JPH0269199A - ガラクトシドの酵素活性分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物学的分析方法に関し、特に酵素反応の制御
に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

臨床検査、診断分野においては、各種生体内物質の定性
、定量を行うに当り、酵素反応を利用する測定法が広く
用いられており、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシターゼを用
いる方法かある。

例えばＤ−ガラクトースの測定は加水分解酵素である。

β−がラクトンダーゼ等を作用させることにより生成す
る非糖成分（アグリコン）の呈色反応を用いて定量する
ことにより行われる。

又抗原抗体反応を利用する酵素免疫測定法においては、
標識体として酵素を用いることにより、その活性量又は
活性量の変化を指標として試料中の解析物質の測定が行
われる。標識として用いられる酵素としては経済性、感
度の面からβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが広く使用されて
いる。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素反応に使用される基質
は該酵素による作用により解析手段（−船釣には物質）
を与える化合物が対象とされ、通常呈色反応か解析手段
としてえもばれる。

しかしながら、一般に基質は反応性が十分でない場合が
多く、例えばインドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼで
加水分解し生成した３−ヒドロキシインドールに３．３
　’−（４，４’−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジ
フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロライド）（Ｎｅｏ　
ＴＢ）を作用させて色素を生成させる場合に、反応は充
分が色素量を生成しないままに飽印に到る。かつその呈
色は不安定で室温３０分の放置で褪色し、生体物質中の
極微量成分の測定を目的とする酵素免疫分析法において
は、測定誤差の要因となることが考えられる。

又生物物質中のガラクトースの測定においてもガラクト
ースは生体生理上重要な糖の−っであって、例えば乳中
の糖分ラクトース、少糖類、単純又は複合多糖類、配糖
体、脳、神経組織の糖脂質或いは糖蛋白の中に見出され
、正確な定量測定法が望まれている。

〔発明の目的〕

前記の情況に照らし、本発明の目的は、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼの酵素活性分析法及びβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを標識物質として用いる酵素免疫分析法において、
呈色濃度が充分であり、かつ呈色安定性が良好で定ｉ　
ｉｓ度の高い分析法を提供することにある。

〔発明の構成〕

前記本発明の目的は、ガラクシドのβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼによる酵素活性分析法において、前記酵素反応の
生成系のガラクトースを触媒物質を用いて除去すること
を特徴とするガラクシドの酵素活性分析法によって達成
される。

尚、本発明の態様において、前記触媒物質がβＤ−ガラ
クトース脱水素酵素、β−Ｄ−ガラクトース酸化酵素及
びガラクトキナーゼの群から選ばれた少くとも１種であ
ることが好ましい。

更に本発明においては前記ガラクトシドのアグリコンは
自己顕色性又は非自己顕色性物質であってもよく、自己
顕色性物質としてはニトロフェノル類、ウンベリフェロ
ン類が好都合であり、非自己顕色性物質としてはインド
ール類、フェノール類、ナフトール類が好ましい。

本発明によれば、ガラクトシドのβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼによる加水分解反応は生成系からβ−Ｄ−ガラクト
ースがβ−Ｄ−ガラクトース脱水素酵素、β〜Ｄ−ガラ
クトース酸化酵素もしくはガラクトキナーゼ等の接触に
よって排除され、アグリコンの濃度の増大従って呈色濃
度の濃厚化を導き、更に詳細な理由は不詳であるが呈色
安定性が大いに改まり、分析操作性及び定量分析精度を
上げることができる。

本発明において、前記本発明に好都合もしくは好ましい
アングリコンの呈色もしくは発色は常用される好ましい
条件、ｐＨ６，０〜９．０、反応温度２０〜４５°Ｃに
整えられ、必要に応じてメルカプト化合物、有機溶媒等
を共存させるとよい。

更に好ましくは前記触媒物質としてβ−Ｄ−ガラクトー
ス脱水素酵素を用いる場合にはｐｉ−１７，０〜８．５
、反応温度２０〜４０　’（：！の条件で、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下に反応
させ、前記触媒物質としてβ−Ｄ−ガラクトース酸化酵
素を用いる場合には、ｐＨ６，０〜８．５反応温度２５
〜４０°Ｃの条件で反応させるのが好ましい。

前記触媒物質としてガラクトキナーゼを用いる場合ニハ
、ｐＨ７，０−８，５，２０〜４０℃ノ条件ＴＭｇ及び
アデノシントリホスフェイト　（ＡＴＰ）の存在下に反
応させることが好ましい。

前記呈色、発色もしくは発光（信号）は、吸光度法（比
色法）、蛍光法又は、発光法で検出することができ、測
定法としては信号の経時的変化を測定するレート測定法
又は一定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法
で測定することができる。好ましくは吸光度法であり、
吸光度法（比色法）では、紫外光、可視光、近赤外光を
利用することができ、例えば体液試料として血清及び血
漿を用いる場合には、血清及び血漿による吸光の影響を
小さくするために緑色光、赤色光又は、近赤外光を利用
するのが好ましい。

本発明のガラクトースの測定を目的とする分析法或いは
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識物質として用いる酵素
免疫分析法は溶液測定系に適用してもよく、或いは酵素
免疫分析を乾式で行うことを目的とする免疫分析素子（
特開昭６２−２４９０６３号、特願昭６２−１６７３４
２号、同６３−２９６３２号、同６３−２９６３５号、
同６３−２９６３６号等）に適用してもよい。特に免疫
分析素子に本発明を適用することにより著しい効果が認
められる。尚、このとき前記触媒物質は補助剤、補助部
材と共に乾燥状態で免疫分析素子内に組込んだ形でもよ
く、又外部から免疫分析素子中に供給する形でもよい。

次に本発明に係る免疫分析素子の１例をとって詳細に説
明するか本発明が適用できる免疫分析素子はこの例に限
定されるものではない。

本発明に係る免疫分析素子としては、流体試料中の特定
成分と結合しない生物活性物質（以下生物物質と略）又
は該生物物質と特異的に結合し得る物質のいずれか一方
、及び標識物質と特異的に結合して、該標識物質に起因
する信号を変調させる物質が、同−又は別々の担体に固
定化された形で、それぞれ多孔質反応層の一部又は全部
に含有されている分析素子があり、該標識物質がβ−Ｄ
ガラクトシダーゼであることを特徴とし、流体試料中の
特定成分を測定するための免疫分析素子である。流体試
料中の特定成分と該特定成分と特異的に結合する物質と
の結合反応とこの結合反応によって生成した結合反応生
成物と未反応成分の分離（いわゆるＢ／Ｆ分離）すなわ
ち２種の固定化物（生物物質、又は該生物物質と特異的
に結合する物質の固定化物、標識物質と特異的に結合し
、１１識物質に起因する信号を変調させる物質の固定化
物）との結合反応を一回の操作で段階的に行うことを目
的とした免疫分析素子である。

