JPS63131063A - 免疫学的分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析するた
めの分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する各種分析法が開発されてきた。

その分析法は、主として免疫反応をその原理とするもの
である。上記原理を用いる測定法として、種々のものが
提案されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫測
定法がしられている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙ　ａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標
識したウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗イノン
コリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられて
いる。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種種開発され、該標識化合物としては例えば、酵素、
酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ
、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子
族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下、Ｂ／
Ｆ分離と略記する）がある。

前記免疫測定法における諸問題点を解決するために各種
の方法が開発提示されている　（例えば、特開昭５３−
３８６１９号、同５３−７９０２４号、同５５−９＜１
８５９号、同５７−６７８６０号、同５７−２００８６
２号、同５８−１８１６７号、同５９−７７３５６号及
び同５９−１７０７６８号参照）。

しかし、これらの方法は、Ｂ／Ｆ分離が不完全である、
ノイズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物
質が低分子物質に限られる等の欠点があった。

一方、ウェット・ケミストリにおいて、固定相を用いた
競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特開
昭５８−２０９９９４号及び同５９−２０２０６４号参
照）。

しかしそれらの測定法では、比較的多磯の水溶液中にお
いて、担体に固定相を分離して固定した２種の物質と溶
液中の物質との競合反応を行っているため、意図とした
結合を起こすことなく溶液中に残存する物質が多く、し
かも両同定相を区別することなく全体の酵素活性を測定
しているため、バックグランドやノイズの問題から、感
度、精度及び再現性について満足な結果が得られない。

他方、ドライ・ケミストリにおいて、第２抗体を用いる
免疫測定法が開発されている（特開昭５７−８２７７６
号及び同５７−８２７６７号参照）。

しかし、これらは、操作が煩雑であること、再現性の良
い展開を行う技術が必要であること等、改良の余地があ
る。更に、特開昭５９−３４１５５号には、未結合物収
納シートを用いる方法が開示されている。しかし、この
方法でも、反応用シートと未結合物収納シートとを密着
させたままで測定を行おうとすると前述した問題が生じ
、また測定時に両シートを分離するのは煩雑であり、特
に測定を自動化する際障害となる。

〔発明の目的〕

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は分析素子内で簡便、有効な
合理的なり／Ｆ分離を行い、しかもバックグランドやノ
イズが少なく、感度、精度及び再現性に優れた、流体試
料中の特定成分を定量するだめの分析素子を提供するこ
とにある。

〔発明の構成及び作用効果〕

本発明の構成は、流体試料中の特定成分と特異的に結合
し得る物質を含有する少なくとも一層の多孔質反応層と
酵素により標識された標識物に特異的に結合して該酵素
に起因する信号を変調させる物質を含有する少なくとも
一層の非多孔質とを分析素子に組入れることを特徴とす
る。

本発明の分析素子を用いることにより流体試料中の特定
成分および／または標識物と該特定成分と特異的に結合
する物質との結合反応を多孔質反応層で、また未反応の
標識物と標識酵素に起因する信号を変調させる物質との
結合反応を非多孔層で行なわせることにより、分析素子
中でいわゆるＢ／Ｆ分離が確実に簡便、効率的に行われ
る。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中の特定成分としては
、その存在が定性分析的にチェックできること、望むら
くはその流体試料中での量が定量分析的に測定されるも
のであり、更に特異的に結合する物質が存在しうる物質
又は物質群である。

すなわち、ポリペプチド、タンパク質、複合タンパク質
、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類、ビタミ
ン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。具体的に
は、下記の物質、または物質群を挙げることができるが
、これらに限定されるものではない。

〈タンパク質、複合タンパク質〉 プレアルブミン、アルブミン、α、−酸性糖タンパク質
、α、−アンチトリプシン、α、−糖タンパク質、トラ
ンスコルチン、α、−アンチキモトリプシン、α、−リ
ポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セルロブラ
スミン、Ｚｎ−α、−糖タンパク質、Ｇｃ−グロブリン
、インター−α−トリブシンインヒビター、α１−マク
ログロブリン、α！−ＭＳ−糖タンパク質、α！−マク
ログロブリン、ハプトグロビン、α、−リポタンパク質
、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタンパク
質、β、−糖タンパク質１、β！−マクログロブリン、
Ｃ−反応性タンパク質、ミオグロビン、工リスロポイエ
チン、免疫グロブリン　（ＩｇＧ、　ＩｇＭ。

ＩｇＡ、Ｉｇｒ）、　ｒｇＥ）、補体系成分（Ｃ＋ｑ、
Ｃ＋ｒ、０１５％Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４，Ｃｓ、Ｃ６、Ｃ７
、Ｃｓ　、　Ｃｓ、等）フィブリノ−ダン、ヘモグロビ
ン、グリコヘモグロビン、血液凝固因子、ＨＢｓ抗原、
ＨＢｓ抗体、酵素（例えば、酸性ホスファターゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、アルカリ性ホス７Ｔターゼアイ
ソエンザイム、α−アミラーゼ、アミラーゼアイソエン
ザイム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソエ
ンザイ□ム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）、
乳酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザイム、γ
−ＧＴＰ、リバーゼモノアミンオキシグーゼ、ロイシン
アミノベブチグーゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素酵素等）
等。

〈ホルモン及びホルモンｎ物ｎ＞ 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａ　ｃＴ　Ｈ）、メラニ
ン刺激ホルモン（Ｍ　Ｓ　ＨＬバリプレッシン、オキシ
トシン、インシュリン、グルカゴン、アンギオテンシン
■及び■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セ
ロトニン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ４）、ト
リヨードサイロニン（’ｒ　３）、ガストリン、コルチ
ゾール、アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン
、プロゲステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロ
ピン、胎盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子（
ＴＲＨ。

ＦＳＨ−ＲＨ，ＣＰ、、ＨＳ　ＬＨ−ＲＨ等）等。

くビタミン類〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１ビタミンＢ７、ビタ
ミンＢいビタミンＢＩｆｆｉ、ビタミンＣ１ビタミンＤ
１　ビタミンＥ１　ビタミンＫＳ葉酸等。

〈腫瘍マーカー〉 α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、膵臓癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、
Ｍ−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原
（Ｃ，Ａ　１９−９、ＯＡ　１２５等）、ガングリオサ
イズ。

