　−（４’−ジチオピリジル）プロビオンイミデートな
ど また、前述のマレイミド試薬としては次のような例が挙
げられる。

■　Ｎ、Ｎ’−Ｑ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ
’−ｐ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、　Ｎ’　−Ｉ
Ｑ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、　Ｎ’−オキシジ
メチレンシマレイミド■　Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−
マレイミドアセテート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブ
チレート （３ｗ−スクシンイミジル−５−（Ｎ−マレイミド）ヘ
プタノエート ■　Ｎ−スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド）ヘ
キサノエート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ［相］　Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド
）ベンゾエート ＯＮ−スクシンイミジル−ｐ−（Ｈ−マレイミドフェニ
ル）−４−ブチレート ｏ　Ｎ−スルホスクシンイミジル−＜−（ｌｌ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ＯＮ−スルホスクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド
）ぺ／シェード ＯＮ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミド
フェニル）−４−ブチレート■　Ｎ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）ベンゼン−１−カルボ
キシレート　　　　　　　　　　　　　　など〕（４）
該物質Ｅ又は該標識にピリジル・ジスルフィド基と導入
し、結合すべき相手化合物に導入した、あるいは元々存
在するチオール基と反応させる方法。

〔ピリジル・ジスルフィド基の導入は３−（２′−ジチ
オピリジル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルやメチル−５−（ａ’−ジチオピリジル）プ
ロピオ／イミデートなどで処理すれば良い。またチオー
ル基の導入は（３）項で述べた方法などが利用できる〕 （５）　　該物質コ及び該標識がチオール基を有してい
るか、あるいは還元等にょジチオール基を生ずる、ある
いは適当な化合物で処理することによりチオール基？導
入できる場合、その片方の物質のチオール基？ピリジル
・ジスルフィド基に変換し、結合すべき相手物質のチオ
ール基と反応させる方法。

（チオール基のピリジル・ジスルフィド基への変換は、
４．４’−ジチオジピリジンなどにより行うことができ
る） （６）該物質Ｅ及び該標識に、存在する又は導入した、
アミン基又はチオール基と、ｐ−ベンゾキノリン全反応
させる方法。

（７）　　モノヨー）’酢酸ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルを、該物質Ｅ及び該標識に、存在する又は
導入した、チオール基に反応させる方法。

（８）該物質Ｅに対する抗体、該標識に対する抗体、及
び前２者の抗体に共通に特異結合する抗体を反応させる
方法。

（９）該物質Ｅ・該標識の片方をアビジンと残シをビオ
チンと結合しておき、両者をビオチン・アビジン結合に
より結合させる方法。

本発明に使用する物質Ｄ２すなわち、前述の標識物Ｃの
標識部位に特異的に結合して、該標識に起因する信号？
変調させる物質りは、使用する標識に対応して選ばれる
べきものであり、下記のような物質１ｒ　９１に挙げる
ことができる。

１、　都識が「酵素」である場合 ０標識に起因する信号 該酵素活性による基質の減少・生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化 ０好ましい物質り 該酵素に対する阻害剤 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの ２　標識が「蛍光物質」である場合 Ｏ標ａＩ／ｃ起因する信号 該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光、 ０好ましい物質り 該標識に対する抗体及びその誘導体で、該標識の蛍光波
長・強度を変化させるもの。

上記の各種吸収物質の具体別はいずれも当業者によぐ知
られておシ、あらためて開示するまでもないが本発明の
理解を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素阻害剤としては、ジャーナル　
オプ　ジ　アメリカン　ケミヵルソサイアティ（：ｒ、
　ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　ＳＯＣ）第８０巻、第４５６頁
（１９５８年）；同第８２巻、第５９６頁（１９６０年
）：アカウンツ　オブ　ケミカル　リサーチ（ＡＣＣ，
Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ　）　　第９巻３１５頁（１９７６
年）：サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）第１８５巻３２
０頁（１９７４年）：化学工業１９８５第２１頁（１９
８５年）などに記載された、若しくは引用された酵素阻
害剤などが好ましく用いられ、また以下に開示した阻害
剤も好ましく用いられる。

酵素阻害物質の例 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルドファイア（ｗｉ１＋１ｆｉｒｅ　）毒素ブルー
デキストラン ０−ジアニシジン−セルロース ０−ジアニシジ／−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリシン アミノアセトニトリル ２−アミノ−３−ヒドロキシプロビル−１，３′−カル
ボキシ−３′−アミノ−１′−プロペニル−１エーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−トランス−５−ブテン
酸 エタノールアミン　０−サルフェート アルビシイン アザセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソノアノルバリン Δ３−７−アミノセファロスポリン酸 ミモシン ２−アミノ−４−ペンテン酸 ２−アミノ−４−クロロ−４−ペンテン酸３．３−ジク
ロロアラニン ４３．３−トリクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロヤシルー５−ブチン酸 Ｎ、Ｎ−）ジメチル−２−プロピニルアミンβ−アミノ
プロピオニトリル ２−ブロモエチルアミン ３−デシメイル−Ｎ−アセチルシステアミンλ５−デカ
ジェノイル−Ｎ−アセチルシステアミン β−クロロ−Ｌ−アラニン Ｌ−セリン−〇−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン ガバクリン ５−ニトロ−Ｌ−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン ３−ジメチルアミノ−１−プロピン グリセａ−ル ジイソプロピルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライドクラプラン酸 アロプリノール ブチルチン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ペスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロフランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 キレニド化剤 重金属イオン 水銀化合物　　　　　　　等 本発明における多孔質反応層とは、該特定成分Ａ、該物
質Ｂ、該標識物Ｃ１及び該物質りの間に起きる結合反応
を行う層であり、該物質Ｂ及びＤは反応層の一部若しく
は全部に固定化されている必要がある。また、反応時間
中流体試料？保持するために、反応層の一部若しくは全
部に、流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙孔（短
径５μｍ〜５００μｍが好ましい）ｆｊ！：有する多孔
性構造が存在していることが必要である。

上記の条件２満たしていれば、該多孔質反応層の素材は
特に限定されない。

好ましい例としてはサイズ１０〜３５０μｍの粒状体あ
るいけ４０〜４００メツシユの繊維から１つ以上選ばれ
た素材によシ構成される構造体が挙げられる。

該粒状体の材料としては、例えばケイ藻土、二酸化チタ
ン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロー
ス、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストラン、
架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロース
、キチン、キトサン、各種合成樹脂（ポリスチレンなど
）などの他、下記のような反応性基を持つ化合物から成
る自己結合型粒子が挙げられる。