本発明に係る免疫分析素子において用いられる生物物質
及び該生物質と特異的に結合する物質の組合せとしては
、 酵　　素　　： 基質（生成物） 阻害剤 補欠分子族 補酵素 アロステリンクエフアクタ 抗原 プロティンＡ 多糖類 糖タンパク質 相補性の塩基配列 ヒストン 抗　　体 レクチン： 核　　酸 核酸 ポリメラーゼ ホルモン：　受容体 ヒオチン：　アビジン（ストレプトアビジン）が挙げら
れ、好ましくは抗体と抗原、又はビオチン類とアビジン
類であり、更に好ましくはビオチン類とアビジン類であ
る。

これらの生物物質及び生物物質と特異的に結合する物質
は、後述する測定しようとする流体試料中の特定成分及
び該特定成分と特異的に結合する物質や測定に用いる標
識物質と結合反応や相互作用しない物質が用いられる。

本発明に係る免疫分析素子における流体試料としては、
あらゆる形態の溶液、コロイド溶液が使用しうるが、好
ましくは生物由来の流体試料例えば、血液、血漿、血清
、脳を髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げら
れる。

本発明に係る免疫分析素子により測定しうる流体試料中
での特定成分とは、その存在の有無又はその流体試料中
での量が検出され、その特定成分に特異的に結合する物
質が存在しうる物質又は物質群である。即ち、ポリペプ
チド、蛋白質、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、
核酸、ホルモン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬
等が挙げられる。具体的には、下記の物質、又は物質群
を挙げることができるが、これらに限定されるものでは
ない。

〈蛋白質、複合蛋白質〉 プレアルブミン、アルブミン、σ、−酸性糖蛋白質、ａ
ｌ−アンチトリプシン、σビ糖蛋白質、トランスコルチ
ン、α１−アンチキモトリプシン、σ１−リポ蛋白質、
チロキシン結合グロブリン、セルロプラスミン、Ｚｎ−
α２−糖蛋白質、Ｇｃ−グロブリン、インターσ−トリ
プシンインヒビタ、α１−マクログロブリン、α２−Ｈ
３−糖蛋白質、α２−マクログロブリン、ハプトグロビ
ン、α２−リポ蛋白質、ヘモベキシン、トランスフェリ
ン、β−リポ蛋白質、β。

糖蛋白質、β２−マクログロブリン、Ｃ−反応性蛋白質
、ミオグロビン、エリトロマイシン、免疫グロブリン　
（ＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　ＩＨＤ、ＩｇＥ）、
補体系成分（Ｃ１ｑｓ　Ｃ１ｒＸＣ＋Ｓ、　Ｃ２、Ｃ３
、Ｃ４，Ｃ６、ＣいＣ７、ＣいＣ９、等）フィブリノー
ゲン、ヘモグロビン、グリコへモグロヒン、血液凝固因
子、１１Ｂ　ｓ抗原、ＨＢｓ抗体、酵素（例えば、酸性
ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アルカリ
性ホスファターゼアイソエンザイム、α−アミラーゼ、
アミラーゼアイソエンザイム、アルドラーゼ、コリンエ
ステラーゼ、クレアヂンホスホキナーゼ、タレアチンホ
スホキナーゼアイソエンザイム、トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ、　ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素
アイソエンザイム、γ−ＧＴＰ、　　リパーゼモノアミ
ンオキシダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ぶどう
糖６燐酸脱水素酵素等）等。

くホルモン及びホルモン様物質〉 卵胞’ＩＩＩ激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン
　（Ｌ　Ｈ）、成長ホルモン　（ＧＨ）、甲状腺刺激ホ
ルモン（ＴＳＨ）、Ｉ１１腎皮質刺激ホルモン　（Ａｃ
ＴＨ）、メラニン刺激ホルモン　（ＭＳｌｌ）、バンブ
レッンン、オキシトシン、インンユリン、グルカコ゛ン
、アンギオテンシン■及び１１　、プロラクチン、セク
レチン、ドーパミン、セロトニン、ソマトスタチン、サ
イロキシン（”ｒｔ）、］・リョードサイロニン（Ｔ３
）、ガストリン、コルチゾール、アルドステロン、カテ
コラミン、ニス１−ロゲン、プロゲステロン、テストス
テロン、胎盤性ゴナドトロピン、胎盤性ラクトージン、
下垂体ホルモン放出因子（ＴＲＩ（、ＦＳＨ−ＲＨ，Ｃ
ＲＨｌＬ　Ｈ−ＲＨ等）等 〈ビタミン類〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１　ビタミンＢ２、ビ
タミンＢい　ビタミンＢ１１、ビタミンＣ１ビタミンＤ
、ビタミンＥ１　ビタミンに１葉酸等。

・ぐ腫瘍マーカ〉 α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、膵臓癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、
Ｍ−蛋白、前立腺酸性ホス７了ターゼ、糖鎖性抗原（Ｃ
Ａ１９−９、ＣＡ１２５等）、ガングリオサイズ。

〈各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コデイン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルク酸、モルヒ茅、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマインン、カナ
マインン、ネオマイシン、トブラマインン、アクチノマ
イセチン、カロイマインン、タロラムフェニコール、タ
ロルマイセチン、タロルテトラサイクリン、エリトロマ
イシン、オキンテトラサイクリン、ベニンリン、ポリミ
キシンＢ１テラマインン、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクンミド
、フェノバルビタール、プリミドン、セコバルビタール
、アセタミノフェン、アミトリブチリン、カルバマゼピ
ン、ジゴキシン、ジンビラミド、リドカイン、メソトレ
キセート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、フェニトイン
、プロカイナミド、プロプラノロール、テオフィリン、
カナピノール、テトラヒドロカナピノール、コリン抑制
薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチロフェノン、
カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリン、グリセ
オフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、メペリジン、
メブロバメート、メタトン、ナルセイン、ノルトリブチ
リン、オキザゼパン、ババベリン、プロスタグランジン
、テグレトール、バルプロン酸等及びこれらの代謝産物
。

く微生物表面マーカ〉 バクテリア抗原、　　菌類抗原 寄生虫抗原、　　　　ウづルス抗原 〈農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、燐酸エステル類、チオホスフェ
ート類、及びこれらの代謝産物。

くその他〉 血液型物質、カルシオリピン、アレルゲン、本発明に係
る免疫分析素子に使用しうる流体試料中の特定成分と特
異的に結合する物質としては、測定対象により抗体、抗
原、レクチン、プロティンＡ、特定酵素の阻害物質など
が挙げられるが、該特定成分と該結合物質の結合反応が
抗原〜抗体反応である場合が特に好ましい。使用する抗
体は、その由来を特に限定されるものではなく、哺乳動
物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液を
そのままか、あるいは従来公知の方法である硫酸ナトリ
ウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、セファデックス
ゲルによるゲル濾過法、イオン交換セルロールクロマト
グラフィ法、電気泳動法等（右田俊介編「免疫化学」中
山書店第７４〜８８頁参照）で精製して用いることがで
きる。