〈各種の薬剤及び代謝産物〉 ベンゾイルエクゴニン、コカイン、コディン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、カロイマイシン、クロラムフェニコール、ク
ロロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマ
イシン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミ
キシンＢ１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド
、フェノバルビタール、ブリミドン、セコバルビタール
、アセタミノフェン、アミドリプ千リン、カルバマゼピ
ン、ジゴキシン、シソビラミド、リドカイン、メソトレ
キセート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、フェニトイン
、プロカイナミド、プロプラノロール、テオフィリン、
カナピノール、テトラヒドロカナピノール、コリン抑制
薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチロフェノン、
カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリン、グリセ
オフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、メペリジン、
メブロバメート、メタトン、ナルセイン、ノルトリブチ
リン、オキサゼパン、パパベリン、プロスタグランジン
、テグレトール、バルプロン酸等及びこれらの代謝産物
。

〈微生物表面マーカー〉 バクテリア抗原、　　菌類抗原 寄生虫抗原、　　　　ウィルス抗原。

〈農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

くその他〉 血液型物質、カルシオリピン、アレルゲン、本発明に使
用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質
としては、測定対象により抗体、抗原、レクチン、プロ
ティンＡ、特定酵素の阻害物質などが挙げられるが、該
特定成分と該結合物質の結合反応が抗原−抗体反応であ
る場合が特に好ましい。本発明で使用する抗体は、その
由来を特に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原
を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか
、あるいは従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈殿法
、硫酸アンモニウム沈殿法、セファデックスゲルによる
ゲル濾過法、イオン交換セルロールクロマトグラフィー
法、電気泳動法等（右田俊介編「免疫化学」中山書店第
７４〜８８頁参照）で精製して用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）膵
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっても
良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ　、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ　
　ＩｇＤ　。

ＩｇＥ各分画を用いることができ、あるいはこれらの抗
体を酵素処理してＦ　ａｂＳＦ　ａｂ’又はＦ（ａｂ’
）。

といった活性抗体フラグメントにして使用してもよい。

更にこれらの抗体は単一で使、用しても、複数の抗体を
組み合わせて使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質として抗
体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定原理は
免疫測定法に属しその反応型式としては、競合法、２抗
体法、サンドイツチ法があげられる。本発明の分析素子
は免疫測定法において特に好ましく使用できるので、以
下免疫測定法を例にとって本発明の詳細な説明するが、
本発明はこの説明内容に限定されるものではなく、種々
の応用が可能であることは以上に述べてきた内容からも
明らかである。

本発明に適用しうる標識物としては、特定成分、特定成
分の類縁体および特定成分と特異的に結合する物質より
なる群から選ばれた物質と酵素、酵素基質、酵素阻害物
質、補酵素、補欠分子族、アポ酵素または蛍光物質など
との結合物が挙げられ、好ましくは、特定成分、特定成
分の類縁体および特定成分と特異的に結合する物質より
なる群から選ばれた物質と酵素との結合物であり、標識
酵素としては、下記表１に開示された酵素を挙げること
ができる。

表１ １．１．１．１　　　アルコールデヒドロゲナーゼ１．
１．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ１．１
．１．８　　　　グリセロール−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ １．１．１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．２９　　　グリセリン酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．３７　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１．１．
４０　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ
　”） １．１．１．４Ｌ　　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｎ　　Ａ　　Ｄ　　十） １．１．１．４２　　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．１．１．４７　　　グルコースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４８　　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４９　　　グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ １．１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム） １．１．３．１　　　グリコール酸オキシダーゼ１．１
．３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１．３．４　　　
グルコースオキシダーゼ１．１．３゜６　　コレステロ
ールオキシダーゼ１．１．３．９　　　ガラクトースオ
キシダーゼ１．１．３．１７　　　コリンオキシダーゼ
１．１．３．−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ １．２゜１．１　　　ホルムアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ １．２．１．４　　　アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｎ
　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．２．１．５　　　アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｎ
　Ａ　Ｄ　（１））”） １．２．１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １．２．３．２　　　キサンチンオキシグーゼ１．２．
３．３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２．３．４　
　　オキサル酸オキシダーゼｔ、ａ、ａ、−アシルＣｏ
Ａオキシダーゼ１．４．１．ｌ　　　アラニンデヒドロ
ゲナーゼＬ、４．１．ｌ　　　グルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（ｐ）”） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．４．３．２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．４
．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．３．
４　　　アミンオキシダーゼ（フラビン含有） １．４．３．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１
．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ １．５．１．５　　　メチレンテトラヒドロ葉酸デヒド
ロゲナーゼ １．５．３．１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．６．
４．２　　　グルタチオンレダクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
（ｐ）Ｈ） １．６．４．３　　　ジヒドロリボアミドレダクターゼ
（Ｎ　Ａ　Ｄ　”）（ジアホラーゼ）１．７゜３．３　
　　尿酸オキシダーゼ１　、　ｌ　１　、１．　、６　
　　カタラーゼ■。１．１．１．７　　　ペルオキシダ
ーゼ１．１３．１２．４　　乳酸−２−モノオキシゲナ
ーゼ１．１３．１２．５　　Ｒｅｎｉｌｌａルシフェリ
ン−２−モノオキシゲナーゼ １．１３．１２．６　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリ
ン−２−モノオキシゲナーゼ １．１３．１２．７　　Ｐ　ｈｏｔｉｎｕｓルシフェリ
ン−４−モノオキシゲナーゼ （ＡＴＰ加水分解） １．１４．１３．２　４−ヒドロキシ安息香酸３−モノ
オキシゲナーゼ １．１４．１６．ｌ　　フェニルアラニン−４〜モノオ
キンゲナーゼ １．１４．９９．２１　　Ｌ　ａｔｉａルシフェリンモ
ノオキシゲナーゼ ２．１．３．１　　　メチルマロニルＣｏＡカルボキシ
トランスフェラーゼ ２．１．３．２　　　アスパラギン酸カルバモイルトラ
ンスフェラーゼ ２．３．１．６　　　コリンアセチルトランスフェラー
ゼ ２．３．２．２　　　　γ−グルタミルトランスフェラ
ーゼ ２．７．１．１　　　へキソキナーゼ ２．７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７．１．１２　　　グルコノキナーゼ２　、７　、
１　、１．５　　　リボキナーゼ２．７．１．２８　　
　）−リボキナーゼ２．７．１．３２　　　コリンキナ
ーゼ２．７．１．４０　　　ピルビン酸キナーゼ２．７
．３．２　　　クレアチンキナーゼ２．７．５．１　　
　ホスホグルコムターゼ３．１．１．３　　　　トリア
ジルグリセロールリパーゼ ３．１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ。