例示化合物 （１）　　ポリ（スチレン−コーグリシジルメタクリレ
−ト　）［９０／１０Ｆ （２）　　ポリ（スチレ／−コーメチルアクリレートー
コーグリシジルメタクリレート）　Ｃ８０／１５１５］ （３）ポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルメタクリレート
−コーグリシジルメタクリレート）〔７５／１５／１０
〕 （４１ホＩＪ（スチレンーコービニルベンジルクロライ
ドーコーグリシジルメタクリレート）〔８０／１０／１
０］ （５）　　ポリ（スチレンーコージビニルベンゼンーコ
ーグリシジルアクリレー））〔９０／２／８〕 （６）　ｙｔｅ　Ｉ）　（ｐ−ビニルトルエン−コーグ
リシジルメタクリレ−）　）　［９０／　１０　］（７
）　　ポリ（メタクリレート−コーグリシジルメタクリ
レ−））［：ｓｏ／ｚｏｌ （８）　　ポリ（スチレンーコーＮ、１４−ジメチルア
ミノエチルメタクリレ−）　）　Ｃ９５１５３（９）ポ
リ（スチレンーコーアジリジルエチルメタクリレート）
〔９５１５〕 叫　ポリ（スチレンーコーメチルアクリレート−コーア
クロレイン）　Ｃ９ｏ／ｓ／ｓ　］αル　ポリ（スチレ
ンーコーアクリルアミド）［９５１５］ （６）　ポリ（スチレンーコービニルチオール）［９５
１５コ α：ｌ　ポリ（スチレンーコーメチロール化アクリルア
ミド）（９５１５］ Ｑ４　　ポリ（スチレン−ツーをブチルアクリレート−
グリシジルメタクリレ−））（９０１５１５〕 （至）　ポリ（スチレンーコービニルイソシアネート　
）　〔９５１５〕 αＱ　ポリ（メチルアクリレートーコースチレンーコ−
Ｎ−メｆローＡ／　７３ｙ　Ｉフルアミド）〔５゜１５
５／１５〕 αη　ポリ（スチレンーコーグリシジルメタクリレート
ーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）
〔９０１５１５〕 α神　ポリ（スチレンーコーメタクＩＪ　ル酸−コーア
クリルアミド）　Ｃ９５／２１５　］西　ポリ（スチレ
ンーコーＮ−メチロールアクリルアミドーコーアクリル
酸メトキシエチル）［９０１５１５］ ｚ　　ボ＋７（ｐ−ビニルトルエン−ツー１！−メチロ
ールアクリルアミドーコーアクリル酸）［９０／　８　
／　２　］ ？珍　ポリ（メチルメタクリレートーコーグリシジルメ
タクリレートーコーをブチルアクリレ−ト　）　〔８０
／　１０　／　１０　］ＨボｌＪ（スチレンーコーｐ−
ビニルペンジルクロライドーコーアクリル酸−コーアク
リル酸ウレイドエチル）［７５／１０１５／１０１に）
ポリ（スチレンーコーメタクロレインーコーα−ヒドロ
キシエチルメタクリレート）Ｃ９ｏ　／　５　／　５　
］ （ハ）ポリ（スチレンーコーアクロレインーコーアセト
アセトキシエチルメタクリレート）［：　８５１５／１
０　］ （ハ）　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノ
エチルアクリレートーコービニルスルホニルエチルメタ
クリレー））［９０１５１５コ＠、ｔ’１Ｊ（ｐ−ビニ
ルトルエンーコーアミノスチレンーコービニルスルホニ
ルエチルメタクリ　レー　ト　）　　［ｓ　　５　／　
　１　ｏ　　／　　ｓ　　３（社）　ポリ（スチレンー
コーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）［
９０／１０Ｆ（ハ）　ポリ（スチレンーコーアクリル酸
）〔９７／３〕 四　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）［９７／　
ｓコ （至）　ポリ（ｐ−ビニルトルエン−ニーをブチルアク
リレ−）　）　［９５１５］Ｇ η　ポリ（メチルアクリレートーコーメタクリルアミド
）　［：　９５１５　］０ ９　　ポリ（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリルア
ミド）１：９５１５］ （３３ポ！Ｊ（ｐ−ビニルベンジルクロラｆドーコ−Ｎ
−メチロールアクリルアミド）［”　９６／４〕 （ロ）　ポリ（スチレンーコーイタコン酸）　［１，９
８／２　〕 （至）　ポリ（スチレンーコーを−・ブチルアクリレ−
ト　）　〔９２／　８　〕 （至）　ポリ（メチルアクリレートーコースチレンーコ
ーアクロレイン）　（ｓ　ｏ　／　６　ｓ　／　ｓ　〕
（６口ポリ（メチルメタクリレートーコースチレンーコ
−２−ヒドロキシエチルメタクリレート　）　〔２５／
７０　／　５　〕 （至）　ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエチル
アクリレート）［ａｏ／２ｏ〕 に）　ポリ（スチＶンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエ
チルアクリレート）〔９０／１０〕顛　ポリ（スチレン
−メチルアクリレート−コーアセトアセトキシエチルア
クＩＪＶ−ト）〔９０１５１５〕 Ｏ］）　　ポリ（スチレンーコーメタクリル酸）（ｑ　
ｓ　／　ｓ　］ 各例示化合物の稜の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重塁％を示す。

あるいは、これらの粒子数種？混合して用することもで
きる。

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、パ
ルプ（粉末戸紙など）、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キ
トサン、セルロースエステル、ビスコースレーヨ／、銅
アンモニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６．
６−ナイロン、６．１０−ナイロンなど）、ポリエステ
ル（ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオレフィ
ン（ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石
綿など。植物性・動物性・鉱物性・合成・半合成・再生
繊維を用いることができ、あるいはこれらを混合して用
いても良い。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は製膜することＫより、流体試料と自
由に接触し得る相互連絡空隙孔？有する多孔性構造が存
在する多孔質反応層？形成する。自己結合性全方しない
粒子は適当な接着剤？用いて粒子同志が点接着する形で
製膜することができ、例えば特開昭４９−５５８８８号
、同５５−９０８５９号、同５７−６７８６０号各公報
の方法？適用することができる。自己結合性全方する有
機ポリマー粒子は特開昭５７−１０１７６０号、同５７
−１０１７６１号：同５８−７０１６３号各公報に記載
の方法によシ同様に製膜できる。繊維又は繊維及び粒子
の混合物については特開昭５７−１２５８４７号、同５
７−１９７４６６号各公報に記載された繊維分散液？塗
布することにより多孔質反応層を形成できる。また特願
昭５９−２８５７１号明細書で行われている方法のよう
にゼラチンやポリビニルピロリドンのような水溶性バイ
ンダー全使用した繊維分散液を塗布することも可能であ
る。

このような分散液を製造するためには、多くの方法を単
独又は組合せて用いることが可能である。例えば有用な
方法の１つとして、界面活性剤？液体キャリヤーへ添加
し、粒子及び／又は繊維の分散液中における分布及び安
定化？促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ンＸ−１ａａ（ローム　アンド　）−一ス社製、オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタール）、サーファクタン
ト１０Ｇ（オリーン社製、ノニルフエノキシボリグリク
ドール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は、広範に選択された舒全用いることが
可能であるが、粒子及び／又は繊維の重？に対して１０
重ｌ優〜ｎ、ｏｏｓ重険係、好ましくは６重４％〜１０
５重囲鳴用いることができる。更に別の方法として、該
粒子及び／又は繊維と液体キャリヤーの音波処理、物理
的混合、及び物理的かくけん処理、ｐＨ￥ｉ４整などが
ある。これらは前記の方法と組合せることにより、更に
有用である。