或いは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）肺臓
細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハイ
ブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、使用
することもできる。

又、これらの抗体はＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　Ｉ
ｇＤ、　ＩｇＥ各分各企画いることができ、或いはこれ
らの抗体を酵素処理してＦａｂ、　Ｆａｂ’又はＦ　（
ａｂ’）２といった活性抗体フラグメントにして使用し
てもよい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数
の抗体を組合せて使用してもかまわない。流体試料中の
特定成分と特異的に結合する物質として抗体又は抗原を
用いた場合、本発明分析素子の測定原理は免疫測定法に
属しその反応型式としては、競合法、２抗体法、サンド
イツチ法があげられる。分析素子は免疫測定法において
特に好ましく使用できるので、以下免疫測定法を例にと
って本発明の詳細な説明する。

本発明は、」二記分析素子において、標識物質として、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ，３，２，１，２３）
を更に前記触媒物質を分析素子内に内臓もしくは外部か
ら供給する形で用いることが特徴である。

本発明の測定方法で使用される特定成分、該特定成分の
類縁体及び該特定成分に特異的に結合する物質と標識物
質及び生物物質又は、該生物物質と特異的に結合する物
質との結合物は、前記物質の特異的に結合する能力及び
標識物質の信号を発する能力を保持したまま化学的手段
等で、直接又は間接的に両物質を結合することによって
得られる。これらの結合物は、当業者間でよく知られて
いる公知の試薬と公知の方法で結合させることにより得
ることができ、更にくわしく言えば石川栄治、河合忠、
宮井潔Ｎ［酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１
９７８年刊）や日本臨床病理学全編「臨床病理」臨時増
刊特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技
術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年刊）などに
記載された方法を参考にすることができる。具体的な方
法としては、特願昭６１２８０１６６号に記載した種々
の方法を利用することができる。

本発明に使用する標識物質と特異的に結合して、該標識
物質に起因する信号を変調させる物質は、使用するβ−
Ｄ−ガラクト／ダーゼに対して、酵素活性に影響を及ぼ
す物質から選ばれるが、好ましくは、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼに対する酵素阻害剤であり、具体的には、特開
昭６２−２４９０６３号記載の有機銀化合物、好ましく
はアリール水銀化合物である。又有機銀化合物、ガラク
トスタチン類、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド、０−マーキュリフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドクロライド等を挙げることができる。

本発明に係る分析素子において、標識物質であるβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼに起因する信号は、吸光度法（比色
法）、蛍光法又は発色法で検出することができ、例えば
、石川栄治、河合忠、宮井潔編「酵素免疫測定法（第２
版）」り医学書院、１９７８年刊）等に記載されている
方法を挙げることができ、測定法としては、信号の経時
的変化を測定するレート測定法又は一定時間後の信号を
測定するエンドポイント測定法で測定することができる
が、好ましくは、比較的簡便な装置で測定でき、目視に
よる判定も可能な比色法による検出である。比色法では
、紫外光、可視光、近赤外光を利用できるが、例えば流
体試料として血清や尿を用いる場合には、血清や尿によ
る測定光への影響を小さくするために緑色光、赤色光又
は近赤外光を用いるのが好ましい。

本発明に係る免疫分析素子の多孔質反応層とは、該特定
成分と該特定成分と特異的に結合する物質との結合反応
、標識物質と該標識物質と特異的に結合し該標識物質に
起因する信号を変調させる物質との結合反応及び生物物
質と該生物物質と特異的に結合する物質との結合反応を
行ない得る層であり、標識物質と特異的に結合し、該標
識物質に起因する信号を変調させる物物質及び生物物質
又は該生物質と特異的に結合する物質は、反応層の一部
若しくは全部に固定化されている必要がある。

又、反応時間中流体試料を保持するために、反応層の一
部若しくは全部に、流体試料と自由に接触し得る相互連
絡空隙孔（短径１μｍ〜３００μｍが好ましい）を有す
る多孔性構造が存在していることが必要である。

上記の条件を満たしていれば、該多孔質反応層の素材は
特に限定されない。

好ましい例としてはサイズ１〜３５０μｍの粒状体或い
は４０〜４００メツシユの繊維から１つ以上選ばれた素
材により構成される構造体が挙げられる。

該粒状体の材料としては、珪藻土、二酸化チタン、硫酸
バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、珪砂
、ガラス、シリカゲル、架橋デキストラン、架橋ポリア
クリルアミド、アガロース、架橋アガロース、各種合成
樹脂（ポリスチレンなと）などの他、特開昭６３−４５
５６２号記載の反応基を持つ化合物から成る自己結合型
粒子が挙げられる。更にこれらの粒状体の数種を混合し
て用いることもできる。

又、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、パル
プ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、
セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモニ
アレーヨン、ポリアミｌ’　　（６ナイロン、６．６−
ナイロン、６．１０−ナイロンなと）、ポリエステル（
ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオレフィン　
（ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿
などの植物性、動物性、鉱物性、合成、半合成、再生繊
維を用いることができ、或いはこれらを混合して用いて
もよい。或いは別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、
濾紙、プラッシュポリマ、或いはガラス繊維、鉱物性繊
維（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど）
、動物性繊維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロ
ン、ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロ
ピレンなど）、再生繊維（レーヨン、セルロースエステ
ルなど）などヲ単独或いは混合して製造した織布、不織
布、合成紙などを該多孔質反応層に用いることもできる
。

このような粒状体、繊維、或いは粒状体と繊維の混合物
を塗布及び／又は製膜することにより、流体試料と自由
に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が存在
する多孔質反応層を形成する。自己結合性を有しない粒
子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で製
膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８号、
同５５−９０８５９号、同５７−６７８６０号等の方法
を適用することができる。

自己結合性を有する有機ポリマ粒子は特開昭５７−１０
１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８−７０１
６３号等に記載の方法により同様に製膜できる。繊維又
は繊維及び粒子の混合物については特開昭５７−１２５
８４７号、同５７−１９７４６６号に記載された繊維及
び／又は粒状体分散液を塗布することにより多孔質反応
層を形成できる。又特開昭６０−１７３４７１号に記載
されている方法のようにゼラチンやポリビニルピロリド
ンのような水溶性バインダを使用した繊維分散液を塗布
することも可能である。このような分散液を製造するた
めには、多くの方法を単独又は組み合わせて用いること
が可能である。例えば有用な方法の一つとして界面活性
剤を液体キャリヤへ添加し粒状体及び／又は繊維の分散
液中における分散及び安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ−１００（ロームアンドハース社製；オクチルフ
ェノキシポリエトキンエタノール）サーファクタント１
０Ｇ■（オリーン社製；ニルフェノキシポリグリシドー
ル）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、粒状体及び／又は繊維の重量に対して２０
ｗｔ％乃至０．００５ｗｔ％好ましくは１５ｖＬ％乃至
９．１ｗｔ％用いることができる。更に別の方法として
該粒子単位と液体キャリの超音波処理、物理的混合、及
び物理的攪拌処理、ｐｔｉ調整がある。