３．１．１．７　　　アセチルコリンエステラーゼ３．
１．１．８　　　コリンエステラーゼ３．１．Ｌｉ２　
　　コレステロールエステラーゼ３．１．．３．１　　
　アルカリホスファターゼ３．１！、２　　　酸ホスフ
ァターゼ ３．１．３．９　　　グルコース−６−ホスファターゼ ３．１．３．Ｉｌ　　　フルクト−スジホスファターゼ ３．１．３．２１　　　グリセロール−１−ホスファタ
ーゼ ３．１．４．１　　　ホスホジェステラーゼＩ３．１．
４．３　　　ホスホリパーゼＣ３，１，４，４ホスホリ
パーゼＤ ３．２．１．１　　　　α−アミラーゼ３．２．１．２
　　　　β−アミラーゼ３．２．１．１４　　　キチラ
ーゼ ３．２．１．１７　　　ライリザイム ３．２．１．１８　　　ノイラミニダーゼ３．２．１．
２０　　　α−Ｄ−グルコシダーゼ３．２．１．２１　
　　β−Ｄ−グルコシダーゼ３゜２．１．２２　　　α
−Ｄ−ガラクトシダーゼ３．２．１．２３　　　β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ３．２．１Ｊ５　　　ヒアルロノグ
ルコサミニダーゼ ３．４．１１．６　　　アルギニンアミノペプチダーゼ ３．４．２２．４　　　プロメライン ３゜５．１．１　　　アスパラギナーゼ３．５．１．５
　　　ウレアーゼ ３．５．４．２　　　アデニンデアミナーゼ３．５．４
．４　　　アデノシンデアミナーゼ３．５．４．６　　
　ＡＭＰデナミナーゼ４．１．１．ｌ　　　ピルビン酸
デカルボキシラーゼ ４．１．１．３　　　オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ ４．１．１．４１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ ４．１．２．１３　　　フルクトースニリン酸アルドラ
ーゼ ４．２．１．２０　　　）リプトファンシンセターゼ５
．３．１．９　　　グルコースリン酸イソメラーゼ ６．３．４．１４　　　ビオチンカルボキシラーゼ６．
４．１．ｌ　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４．
１．２　　　アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ ６．４．１．３　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ（ＡＴＰ−加水分解） ６．４．１．４　　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ ６．４．１．５　　　ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ　　　　　　　等 本発明の測定方法で使用される特定成分、特定成分の類
縁体および特定成分に特異的に結合する物質等の酵素に
よる標識物は、前記物質の特異的に結合する能力および
酵素の信号を発する能力を保持したまま化学的手段等で
、直接または間接的に両物質を結合することによって得
られる。これらの標識物は、当業者間で良く知られてい
る公知の試薬と公知の方法で結合させることにより得る
ことができ、更にくわしくは、石川栄治、河合　忠、宮
井　潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１
９７８年刊）や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増
刊特集第５ａ号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技
術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年刊）などに
記載された方法を参考にすることができる。

本発明に使用する酵素により標識された標識物と結合し
て、該標識物に起因する信号を変調させる物質は、該酵
素に対する阻害剤または、該酵素に対する抗体＋、酵素
に結合してその活性に影響を与えるものから選ばれる。

酵素に対する阻害剤としては、下記表２に開示されたも
のを挙げることができる。

表２ フィソスチグミン メチオニンスルホキシミン ワイルドファイア（ｗｉｌｄｆｉｒｅ）毒素ブルーデキ
ストラン ０−ジアニシジン−セルロース ０−ジアニシジン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリシン アミノアセトニトリル ２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル−１，３′−カル
ボキシ−３′−アミノ−１′−プロペニル−１−エーテ
ル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−ｔｒａｎｓ−３−ブテ
ン酸 エタノールアミン−〇−サルブエート アルビジイン アザセリン ジアゾオキリノルロイシン ジアゾオキリノアノルバリン Δ３−７−アミツセフアロスボリン酸 ミモシン ２−アミノ−４−ペンチン酸 ２−アミノ−４−クロロ−４−ペンテン酸３．３−ジク
ロロアラニン ３．３．３−トリクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−プロピニルアミンβ−アミノ
プロピオニトリル ２−ブロモエチルアミン ３−デシノイル−Ｎ−アセチルシステアミン２．３−デ
カジェノイル−Ｎ−アセチルシステアミン β−クロロ−し−アラニン Ｌ−セリン−〇−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン ガバクリン ５−ニトロ−し−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン ３−ジメチルアミノ−１−プロピン グリセロール ジイソプロピルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライドクラプラン酸 アロプリノール ブチルチン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロフランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 アリール水銀とその誘導体 キレート化剤　　　　　　　　　　　　等上記の各種物
質の組合せの具体例は、いずれも当業者によく知られて
おり、あらためて開示するまでもないが、本発明の理解
を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
フェニル水銀誘導体とＳ　Ｈ酵素（グルコースオキシダ
ーゼ、コリンオキシダーゼ、グリコール酸オキシダーゼ
、グリセロール−３−リン酸ジヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロデナーゼ、など）；イン７タル［％導体とグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ；α−アミラーゼとアミラーゼイン
ヒビター；エステラーゼとベスタチン；ビオチン酵素（
ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルＣ。

−Ａカルボキンラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシラーゼな
ど）と７ビシン；ペルオキシダーゼと　ｏ　−ノアニシ
ン−デキストラン；乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキシ
ル−３−ブチン酸；モ／アミンオキシグーゼとＮ、Ｎ−
）ツメチル−２−プロピニルアミン又はβ−アミ／プロ
ピオニトリルなどが挙げられ、更にジャーナル　オプ　
ノ　アメリカンケミカル　ソサイティ（Ｊ　、　Ａ　ｔ
ａ、　Ｃｈｅ＋ｅ、　Ｓ　ｏｃ）＄　８０８、ＰｊＳ４
５６ｉ　（１９５８年）：同第８２巻、第５９６頁（１
９６０年）：アカウンツ　オプ　ケミカル　リサーチ（
Ａｅｃ、Ｃｈｅｍ。

Ｒｅ５）ＰＡ９巻、３１３頁（１９７６年）：サイエン
Ｘ（Ｓｃｉｅｎｃｅ）ｆｊＳ１８５巻３２０３’［（１
９７４年）：化学工業１９８５　Ｐｔ５２１　頁（１９
８５年）などに記載された、若しくは引用された重責・
随寥割の島日合ぜＬ　ｂｚ幸１ビ田い入−と＾Ｃできる
。

標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光
法または、発光法で検出することができ、測定法として
は、信号の経時的変化を測定するレート測定法または一
定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法を用い
ることができる。吸光度法（比色法）では、紫外光、可
視光、近赤外光を利用することができ、例えば、流体試
料として血清を用いる場合には、血清による吸光の影響
を小さくするために、緑色光、赤色光、近赤外光を利用
するのが好ましい。

