JPS63131062A - 免疫学的分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析するた
めの分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する各種分析法が開発されてきた。

その分析法は、主として免疫反応をその原理とするもの
である。上記原理を用いる測定法として、種々のものが
提案されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫測
定法がしられている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙ　ａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標
識したウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インシ
ュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられて
いる。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種種開発され、該標識化合物としては例えば、酵素、
酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ
、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子
族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下、Ｂ／
Ｆ分離と略記する）がある。

面記免疫測定法における諸問題点を解決するために各種
の方法が開発提示されている　（例えば、特開昭５３−
３８６１９号、同５３−７９０２４号、同５５−９０８
５９号、同５７−８７８６０号、同５７−２００８６２
号、同５８−１８１６７号、同５９−７７３５６号及び
同５９−１７０７６８号参照）。

しかし、これらの方法は、Ｂ／Ｆ分離が不完全である、
ノイズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物
質が低分子物質に限られる等の欠点があった。

一方、ウェット・ケミストリにおいて、固定相を用いた
競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特開
昭５８−２０９９９４号及び同５９−２０２０６４号参
照）。

しかしそれらの測定法では、比較的多量の水溶液中にお
いて、担体に固定相を分離して固定した２Ｍの物質と溶
液中の物質との競合反応を行っているため、意図とした
結合を起こすことなく溶液中に残存する物質が多く、し
かも両固定相を区別することなく全体の酵素活性を測定
しているため、バックグランドやノイズの問題から、感
度、精度及び再現性について満足な結果が得られない。

他方、ドライ・ケミストリにおいて、第２抗体を用いる
免疫測定法が開発されている（特開昭５７−８２７７６
号及び同５７−８２７６７号参照）。

しかし、これらは、操作が煩雑であること、再現性の良
い展開を行う技術が必要であること等、改良の余地があ
る。更に、特開昭５９−３４１５５号には、未結合物収
納シートを用いる方法が開示されている。しかし、この
方法でも、反応用シートと未結合物収納シートとを密着
さ仕たままで測定を行おうとすると前述した問題が生じ
、また測定時に両シートを分離するのは煩雑であり、特
に測定を自動化する際障害となる。

〔発明の目的〕

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は分針素子内で簡便、有効な
合理的なり／Ｆ分離を行い、しかもバックグランドやノ
イズが少なく、感度、精度及び再現性に優れた、流体試
料中の特定成分を定量するための分析素子を提供するこ
とにある。

〔発明の構成及び作用効果〕

本発明の構成は、流体試料中の特定成分と結合しない生
物活性物質（以下生物活性物質と略す）または該生物活
性物質と特異的に結合し得る物質のいずれか一方を含有
する少な（とも一層の多孔質反応層と酵素により標識さ
れた標識物に特異的に結合して該標識酵素に起因する信
号を変調させる物質を含有する少なくとも一層の非多孔
質とを分析素子に組入れることを特徴とする。本発明の
分析素子を用いることに上り流体試料中の特定成分およ
び／または標識物と該特定成分と特異的に結合する物質
との結合反応と、この結合反応によって生成した結合反
応生成物と、未反応の標識物と標識酵素に起因する信号
を変調させる物質との結合反応を行なわせることにより
、分析素子中でいわゆるＢ／Ｆ分離が確実に簡便、効率
的に行われる。

本発明において用いられる生物活性物質及び該生物活性
物質と特異的に結合する物質の組み合せとしては、 酵　　素　二　基質（生成物） 阻害剤 補欠分子族 補酵素 ７０ステリツクフアクター 抗　　　体　　：　　抗　　原 プロティンＡ レクチン　：　多Ｓ類 糖タンパク質 核　　酸　：　相補性の塩基配列 ヒストン 核酸 ポリメラーゼ ホルモン　：　受容体 ビオチン　：　アビジン（ストレプトアビクン）が挙げ
られ、好ましくは抗体と抗原、抗体とプロティンＡまた
はビオチン類とアビジン類であり、更に好ましくはビオ
チン類とアビジン類である。

これらの生物活性物質及び生物活性物質と特異的に結合
する物質は、後述する測定しようとする流体試料中に特
定成分及び該特定成分と特異的に結合する物質や測定に
用いる標識物質と結合反応や相互作用しない物質が用い
られる。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、悩を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中の特定成分としては
、その存在が定性分析的にチェックできること、望むら
くはその流体試料中での量が定量分析的に測定されるも
のであり、更に特異的に結合する物質が存在しうる物質
又は物質群である。

すなわち、ポリペプチド、タンパク質、複合タンパク質
、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類、ビタミ
ン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。具体的に
は、下記の物質、または物質群を挙げることができるが
、これらに限定されるものではない。

くタンパク質、複合タンパク質〉 プレアルブミン、アルブミン、α、−酸性糖タンパク質
、α、−アンチトリプシン、Ｃ１−糖タンパク質、トラ
ンスコルチン、α、−アンチキモトリプシン、Ｃ１−リ
ポタンパク質、ヂロキンン結合グロブリン、セルロブラ
スミン、Ｚｎ−α、−糖タンパク質、Ｇｃ−グロブリン
、インター−α−トリプシンインヒビター、Ｃ１−マク
ログロブリン、α、−Ｈ５−糖タンパク質、α、−マク
ログロブリン、ハプトグロビン、α、−リポタンパク質
、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタンパク
質、β、−糖タンパク質、β、−マクログロブリン、Ｃ
−反応性タンパク質、ミオグロビン、エリスロボイエチ
ン、免疫グロブリン　（ＩｇＧ　、　ＩｇＭ　。