また、繊維や粒子等に固定された該物質Ｂ及びＤ２又は
該標識物Ｃの活性を保持し、多孔質反応層又は後述の層
中に含有させるために、特願昭６０−１９５２４号明細
書に記載の方法と用いることができる。

あるいは別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、Ｆ紙、
プラッシュポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維
（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど）、
動物性繊維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン
、ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロビ
レ／ナト’）　、再４ｊＪｌｌ維（レーヨン、セルロー
スエステルなど）などを単独あるいは混合して製造した
織物、不織布、合成紙などを該多孔質反応層に用いるこ
ともできる。

該物質Ｂ及びＤの多孔質反応層への固定化は、種々の公
知の方法により、該物質？数多孔質反応層の表面に物理
的に吸着させるか、化学反応により直接あるいは間接的
に結合させることにより達成される。この際該物質の該
特定成分に対する特異的結合性が失われなｈように留意
する必要があり、例えば石川栄治、回合忠、宮井潔編「
酵素免疫測定法（第２版）」（へ学書院、１９７８年刊
）、千畑一部、土佐四組、松尾雄志著「実験と応用　ア
フイニテイクロマトグラフイー」（講談社　１９７６年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例として
挙げることができる。

また、多孔質反応層への該物質Ｂ及びＤの固定化は、特
異結合部位が保持されており、かつ流体試料中に遊離、
溶解した状態でなければよく、流体試料中に不溶の状態
で分散されていてもよい。また、カラー写真で用いられ
るカプラーの分散に用いられる方法〔例えば日本写真学
会綿［写真工学の基礎、銀塩編」（コロナ社１９７８年
刊）〕、脂質二分子膜中に含有させる方法等も使用でき
る。

また、該特定成分と特異的に結合し得る物質を固定化し
た後に、必要に応じて免疫反応における非特異的反応を
排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与しないタ
ンパク質を担持することが可能である。それらの代表的
な岡としては、哺乳動物の正常血清タンパク質、アルブ
ミン、ゼラチン及びその分解物等が挙げられる。

これらの固定化操作は、前述の粒状体あるいは繊維にあ
らかじめ行っておいた後、多孔質反応層を形成しても良
く、あるいは多孔質反応層を形成した後に該固定化操作
２行うことも可能である。

前者の場合、該物質Ｂを固定化した粒状体又は繊維及び
該物質りを固定化した粒状体又は繊維の他に前述の特異
的反応に関与しないタンパク質のみを固定化した粒状体
又は繊維を調節の九めに加えることも可能である。

本発明による分析素子において、標識酵素に起因した信
号は、吸光度法（比色法）、蛍光法又は、発光法で検出
することができ、測定法としては信号の経時的変化を測
定するレート測定法又は、一定時間後の信号を測定する
エンドポイント測定法で測定することができる。吸光度
法（比色法）では、紫外光、可視光、近赤外光を利用す
ることができ、例えば流体試料として血清を用いる場合
には、血清による吸光の影響を小さくするために緑色光
、赤色光又は近赤外光全利用するのが好ましい。

本発明の特徴はここで用いられる「該特定成分Ａと特異
的に結合し得る物質Ｂ」及び「該物質Ｂに結合していな
い該標識物Ｃの標識部位に特異的に結合して該標識に起
因する信号を変調させる物質Ｄ」の含有量に関する。本
発明者らは検討を重ねた結果この含有量が分析素子の性
能に極めて大きな影響を与えること？見出した点にある
。

すなわち、該物質Ｂの含有量が不足していると流体試料
中の特定成分ム及び＃標識物Ｃが該物質Ｂと充分結合せ
ず、また逆に該物質Ｂの含有量が過剰である場合は該特
定成分ムのむにかかわらず該標識物Ｃのほぼ一定量が該
物質ＢＩＣ結合する現象が起き、どちらも満足な検量線
を与えない。

また、該物質りの含有量が不足していると、該物質Ｂ及
びＤと結合せず分析素子中の流体試料中に残存する該標
識物Ｃが増加することによシ信号のパックグラセンドが
増大する。逆に該物質りの含有量が過剰であると該物質
Ｂと結合する該標識物Ｃが極めて少なく々す、いずれの
場合も測定が困難となる。

そこで、該物質Ｂ及びＤの好ましい含有量について、本
発明者らは検討？更に重ねたところ、次の事実が見出さ
れた。すなわち、該物質Ｂ及びＤの好ましい含有量は、
該標識物Ｃの量、該標識物Ｃと該物質Ｂのアフィニティ
ー、該標識物Ｃと該物質りのアフィニティー、該特定成
分Ａと該物質Ｂのアフィニティー、該物質Ｂ及びＤの多
孔質反応層への固定化方法、等の要因により変動する。

また、単位面積当りの多孔質反応層に含まれるべき該物
質Ｂ及びＤの含有量は、該流体試料の一定量を該多孔質
反応層に適用した際の、該流体試料の展開面積にも左右
されることは言うまでもない。

また、該物質Ｂ及びＤけ生体由来の物質？用いる場合が
多く、こうした場合核物質の完全な純品を入手するのは
事実上不可能であり、またロットによる純度のバラツキ
も避は得ない。このような場合、該物質Ｂ及びＤの好ま
しい含有ｉｔｔ質量やモル数など物理的な単位で規定す
るのけ無意味であり、むしろ該物質の総活性などを単位
として規定されるべきである。

本発明者らはこうした多数複雑な要因により変動する該
物質Ｂ及びＤの好ましい含有量について明確かつ簡単な
基準を見出すべく、更に努力２重ねた結果、本発明全完
成するに至ったのである。

すなわち、該物質Ｂ及びＤの好ましい含有量は既に概説
したように規定される。

該標識物Ｃの総量のうち、３〜７０％、好ましくけ３〜
５０ｓ１更に好ましくは１０〜２５惨が該物質Ｂと結合
しているのが必要である理由は、この数値より不足又は
逆に過剰のいずれの場合にも、満足な検量線を与えない
からである。

また該標識物Ｃの総量のうち、０．１〜１０幅、好まし
くけＱ、１〜５％が、該物質Ｂ及びＤと結合しないフリ
ーの状態とするのけ、１０％？越えると信号のバックグ
ラ紮ンドが増大し、逆にＱ、１％未満となると、該抗原
又は抗体と結合する該標識物が極めて少なくなり、いず
れの場合も、測定が困難となるからである。