本発明における多孔質反応層は、該特定成分と該特定成
分と特異的に結合する物質との結合反応、該標識物と該
特定成分と特異的に結合する物質との結合反応、または
該標識物と該特定成分との結合反応を行なう層であり、
該特定成分と特異的に結合する物質は、反応層の一部も
しくは全部に固定化されていることが好ましい。また、
反応時間中、流体試料を保持するために、反応層の一部
もしくは全部に、流体試料と自由に接触し得る相互連絡
空隙孔（短径５μｍ〜３００μｍが好ましい）を有する
多孔性構造が存在していることが必要である。

上記の条件を満たしていれば、該多孔質反応層の素材は
特に限定されない。

好ましい例としてはサイズｌＯ〜３５０μｍの粒状体あ
るいは４０〜４００メツシユの繊維から１つ以上選ばれ
た素材により構成される構造体が挙げられる。

該粒状体の材料としては、ケイ藻土、二酸化チタン、硫
酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、ケ
イ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストラン、架橋ポ
リアクリルアミド、アガロース、架橋アガロース、各種
合成樹脂（ポリスチレンなど）などの他、次のような反
応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げられ
る。

（１）　　ポリ（スチレン−コーグリシジルメタクリレ
ート）　（９０／１０　）。

（２）　ポリ（スチレンーコーメチルアクリレートーコ
ーグリシジルメタクリレート）（８Ｇ／１５１５　）。

（３）ポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルメタクリレート
−コーグリシジルメタクリレート）（７５／１５／１０
　）。

（４）ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロライド
ーコーグリシジルメタクリレート）（８０／１０／１０
　）。

（５）　ポリ（スチレンーコージビニルベンゼンーコー
グリシジルアクリレート）（９０／２／８　）。

（６）　ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コーグリシジルメ
タクリレート）　（９０／１０　）。

（７）　ポリ（メタクリレート−コーグリシジルメタク
リレート）　（８０／２０　）。

（８）　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノ
エチルメタクリレート）（９５１５）。

（９）　ポリ（スチレンーコーアジリジルエチルメチク
リレー））（９５１５）。

（１０）　　ポリ（スチレンーコーメチルアクリレート
ーコーアクロレイン）　（９０１５１５）。

（１１）　　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（
９５１５）（１２）ポリ（スチレン〜コービニルチオー
ル）（９５１５）（１３）ポリ（スチレンーコーメチロ
ール化アクリルアミド）（９５１５）。

（１４）　　ポリ（スチレンーコ・ｔ−ブチルアクリレ
ート−グリシジルメタクリレート”）　（９０１５１５
）（１５）　　ポリ（スチレンーコービニルイソシアネ
ート）（９５１５）。

（１６）　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーＮ−メチロールアクリルアミド）　（５０／３５
／１５　）。

（１７）ポリ（スチレンーコーグリシジルメタクリレー
トーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート
）　　（９０１５１５）。

（１８）　　ポリ（スチレンーコーメタクリル酸−コー
アクリルアミド）（９５／２／３　）。

（１９）ポリ（スチレンーコーＮ−メチロールアクリル
アミドーコ〜アクリル酸メトキシエチル）（９０１５１
５）。

（２０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーＮ−メチロー
ルアクリルアミドーコーアクリル酸）　（９０／８／２
　）（２１）　　ポリ（メチルメタクリレートーコーグ
リシジルメタクリレートーコーｔ−ブチルアクリレート
）（８０／１０／１０　）。

（２２）ポリ（スチレンーコーｐ−ビニルベンジルクロ
ライドーコーアクリル酸−コーアクリル酸ウレイドエチ
ル）　　（７５／１０１５／１０　）。

（２３）ポリ（スチレンーコーメタクロレインーコーα
−ヒドロキシエチルメタクリレート）　（９０１５１５
）（２４）　　ポリ（スチレンーコーアクロレインーコ
ーアセトアセトキシエチルメチクリレート） （８５１５／１０　）。

（２５）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルア
ミンエチルアクリレートーコービニルスルホニルエチル
メタクリレート）　（９０１５１５）。

（２６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミノスチレ
ンーコービニルスルホニルエチルメタクリレー）　）　
　　　　（８５／１０１５　）。

（２７）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルア
ミノエチルメタクリレート）　（９０／１０　）。

（２８）　　ポリ（スチレンーコーアクリル酸）（９７
／３）。

（２９）　　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）［
９７／３］。

（３０）　　ポリ（ｐ−ビニルトルエン−ツーｔ−ブチ
ルアクリレート）（９５１５）。

（３１）　　ポリ（メチルアクリレートーコーメタクリ
ルアミ　ド）　　［９５１５）。

（３２）ポリ（スチレン−ニーＮ−メチロールアクリル
アミ　ド）　　（９５１５）。

（３３）ポリ（ｐ−ビニルベンジルクロライド−ツーＮ
−メチロールアクリルアミド）　［９６／４］。

（３４）ポリ（スチレンーコーイタコン酸）（９ｇ／２
）。

（３５）　　ポリ（スチレンーコーし一ブチルアクリレ
ート）（９２／８）。

（３６）　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーアクロレイン）　（３０／６５１５　）。

（３７）ポリ（メチルメタクリレートーコースチレンー
コ−２−ヒドロキソエチルメタクリレート）（２５／７
０１５　）。

（３８）ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエチル
アクリレート）　（８０／２０　）。

（３９）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノ
エチルアクリレート）　（９０／１０　）。

（４０）　　ポリ（スチレンメチルアクリレートーコー
アセトアセトキシエチルアクリレート） （９０１５１５）。

（４１）ポリ（スチレンーコーメタクリル酸）（９５１
５）。

各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、バ
ルブ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン
、セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモ
ニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６ローナイ
ロン、６１０−ナイロンなど）、ポリエステル（ポリエ
チレンテレフタレートなど）、ポリオレフィン（ポリプ
ロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿などの植
物性・動物性・鉱物性・合成・半合成・再生繊維を用い
ることができ、あるいはこれらを混合して用いても良い
。

さらに別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、ブ
ラシュボリマーあるいはガラス繊維、鉱物性繊維（石綿
など）、植物性繊維（木綿、麻、バルブなど）、動物性
繊維（羊毛、絹など）、合成縁！（各種ナイロン、ビニ
ロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレンな
ど）、再生繊維（レーヨン、セルロースエステルなど）
などを単独あるいは混合して製造した織物、不織布、合
成紙などを該多孔質反応層に用いることもできる。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は製膜することにより、流体試料と自
由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が存
在する多孔質反応層を形成する。自己結合性を有しない
粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で
製膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８号
、同５５−９０８５９号、同５７−６７８６０号の方法
を適用することができる。

自己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭５７−１
０１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５４−７０
１６３号に記載の方法により同様に製膜できる。繊維又
は繊維及び粒子の混合物については特開昭５７−１２５
８４７号、同５７−１９７４６６号に記載された繊維分
散液を塗布することにより多孔質反応層を形成できる。