これらは前記の方法と組み合わせることにより、更に有
用である。

又繊維や粒状体等に固定化れな生物物質又は該生物物質
と特異的に結合する物質及び標識物質と特異的に結合し
、該標識物質に起因する信号を変調させる物質や特定成
分、該特定成分の類縁体、該特定成分と特異的に結合す
る物質と生物物質又は該生物物質と特異的に結合する物
質及び標識物質の結合物の特異的に結合する能力及び標
識物質の信号を発する能力を保持し多孔質反応層又は後
述の層中に含有させるために、特開昭６１−１７７９９
７号に記載されている方法を用いることができる。

生物物質又は該生物物質と特異的に結合する物質及び標
識物質と特異的に結合し、該標識物質に起因する信号を
変調させる物質の多孔質反応層への固定化は、種々の公
知の方法により、該物質を該多孔質反応層の表面に物理
的に吸着させるか、化学反応により直接或いは間接的に
結合させることにより達成される。その際、該物質の該
特定成分に対する特異的結合性が失われないように留意
する必要があり、例えば石川栄治、河合忠、宮井潔編「
酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１９７８年刊
）や千畑一部、土佐哲也、松尾雄志著−「実験と応用　
アフイニテイクロマトグラフィ」（講談社＝１９７６年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例として
挙げることができる。又多孔質反応層へのこれらの物質
の固定化は、特異結合部位が保持されており、かつ流体
試料中に遊離、溶解した状態でなけれはよく、流体試料
中に不溶の状態で分散されていてもよい。又カラー写真
で用いられるカプラの分散に用いられる方法（例えば日
本写真学会編「写真工学の基礎、銀塩編」（コロナ社１
９７８年刊）、脂質二分子膜中に含有させる方法等も使
用できる。又、該特定成分と特異的に結合し得る物質を
不動化後に、必要に応じて免疫反応における非特異的反
応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与しな
い蛋白質を担持することが可能である。それらの代表的
な例としては、哺乳動物の正常血清蛋白質、アルブミン
、ゼラチン及びそれらの分解物等が挙げられる。

これらの固定化操作は、前述の粒状体或いは繊維にあら
かじめ行っておいた後、多孔質反応層を形成してもよく
、或いは多孔質反応層を形成した後に該固定化操作を行
うことも可能である。前者の場合、前記物質を固定化し
た粒状体又は繊維の他に前述の特異的反応に関与しない
蛋白質を固定化した粒状体又は繊維を調節のために加え
ることも可能である。

二種の固定化物の混合比は、各々に固定化された特異結
合物質の量と結合定数に応じて定められ、必要に応じて
は更に、特異的結合物質を固定化しない粒状体又は繊維
を調整のために加えてもよい。

本発明に係る免疫分析素子の固定化物の組合せは、生物
物質と標識物質と特異的に結合して該標識物質に起因す
る信号を変調させる物質との組合せ、該生物物質と特異
的に結合し得る物質と標識物質と特異的に結合して該標
識物質に起因する信号を変調させる物質との組合せであ
る。このように二つの固定化物を用いるのは、Ｂ／Ｆ分
離を行うためと、標識物質に起因する信号を変調させる
ためである。

分析素子の形態は分析を行いうるものであればよく、特
に制限されるものではないが、製造上及び操作、測定上
、フィルム状或いはシート状であることが好ましい。

分析素子の態様は、二種の固定化物が多孔質反応層の同
一層に固定されて含有されている場合及び該二種の固定
化物が二層以上の多孔質反応層に固定化されて含有され
ている場合を含む。

本発明に係る分析素子の理解を助けるために、−例を挙
げて原理を説明する。

第１図は本発明に係る分析素子の最も単純な態様の断面
図の一例である。この場合は多孔質反応層０のみで分析
素子が構成されており、該二種の固定化物が固定化され
て多孔質反応層中に含有されている。

第２図は第１図の拡大図である。第２図において符号Ａ
は生物物質又は、該生物物質と特異的に結合する物質が
固定化された粒状体、Ｂは標識物質と特異的に結合し該
標識物質に起因する信号を変調させる物質が固定化され
た粒状体、モしてＣは調整ために添加された粒状体であ
る。

第２図は粒状体Ａ％Ｂ及びＣが均一に混合され、点接着
することにより多孔質反応層が構成されていることを示
している。

第３図は分析素子の測定原理を説明するための模式図で
あり、反応型式を競合法に例をとって説明する。

第３図においてｌは特定成分、２は標識物質、３は特定
成分と標識物質の結合物（標識体と略す）、４は特定成
分と特異的に結合する物質、５は生物物質（又は、生物
質と特異的に結合する物質）、６は特定成分に特異的に
結合する物質と生物物質の結合物、７は生物物質と特異
的に結合する物質（又は生物物質）、８は標識物質と特
異的に結合し７、標識物質に起因する信号を変調させる
物質、９は特定成分と結合物６との結合反応生成物、１
０は標識体３と結合物６との結合反応生成物、Ａは７の
固定化物、Ｂは８の固定化物を表す。

流体試料の一定量、標識体３を含有する溶液、流体試料
中の特定成分と特異的に結合する物質と生物物質との結
合物６を含有する溶液を混合後、又は順次滴下する。

特定成分ｌ、１票識体３、結合物６は液相に存在してい
るために、これらの結合反応（ｌと６又は３と６）は、
液相反応系となり、固定化物Ａと結合物６の結合反応（
結合部位は５と７）、固定化物Ｂと標識体３の結合反応
（結合部位は２と８）よりも十分に速く起こるために、
液相の結合反応が優先的に起こると考えられる。よって
結果的には、上記の固液系の反応は起こらず、液相系の
反応が十分量起こった後に、固液系の反応が起こる。

液相系の結合反応の結果、液相に存在する未反応の結合
物３、特定成分１と結合物６との結合反応生成物９は、
それぞれ未反応の標識体３は固定化物Ｂと結合反応（結
合部位は、２と８）し、結合反応物９は、固定化物Ａと
結合反応（結合部位は、５と７）する。又標識体３と結
合物６との結き反応生成物ＩＯは、固定化物Ａ又はＢと
結合反応が可能であるが、５と７の結合力が２と８との
結合力よりも強い組み合せを選択することにより、固定
化物Ａと優先的に結合させることが可能である。