ＩｇＡ　、　ＩｇＤ　、　ＩｇＥ　）、補体系成分（Ｃ
ＩＱ％　Ｃ１ｒ−ＣＩＳ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ
８，Ｃ？、Ｃ８、Ｃｅｑ等）、フィブリノーゲン、ヘモ
グロビン、グリコヘモグロビン、血液凝固因子、ＨＢ　
ｓ抗原、ＨＢ　ｓ抗体、酵素（例えば、酸性ホスファタ
ーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファ
ターゼアイソエンザイム、α−アミラーゼ、アミラーゼ
アイソエンザイム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ
、クレアチンホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナー
ゼアイソエンザイム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、Ｇ
ＰＴ）、乳酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザ
イム、γ−ＧＴＰ、リパーゼモノアミンオキンダーゼ、
ロイシンアミノペプチダーゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素
酵素等）等。

くホルモン及びホルモン様物質〉 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＬ
［）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡｃＴＨ）、メラニン
刺激ホルモン（ＭＳＩ−１）、バリプレッシン、オキン
トノン、インツユリン、グルカゴン、アンギオテンシン
Ｉ及び■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セ
ロトニン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ４）、ト
リヨードサイロニン（Ｔ　３）、ガストリン、コルチゾ
ール、アルドステロン、カテ１−ｙ　；　’７　τフＩ
＋ロノぜ・ノ　プロどフ壬。ラ　卆ストステロン、胎盤
性ゴナドトロピン、胎盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモ
ン放出因子（ＴＲＨｌＦＳＨ−ＲＨ，ＣＲＨ％　Ｌ　Ｈ
−ＲＨ等）等。

〈ビタミン類〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１ビタミンＢ２、ビタ
ミンＢ６、ビタミンＢｌｔｈ、ビタミンＣ１ビタミンＤ
１　ビタミンＥ１ビタミンに１葉酸等。

く腫瘍マーカー〉 α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、膵臓癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、
Ｍ−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原
（ＣＡ　１９−９、ＣＡ　１２５等）、ガングリオサイ
ズ。

〈各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コディン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセヂン、カロイマイノン、クロラムフェニコール、ク
ロロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマ
イシン、オキシテトラザイクリン、ペニシリン、ポリミ
キシンＢ１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド
、フエノバルビタール、プリミドン、セコバルビタール
、アセタミノフェン、アミトリブチリン、カルバマゼピ
ン、ジゴキシン、シソピラミド、リドカイン、メソトレ
キセート、Ｎ−アセデルプロカイナミド、フェニトイン
、プロカイナミド、プロプラノロール、テオフィリン、
カナピノール、テトラヒドロカナピノール、コリン抑制
薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチロフェノン、
カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリン、グリセ
オフルビン、イミブラミン、し−ドーパ、メペリジン、
メブロバメート、メタトン、ナルセイン、ノルトリブチ
リン、オキサゼパン、パバベリン、プロスタグランジン
、テグレトール、バルプロン酸等及びこれらの代謝産物
。

〈微生物表面マーカー〉 バクテリア抗原、　　菌類抗原 寄生虫抗原、　　　　　ウィルス抗原。

〈農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホス７
エー）！、及１これらの代ｍｔ　ｆＢ　Ｑ’ｔＪ。

〈その他〉 血液型物質、カルシオリビン、アレルｒン、本発明１÷
使用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結合する物
質としては、測定対象により抗体、抗原、レクチン、プ
ロティンＡ１特定酵素の阻害物質などが挙げられるが、
該特定成分と該結合物質の結合反応が抗原−抗体反応で
ある場合が特に好ましい０本発明で使用する抗体は、そ
の由来を特に限定されるものではなく、ｆｉｉｌ［Ｌ！
［！Ｉｌ物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、
腹水液をそのままか、あるいは従来公知の方法である硫
酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、セファ
デックスデルによるデルは適法、イオン交換セルロース
クロマトグラフィー法、電気泳動法等（右田俊介編「免
疫化学」中山書店第７４〜８８頁参１！＜ｔ　）で１？
１　！！　Ｌで用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）ｌ
＄臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（
ハイブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくって
も良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ　、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ　
　ＩｇＤ　。

ＩｇＥ各分各企画いることができ、あるいはこれらの抗
体を酵素処理してＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ’又はＦ　（ａ
ｂ”）ｔといった活性抗体フラグメントにして使用して
もよい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の
抗体を組み合わせて使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質として抗
体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定原理は
免疫測定法に属しその反応型式としては、競合法、２抗
体法、サンドイツチ法があげられる。本発明の分析素子
は免疫測定法において特に好ましく使用できるので、以
下免疫α１定法を例にとって本発明の詳細な説明するが
、本発明はこの説明内容に限定されるものではなく、種
々の応用が可能であることは以上に述べてきた内容かＬ
　ｔ＋ＪＩＯ；　ｒ）−ホス 本発明に適用しうる標識物としては、特定成分、特定成
分の類縁体および特定成分と特異的に結合する物質より
なる群から選ばれた物質と酵素、酵素基質、酵素阻害物
質、補酵素、補欠分子族、アポ酵素または蛍光物質など
との結合物が挙げられ、好ましくは、特定成分、特定成
分の類縁体および特定成分と特異的に結合する物質より
なる群から選ばれた物質と酵素との結合物であり、標識
酵素としては、下記表１に開示された酵素を挙げること
ができる。