また特開昭６０−１７３４７１号で行われている方法の
ようにゼラチンやポリビニルピロリドンのような水溶性
バインダーを使用した繊維分散液を塗布することも可能
である。

このような分散液を製造するためには、多くの方法を単
独または組合わせて用いることが可能である。例えば有
用な方法の一つとして、界面活性剤を液体キャリアへ添
加し、粒状体および／または、繊維の分散液中における
分布および安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ンＸ−１ｏｏ（ローム　アンドハース社製、オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール）、サーファクタント
ｌ０Ｃ（オリーン社製、ノニルフェノキシポリグリシド
ール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は、広範に選択された量を用いることが
可能であるが、粒状体および／または繊維の重量に対し
て１０重量％〜０．００５重量％、好ましくは６重量％
〜０．０５重量％用いることができる。

更に別の方法として該粒子及び／または繊維と液体キャ
リアの音波処理、物理的混合、および物理的撹拌処理、
ｐＨＲ整などがある。これらは前記の方法と組合わせる
ことにより、さらに有用である。

また、粒状体および／または繊維などに固定化された前
記特定成分と特異的に結合し得る物質または、前記標識
物の活性を保持して、多孔質反応層中に含有させるため
に、特開昭６１−１７７９９７号に記載されている方法
を用いることができる。

前記特定成分と特異的に結合し得る物質の多孔質反応層
への固定化は、種々の公知の方法により、該物質を該多
孔質の反応層の表面に物理的に吸着させるか、化学反応
により直接あるいは間接的に結合させることにより達成
される。その際、該物質の該特定成分に対する特異的結
合性が失われないように留意する必要があり、例えば石
川栄治、河合忠、宮井　潔編「酵素免疫測定法（第２版
）」（医学書院、１９７８年刊）や千畑一部、土佐四組
、松尾雄志著「実験と応用アフィニテイクロマトグラフ
ィー」（講談社、１９７６年刊）に記載されている方法
を、好ましい方法の例として挙げることができる。

また多孔質反応層への該特定成分と特異的に結合し得る
物質の固定化は、特異結合部位が保持されており、かつ
流体試料中に遊離、溶解した状態でなければよく、流体
試料中に不溶の状態で分散されていてもよい。またカラ
ー写真で用いられるカプラーの分散に用いられる方法（
例えば日本写真学会編［写真工学の基礎、銀塩編」（コ
ロナ社１９７８年刊）、脂質二分子膜中に含有させる方
法等も使用できる。

また、該特定成分と特異的に結合し得る物質を固定化し
た後に、必要に応じて免疫反応における非特異的反応を
排除する目的で、測定すべき特異的反応に関与しないタ
ンパク質を担持することが可能である。それらの代表的
な例としては、哺乳動物の正常血清タンパク質、アルブ
ミン、ゼラチン及びそれらの分解物等が挙げられる。

これらの固定化操作は、前述の粒状体あるいは繊維にあ
らかじめ行っておいた後、多孔質反応層を形成しても良
く、あるいは多孔質反応層を形成した後に該固定化操作
を行うことも可能である。

前者の場合、該特定成分と特異的に結合し得る物質を固
定化した粒状体または繊維などの他に前述の特異的反応
に関与しないタンパク質のみを固定化した粒状体または
繊維などを調節のために加えることも可能である。

本発明における非多孔質層とは、酵素により標識された
標識物の標識酵素に特異的に結合して該酵素に起因する
信号を変調させる物質を含有するバインダー均一層であ
る。また非多孔質層とは、前記、相互連絡空隙孔（短径
５μｍ〜３００μｍ）を有する多孔性構造が存在する多
孔質反応層と区別するために用いた用語であり、短径５
μｍ以下の空隙孔は有していてもよい。該非多孔質層を
形成するバインダーとしては、特に限定されないが、好
ましい例としては、例えば、ゼラチン、ゼラチン誘導体
、多糖類（アガロースなど）、カルボキシメチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロースなどの親水性高分子
物質、あるいはビニルピロリドン、アクリル酸およびそ
の誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、ビニルアル
コール、スチレンおよびその誘導体などをモノマーとし
たホモポリマーあるいはコポリマーなどの合成高分子、
さらにポリマーラテックス分散粒子などを用いることが
できる。

本発明による非多孔質層中に、該標識物に特異的に結合
して標識酵素に起因する信号を変調させる物質を含有さ
せるには、前記バインダー塗布液中に、溶解または分散
し、塗布することにより含有させることができる。非多
孔質層中に含有された上記標識物に特異的に結合して酵
素に起因する信号を変調させる物質は、測定時、多孔質
反応層に拡散すると検出すべき信号をも変調してしまう
ため、多孔質反応層への拡散を防止するように含有させ
るべきである。このような方法としては、例えばカラー
写真で用いられるカプラーの分散に多用されているオイ
ルプロテクト分散法（前記、日本写真学会編「写真工学
の基礎、銀塩編」など）、または、脂質二分子膜中に含
有させる方法が使用できる。また、標識物に特異的に結
合して酵素に起因する信号を変調させる物質を修飾して
含有させることができる。例えば該物質を反応性基を有
する高分子に結合させた後含有させる方法、あるいは反
応性基を有する単量体単位に結合させた後高分子化して
含有させる方法、または該物質にカラー写真で用いられ
ているカプラーの拡散防止に用いられている耐拡散性基
を導入した後含有させる方法が使用できる。さらに標識
物に特異的に結合して酵素に起因する信号を変調させる
物質を該物質に対して媒染剤様の作用を有する物質とあ
わせて含有させることもできる。

上記反応性基を有する高分子としては、エポキシ基、ア
ジリジル基、ホルミル基、ヒドロキシメチル基、イソシ
アネート基、チオール基、カルバモイル基、ヒドロキシ
ル基、活性メチレン基、ハロエチルスルホニル基、ビニ
ルスルホニル基などの反応性基を有する単量体単位を含
むものであれば任意であり、例えば前記多孔質反応層の
素材として挙げた自己結合型粒子の組成からなる高分子
および特開昭５８−１３１５６５号に記載されている反
応性高分子重合体などが挙げられる。

また上記耐拡散性基としては、耐拡散効果のある有機基
であれば任意であり、例えば特開昭５０−２３６２７号
および特開昭５ｓ−ｔ９ｏ４９号に記載されているカプ
ラーの耐拡散性基などが挙げられる。

標識物に特異的に結合して酵素に起因する信号を変調さ
せる物質を含むバインダー塗布液を製造するためには、
非多孔質層形成のみならず、該物質の安定化のために、
前記界面活性剤を添加することが有用である。