このように、特定成分１及び特定成分と標識物質からな
る標識体３の夫々に対する結合物６との結合反応生成物
９とＩＯは固定化物Ａに、未反応の標識体３は固定化物
Ｂにそれぞれ層内で分離（Ｂ／Ｆ分離）することができ
る。標識体３の標識物質２は、固定化物Ｂと８との結合
により標識物質に起因する信号が変調されるので、流体
試料中の特定成分の濃度と標識物質全体の信号強度の間
には、関数関係が成立する。そこであらかじめ特定成分
ｌの濃度がわかっている流体試ネ４　（標準試料）を数
種類用いて検量線を作成しておけば、未知の液体試料中
の特定成分の濃度を知ることができる。

又、特定成分と特異的に結合する物質と標識物質の結合
物を標識体としたサンドイツチ法による測定についても
同様に説明できる。

第４図は、多孔質反応層が二層であり、生物質又は、該
生物質と特異的に結合する物質、及び標識物質と特異的
に結合し、該標識物質に起因する信号を変調させる物質
は、それぞれ別々の層に固定化されて含有されている。

これらの層は、多孔質反応層に用いられると同−又は異
種の素材を塗布、製膜又は、貼付けによって得られる。

分析素子は前述の多孔質反応層が最低必要構成要素であ
るが、発明の効果をより一層発揮するために種々の補助
層を設けることができる。第４図〜第１２図に分析素子
の実施の態様を表す断面概略図を示す。

第５図に示しＩ；分析素子は光透過性支持体１１の上に
多孔質反応層０が積層されており、支持体の存在により
素子の取扱い性が向上している。このような目的で使用
し得る支持体は、例えば酢酸セルロース、ポリエチレン
テレフタレート、ホリヵーポ不一ト及びポリビニル化合
物（例えばポリスチレン）のような高分子化合物、或い
はガラスのような透明無機化合物が挙げられる。該多孔
性反応層はこのような支持体の上で直接塗布及び／又は
製膜するか、或いはいったん多孔質反応層を別に形成し
た後に前述の支持体に貼りつけてもよい。

第５図に示した態様の場合、流体試料は反応層側から滴
下する必要があるが、信号の測定は両側から行うことが
可能である。

第６図に示した分析素子の別の態様では、光反対性支持
体１２の上に反応層が設けられている。この態様では、
試料等の滴下、信号沖Ｉ定とも多孔性反応層側から行い
、信号を反射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれ
を容易にしている。

このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミックス、金属、或いは樹
脂被覆等で防水処理を施した紙等が挙げられ、これらの
材質に必要ならばＴ　ｉｏ２、Ｂ　ａｓｏいマイカなど
の白色顔料等を塗布するか含有させることにより目的を
果たすことができる。

第７図の態様も同様な目的によるもので、光透過性支持
体１１の上に多孔質反応層０、光反射層１３が順に積層
されている。この態様では試料等は光反射層側から滴下
され、信号測定は光透過性支持体側から行われる。光反
射層は公知の分析素子及びその類似品に用いられていた
ものをいずれも使用できるが、好ましくは多孔質反応層
に用いられるのと同様な粒子及び繊維に前述の白色顔料
等を含有させたものを塗布又は製膜するか貼りつ１プる
ことができる。更に好ましくは内部に白色顔料を含有す
る粒子の表面に多孔質反応層に用いる時と同様に生物質
又は該生物質と特異的に反応する物質及び該標識物質と
特異的に反応し、該標識物質に起因する信号を変調させ
る物質を固定化し、下層の多孔質反応層と同様の機能を
持たせた光反射層を設けることができる。このような特
殊な光反射層を用いると、光反射層内に多くの未反応標
識物質が残ることを防止できる。

第１２図の態様では、光透過性支持体上に、発色試薬層
１５が設けられている。この発色試薬層は、酵素活性測
定に必要な基質、発色試薬を含有させた少なくとも一層
の親水性コロイドから成る。

基質や発色試薬は親水性コロイドから成るバインダ中に
溶解、或いは分散し塗布液とすることができる。特に疎
水性化合物の分散には写真業界で多用されているオ“イ
ルプロテクト分散法、直接分散法等種々の公知の分散法
を用いることができる。

更に本発明に係る分析素子の発色試薬層に用いられる親
水性コロイドは、ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラ
チン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルイミダゾール、ポリアクリルアミド、
ポリアクリル酸す１〜リウム等の合成高分子、ヒドロキ
シエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナト
リウム塩等のセルロース誘導体の多糖類等が挙げられる
。

そして好ましくはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラ
チン誘導体が挙げられる。

更に本発明に係る分析素子の発色試薬層のバインダは、
その膜物性、例えば膨潤度や熱ｌこよる溶解性の改良の
ために一部を他の水分散性高分子重合体、即ち高分子ラ
テックスと置換することができる。好ましい高分子ラテ
ックスの例としては、例えば特開昭５７−１１６２５８
号、同５Ｌ９９７５２号記載のもの力Ｓ有用である。こ
れらの高分子ラテックスは、親水性コロイドバインダの
最大７０％を置換することが可能であるが、好ましくは
約５５％以下の置換である。該発色試薬層には他の添加
剤、例えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目
的に応じて添加することができる。又、その膜厚は約３
〜約５０μ■、好ましくは約５〜３０μｍである。緩衝
剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適した
ｐＨにするために含有される。用いることができる緩衝
剤としては日本化学全編「化学賀覧基礎編」（東京、丸
善（株）１９６６）　ｐｐ１３１２〜ｌ３２０、Ｎ、Ｅ
。

Ｇｏｏｄ等；バイオケミストリ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、ｖｏ４５゜ｐ４６７　（１９６ｆｉ）、今村
、斉藤：化学の領域ｖｏＬ３０（２）。