読物’Ｊ’（Ｂ及びＤに結合していない該標識物Ｃけ、
信号の測定の際のバックグラ〜ンドとなるので、少ない
方が好ましいと予想されるが、本発明者らは検討を重ね
た結果、この該物質Ｂ及びＤに結合していない該標識物
Ｃが、分析素子内の反応に関与した該標識物０の総量の
［１１％未満である場合は検９線の形状に好ましくない
影響（測定可能範囲が非常に狭くなるなど）を与えるこ
とを発見した。

すなわち、このような場合は、いわゆるＳ字状曲線型の
検ｍ線の曲がり方がきつくなり、測定可能範囲が非常に
狭くなる。しかも、該物質Ｂ又はＤの固定化０若しくは
活性のわずかな変動によって、検量線が著しく変動する
たぬ、一定な検量線？与える該固定化物の１．Ｌ産が著
しく困難になる。これは全く予想できない驚嘆すべき結
果であった。

更ＶＣ、本発明について詳説する。

該特定成分Ａを実質上含有しない流体試料とは、該流体
試料から特定成分Ａをアフィニティークロマトグラフィ
ー等で完全に除去したものが好ましいが、該流体試料中
に含まれる特定成分Ａが本発明の実施者が意図する目的
に対して無視しうる量であることが確認されておれば充
分であり、場合によっては蒸留水、生理食塩水、特定成
分Ａを含まない適当なタンパク溶液などで代用すること
も可能である。

所定の分析操作とは、実施を意図する態様において、該
流体試料の一定量を該分析素子に滴下、所定の時間所定
の温度でインキュベートすることを意味する。態様によ
り、該標識物Ｃなど必要な試薬が分析素子に内蔵されて
いない場合、必要に応じて該試薬を一定量添加すること
も該分析操作のうちに含まれるのは言うまでもない。

「所定の分析操作？終了した時点」というのは、いわゆ
るエンドポイント測定法の態様においては該分析素子の
信号を測定し終えるべき時刻を意味し、レート測定法の
態様においては最終の信号測定を終えるべき時刻を意味
する。

「反応に関与した該標識物０の総量」とは、該標識物Ｃ
が分析素子に内蔵されている態様においては、該分析素
子内に展開した流体試料により溶出し、実際に反応に関
与した該標識物Ｃの総量？意味し、該標識物Ｃ含有層に
おける該標識物Ｃの面積濃度及び該流体試料の展開面積
よりそれを知ることができる。該標識物Ｃをあらかじめ
流体試料に添加しておく態様においては分析素子に適用
された流体試料中に含有される該標識物Ｃの量がすなわ
ち反応に関与した該標識物の総量である。

この該標識物の総量は実施者が意図する測定範囲に応じ
て設定されるべきもので、該反応において測定下限濃度
における流体試料中の該特定成分Ａの絶対量の１０〜２
０倍となるように設定するのが好ましい。

以上の条件により設定される該物質Ｂ及びＤのｔｆｔ具
体的に知るには種々の方法がある。

該多孔質反応層に固定化された状態における該物質Ｂ及
びＤと該標識物Ｏのアフィニティーが結合反応の平衡定
数等、定量的な形で判明している場合は、シュミレーシ
ョン等の方法において好ましい量？知ることができる。

しかし、よシ簡便かつ確実な手段としては、好ましいと
予想される範囲で、あらかじめ該物質Ｂ及びＤの量を変
化させた予備試験用分析素子を数種類作成し、該特定成
分Ａを実質上含有しない流体試料を用いて実際に検定す
ることが挙げられる。

この場合、該予備試験用分析素子は本発明の実施者が意
図する態様において作成するべきであるのは言うまでも
ないが、該標識物Ｃと該物質Ｂ及びＤの結合反応に実質
的に影響を与えない範囲において該検定が容易に行える
よう変更を加えることができる。（例えば標識が酵素で
ある場合、該酵素の基質、発色試薬は分析素子に内蔵さ
れていない方が該検定が容易となる場合がある。） 該検定の方法は標識の種類により、細かい点で若干異な
る場合があるが、当業者は、本発明の実施例を参考に、
該検定を容易に行うことができる。

また、数種類の条件について検定を行えば、前述の該物
質Ｂ及びＤの過不足によって起きる現警についての記載
を参考に本発明が設定する該物質Ｂ及びＤの具体的な！
ｌを決定することも極めて容易である。

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるものであれば
よく、特に制限されるものではないが、製造上及び操作
・測定上、フィルム状、あるいはシート状であることが
好ましい。

更に詳しく言えば、従来の生化学用分析素子に用いられ
ているマウント付スライド状の形態、あるいは尿試験ス
トリップに用いられているような細長い支持体の一端に
分析素子が形成されている形態などはいずれも好ましい
ＶＡＩであり、また多検体連続分析用等にはロールフィ
ルム状の形態？とることも好ましい。

本発明の分析素子の理解を助けるために、以下図向に基
づいて具体的に説明するが、これは本発明？限定するも
のではない。

本発明の態様は、該物質Ｂ及びＤが多孔質反応層の同一
部分に固定化されて含有される場合、及び多孔質反応層
が２層以上に分れており該物質Ｂ及びＤがそれぞれ別の
層に固定化されている場合？含む。

以下、これ？区別するため、該物質Ｂ及びＤが含まれる
多孔質反応層全［多孔質反応層Ｂ・ＤＪ、該物質Ｂのみ
？含む多孔質反応に１？［多孔質反応層ＢＪ、該物質物
質み？含む多孔質反応層を「多孔質反応層Ｄ」と称する
。

第１図は本発明による分析素子の最も単純な態様の断面
図の一例である。この場合は多孔質反応ｒｆ４Ｂ　−Ｄ
　Ｉのみで分析素子が構成されている。

第２図は第１図の拡大図である。第２図において符号２
は該物質Ｂが固定された粒状体、３は該物質りが固定さ
れた粒状体セして４は調整のため添加された粒状体であ
る。

第２図は粒状体２．３及び４が均一に混合され点接着す
ることにより多孔質反応層Ｂ−Ｄが構成されていること
？示している。

第３図は標識物Ｃの模式図であり、符号８は流体試料中
の特定成分Ａ又はその類縁体、９は標識、１０は標識物
Ｃ？意味する。

第４図は本発明？説明する模式図であり、符号５は該物
質Ｂ、６は該物質Ｄ、７は流体試料中の特定成分ムを意
味する。

第１図〜第４図により本発明の分析素子の反応機構全説
明する。

まず流体試料の一定量をはかりとり、前述の標識物Ｃの
一定量と混合し、第１図の分析素子に滴下する。

流体試料中の特定成分ム及び添加された標識物Ｃは、第
２図の粒状体２０表面に固定化された「流体試料中の特
定成分Ａに特異的に結合する物質」Ｂと競合的に反応す
る。更に標識物Ｃは粒子５の表面に固定化された該物質
りとも反応する。（第４図） 一定の反応時間の後のｅ４識物Ｃは イ、流体試料中の特定成分Ａに特異的に結合する物質Ｂ
’）固定化した粒子に該物質を介して吸着される 口、該物質Ｄｉ固定化した粒子に該物質を介して吸着さ
れる ハ、流体試料中に残存する ０３通りの状態にある。