本発明の分析素子の形態は、分析を行いうるちのであれ
ばよく、特に制限されるものではないが、製造上および
操作・測定上、フィルム状あるいはシート状であること
が好ましい。

本発明の態様は、特定成分と特異的に結合する物質を固
定化等の手段により含有させた多孔質反応層を有し、さ
らに標識物に特異的に結合して標識酵素に起因する信号
を変調させる物質を含有する非多孔質層を有する分析素
子であり、分析素子中でいわゆるＢ／Ｆ分離を行なわせ
て、流体試料中の特定成分の測定を行なうための分析素
子である。すなわち、該特定成分と特異的に結合し得る
物質、該特定成分および標識物との結合反応を多孔質反
応層で行なわせ、未反応の標識物は非多孔質層に含有し
た標識物に特異的に結合して標識酵素に起因する信号を
変調させる物質と結合反応させることにより、分析素子
中でＢ／Ｆ分離を行なうことができる。また該特定成分
と特異的に結合し得る物質と標識物と特異的に結合して
標識酵素に起因する信号を変調させる物質、とを別々の
層に含有させることにより、効果よ＜Ｂ／Ｆ分離を行な
うことができ、さらに標識物に特異的に結合して標識酵
素に起因する信号を変調させる物質を非多孔質層に含有
させることにより、多孔質反応層での反応と未反応の標
識物との反応の開始に差を設定することができ、さらに
より効率よ＜　Ｂ／Ｆ分離を行なうことができる。

本発明の分析素子の理解を助けるために、−例を挙げて
原理を説明する。

第１図に、本発明の分析素子の基本的な構成の一例を示
す。第１図において１は流体試料中の特定成分と特異的
に結合する物質を含有する多孔質反応層を示し、２は酵
素により標識された標識物の酵素部位に特異的に結合し
て該酵素に起因する信号を変調させる物質を含有する非
多孔質層を示す。本発明の原理を競合法を例にとって説
明する。

流体試料の一定量を量りとり標識物の一定量と混合後、
第１図の多孔質反応層１に滴下する。特定成分と標識物
が、多孔質反応層において競争的に反応し標識物の一部
が結合し、未反応の標識物は、非多孔質層中の酵素に起
因する信号を変調させる物質と結合する。多孔質反応層
中で結合する標識物の量は、流体試料中の特定成分の濃
度に依存しているため、あらかじめ特定成分の濃度がわ
かっている種々の濃度の流体試料（標準試料）を用いて
検量線を作成しておけば、未知の流体試料中の特定成分
の濃度を知ることができる。

信号の測定方法は、標識酵素の適当な基質を添加し、比
色、蛍光または発光として、信号強度を測定することが
できる−０好ましくは、信号を比色として測定する方法
であり、このような目的で用いられる基質・発色系は標
識酵素の種類に従って公知の方法から適当な系を選択す
ることができる。

また、本発明の原理は、サンドイツチ法を例にとっても
、標識物が異なるが上記競合法の場合と同様に説明でき
る。

本発明の分析素子の特徴は、分析素子中においてＢ　／
、Ｆ分離を行なわせることにあり、特に標識物に特異的
に結合して酵素に起因する信号を変調させる物質を非多
孔質層に含有させることにより、未反応の標識物との結
合反応の開始時間に差を設定することができ、より効率
のよいＢ／Ｆ分離をすることができることである。

本発明の分析素子は、第１図に示した層構成が必要な基
本構成要素であるが、発明の効果をより一層発揮するた
めに種々の補助層を設けてもよい。

第２図は、支持体４を設置した分析素子を示す。

３は標識物の信号を測定するための検出層である。

支持体４を設置することにより素子の取扱性が向上して
いる。

このような目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セル
ロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な高分子化合物、あるいはガラスのような透明無機化合
物が挙げられる。

また、光透過性が必要とされない場合は、セラミックス
、金属、あるいは樹脂被覆等で防水処理をした紙等も使
用できる。該多孔質反応層はこの様な支持体上で直接塗
布および／または製膜するか、あるいは一旦多孔質反応
層を別に形成した後に前述の支持体に張りつけても良い
。

検出層３は、好ましくは発色試薬層であり、標識酵素の
基質などを含有させた少な（とも一層の親水性コロイド
から成る層である。標識酵素の触媒反応によって発色体
を生成しないような標識酵素を用いる場合には、標識酵
素の反応生成物を基質として発色体を生成させる酵素と
その発色色原体を含む。試薬層に含有される基質や発色
色原体等の物質は、親水性コロイドから成るバインダー
中に溶解あるいは分散して塗布液とすることができる。

特に疎水性化合物の分散には、写真業界で多用されてい
るオイルプロテクト分散法、直接分散法等種々の公知の
分散法を用いることができる。

更に本発明に係る発色試薬層に用いられる親水性コロイ
ドは、ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ
ビニルイミダゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリ
ル酸ナトリウム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等の
セルロース誘導体の等の糖類等が挙げられる。そして好
ましくはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導
体が挙げられる。

更に、本発明に係る発色試薬層のバインダーは、その膜
物性、例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のために、
一部を他の水分散性高分子重合体、即ち高分子ラティッ
クスと置換することができる。

好ましい高分子ラテックスの例としては、例えば特開昭
５７−１１６２５８号、同５８−９９７５２号に記載の
ものが有用である。これらの高分子ラテックスは、親水
性コロイドバインダーの最大７０％を置換することが可
能であるが、好ましくは約５５％以下の置換でよい。

発色試薬層には、他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、
界面活性剤、媒染剤等を、目的に応じて添加することが
できる。

また、その膜厚は約３〜５０μｍ、好ましくは約５〜３
０μｍである。

第２図においてさらに標識物含有層を設けることにより
、流体試料を一定量滴下するだけでその定量が容易にで
き、簡単な操作で再現性の良い結果を得ることができる
。標識物含有層は多孔性媒体に面積濃度が一定となるよ
うに標識物を含有させた層であり、流体試料の一定量を
滴下すると一定量の標識物が溶出され、多孔質反応層に
試料と共に拡散するものである。素材としては、多孔質
反応層と同様のものが用いられ、これらの素材を重層塗
布、製膜しても良いし、あるいはこれらの素材を別々に
塗布、製膜したものあるいは織物、不織布、合成紙にし
たものを標識物含有層として貼付けてもよい。

また標識物含有層は多孔質反応層１と兼ねることもでき
る。

こうした多孔質反応層１１非多孔質層２、発色試薬Ｈ３
や標識物含有層の位置関係は、第２図に限定されるもの
ではなく、多孔質反応層の信号の測定の障害にならない
限り、任意の位置に設けることができる。