表１ １．１．１．ｌ　　　アルコールデヒドロゲナーゼ１．
１．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ１．１
．１．８　　　　グリセロール−３〜リン酸デヒドロゲ
ナーゼ １、Ｌ、１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．２９　　　グリセリン酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．３７　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１．１．
４０　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ
　”） １．１．１．４１　　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（ＮＡＤ”） １．１．１．４２　　　イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．１．１．４７　　　グルコースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４８　　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４９　　　グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ １．１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム） １．１．３．１　　　グリコール酸オキンダーゼ１．１
．３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１．３．４　　　
グルコースオキシダーゼ１．１．３．６　　　コレステ
ロールオキンダーゼ１、Ｌ、３．９　　　ガラクトース
オキノダーゼ１．１．３．１７　　　コリンオキシダー
ゼ１．１．３．−Ｌ−α−グリセロリン酸オキンダーゼ １．２．１．１　　　ポル１４アルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ １．２．１．４　　　アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｎ
　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．２．１．５　　　アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｎ
　Ａ　ｏ　（ｐ）”） １．２．１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １．２．３．２　　　キサンヂンオキシダーゼ１．２．
３．３　　　ピルビン酸オキソグーゼ１．２．３．４　
　　オキサル酸オキシダーゼ１．３．３−　　アシルＣ
ｏＡオキソダーゼ１．４．１．１　　　アラニンデヒド
ロゲナーゼ１．４．１．３　　　グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（ｐ）＋） １．４．１．４　　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋） １．４．３．２　　　Ｌ−アミノ酸オキンダーゼ１．４
．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オギノダーセ１４．３．４
　　　アミンオキシダーゼ（フラビン含有） １．４．３．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含何）１
．５．１．３　　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナー
ゼ １．５．１．５　　　メヂレンテトラヒドロ葉酸デヒド
ロゲナーゼ １．５．３．１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．６．
４．２　　　グルクチオンレダクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
（ｐ）Ｈ） １．６．４．３　　　　ノヒドロリポアミドレダクター
ゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　”）（ジアホラーゼ）１．７．３．３
　　　尿酸オキシダーゼ１．１１．１．６　　　カタラ
ーゼ １．１１．１．７　　　ペルオキシダーゼ１．１３．１
２．４　　乳酸−２−モノオキシゲナーゼ１．１３．１
２．５　　Ｒｅｎｉｌｌａルシフヱリン−２−モノオキ
シゲナーゼ １．１３．１２．６　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルンフェリ
ン−２＝モノオキシゲナーゼ １．１３．Ｌ２．７　　Ｐ　ｈｏｔｉｎｕｓルシフェリ
ン−ｌＩ−モノオキシゲナーゼ （Ａ　Ｔ　ｐ　Ｉｎｎ　ｋ　１５１？２）１．１４．１
３．２　４−ヒドロキシ安巳香酸３−モノオキンゲナー
ゼ １．１４．１６．ｌ　　フェニルアラニン−４−モノオ
キシゲナーゼ １．１４．９９．２１　　Ｌ　ａｔｉａルシフエリンモ
ノオキンゲナーゼ ２．１．３．１　　　メチルマロニルＣｏＡカルボキシ
トランスフェラーゼ ２．１．３．２　　　アスパラギン酸カルバモイルトラ
ンスフェラーゼ ２．３．１．６　　　コリンアセデルトランスフェラー
ゼ ２．３．２．２　　　γ−グルタミルトランスフェラー
ゼ ２．７．１．ｌ　　　ヘキソキナーゼ ２．７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７．１．１２　　　グルコノキナーゼ２．７．１．
１５　　　リボキナーゼ ２．７．１．２８　　　トリオキナーゼ２．７．１．３
２　　　コリンキナーゼ２．７．１．４０　　　ピルビ
ン酸キナーゼ２．７．３．２　　　クレアチンキナーゼ
２．７．５．１　　　ホスホグルコムターゼ３．１．１
．３　　　　トリアジルグリセロールリパーゼ ３．１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ。