流体試料中の特定成分ムと標識物Ｃの競合反応の結果に
、イの割合は支配され、該特定成分Ａの濃度が高いほど
イの割合は低くなり、口の割合が高くなる。口の状態の
標識物Ｃはその標識部位と該物質りとの結合により該標
識に起因する信号が変調されるので、流体試料中の特定
成分Ａの濃度と、標識物Ｃ全体の信号強度の間には関数
関係が成立する。そこであらかじめ特定成分Ａの濃度が
わかっている流体試料（標準試料）全数種類用いて検量
線を作成しておけば、未知の流体試料中の特定成分の濃
度を知ることができるようになる。

信号の測定方法は標識の種類により異なる。

ｆ９１Ｊえば標識が蛍光物質であれば、分析素子に励起
光？当て、蛍光強度？測定すれば良い。標識が酵素であ
れば適当な基質、必要ならば酵素や発色試薬？含む溶液
を添加し一定時間インキユベートした後に、該発色系に
適合した波長の光の反射濃度（基質の種類によっては蛍
光強度、発光強度）を測定することにより信号強度を測
定できる。

酵素活性測定に必要な基質、発色試薬は、標識酵素ごと
に異なり、各酵素について多くの公知の試薬音用いるこ
とができる。これらは標識酵素に触媒される化学反応に
よφ、分光特性の変化を生じる成分を含んでいる。分光
特性の変化とは、可視光に対する吸光度の変化のみなら
ず、紫外光、赤外光に対する吸光度の変化も意味するし
、蛍光等吸収波長と異なる光の発光、吸光？伴わない発
光も意味する。史には消光も意味する。また、これらの
分光特性変化は該酵素が触媒する化学反応により直接的
に生じるもののみではなくて、該酵素反応の生成物が更
に他の触媒、酵素により別の化学反応？起こし、その結
果該分光特性が変化するような場合も含む。本発明にお
ける基質、発色試薬とは、こうした分光特性変化を生じ
るために必要な、標識と異なる触媒、酵素や反応系に必
要な種々の基質、補酵素、緩衝剤といったものをも含む
混合物を意味する。

一例？挙げれば、標識がペルオキシダーゼである場合は
、過酸化水素を（ＬＯＯ１〜１１０憾含む緩衝液（ｐＨ
４，０〜９．０）に下記に例示した化合物のうちの１種
若しくは数種を選んで溶解したもの？用いることができ
る。

（］）　］０−シアニジ ン２）０−トリジン又はその酸塩 （３）０−フェニレンジアミン又はその酸塩（４１グア
ヤク （５）　　アドレナリン （６）　フェノールフタレイン （７）　フェロシアン化物 （３）　４−アミノアンチピリン、及びその誘導体又は
それらの酸塩とフェノール又はナフ）　−ル又はそれら
の誘導体との組合わせ （９）　　アニリン及びその誘導体 ＱＩＩＯ−）ルイジン、ｐ−トルイジン等のモノアミン
類 α１０−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ′−ジメチル−ｐ
−７二二レンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジエチルフェニレン
ジアミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類 （ロ）　フェノール、チモール、０−ｌｍ−及びｐ−ク
レゾール、ａ−す７トール、β−ナフトール等のフェノ
ール類 （至）　カテコール、グアヤコール、オルシノール、ピ
ロガロール、ｐ、ｐ−ジヒドロ、キシジフェニル、フロ
ログルシノールのようなポリフェノール類 α◆　サリチル酸、ビａカテキン酸、没食子酸のような
芳香族の酸 （至）　ロイコマラカイトグリーン、ロイコフェノール
フタレインのようなロイコ染料 αＱ　　２．６−シクロロフエノールインドフエノール
のような着色染料 αη　エピネフリン、フッダン類、チロシン、ジヒドロ
キシフェニルアラニン、トリプトファンのような種々の
生化学物質 （至）　２．２′−アジノジ（３−エチル−６−スルホ
ペンジチアゾリン）又はその塩、及び３．ｓｌ　−ジア
ミノベンジジンのような特殊染料 ａ１　　その他、グアヤゴム、グアヤコール、ヨウ化カ
リウム、ヨウ化ナトリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並
びにビリルビンのような物質本発明の分析素子は前述の
多孔質反応層が最低必要構成要素であるが、発明の効果
をより一層発揮するために種々の補助層を設けることが
できる。第５図〜第１１図及び第１３〜第１５図に本発
明の分析素子の１実施の態様を表す断面概略図を示す。

なお第１２図は、第１１図の分析素子の斜視図である。

第５図に示した本発明の分析素子は光透過性支持体１１
の上に多孔質反応層Ｂ−Ｄが積層されており、支持体の
存在により素子の取扱い性が向上している。

このような目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セル
ロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な高分子化合物、あるいけガラスのような透明無機化合
物が挙げられる。該多孔性反応Ｊ′ＶＩＢ−Ｄはこのよ
うな支持体の上で直接塗布及び／又は製膜するか、ある
いはいったん多孔質反応層Ｂ−Ｄを別に形成した後に前
述の支持体に貼りつけても良い。第５図に示した態様の
場合、流体試料は多孔質反応層Ｂ−Ｄ側から滴下する必
要があるが、信号の測定は両側から行うことが可能であ
る。

第６図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
１２の上に多孔質反応層Ｂ−Ｄが設けられている。この
態様では、試料滴下、信号測定とも多孔質反応層Ｅ−Ｄ
側から行い、信号を反射濃度で測定する際に光反射性支
持体がそれを容易にしている（信号を蛍光強度で測定す
る際は黒色の吸光性支持体を同じように用いることで同
様な効果を得ることができる）。

このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミックス、金属、あるいけ
樹脂被覆等で防水処理？施した紙等が挙げられ、これら
の材質に必要ならばＴ１０７、Ｂａ５Ｏいマイカなどの
白色顔料等ｔａ布するか含有させることにより目的？果
すことができる。

第７図の態様も同様な目的によるもので、光透過性支持
体１１の上に多孔質反応層Ｂ−ＤＩ、光反射層１３が順
に積層されている。この態様では試料は光反射層側から
滴下され、信号測定は光透過性支持体側から行われる。

光反射層は公知の分析素子及びその類似品に用いられて
いたもの？いずれも使用できるが、好ましくは多孔質反
応層Ｂ−Ｄに用いられるのと同様な粒状体及び繊維に前
述の白色顔料等？含有させ念もの？塗布又は製膜するか
貼りつけることができる。史に好ましくは内部に白色顔
料？含有する粒状体の表面に多孔質反応層Ｂ−Ｄに用い
る時と同様に流体試料中の特定成分に特異的に結合する
物質Ｂ及び物質Ｄ’ｌＨ固定化し、下層の多孔質反応層
Ｂ−Ｄと同様の機能を持たせた光反射層？設けることが
できる。このような特殊な光反射層を用いると、光反射
層内に多くの未反応標識物Ｃが残ることを防止できる。