第２図において必要であれば、タイミング層を設けても
よい。すなわち第３図において、多孔質反応層ｌと非多
孔質層２または、非多孔質層２と発色試薬層３との間に
タイミング層５を設けることにより、さらに−暦本発明
による効果を発揮することができる。

タイミング層は写真化学の分野で広く知られている技術
であり、例えば硬膜度を適当に調節したゼラチン層など
が用いられる。

例えば、第３図のように非多孔質層２と発色試薬層３と
の間にタイミング層を設けた場合には、素子に流体試料
および標識物の一定量を滴下すると、多孔質反応層およ
び非多孔質層での充分な反応が進行した時点でタイミン
グ層が溶角イすることにより、試薬が拡散し、特定成分
の量に応じた標識物の検出が可能となる。このタイミン
グ層を設けることによって該反応中に生ずる標識物によ
る発色を抑えることができるため、バックグラウンドを
最小限にとどめることができる。

本発明の分析素子は、さらに流体試料を素子に適用した
際にその展開を補助する展ｒ５１ｇ層、流体試料が血ｐ
＆（全血）の際に必要となることがある血球分離層、必
要に応じて設ける接着層、保ＷＩＭ、といった補助層を
設けることができる。これらの補助層及び前述の発色試
薬層、ｔ２ａ物含吻合、タイミング層は独立して設けて
も良く、あるいは複数の機能を併わせもった層として設
けても良い。これらの層はその機能に応じて設けられる
べき位置が容易に決定できる。。

また、必要に応じて緩衝剤は、保恒剤、界面活性剤、媒
染剤などの添加剤をこれらの層に含有させてもよい。

緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適
したｐＨとするために使用れる。使用可能なｔ１衝剤の
例としては、日本化学全編「化学便覧　基ｌ！扁」〔丸
首（株）１９６８年刊〕第１３１２〜１３２０頁、Ｎ、
Ｅ、グツド（Ｎ、Ｅ、Ｇｏｏｄ）ほか、バイオケミスト
リ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　第５８第４６７頁　
（１９６６）、金材、青藻、化学の領域、第３０巻（２
）第７９Ｋ　（１９７６）、１４．Ｊ。

７アーグソン（Ｗ、Ｊ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ほか７ナリ
チカルバイオケミストリ（＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、
第１０４巻第３００頁（１９８０）等の文献に記載され
ているものを挙げることができる。

具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、バルビタール
、グリシン、グツド緩衝剤等が挙げられる。これらの緩
衝剤は、必要に応じて、発色試薬層以外の層に含有させ
てもよい。

保恒剤は、基質光、色試薬の保存安定化のために含有さ
れ、酸化防止剤などがある。

また、固定化された物質、及び酵素標識物の活性保持の
ために、固定化酵素、アフィニテイクロマトグラフィー
の吸着体、固定化抗体及びタンパク質や酵素等の保存に
用いられる保恒剤を含有される。その物質としては、日
本生化学余幅［生化学実験講座１、タンパク質の化学１
ｊ（東京、東京化学同人（株）１９７６年刊〕第６６〜
６７頁、前述の「実験と応用アフィニテイクロマトグラ
フィー」第１０３〜１０４頁、特開昭６０−１４９９２
７号等に記載されているものが挙げられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、シクロデキス
トリン類、非還元糖類（ショ糖、トレハロース）、ポリ
エチレングリコール、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソ
ーダ等が挙げられる。

これらの保恒剤は、固定化された物質及び酵素標識の近
傍に存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用い
ることができ、Ｔ、Ｈジエイムス（Ｔ、）１．Ｊａｎｅ
ｓ）編「ザ・セオリ・オブ・ザ・フォトグラフィックプ
ロセスＪ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐ
ｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ）（第４版）第
７７〜８７頁に記載されているもの番卒１’ｆる□こと
ができる。具体的な例としては、アルデヒド類、活性オ
レフィン類、活性エステル類等があげられる。

界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。

媒染剤は、酵素活性測定のための検出物質を、発色試薬
層に集中的に集めたり、検出物質が色素の場合吸光度係
数を高めたり、波長をシフトさせる物質であり、検出物
質と強い相互作用を示めすカチオン性ポリマー、アニオ
ン性ポリマー及びこれらのポリマーのラテックスが用い
られる。

またＴ　ｔｏ　ｔ、　Ｂ　ａＳ　Ｏ４，マイカなどの白
色顔料等を含有させることにより、光反射層の機能を持
たせることができる。

その他の層中に含有させる試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカ−試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応
じて適当量添加する。

第４図及び第５図は、本発明の好ましい態様の１例につ
いて断面図、その斜視図を示したものである。分析素子
の取扱いが容易になるよう、全体がプラスチック製のマ
ウント６で覆われており、マウント上部に試料注入孔、
下部に信号測定孔が開いている。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例によつて限定されるものでは
ない。

実施例　！ （１）　　標識物（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識
ヒトＩｇＧ）の作成 ヒトＩｇＧ（米国カッペル社製）１０＋Ｉ１ｇを、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　１　ｍ＋２ニ溶解し
、これ（、＝１２ｍｇ／ｍ（ｌ濃度のＳ−アセチルメル
カプト無水コハク酸のジメチルホルムアミド溶液２０μ
Ｑを加えて室温で３０分放置し、さらにＱ、ＬＭＥＤＴ
Ａ４０μＱと、０．ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣ１２緩衡液（ｐ
Ｈ７，０）０．２ｍＲとヒドロキシアミン塩酸塩（ｐＨ
７，０）０．２１ｔを加えテ３０℃で５分放置した後、
０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，０，５ｎ＋ＭＥＤＴ
Ａ）で平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過を
行ない、メルカプト基を導入したヒトＩｇＧを得た。ま
たＯ、１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で透析したｌｈ
ｙ／ｍ（２（タンパク濃度）のグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣＬ、４．１．４東洋Ｉｊｊ社１１）０．６
ｍｅに１．５ｍｔｉ／ｍＱ濃度のＮ−（ε−マレイミド
カプロイロキシ）−サクシイミドのジメチルホルムアミ
ド溶液１２μｇを加えて、室温で３０分放置した後、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５でゲル濾過を行ないマレイミド基を導
入したグルタミン酸デヒドロゲナーゼを得た。

次に、メルカプト基を導入したヒトＩ　ｇＧ　（３０ｎ
ｓｏｉ２／ｍυと、マレイミド基を導入したグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ（３０ｎｍｏｇ／　ｍ（２）とを混
合し、４℃で２２時間反応させ、０．１Ｍメルカプトエ
チルアミンを加えて３０℃２０分放置した後、０．０５
Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣＱｆｌｋ衡液（ｐＨ７，８，５
ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）で平衡化したＵｆｆｔｒｏｇ
ｅ（２ＡｃＡ３４．　ＣＬ、に、Ｂ社製）でゲル濾過を
行ない、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識したヒトＩ
ｇＧを得た。