３．１．１．７　　　アセチルコリンエステラーゼ３．
１．１．８　　　コリンエステラーゼ３．１．１．１３
　　　コレステロールエステラーゼ３．１．３．１　　
　アルカリホスファターゼ３．１．３．２　　　酸ホス
ファターゼ３．１．３．９　　　　グルコース−６−ホ
スファターゼ ３．１．３．１１　　　フルクト−スジホスファターゼ ３．１．３．２１　　　グリセロール−１−ホスファタ
ーゼ ３．１．４．１　　　ホスホジェステラーゼＩ３．１．
４．（ホスホリパーゼＣ ３，１，４，４ホスホリパーゼＤ ３．２．１．１　　　　α−アミラーゼ３．２．１．２
　　　　β−アミラーゼ３．２．１．１４　　　キチラ
ーゼ ３．２．１．１７　　　ライリザイム ３．２．１．１８　　　ノイラミニダーゼ３．２．１．
２０　　　α−Ｄ−グルコシダーゼ３．２．１．２１　
　　β−Ｄ−グルコシダーゼ３．２．１．２２　　　α
−Ｄ−ガラクトシダーゼ３．２．Ｌ、２３　　　β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ３．２．１．３５　　　ヒアルロノ
グルコサミニダーゼ ３．４．１１．６　　　アルギニンアミノペプチダーゼ ３．４．２２．４　　　プロメライン ３．５．１．１　　　アスパラギナーゼ３．５．１．５
　　　ウレアーゼ ３．５．４．２　　　アデニンデアミナーゼ３．５．４
．４　　　アデノシンデアミナーゼ３．５．４．６　　
　ＡＭＰデナミナーゼ４．１．１．ｌ　　　ピルビン酸
デカルボキシラーゼ ４．１．１．３　　　オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ ４．１．１．４１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ ４．１．２．１３　　　フルクトースニリン酸アルドラ
ーゼ ４．２．１．２０　　　トリプトファンシンセターゼ５
．３．１．９　　　　グルコース゛リン酸イソメラーゼ ６．３．４．１４　　　ビオチンカルボキシラーゼ６．
４．１．Ｌ　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４．
１．２　　　アセデル−ＣｏＡカルボキソラーゼ ６．４．１．３　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ（ＡＴＰ−加水分解） ６．４．１．４　　　メヂルクロトニルーＣｏＡカルボ
キンラーゼ ６．４．１．５　　　ゲラノイル−ＣｏＡカルボキ本発
明の測定方法で使用される特定成分、特定成分の類縁体
或は特定成分に特異的に結合する物質と酵素或は生物活
性物質または該生物活性物質と特異的に結合する物質と
の結合物は、前記物質の特異的に結合する能力および標
識物の信号を発する能力を保持したまま化学的手段等で
、直接または間接的に両物質を結合することによって得
られる。これらの結合物は、当業者間で良く知られてい
る公知の試薬と公知の方法で結合させることにより得る
ことができ、更にくわしくは、石川栄治、河合　忠、宮
井　潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１
９７８年刊）や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増
刊特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技
術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年刊）などに
記載された方法を参考にすることができる。

本発明に使用する酵素により標識された標識物と結合し
て、該標識物に起因する信号を変調させる物質は、該酵
素に対する阻害剤または、該酵素に対する抗体で、酵素
に結合してその活性に影９を与える乙のから進ばれる。

酵素に対する阻害剤としては、下記表２に開示されたも
のを挙げることができる。

表２ フィソスチグミン メヂオニン　スルポキンミン ワイルドファイア（ｗｉ　ｌｄｒ　１ｒｅ）毒素ブルー
デキストラン ０−ジアニンジン−セルロース Ｏ−ノアニシジン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリジン アミノアセトニトリル ２−アミノ−３−ヒドロキノプロピル−１，３′−力ル
ボキシ−３′−アミノ−ピープロペニル−１−エーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−ｔｒａｎｓ−３−ブテ
ン酸 エタノールアミン−〇−サルフエート アルビジイン アザセリン ノアジオキリノルロイシン ジアゾオキリノアノルバリン Δ３−７−アミツセフアロスボリン酸 ミモンン ２−アミノ−４−ベンヂン酸 ２−アミノ−４−クロロ−１１−ペンテン酸３．３−ノ
クロロアラニン ３．３．３−トリクロロアラニン Ｄ−クロロセリン ２−ヒドロキンルー３−ブチン酸 Ｎ、Ｎｈトリチル−２−ブ［ｊビニルアミンβ−アミノ
プロピオニトリル ２−ブロモエチルアミン ３−デシノイル−Ｎ−アセチルノステアミン２．３−デ
カジェノイル−Ｎ−アセヂルノステアミン β−クロロ−Ｌ−アラニン Ｌ−セリン−０−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリジン ガバクリン ５−ニトロ−し−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン ３−ツメチルアミノ−Ｉ−プロピン グリセロール ジイソプロピルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライドクラプラン酸 アロプリノール ブチルチン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロフランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 了り−ル水銀とその誘導体 キレート化剤　　　　　　　　　　　　等上記の各種物
質の組合せの具体例は、いずれら当業者によく知られて
おり、あらためて開示するまでもないが、本発明の理解
を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
フェニル水銀誘導体とＳ　Ｉ−１酵素（グルコースオキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、グリコール酸オキシダ
ーゼ、グリセロール−３−リン酸ジヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、など）；イソフタル酸誘導体とグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ：α−アミラーゼとアミラーゼ
インヒビター、エステラーゼとベスタチン；ビオチン酵
素（ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルＣ〇−Ａカ
ルボキシラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラー
ゼ、メチルマロニル−ＣｏΔカルボキシラーゼなど）と
アビジン；ベルオキシグーゼと０−ノアニシン−デキス
トラン；乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキシル−３−ブ
チン酸；モ／アミンオキシグーゼとＮ、Ｎ−）リフチル
−２−プロピニルアミン又はβ−７ミノプロビオニトリ
ルなどが挙げられ、更にツヤ−ナル　オブ　ノ　アメリ
カンケミカル　ソサイティ（Ｊ　、　Ａ　＋ｎ、ＣＩ＋
ｅｍ、Ｓ　ｏｃ）第８０巻、ｆｊｓ　４５（３頁（１９
５８年）二同第８２巻、第５９６頁（１９６０年）：ア
カウンツ　オブ　ケミカル　リサーチ（Ａ　ｃｃ、ＣＩ
＋ｅ＋ａ。