ｐ７９　（１９７６）、Ｗ、Ｊファーギュソン（Ｆｅｒ
ｇｕｓｏｎ）等：Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈｅａ＋、、ｖｏ
Ｑ１０４．　ｐ３００　（１９８０）等の文献に記載さ
れているものを挙げることができる。具体的な例として
は、くえん酸塩、硼酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリスバル
ビッール、グリシン、グツド緩衝剤等が挙げられる。こ
れらの緩衝剤は必要に応じて発色試薬層以外の層に含有
させてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のために含をされ
、酸化防止剤などがある。又二種の固定化物や結合物、
及び標識体を層中に含有させる場合の活性保持のために
、固定化酵素、アフイニテイクロマ１−グラフィの吸着
体、固定化抗体、及び蛋白質や酵素等の保存に用いられ
る保恒剤を含有させてもよい。その物質としては、日本
生化学会編「生化学実験講座１．蛋白質の化学ＩＪ（東
京化学同人（採用９７６）　ｐｐ６６〜６７、前述の実
験と応用　「アフィニティクロマトグラフィＪ　ｐｐ１
０３〜１ｏ４、特開昭６０−１４９９２７号等に記載さ
れているものが挙げられる。具体的な例としては、ゼラ
チン、ゼラチン分解物、アルブミン　ＢＳＡ、シクロデ
キストリンｆＲ１非還元Ｍ類（シュクロース、トレハロ
ース）、ポリエチレングリコール、アミノ酸、各種イオ
ン、アジ化ソーダ等が挙げられる。これらの保恒剤は二
種の固定化された物質や結合物及び酵素標識体の近傍に
存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用い
ることができ、Ｔ、Ｈ，ジエイムス（Ｔ、ｌ］。

Ｊａｍｅｓ）編［ザ・セオリ・オブ・ザ・）オドグラフ
インクプロセスＪ（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏ（ｔｈｅ
　ＰｏｔｏｇｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ）（第４版）
　ｐｐ７７−８７に記載されているものを挙げることが
できる。具体的な例としては、アルデヒド類、活性オレ
フィン類、活性エステル類等が挙げられる。

界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。

その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカ試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応じ
て適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定の１＝めの
検出物質を、発色試薬層に集中的に集めたり、検出物質
が色素の場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフトさ
せる物質であり、検出物質と強い相互作用を示す。カチ
オン性ポリマ、アニオン性ポリマ及びこれらのポリマの
ラテックスが用いられる。

以下、分析素子の内蔵型態様の例を示す。

第８図の態様では、光透過性支持体上に、発色試薬層１
５が設けられておりその上に特定成分と特異的に結合す
る物質と、生物物質又は該生物物質と特異的に結合する
物質との結合物含有層１４多孔質反応層の順に積層され
ている。結合的含有層は多孔性媒体に面積濃度が一定と
なるように結合物を含有させた層であり、流体試料の一
定量及び標識体を含有した溶液を滴下すると一定量の結
合物が溶出され、多孔質反応層に試料と共に拡散するも
のである。素材としては多孔質反応層と同様のものを塗
布、製膜貼付してもよく、或いは吸水性の洋紙、和紙、
濾紙、ブラソンユポリマ、或いはガラス繊維、鉱物性繊
維（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど）
、動物性繊維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロ
ン、ヒニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロ
ピレンなト）、再生ｔＪ＆維（レーヨン、セルロースエ
ステルなど）などを単独或いは混合して製造した織布、
不織布、合成紙などで作成した結合的含有層を貼付して
もよい。

結合的含有層の位置は、必要に応じて種々選択でき本態
様のように結合的含有層が最上層以外の部分にある場合
、結合的含有層に用いる素材としては前述のものの他に
ゼラチン、ゼラチン語導体、多糖類（アガロースなど）
、カルボキンメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロールなどの親水性高分子物質、或いはビニルピロリド
ン、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、ビニルア
ルコール、スルホニルスチレンなどをモノマとしたホモ
ポリマ或いはコポリマといった均質バインダを塗布して
用いる方法かある。

第９図は、標識体も分析素子中に含有されている例であ
る。層構成としては、第８図と同様であるが、多孔質反
応層に標識体が含有されている。

この多孔質反応層には、標識体の標識物質と特異的に結
合し、該標識物質に起因する信号を変調させる物質の固
定化物が含有されているため、分析素子の製造や保存中
に標識体との結合反応を生じさせないために、例えはク
リニカルケミストリ（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）　ｖｏｆ２．２７　ｐ１４９９　（１９８１年
）記載の方法等を用いることができる。

結合物、標識体を分析素子中に含有させる他の態様とし
ては、多孔質反応層に結合物を、結合的含有層に標識体
を含有させる方法がある。標識体含有層は、結合的含有
層と同様な方法が適用でき、多孔質反応層に結合物を含
有させる場合も標識体の場合と同じ方法が用いられる。

更に他の態様としては、多孔質反応層に、結合物及び標
識体を含有させる場合が挙げられる。

第１Ｏ図及び第１１図は、分析素子の好ましい態様の１
例について断面図、斜視図を示したものである。分析素
子の取扱いが容易になるよう、全体がプラスチック製の
マウント１７で覆われており、マウント上部に試料注入
孔、下部に信号測定孔が開いている。

本発明に係る分析素子は更に、流体試料を素子に適用し
た際にその展開を補助する展開層、流体試料が血液（全
血）の際に必要となることがある血球分離層、必要に応
じて設ける接着層、保護層、タイミング層といっｔ；補
助層を設けることができる。

これらの補助層及び前述の発色試薬層、結合物又は標識
体含有層、タイミング層は独立して設けてもよく、或い
は複数の機能を併せもった層として設けてもよい。これ
らの層はその機能に応じて設けられるべき位置が容易に
決定できる。

以上述べてきた分析素子は、従来、長時間反応させた場
合、酵素反応及び、生成した色素が不安定となるという
問題があった。

しかしながら本発明を適用することにより、酵素反応の
安定性及び呈色安定性に著しい改善が認められた。

〔実施例〕

以下本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。

実施例１ ｌ−（１）　　β−Ｄ−ガラクトース酸化酵素固定ビー
ズの作成 β−Ｄ−ガラクトース酸化酵素（東洋紡社製）２゜０ｍ
ｇを０．１Ｍ　　ＰＢＳ溶液　（０，１５Ｍ　　ＮａＣ
Ｑ　ｐＨ７，３）　２０ｏｔａＱ中に溶解し、これにス
チレンビーズ（６ｍｍ−住友ベークライト社製）２００
個を加え４°Ｃで１晩攪拌する。１晩攪拌後、０．１Ｍ
　ＰＢＳ＋　０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０溶液２００ｍ
Ｑで３回洗浄後、再び１％ウシ血清アルブミン＋０．１
Ｍ　ＰＢＳ　（０，１５Ｍ　ＮａＣＱ　ｐＨ７，３）中
４°Ｃで１晩攪拌し、β−Ｄ−ガラクトース酸化酵素固
定化ビーズを作成した。

１−（２）　　ガラクトシドのβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼによる酵素活性測定 ２本の試験管（Ａ　）、（Ｂ　）を用意し、（Ａ　）、
（Ｂ　）それぞれに下記組成から成る溶液を加える。