第８図の態様では多孔質反応層Ｂ−ＤＩの上に標識物Ｃ
含有層１４が設けられている。標識物Ｃ含有層は多孔性
媒体に面積濃度が一定となるように標識物ｃｌ含有させ
た層であり、流体試料の一定量を滴下すると一定量の標
識物Ｃが溶出され、多孔質反応層に試料と共に拡散する
ものである。素材としては多孔質反応層Ｂ−Ｄと同様の
ものを塗布、製膜、貼付しても良く、あるいけ吸水性の
洋紙、和紙、ｐ紙、プラッシュポリマー、あるいけガラ
ス繊維、鉱物性繊維（石綿など）、植物性繊維（木綿、
麻、パルプなど）、動物性９．維（羊毛、絹など）、合
成繊維（各種ナイロン、ビニロン、ポリエチレンテレフ
タレート、ポリプロピレンなど）、再生繊維（レーヨン
、セルロースエステルナト）ナト？単独あるいは混合し
て現遺したｉ魔物、不織布、合成紙などで作成した標識
物Ｃ含有層？貼付しても良い。また必要に応じてこの標
識物Ｃ含有）に前述の光反射層の効果を合せ持たせるこ
とができる。第８図の態様の場合標識が蛍光物質であれ
ば、流体試料のみを滴下し、インキュベートすれば直ち
に測定が可能である。標識が他の物質の時は、流体試料
？滴下後一定時間インキユベートした後、必要な基質、
発色試薬等？含む溶液を滴下することにより測定できる
。

第９図も標識物Ｃ含有層？有する別な報様である。この
場合は下から順に光透過性支持体１１、標識物Ｃ含有層
１４、タイミング層１５、多孔質反応層Ｂ−ＤＩが積層
されている。タイミング層は写真化学の分野で広く知ら
れている技術であり、例えば硬膜度を適当に調節したゼ
ラチン層などが用いられる。本態様においては流体試料
滴下後、試料中の特定成分が多孔質反応層Ｂ−Ｄ中の対
応する粒子の表面にある程度吸着された後に！Ｑ識物Ｃ
が多孔質反応層に放出される。このような方法はディレ
ードアディジョンとして広く知られ、本発明においては
特に有効である。

本態様のように標識物Ｃ含有層が最上層以外の部分にあ
る場合、標識物Ｃ含有層に用いる素材としては前述のも
のの他にゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロー
スなど）、カルボキシメチルセルロース、とドロキシエ
チルセルロースなどの親水性高分子物質、あるいはビニ
ルピロリド／、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体
、ビニルアルコール、スルホニルスチレンなど全モノマ
ーとしたホモポリマーあるいはコポリマーといった連続
バインダーを塗布して用いる方法がある。更に別な態様
としてはこうした親水性高分子物質やポリマーの膜厚及
び組成を調節することにより標識物Ｃ有層からの標識物
溶出速度？制御し、タイミング層の機能全も兼ねさせる
ことが可能である。

第１０図に示した態様は標識が蛍光物質以外の際（信号
測定に当り何らかの形で酵素反応を利用する標識の場合
）特に有用なものである。

試薬層１６は、酵素活性測定の際に必要な基質、発色試
薬？含有させた少なくとも一層の親水性コロイドからな
る。

本発明による分析素子において、基質や発色試薬は、親
水性コロイドから成るバインダー中に溶解、あるいは分
散して塗布液とすることができる。特に疎水性化合物の
分散には、写真業界で多用されているオイルプロテクト
分散法、直接分散法等種々の公知の分散法を用いること
ができる。

更に、本発明に係る試薬層に用いられる親水性コロイド
は、ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビ
ニルイミダゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル
酸ナトリウＡ％の合成高分子物質、ヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等
のセルロース誘導体等の多糖類等が挙げられる。そして
好ましくはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘
導体が挙げられる。

更に、本発明に係る試薬層のバインダーは、その膜物性
、例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のために、一部
？他の水分散性高分子重合体、すなわち高分子ラテック
スと置換することができる。好ましい高分子ラテックス
の例としては、例えば特願昭５６−１９３１号、同５６
−１７７５９６号各明細書に記載のものが有用である。

これらの高分子ラテックスは、親水性コロイドバインダ
ーの最大７０％を置換することが可能であるが、好まし
くは約５５％以下の置換でよい。

試薬層には、他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、硬膜
剤、界面活性剤、媒染剤等を、目的に応じて添加するこ
とができる。

緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適
したｐＨとするために使用される。

使用可能な緩衝剤の例としては、日本化学金線、「化学
便覧基礎編」〔丸善■１９６６年刊〕第１３１２〜１３
２０頁、Ｎ、ＩＣ，グツド（Ｎ、　Ｋ、　Ｇｏｏｄ）ほ
か、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）第５巻＠　４６　ｙ頁（１９６６）、金材、斉藤、化
学の領域第３０巻（２）第７９頁（１９７６）、Ｗ、　
Ｊ、ファーグツｙ　（ｗ、　Ｊ、　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ　
）　　ほか、アナリチカル　バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１０４巻第５００頁（１９８０
）等の文献に記載されているものを挙げることができる
。具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、
トリス（ｔｒｉａ）、バルビタール、グリシン、グツド
緩衝剤等が挙げられる。

これらの緩衝剤は、必要に応じて、試薬層以外の層に含
有させてもよい。

保恒剤は、基質、発色試薬の保存安定化のために含有さ
れ、酸化防止剤などがある。

また本試薬）Ｍに限らず、すべての層において固定化さ
れた物質ＢやＤ、及び酵素標識物Ｃの活性保持のために
、固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイーの吸着
体、固定化抗体及びタンパク質や酵素等の保存に用いら
れる保恒剤を含有させることができる。その物質として
は、日本生化学金輪［生化学実験講座１、タンパク質の
化学１」（東京化学同人＠　１９７６年刊）第６６〜６
７頁前述の嘆験と応用アフイニテイクロマトグラフイー
」第１０３〜１０４頁、特開昭６０−１４９９２７号公
報等に記載されているものが挙げられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン、Ｂ１９Ａ、シフロブキストリｙｌＪ、非還元糖
類（スクロース、トレノ・ロース）、ポリエチレングリ
コール、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げ
られる。これらの保恒剤は、固定化された物質Ｂ、Ｄ及
び酵素標識Ｃの近傍に存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物ｉｆｆ　
を用いることができ、Ｔ、Ｈ，ジエイムス（Ｔ。

ＨｏＪａｍｅｓ　）　ｌｋｎ　ｒザ・セオリー・オプ・
ザ・フオトゲラフイック・プロセスＪ（ＴｈθＴｈθｏ
ｒｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏ
ｃｅｓｓ　）（第４版）第７７〜８７頁に記載されてい
るものを挙げることができる。具体的な例としては、ア
ルデヒド類、活性オレフィン類、活性エステル類等が挙
げられる。