Ｒｃｓ）１９巻、３１３頁（１９７６年）：サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１１８５９３２０′Ｆ１（１９７４
年）：化学工業１９８５第２１頁（１９８５年）などに
記載された、若しくは引用された酵素・阻害剤の組合せ
も好ましく用いることができる。

標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光
法または、発光法で検出することがでさ、測定法として
は、信号の経時的変化を測定するレート測定藷または一
定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法を用い
ることができる。吸光度法（比色法）では、紫外光、可
視光、近赤外光を利用することができ、例えば、流体試
料として血清を用いる場合には、［ｆｎ　Ｐｅｔによる
吸光の影響を小さくするために、緑色光、赤色光、近赤
外光を利用するのが好ましい。

本発明における多孔質反応層は、生物活性物質或は該生
物活性物質と特異的に結合する物質との結合反応、特定
成分に対する該特定成分と特異的に結合する物質の結合
反応および、該標識物に対する該特定成分と特異的に結
合する物質の結合反応または、該標識物と該特定成分と
の結合反応を行なう層であり、該生物活性物質または該
生物活性物質と特異的に結合し得る物質のいずれか一方
は、反応層の一部もしくは全部に固定化されていること
が好ましい。

また、反応時間中、流体試料を保持するために、反応層
の一部もしくは全部に、流体試料と自由に接触し得る相
互連絡空隙孔（短径５μｍ〜３００μｍが好ましい）を
有する多孔性構造が存在していることが必要である。上
記の条件を満たしていれば、該多孔質反応層の素材は特
に限定されない。

好ましい例としてはサイズｌＯ〜３５０μｍの粒状体あ
るいは４０〜４００メツシユの繊維から１つ以上選ばれ
た素材により構成される構造体が挙げられる。

該粒状体の材料としては、ケイ藻土、二酸化チタン、硫
酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、ケ
イ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストラン、架橋ポ
リアクリルアミド、アガロース、架橋アガロース、各種
合成樹脂（ポリスチレンなど）などの他、次のような反
応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げられ
る。

（＋）　　ポリ（スチレン−コーグリシジルメタクリレ
ート）　（９０／１０　）。

（２）　ポリ（スチレンーコ・メチルアクリレート−コ
ーグリンノルメタクリレート）（８０／１５１５　）。

（３）ポリ（スチレン−クーｎ−ブチルメタクリレート
−コーグリシジルメタクリレート）（７５／１５／１０
　）。

（４）ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロライド
ーコーグリシジルメタクリレート）（８０／１０／１Ｇ
　）。

（５）ポリ（スチレンーコージビニルベンゼンーコーグ
リシジルアクリレート）　Ｃ９０／２／８　）。

（６）　ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コーグリシジルメ
タクリレート）　（９０／ｌｏ　）。

（７）　ポリ（メタクリレート−コーグリシジルメタク
リレート）　（８０／２０　）。

（８）　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメヂルアミノ
エチルメタクリレート）（９５１５）。

（９）ポリ（スチレンーコーアジリジルエチルメチクリ
レート）（９５１５）。

（１０）　　ポリ（スチレンーコーメ°チルアクリレー
トーコーアクロレイン）　（９０１５１５）。

（１１）　　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（
９５１５）（１２）ポリ（スヂレンーコービニルヂオー
ル）（９５１５）（１３）ポリ（スチレンーコーメヂロ
ール化アクリルアミ　ド）（９５１５）。

（１４）　　ポリ（スチレンーコーＬ−プチルアクリレ
ート−グリシジルメタクリレート）（９０１５１５）（
１５）　　ポリ（スチレンーコービニルイソシアネート
）（９５１５）。

（１６）　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーＮ−メチロールアクリルアミド）　（５０／３５
／１５　）。

（（７）ポリ（スチレンーコーグリシジルメタクリレー
トーコーＮ、Ｎ−ジメヂルアミノエヂルメタクリレート
）　　（９０１５１５）。

（１８）　　ポリ（スチレンーコーメタクリル酸−コー
アクリルアミド）　（９５／２／３　）。

（１９）　　ポリ（スチレンーコーＮ−メチロールアク
リルアミドーコーアクリル酸メトキシエチル）Ｃ９０１
５１５）。

（２０）　　ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーＮ−メチ
ロールアクリルアミドーコ−アクリル酸）　（９０／８
／２　）（２１）　　ポリ（メチルメタクリレートーコ
ーグリシジルメタクリレートーコーｔ−ブヂルアクリレ
ート）（８０／’１０／１０　）。

（２２）　　ポリ（スヂレンーコーｐ−ビニルベンノル
クロライドーコーアクリル酸−コーアクリル酸ウレイド
エチル）（７５／１０１５／１０　）。

（２３）　　ポリ（スヂレンーコーメタクロＬノインー
コーα−ヒドロキシエチルメタクリレート）　（９０１
５１５）（２４）ポリ（スチレンーコーアクロレインー
コーアセトアセトキシエチルメチクリレート） ［８５／Ｓ／１０　）。