０．１Ｍ　燐酸緩衝液（ｐＨ７，３）　　　　　　　２
．５ｍ（２３０ｖａ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ（ｌ溶液（上記緩
衝溶液で溶解）　０．１ｍｆ２３４ｍＭ　　オルトニト
ロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノサイド溶液 （上記緩衝溶液で希釈）　　　　　　　　０．２＋ｏｆ
２次いで試験管（Ａ　）、（Ｂ　）のそれぞれに、上記
緩衝溶液中に溶解したβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ溶液（
５ｐ　ｇ／　１ｌｆｆ）　０．１ｍｆｆを添加する。１
０分後、試験管（Ｂ）にのみ１−（１）で作製したβ−
Ｄ−ガラクトース酸化酵素固定化ビーズを加える。更に
１０分後、１．０Ｍ炭酸ナトリウム溶液０．１ｍ１２を
添加することにより酸素反応を止め、試験管（Ａ　）、
（Ｂ　）中の溶液の吸光度（４１０ｒ＋ｍ）を測定した
。その結果を表１に示す。この結果かられかるように、
β−Ｄ−ガラクトース酸化酵素を作用させることにより
、より多くのオルトニトロフェノールが生成しているこ
とが表　　　　１ 実施例２ ２−（１）ｐ−アミノフェニルマーキュリツクアセテー
ト（酵素阻害剤）固定化アビセル の作成 アビセル（旭化成社製）８０ｇを、２．５Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ１２，０）　８００ｍ１２に加えて懸濁し、氷水
冷下コれに蒸留水８００■に溶解した臭化シアン８００
ｇを加えて、２０分反応後、濾取し、十分に水洗した。

このアビセル８０ｇをｐ−アミノフェニルマーキュリツ
クアセテート４．８ｇを含む２５％ジメチルスルホキシ
ド水溶液９５０ｏ＋Ｉ２に懸濁し、室温で２０時間撹拌
した。

これを濾取し、ジメチルスルホキシド、蒸留水にて洗浄
した後１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　１０１
００Ｏに懸濁し、室温で２０時間撹拌して未反応基をブ
ロックした。これを濾取し、十分に水洗した後、アセト
ンで洗浄後乾燥してｐ−アミ、／フェニルマーキュリン
クアセテート固定化アビセルを作成した。

２−（２）　　アビジン固定化アビセルの作成ウシ血清
アルブミン（フラクンヨン■、米国アーマ社製）　１．
０ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，４）　３３０ｍＱに溶解し、これにビオ
チン−Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル（べ−リン
ガ社製）　１０．４ｍｇを含有するジメチルホルムアミ
ド溶液３−０ｍ０．を加えて室温で２．５時間反応後、
前記緩衝液にて、十分に透析し、凍結乾燥してビオチン
化したウシ血清アルブミンを得た。

次に、アビセル（旭化成社製）９０ｇを２．５Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ１２，０）　１８００ｔｒｒρに加えて懸濁
し、氷水冷下、これに蒸留水５５０ｎ１２に溶解した臭
化シアン４５．０ｇを加えて、２０分反応後、濾取し、
十分に水洗した。このアビセル９０ｇを、上記ビオチン
化つシ血清アルブンミン５００＋ａｇを含む０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム水溶液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム含
有）　９００１１１（２に懸濁し、４°Ｃで２０時間撹
拌した。これを濾取し、蒸留水、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１Ｍ２２酸水素ナトリウム水溶液、Ｏ，
１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４，１）にて交互に洗浄した後、ＩＭＩ−リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）１２００ｏ＋αに懸濁し
、室温で２０時間撹拌して未反応基をブロックした。こ
れを濾取し、十分に水洗した後、アビジン（オリエンタ
ル酵母社製）　２７０ｍｇを溶解した０、１５Ｍ塩化ナ
トリウム含有０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）　４
５０ｍＣに懸濁し、４°Ｃで２００時間反応後濾取し、
水洗してアビジンを固定化したアビセルを作成した。

更に、凍結乾燥して、アビジン固定化アビセルを作成し
た。

２−（３）　　β−ガラクトシダーゼ標識ヒトＩｇＧの
作成 ヒトＩｇＧ　（米国カッペル社製）　２０＋＋＋ｇを０
．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）　２．ＯｍＱに溶解し
、これにＮ−（Ｅ−マレイミドカプロイルオキシ）サク
シイミド（同位化学研究所製）の２．５ｒａｇ／ｍＱジ
メチルホルムアミド溶液７７μＱを加えて３０℃、２０
分間反応後、５１ＩＩＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ６，１））で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラムで精製し、マレイミド化したヒトＩｇＧを得
た。次に、β−ガラクトシダーゼ（東洋紡社１りのｌＯ
，５ＩＩＩｇ／　＋ＩＩＱＯ，１Ｍ燐酸緩衝液１．燐酸
緩衝液１肥８ １３、６＋ｎｇを含む溶液３．２ｍＱを加えて、４°Ｃ
で４５時間反応後、０．１Ｍ　２−メルカプトエチルア
ミン１７５μＱヲ加えて３０’０２０分反応させ、Ｏ．
１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ燐酸緩衝液（　ｐ［
（７．４）で平衡化したスーパローズ６プレツプグレー
ド（ファルマシア社製）カラムで分離・精製し、β−ガ
ラクトシダーゼ標識ヒトＩｇＧを得た。

２−（４）　　ビオチン化ヤギ抗ヒトｔｇｃ抗体の作成
りギ抗ヒトＩｇＧ抗体（米国カッベル社製）　５−８ｍ
ｇを０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．　１Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．４）　２−０ｍｆｆに溶解し、これにビオ
チン−Ｎ．−ヒドロキシ琥珀酸イミドエステル（ベーリ
ンガー社製）０、３２ｍｇを含有するジメチルホルムア
ミド溶液５００μＱを加えて、室温で３時間反応後、Ｌ
１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍ燐酸緩衝液にて十
分に透析してビオチン化したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を得
た。

２−（５）　　免疫学的分析素子−（１）の作成厚さ１
８０μｍの透明な下引き済みポリエチレンテレフタレー
トフィルムの上に下記組成の塗布液（１）を塗布、乾燥
させ、ゼラチン層を形成させた。

塗布液−（１） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　　６．０ｇトライ
トンＸ　−　１００（ロームアンドハース社製）０、１
５ｇ １、２−ビス（ビニルスルホニル）エタン　　０．０１
ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　５４．０ｇ次
に、２−（１）で作成したｐ−アミ／フェニルマーキュ
リツクアセテート固定化アビセルを分散した、発色試薬
を含有した下記の組成の塗布液−（２）を前記ゼラチン
層の上に塗布し、乾燥した。