界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。その他
の層中に含有させる試薬としては、溶解助剤、ブロッカ
−試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応じて適
当量添加する。

婬染剤は、酵素活性測定のための検出物質？、発色試薬
層に集中的に集めたり、検出物質が色素の場合、吸光度
係数？高めたり、波長をシフトさせる物質であり、検出
物質と強い相互作用を示す。

カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー及びこれらの
ポリマーのラテックスが用いられる。

試薬層と標識物含有層を設けることにより、蛍光物質以
外の標識？用いる場合でも、流体試料のみを滴下しイン
キュベートするだけで測定が可能となる。

この場合、多孔質反応層Ｂ−Ｄにおける反応が充分に進
行した後に試薬層の内容物が溶出されるのが好寸しく、
そのためには前述のタイミング層全試薬層の上に設ける
か、あるいは試薬層の組成を調整してタイミング層の効
果全持たせることが債ましい。また、同様の理由から試
薬層は分析素子の最下層（支持体がある場合はその上）
に設けることが好ましい。

なお、酵素反応系にベルオキシダーゼヲ用いる場合は、
基質として過酸化水素と適当な還元物質が必要である。

このうち前者は揮発性であり、そのまま素子の中に含有
させるのけ困難であるので、クメン・Ｈ！０２　　など
の形で含有させるか、流体試料が滴下された時点で過酸
化水素？発生させるのが好ましい。後者は、ＦＢＩえは
グルコースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミンオ
キシダーゼに代表される酸化酵素（反応生成物として過
酸化水素を生じるタイプのもの）と、その酵素の基質全
乾燥状態で試薬層に含有させるか、あるいは該酸化酵素
及び基質のうち片方？試薬層に片方をそれと異なる層に
含有させることによシ達成できる。

第１１図及び第１２図は、本発明の好ましい態様の一列
について断面図、斜視図を示したものである。分析素子
の取扱いが容易になるよう、全体がプラスチック製のマ
ウント１７で覆われており、マウント上部に試料注入孔
、下部に信号測定孔が開いている。

第１３図に示したのは本発明の別な態様である。符号１
８は光反射性多孔質反応層Ｄ５符号１９は多孔質反応層
Ｂ？意味する。この第１３図の分析素子の多孔質反応層
Ｄ１８に、流体試料一定量と標識物Ｃ一定量の混合物を
滴下する。

１９に固定化された「特定成分Ａに特異的に結合し得る
物質Ｂ」に対して、流体試料中の特定成分と標識物Ｃが
競合的に反応した結果、該標識物Ｃのうち一部は１９に
固定化される。前記反応にあずからなかった標識物Ｃは
光反射性多孔質反応層Ｄ１８に固定化された該物質りに
結合することにより１８に固定化される。ここで１９に
固定化された標識物Ｃのｐ　Ｈ＆に起因する信号の強度
と測定する。飼えば標識が酵素であるなら、素子の上面
（１８側）から酵素基質及び適当な発色試薬？含む溶液
を加え、一定時間インキュベートした後に素子の上面か
ら適当な波長の光の反射ａｐＪＬｔ測定する。この際、
１８に固定化された酵素はその活性が低下している上、
１８が光反射性を有しているために入射光がほとんど届
かないのでここに固定化された酵素に起因する色素は測
定に実質上形ｌ！！？及ぼさない。

ここに挙げた例からも明らかなように、本態様の分析素
子の特徴は多孔質反応層Ｂで特異結合反応にあずからな
かった標識物Ｃを、標識に対する特異結合反応を利用し
て光反射性多孔質反応層Ｄ１８へ分離し、史に該層に固
定化された該標識に起因する信号を消滅するか減じるこ
とにある。また、必要に応じ該吸収層に光反射性又は遮
光性？持たせるか、反射層あるいは遮光層？別に設ける
ことにより前述の光反射性多孔質反応／４Ｄ１８に固定
化された標識がわずかに信号２発してもそれが多孔質反
応層ＢＫ存在する標識に起因する信号を測定する際の障
害にならないようにすることができる。したがって測定
の際のバックグラ欺ンドやノイズが著しく減少し、感度
、精度、再現性に優れた測定が可能となる。

これらの反応層Ｂ及び反応層りは、同様又は別の多孔質
反応層に用いられる素材？、塗布、製膜、貼付けをして
もよい。

第１４図に示した本発明の１実施の態様では、多孔質反
応層Ｂ１９と光反射性多孔質反応層Ｄ１８の間にタイミ
ング層１５が設けられている。

この素子の上部に流体試料を適用すると、標識物Ｃ含有
層１４から溶出した標識物Ｃと、流体試料中の特定成分
が競合的に該多孔質反応層Ｂに固定化された該物質Ｂと
反応する。充分に該反応が完結した時点でタイミング層
１５が溶解することにより、流体試料は光反射性多孔質
反応層Ｄ１８に拡散し、該反応にあずからなかった標識
物Ｃは該Ｊす４に固定化される。このようにタイミング
層を用いて多孔質反応ＩノＢにおける競合反応を充分に
行わせるのは分析素子の感度を高める意味で好ましい１
実施の態様である。

第１５図に示した本発明の１実施の態様も、同様の趣旨
に基づくものである。分析素子はａ、ｂ２つの素子から
構成されている。流体試料をａの上面に添加して充分圧
反応させた後、ｂの光反射性多孔質反応７１１８’に密
着させることにより該反応にあずからなかった標識物Ｃ
を級収するものである。

その他、ａとｂとを、測定時にひきはがして用いてもよ
い。すなわち、ａとｂとを、流体試料の適用前には、一
体又は別離しておき、適用時には両者を接触させて反応
を完結させ、測定時に両者？別離して測定を行ってもよ
い。

本発明の分析素子は更に、流体試料を素子に適用した際
にその展開全補助する展開層、流体試料が血液（全血）
の際に必要となることがある血球分離層、必要に応じて
設ける接着層、保護層といった補助層を設けることがで
きる。これらの補助層及び前述の発色試薬層、標識物含
有層、タイミング層は独立して設けても良く、あるいは
複数の機能を併わせもった層として設けても良い。これ
らの層はその機能に応じて設けられるべき位置が容易に
決定できる。

〔実施例〕

以下、本発明全実施例によって更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （υ　抗ヒトエｇＧの固定化 Ｆ紙粉末Ｄ［東洋Ｆ紙■製］　１００　ｆ、蒸留水３０
０ｍ、　２ＮＮａＯＨ１３０ＴＩ＃ｔ、　１．４−ブタ
ンジオールジグリジルエーテルＳＣＪｍを混合し、室温
で１８時間かくはん後、７紙粉末を戸別、乾燥した。