（２５）ポリ（スヂレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミン
エチルアクリレートーコービニルスルホニルエチルメタ
クリレート）　（９０１５／’５　）。

（２６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミノスチレ
ンーコービニルスルホニルエヂルメククリレート）　　
　　　Ｃ８５／１０１５　）。

（２７）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルア
ミノ′エチルメタクリレート）〔９０／ｌＯ〕。

（２８）ポリ（スチレンーコーアクリル酸）［９７／３
）。

（ｚ９）　　ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）［
９７／３３゜（３０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコー
し一ブヂルアクリレート）［９５１５）。

（３１）　　ポリ（メチルアクリレートーコーメタクリ
ルアミ　ド）　　（９５１５）。

（３２）　　ポリ（スヂレンーコーＮ−メチロールアク
リルアミ　ド）　　［９５１５）。

（３３）　　ポリ（ｐ−ビニルベンジルクロライドーコ
ーＮ−メチロールアクリルアミド）　［９６／４］。

（３４）ポリ（スチレンーコーイタコン酸）（９ｇ／２
）。

（３５）　　ポリ（スチレン−ツーｔ−ブチルアクリレ
ート）〔９２７８〕。

（３６）ポリ（メヂルアクリレートーコースチレンーコ
ーアクロレイン）　（３０／６５１５　）。

（３７）　　ポリ（メチルメタクリレートーコースチレ
ンーコ＝２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（２５
／７０１５　）。

（３８）ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエチル
アクリレート）　（８０／２０　）　。

（３９）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルア
ミノエヂルアクリレート）　（９０／１０　）。

（４０）　　ポリ（スチレンメチルアクリレートーコー
アセトアセトキシエチルアクリレート） Ｃ９０１５１５）。

（４１）　　ポリ（スチレンーコーメタクリル１ｌｉ１
２）［［］５１５）。

各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、バ
ルブ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン
、セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモ
ニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６ローナイ
ロン、６１０−ナイロンなど）、ポリエステル（ポリエ
チレンテレフタレートなど）、ポリオレフィン（ポリプ
ロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿などの植
物性・動物性・鉱物性・合成・半合成・再生ｗ＜維を用
いることができ、あるいはこれらを混合して用いてら良
い。

さらに別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、ブ
ラシュボリマーあるいはガラス繊Ｑ（１ｉ、鉱物性線ｔ
Ｉｔ（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど
）、動物性繊維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイ
ロン、ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプ
ロピレンなど）、再生繊維（レーヨン、セルロースエス
テルなど）などを単独あるいは、見合して製造した織物
、不織布、合成紙などを該多孔質反応層に用いることら
できる。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は製膜することにより、流体試料と自
由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が存
在する多孔質反応層を形成する。自己結合性を有しない
粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で
製膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８号
、同５５−９０８５９号、同５７−６７８６０号の方法
を適用することができる。

自己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭５７−１
０１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５ｇ−７０
１８３号に記載の方法により同様に製膜できる。繊維又
はｍ維及び粒子の混合物については特開昭５７−１２５
８４７号、同５７−１９７４６６号に記載された繊維分
散液を塗布することにより多孔質反応層を形成できる。

また特開昭６０−１７３４７１号で行われている方法の
ようにゼラチンやポリビニルピロリドンのような水溶性
バイシダーを使用した繊維分散液を塗布することも可能
である。

このような分散液を製造するためには、多くの方法を単
独または組合わせて用いることが可能である。例えば有
用な方法の一つとして、界面活性剤を液体キャリアへ添
加し、粒状体および／または、繊維の分散液中における
分布および安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ンＸ−１００（ローム　アンドハース社製、オクチルフ
ェノキシポリエトキンエタノール）、ザーファクタント
１０Ｇ（オリーン社製、ノニルフェノキシポリグリシド
ール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は、広範に選択された量を用いることが
可能であるが、粒状体および／または繊維の重量に対し
て１０重量％〜０．００５重量％、好ましくは６重量％
〜０．０５重量％用いることができる。

更に別の方法として該粒子及び／または＃＆維と液体キ
ャリアの音波処理、物理的混合、および物理的撹拌処理
、ｐＨ８整などがある。これらは前記の方法と組合わせ
ることにより、さらに有用である。

また、粒状体および／または繊維などに固定化された生
物活性物質または、該生物活性物質と特異的に結合する
物質、および特定成分と特異的に結合する物質または標
識物の活性を保持して、多孔質反応層または後述の層中
に含有させるために、特開昭６１−１７７９９７号に記
載されている方法を用いることができる。

生物活性物質または該生物活性物質と特異的に結合する
物質の多孔質反応層への固定化は、種々の公知の方法に
より、該物質を該多孔質の反応層の表面に物理的に吸着
させるか、化学反応により直接あるいは間接的に結合さ
せることにより達成される。その際、該物質の特異的結
合性が失われないように留意する必要があり、例えば石
川栄治、河合忠、宮井　潔編「酵素免疫測定法（第２版
）」（医学書院、１９７８年刊）や千畑一部、土佐四組
、松尾雄志著「実験と応用アフィニテイクロマトグラフ
ィー」（講談社：　１９７６年刊）に記載されている方
法を、好ましい方法の例として挙げることができる。