塗布液−（２） ｐ−アミノフェニルマーキュリツクアセテート固定化ア
ビセル　　　　　　　　　　　　１４０ｇトライトンＸ
　−　１００　　　　　　　　　　　　１．４ｇポリヒ
ニルビロリドン（和光純薬社１Ｋ）　　１．２ｇ５−ブ
ロム−４−クロル−３−インドリル−βーＤ−ガラクト
ピラノシド（ベーリンガ社製）０．９０ｇ ＮｅｏＴＢ※（同位化学研究所製）　　　　　　０．３
５ｇｎ−ブタノール　　　　　　　　　　　　　　３４
．０ｇ※ＮｅｏＴＢ；３．３　”（４，４’−ビフェニ
レン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウ
ムクロライド） 次に２−（２）で作成したアビジン固定化アビセルを分
散した、下記の組成の塗布液−（３）を、前記ｐ−アミ
ノフェニルマーキュリツクアセテート固定化アビセル層
の上に塗布し、乾燥した。

塗布液−（３） アビジン固定化アビセル　　　　　　　　２２．５ｇト
ライトンＸ　−１００２，５０ｇ ポリビニルピロリドン　　　　　　　　　３．５０ｇｎ
−ブタノール　　　　　　　　　　　　　　　５２．０
ｇ更に、下記の組成の塗布液−（４）を、前記アビジン
固定化アビセル層の上に、塗布、乾燥して展開層を形成
させた。

塗布液＝（４） 粉末濾紙Ｄ（東洋濾紙社製）　　　　　　　３０．０ｇ
トライトンＸ　−１００３，０ｇ ポリビニルピロリドン　　　　　　　　　　１．４ｇｎ
−ブタノール　　　　　　　　　　　　　　　８０．０
ｇこれを１．５Ｘ　１．５ｃｍ２の大きさに裁断し、分
析素子とした。

１−（６）　　免疫学的分析素子−（２）の作成厚さ１
８０μｍの透明な下引き済みポリエチレンテレフタレー
トフィルムの上に、β−Ｄ−ガラクトース脱水素酵素を
含有した下記の組成の塗布液−（５）を塗布、乾燥させ
、ゼラチン層を形成させた。

塗布液−（５） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　　　６．０ｇトラ
イトンＸ　−１００ （ロームアンドハース社製）　　　　　　０．１５ｇ１
−２−ヒス（ビニルスルホニルエタン）　　０−０１ｇ
β−Ｄ−ガラクトース脱水素酵素　　　　　８ｍｇ蒸留
水　　　　　　　　　　　　　　　５４．０ｇ次に２−
（５）で作成した塗布液＝（２）、塗布液−（３）及び
塗布液−（４）を順次塗布、乾燥させて、免疫学的分析
素子−（２）を作成した。

１−（７）　　ヒト［ｇＧの測定 ｌ　ｍＭ塩化マグネシウム及びｌｖｔ％のウシ血清アル
ブミンを含有する０、３Ｍビス（２−ヒドロキシエチル
）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔ
ｒｉｓと略する）−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解し
たヒトＩｇＧ　（０−６４０ｐｇ／　ｍｌ２）を２−（
３）で作成したβ−ガラクトシダーゼ標識ヒＩ−ＩｇＧ
　（１０ｇｇ／ｍＱの上記緩衝溶液）と２−（４）で作
成したビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（２０ｇｇ／ＩＩＩ
Ｑの上記緩衝液）と混合後、この混合溶液のｌＯμＱを
２−（５）で作成した分析素子−（１）に滴下し、３７
°ＣＩＯ分間密閉状態でインキュベーションした後、支
持体側から５４６ｎｍの反射濃度を測定した。その結果
を第１３図中、実線で示した。上記混合溶液に、更にＮ
ＡＤ（２ｆｆ１ｇ／ｍＱの上記緩衝溶液）を混合後、こ
の混合溶液のｌＯμＱを２−（６）で作成した分析素子
−（２）に滴下し、同様にして測定した結果を第１３図
中、破線で示した。第１３図かられかるようにβ−Ｄ−
ガラクトース脱水素酵素を内蔵していない素子に比べて
、該酵素を内蔵した素子を用いることによりＩｇＧを高
感度に測定できることがわかる。

実施例３ ヒトＩｇＧの測定 １ｍＭ塩化マグ不ンウム及び２ｗｔ％のウシ血清アルブ
ミンを含有するＱ　、　３　Ｍ　Ｂ　ｉ　ｓ　ｔ　ｒ　
ｉ　ｓ−塩酸緩衝液（ｐ）１７．２）に溶解したヒトＩ
ｇＧ　（０〜６４０μｇ／　ｍ４）を２−（３）で作成
したβ−ガラクトシダーゼ標識ヒトＩｇＧ　（１０ｇｇ
／　ｍ４の上記緩衝溶液）と２−（４）で作成したビオ
チン化抗ヒトＩｇＧ抗体（２０ｇｇ／ａａαの上記緩衝
液）と混合後、この混合液（Ａ）、及び、この混合溶液
に更にβ−Ｄ−ガラクトース酸化酵素（１００ｐｇ／　
ｖａｎ上記緩衝溶液）を混合した混合溶液（Ｂ）を２−
（５）で作成した免疫分析素子−（１）にｌＯμＱそれ
ぞれ滴下した。混合溶液（Ａ）を滴下した結果を第１４
図中、実線で、混合溶液（Ｂ）を滴下した結果を第１４
図中破線で示した。

第１４図かられかるように、免疫分析素子−（１）に滴
下する混合液中にβ−Ｄ−ガラクトース酸化酵素を加え
ることにより、ＩｇＧを高感度に測定できた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第４図乃至第９図及び第１２図は本発明の分
析素子の層構成の態様例を示す断面図である。 第２図は多孔質反応層の拡大図である。 第３図は本発明の分析素子の測定原理の模式説明図であ
る。 第１０図及び第１１図は夫々本発明の分析素子の断面図
及び斜視図である。 第１３図及び第１４図は本発明の分析素子による測定結
果を示すグラフである。 １、特定成分 ２、標識物質 ３、特定成分と標識物質の結合物 ４、特定成分と特異的に結合する物質 ５、生物物質（又は、生物物質と特異的に結合する物質
） ６、特定成分と特異的に結合する物質と生物物質の結合
物 ７、生物物質と特異的に結合する物質（又は生物物質） ８、標識物質と特異的に結合し、標識物質゛に起因する
信号を変調させる物質 ９、特定成分と結合物６との結合反応生成物１０、結合
物３と結合物６との結合反応生成物Ａ、７の固定化物 ８．８の固定化物

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ガラクトシドのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼによる
   酵素活性分析法において、前記酵素反応の生成系のガラ
   クトースを触媒物質を用いて除去することを特徴とする
   ガラクトシドの酵素活性分析法。
2. （２）前記触媒物質がβ−Ｄ−ガラクトース脱水素酵素
   、β−Ｄ−ガラクトース酸化酵素及びガラクトキナーゼ
   の群から選ばれた少くとも１種であることを特徴とする
   請求項１に記載のガラクトシドの酵素活性分析法。