α５　Ｍ　ＮａＨＣＯｌ　溶液２５−にヤギ抗ヒトエｇ
Ｇ（グロブリン分画）１５０ａｙを溶解し、先に作成し
た活性化繊維５ｆを加え室温で２４時間かくはんした。

繊維を戸別、水洗後にＩ　Ｍ　−）　ＩＪス塩酸溶液１
５〇−中に加え室温で１９時間かくはんし、戸別、水洗
し、（Ｌ　０１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，６）中
で冷蔵保存した。

（２）ｏ−ジアニシジンの固定化 戸紙粉末Ｄ〔東洋Ｆ紙■製〕１１？を、２．５Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ１２，１）２００−中に浸漬し３
〜１０℃においてかくはんしながら、１００−の臭化シ
アン溶液（０，０５ｆ／−）を徐々に加える。１０分間
反応させた後にＦ紙粉末を戸別し、氷冷した蒸留水及び
［１１Ｍ炭酸水素す）　ＩＪウムで唄に洗浄した。この
７紙粉末と０−ジアニシジンｆｐＨ９において暗所室温
で６時間反応させた後戸別し、ＩＭｌ−アミノ−２−プ
ロパノールと１晩室温で反応させ、水洗後乾燥した。

（３）予備試験用分析素子の作成 下引済ポリエチレンテレフタレートの１イルム上に、下
記のような組成の疑似発色試薬層？、水系塗布、乾燥に
より作成した。

次に（１）及び（２）で作成した戸紙粉末と未処理のＦ
紙粉末を種々の比率で混合し、５％牛血清アルブミン（
ＢＡＡ　）溶液中に懸濁し、４℃で３時間かくはん後凍
結乾燥した。この処理済Ｆ紙粉末を用いて次の組成の繊
維分散液を調製し、該疑似発色試薬層上に塗布乾燥した
。

以上のようにして、処理済ｐ紙粉末の組成の異なる予備
試験用分析素子■〜■を作成した。

（４）予備試験用分析素子の検定 ５０　ｍＭ　　クエン虐緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）にＯ−フ
二二レンジアミンと過酸化水素水全顎え、発色試薬液と
する。

−ｉり、ＰＯＤ−工ｇＧ　（西洋ワサビペルオキシダー
ゼｅｙ４識ヒトエｇＧ　）の３μＶ／−溶液を作成する
。

該溶液１０μｔを該発色試薬液−宇部に加え、含有され
る総ＰＯＤ活廿を測定し、これを「該標識物Ｃの総４１
Ｊｗとする。

次に予備試験用分析素子■〜■に各々、該ＰＯＤ　−１
ｇＧ液１０μを全滴下し、１５分放置後素子全体を前述
の発色試薬液一定量に浸漬し、その総ＰＯＤ活性を測定
し、Ｘとする。

また、同様に予備試験用分析素子■〜■に各々、該ＰＯ
Ｄ　−１ｇＧ液１０μｔを滴下し、１５分放置後、Ｑ、
１４ポリオキシエチレン翰ノルビタンモノオレート溶液
で洗浄し、素子全体？同じく発色試薬液一定１１ｃ浸漬
し、そのａ　ｐ　ＯＤ活性を測定し、ｙとする。

ここで「該標識物Ｃの総量のうち質物′ｎＥと結合した
ものの比率（＠」は÷×１００で近似され、［該標識物
Ｃの総量のうち該物質Ｂ及びＤＫ結合していないものの
比率価）」け巴×１００で近似されるので、予備試験用
分析素子■〜■についてその結果を比較すると、次の表
１のようになった。

表　　１ また、これらの素子において、１０μｔの流体試料は直
径１．２　ｃｒｓの円形に展開した。

（５）分析素子の作成 下引済ポリエチレンテレフタレートのフィルム上に、下
記のような組成の発色試薬層を水系塗布、乾燥により作
成した。

更に、該発色試薬層の上に、下記のような組成の標識物
層を、ブタノールにより塗布した。

更に、（４）で用いた処理済Ｆ紙粉末■〜■を用いて、
次のような繊維分散液をｖ、Ｊ製し、この上に塗布乾燥
した。

こうして作成した、該処理済Ｆ紙粉末■を用いた本発明
の分析素子、及び該処理済Ｆ紙粉末■〜■を用いた比較
例用の分析素子について、種々の濃度のヒトエｇＧ溶液
１０μｔを滴下し、１５分間３７℃でインキュベート後
４９２　ｎｍの反射濃度を測定、検量線を作成したとこ
ろ第１６図のようになった。

すなわち第１６図は、本発明の実施例及び比較例の検量
線をヒトエｇＧ濃度（ｎｌ／ａ／、横軸）と反射濃度（
縦軸）との関係で示したグラフであり、■が本発明の実
施例である。

第１６図から明らかなようＫ、■及び（のけ濃度差によ
る反射濃度変化がなだらかであり、■及び■は高ａ度の
ものが判定できない。結局、■の本発明の検量線が有効
である。

〔発明の効果コ 以上説明したように、本発明の分析素子によれば、実施
者の意図する該特定成分の謎度範囲において安定した検
量線が与えられ、操作が簡単かつ汎用性があり、精度及
び再現性の優れた分析が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第５図〜第１１図、及び第１５図〜第１５図は
、本発明の分析素子の１実施の態様に示す断面概略図、
第２図は第１図の部分拡大図、第５図は標識物Ｃの模式
図、第４図は本発明を説明する模式図、第１２図は第１
１図の斜視図、第１６図は、本発明の実施例及び比較例
における検量線を、ヒトＩｇＧ　８度と反射ｓ度の関係
で示したグラフである。 １：多孔質反応層Ｂ−Ｄ、２：該物質Ｂが固定された粒
状体、３：該物質りが固定された粒状体、４．：調整の
ため添加された粒状体、５：該物質Ｂ、６：該物質Ｄ、
７：特定成分Ａ、　８：特定成分Ａ又はその類縁体、９
：標識、１０：標識物Ｃ１１１：光透過性支持体、１２
：光反射性支持体、１３：光反射層、１４：標識物Ｃ含
有層、１５：タイミング層、１６：試薬層、１７：マウ
ント、１８：光反射性多孔質反応層Ｄ、１９：多孔質反
応層Ｂ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａと特異的
   に結合し得る物質Ｂと、特定成分Ａ又はその類縁体と標
   識とが結合した標識物Ｃとの競合反応によって測定し分
   析するための分析素子であって、該物質Ｂに結合してい
   ない該標識物Ｃの標識部位に特異的に結合して該標識に
   起因する信号を変調させる物質Ｄを用い、該物質Ｂ及び
   該物質Ｄが、担体に固定化された形でそれぞれ多孔質反
   応層の一部及び／又は全部に含有されている分析素子に
   おいて、該特定成分Ａを実質上含有しない流体試料を用
   いて所定の分析操作を終了した時点で、分析素子内の反
   応に関与した該標識物Ｃの総量のうち３〜７０％が該物
   質Ｂと結合し、かつ０．１〜１０％が該物質Ｂ及び該物
   質Ｄと結合していないように、該物質Ｂ及び該物質Ｄの
   含有量が設定されていることを特徴とする分析素子。