また多孔質反応層への該特定成分と特異的に結合し得る
物質の固定化は、特異結合部位が保持されており、かつ
流体試料中に遊離、溶解した状態でなければよく、流体
試料中に不溶の状態で分散されていてもよい。またカラ
ー写真で用いられるカプラーの分散に用いられる方法（
例えば日本写真学会編「写真工学の基礎、銀塩編」（コ
ロナ社１９７８年刊）、脂質二分子膜中に含有させる方
法等も使用できる。また、該生物活性物質または該生物
活性物質と特異的に結合する物質を固定化後に必要に応
じて結合反応における非特異的反応を排除する目的で、
測定すべき特異的反応に関与しないタンパク質を担持す
ることが可能である。それらの代表的な例としては、哺
乳動物の正常血清タンパク質、アルブミン、ゼラチン及
びそれらの分解物等が挙げられる。

これらの固定化操作は、前述の粒状体あるいは繊維にあ
らかじめ行っておいた後、多孔質反応層を形成しても良
く、あるいは多孔質反応層を形成した後に該固定化操作
を行うことも可能である。

旧習の場合、該物質を固定化した粒状体または繊維の他
に前述の特異的反応に関与しないタンパク質のみを固定
化した粒状体または繊維を調節のために加えることも可
能である。

本発明における非多孔質層とは、酵素により標識された
標識物の標識酵素に特異的に結合して該酵素に起因する
信号を変調させる物質を含有するバインダー均一層であ
る。また非多孔質層とは、前記、相互連絡空隙孔（短径
５μｍ〜３００μｍ）を有する多孔性構造が存在する多
孔質反応層と区別するために用いた用語であり、短径５
μｍ以下の空隙孔は有していてらよい。該非多孔質層を
形成するバインダーとしては、特に限定されないが、好
ましい例としては、例えば、ゼラチン、ゼラチン誘導体
、多糖類（アガロースなど）、カルボキシメチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロースなどの親水性高分子
物質、あるいはビニルピロリドン、アクリル酸およびそ
の誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、ビニルアル
コール、スチレンおよびその誘導体などをモノマーとし
たポモポリマーあるいはフボリマーなどの合成高分子、
さらにポリマーラテックス分散粒子などを用いることが
できろ。

本発明による非多孔質層中に、該標識物に特異的に結合
して標識酵素に起因する信号を変調さ口゛る物質を含有
させるには、前記バインダー塗布液中に、溶解または分
散し、塗布することにより含有させることかできる。非
多孔質層中に含有された」二記標識物に特異的に結合し
て酵素に起因ずろ信号を変調させる物質は、測定時、多
孔質反応層に拡散すると検出すべき信号をも変調してし
まうため、多孔質反応層への拡散を防止するように含有
さセ・るべきである。このような方法としては、例えば
カラー写真で用いられるカプラーの分散に多用されてい
るオイルプロテクト分散法（前記、日本写真学会編「写
真工学の基礎、銀塩編」など）、または、脂質二分子膜
中に含有させる方法が使用できる。また、標識物に特異
的に結合して酵素に起因する信号を変調させる物質を修
飾して含有させることができる。例えば該物質を反応性
基を有する高分子に結合させた後含有させる方法、ある
いは反応性基を有する単量体単位に結合させた後高分子
化して含有させる方法、または該物質にカラー写真で用
いられているカプラーの拡散防止に用いられている耐拡
散性基を導入した後含有させる方法が使用できる。さら
に標識物に特異的に結合して酵素に起因する信号を変調
させる物質を該物質に対して媒染剤様の作用を有する物
質とあわせて含有させることもてきる。

上記反応性基を有する高分子としては、エボキン基、ア
ジリノル基、ホルミル基、ヒドロキシメチル基、イソシ
アネート基、チオール基、カルバモイル基、ヒドロキシ
ル基、活性メチレン基、ハロエチルスルホニル基、ビニ
ルスルホニル基などの反応性基を何する単量体単位を含
むものであれば任意であり、例えば前記多孔質反応層の
素材と１プ屑ｌｌＰ士＋自コ仕Δ溶Ｉ中舟ヱハ玄１’ｌ
ｄン去、己す、・１宣ムヱおよび特開昭５８−１３１５
６５号に記載されている反応性高分子重合体などが挙げ
られる。

また上記耐拡散性基としては、耐拡散効果のある有機基
であれば任意であり、例えば特開昭５０−２３６２７号
および特開昭５６−１９０４９号に記載されているカプ
ラーの耐拡散性基などが挙げられろ。

標識物に特異的に結合して酵素に起因する信号を変調さ
仕る物質を含むバインダー塗布液を製造するためには、
非多孔質層形成のみならず、該物質の安定化のために、
前記界面活性剤を添加することが有用である。

本発明の分析素子の形態は、分析を行いうるちのであれ
ばよく、特に制限されるものではないが、製造上および
操作・測定上、フィルム状あるいはシート状であること
が好ましい。

本発明の態様は、生物活性物質または該生物活性物質と
特異的に結合し得る物質のいずれか一方を固定化等の手
段により含有させた多孔質反応層を存し、さらに標識物
に特異的に結合して、標識酵素に起因する信号を変調さ
せる物質を含有する非多孔質層を有する分析素子であり
、分析素子中でいイつゆるＢ／Ｆ分離を行なわせて、流
体試料中の特定成分の測定を行なうための分析素子であ
る。