（２）抗ヒトＩｇＧ抗体固定化セルロース繊維の作成 粉末濾紙Ｄ（東洋濾紙社製）１００９を、ブタンジオー
ルジグリシジルエーテル（アルドリッチ社製）２５０ｖ
＋２と、２ｍ９／Ｉ１ｇの水素化ホウ素ナトリウムを含
む０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５０ｍ（２との混
合液中に懸濁し、４０℃で６時間振盪撹拌した後、純水
およびアセトン洗浄し乾燥してエポキシ基を導入した粉
末濾紙のＤを得た。

この粉末濾紙Ｄ１０９を、１００ｍｇの抗ヒトＩｇＧ抗
体（カッペル社製）を含む０．５Ｍ炭酸ナトリウム−炭
酸水素ナトリウム緩衝液（ＰＨ１０，０）１０Ｇ峠に懸
濁し、４０℃にて２０時間振盪撹拌した。これを濾取し
、純水５００ａ＋＆、　０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）５００ｓ
ｊ２に交互に洗浄した後、ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ緩衝液
（ｐＨ８，５）３０（１＋＋Ｑに懸濁し、室温にて２４
時間振盪撹拌して未反応基をブロックした。これを濾取
し、純水２０００ｍ１２で十分に洗浄し、抗ヒトＩｇＧ
抗体固定化粉末濾紙りを得た。

下記に記載の素子の作成には、この抗ヒトＩｇＧ抗体固
定化粉末濾紙りを、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
４）中に再懸濁し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およ
びショ糖を加えて、凍結乾燥したものを用いた。

（３）耐拡散性基を導入したｐ−アミノフェニルマーキ
ュリツクアセテートの作成 ｐ−アミノフェニルマーキュリツクアセテート３．５９
と、２−（２，４−ジ−ｔ−アミルフェノキシ）ブチロ
イルクロライド４．１９とをジメチルスルホキシド８０
１中に加え、さらに５ｍｆ２のピリジンを加えて室温で
３時間反応させた。反応液を純水５０ＯｍＱ中に注ぎ、
粗生成物を析出させた。水を排棄して、残留物をキシレ
ンにより十分に洗浄した後、酢酸エチルで目的物を抽出
後、酢酸エチルを留去して４（２−（２，４−ジ−ｔ−
アミルフェノキシ）ブチロイルアミノ）フェニルマーキ
ュリツクアセテートを得た。

（４）分析素子（１）の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルム上に下記の組成の発色試薬層を塗布・乾
燥により作成した。

「Ｌ−グルタミン酸ナトリウム　　　　　３．０９／ｍ
”Ｌ脱イオン化ゼラチン　　　　　　　２５．０９／ｍ
”＊　Ｎ　ｅｏ　−Ｔ　Ｂ　；　　３，３’−（４，４
’−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ
− テトラゾリウムクロライド） 次に、上記発色試薬層の上に、下記の組成の塗布液によ
り非多孔質層を設けた。

「コポリ（酢酸ビニル−ビニルピロリドン）Ｌｎ−ブタ
ノール　　　　　　　　　　　８５．０９さらに、上記
非多孔質層の上に、下記の組成の塗布液により多孔質反
応層を設けた。

「コポリ（スチレン−グリシジルメタクリレート）（９
０／　１０　）　　　　　　　　　　　１．５９１　（
凍結乾燥品）　　　　　　　　　　　１５．０９Ｌキシ
レン　　　　　　　　　　　　　　　４０９この塗布試
料１．５ｃｎＸ　１．５ｃｍの大きさに裁断し、本発明
による分析素子（Ｔ）を作成した。

（５）ヒトＩｇＧの測定 前記（１）で作成したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ標
識ヒトＩｇＧと、ヒトＩｇＧ溶液〔０〜１２８０１１９
／ｍＱＳ０．ＯＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　）と
を混合後、６％ウシ血清アルブミンを含有する０、５Ｍ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）で
２倍希釈し、その１０μｇを前記（４）で作成した分析
素子（１）に滴下し、３７℃で１０分間密閉状態でイン
度を測定した。

その結果を下表に示す。

実施例　２ （１）　　高分子に結合そせたｐ−アミノフェニルマー
キュリツクアセテートの作成 コポリ　（グリシジルメタクリレート−メチルメタクリ
レート）（３０／７０　）　１０９をジメチルホルムア
ミド１５０ｍ１２中に入れ、これに５０ｍ１２のジメチ
ルスルホキシドに溶解したｐ−アミノフェニルマーキュ
リツクアセテート３．０９を加え、５０℃で６時間反応
させた後、２−エタノールアミン１０＋＋＋Ｉ２を加え
て、室温で２４時間放置した。この反応液を純水２１２
に注ぎ、反応物を析出させ、さらに純水で充分に洗浄し
、高分子に結合させたｐ−アミノフェニルマーキュリツ
クアセテートを得た。

（２）分析素子（ＩＩ）の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に実施例１−（５）と同様に発色試
薬層を塗布した。次に、この発色試薬層の上に下記の組
成の塗布液により非多孔質層を設けた。

「コポリ（酢酸ビニル−ビニルピロリドン）ヒｎ−ブタ
ノール　　　　　　　　　　　　８５．０９さらに、上
記非多孔質層の上に、実施例１−（４）で用いたのと同
様にして多孔質反応層を設けた。この塗布試料を１．５
ｃｍＸ　１．５ｃｍの大きさに裁断し、本発明による分
析素子（ｆｆ）とした。

（３）ヒトＴｇＧの測定 実施例１−（５）と同様の方法によりヒトＩｇＧ実施例
１および２の結果から、本発明による分析素子を用いる
ことにより、分析素子中で、効率よ＜　Ｂ／Ｆ分離を行
うことができ、ヒトＩｇＧａ度０〜６４０μｇ／ＩＩＱ
の範囲で良好な検量線を得ることができた。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は、本発明の分析素子の層構成の態様
例を示す断面図である。 第４図及び第５図は、夫々本発明の分析素子の断面図及
び斜視図である。 ｌ：　多孔質反応層 ２：　非多孔質層 ３：　試薬層 ４：　光透過性支持体 ５：　タイミング層 ６：　マウント

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 流体試料中の特定成分と特異的に結合し得る物質を含有
   する少なくとも一層の多孔質反応層と酵素により標識さ
   れた標識物に特異的に結合して該酵素に起因する信号を
   変調させる物質を含有する少なくとも一層の非多孔質層
   とを有する分析素子。