すなわち、上記生物活性物質までは該生物活性物質と特
異的に結合し得る物質のいずれか一方を結合し、該特定
成分と特異的に結合し得る物質、該特定成分および標識
物との間で生成した結合反応生成物と生物活性物質また
は該生物活性物質と特異的に結合し得る物質のいずれか
の他の一方との結合反応を多孔質反応層で行なわせ、未
反応の標識物は、非多孔質層に含有した標識物に特異的
に結合して標識酵素に起因する信号を変調させる物質と
結合反応させることにより、分析素子中でＢ／Ｆ分離を
行なうことができる。また生物活性物質または該生物活
性物質と特異的に結合し得る物質のいずれか一方と、標
識物に特異的に結合して標識酵素に起因する信号を変調
させる物質とを別々の層に含有させることにより、効果
よ＜　Ｂ／Ｆ’分離を行なうことができ、さらに標識物
に特異的に結合して標識酵素に起因する信号を変調させ
る物質を非多孔質層に含有させることにより、多孔質反
応層での反応と、未反応の標識物との反応の開始に差を
設定することができ、さらにより効率よ（ｎ　／　Ｆ分
離を行なうことができる。

本発明の分析素子の理解を助けるために、−例を挙げて
原理を説明する。

第１図に、本発明の分析素子の基本的な構成の一例を示
す、第１図において１は生物活性物質と特異的に結合す
る物質のいずれか一方を含有する多孔質反応層を示し、
２は、酵素により標識された標識物に特異的に結合して
、該標識酵素に起因する信号を変調させる物質を含有す
る非多孔質層を示す０本発明の原理を競合法を例にとっ
て説明する。流体試料の一定量を址りとり標識物の一定
量と生物活性物質または、該生物活性物資と特異的に結
合し得る物質のいずれか一方が結合した、該特定成分と
特異的に結合し得る物質の一定量を加えて混合し、滴下
液とした後、第１図の多孔質反応層１に滴下する。該滴
下液中での競合反応の結果生成する標識物が結合した結
合反応生成物は、多孔質反応層中の生物活性物質または
該生物活性物質と特異的に結合し得る物質のいずれかの
他の一方と結合し、未反応の標識物は、非多孔質層中の
酵素に起因する信号を変調させる物質と結合する。多孔
質反応層中で結合した標識物の量は、流体試料中の特定
成分の濃度に依存しているため、あらかじめ特定成分の
濃度がわかっている種々の濃度の流体試料（標準試料）
を用いて検量線を作成しておけば、未知の流体試料中の
特定成分の濃度を知ることができる。

また、上記滴下液中の競合反応は該多孔質反応層中でも
起こさせることができる。第１図において、多孔質反応
層中に、生物活性物質または該生物活性物質と特異的に
結合し得る物質のいずれか一方を固定化して含有させ、
さらに標識物および生物活性物質または該生物活性物質
と特異的に結合し得る物質のいずれかの他の一方を結合
した該特定成分と特異的に結合し得る物質を含有させて
おく。

冷２−　論法せ廿山の鉾宇帥寺の一宝岳本跡名項質反応
層に滴下すると、固相一液相反応より液相中での反応の
方が十分に速いため、前記に説明したのと同様の反応が
起り、多孔質反応層中で結合した標識物の量から、流体
試料中の特定成分の濃度を知ることができる。この際、
競合反応によって生成した標識物結合反応生成物は、非
多孔質層に含有した標識物と特異的に結合して標識酵素
に起因する信号を変調させろ物質とも反応が可能である
が、該物質と標識酵素との結合より、上記標識物結合反
応生成物と該多孔質反応層の固定化物との結合を強くす
るように選択することにより、解決をはかることができ
る。

信号の測定方法は、標識酵素の適当な基質を添加し、比
色、蛍光または発光として、信号強度を測定することが
できる。好ましくは、信号を比色として測定する方法で
あり、このような目的で用いられる基質・発色系は標識
酵素の種類に従って公知の方法から適当な系を選択する
ことができる。

また、本発明の原理は、サンドイツチ法を例にとっても
、標識物が異なるが上記競合法の場合と同様に説明でき
る。

本発明の分析素子の特徴は、分析素子中においてＢ／Ｆ
分離を行なわせることにあり、特に標識物に特異的に結
合して醇索に起因する信号を変調さＵｏる物質を非多孔
質層に含有させることにより、未反応の標識物との結合
反応の開始時間に差を設定することができ、より効率の
よいＢ／Ｆ分離をすることができることである。

本発明の分析素子は、第１図に示した層構成が必要な基
本構成要素であるが、発明の効果をより一層発押するた
めに種々の補助層を設けてもよい。

第２図は、支持体４を設置した分析素子を示す。

３は標識物の信号を測定するための検出層である。

支ＦＪｔ体４を設置することにより素子の取扱性が向上
している。

このような目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セル
ロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト及びボリヒニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な高分子化合物、あるいはガラスのような透明無機化合
物が挙げられる。

また、光透過性か必要とされない場合は、セラミックス
、金属、あるいは樹脂被覆等で防水処理をした紙等も使
用できる。該多孔質反応層はこの様な支持体上で直接塗
布および／または製膜するか、あるいは一旦多孔質反応
層を別に形成した後に前述の支持体に張りつけても良い
。

検出層３は、好ましくは発色試薬層であり、標識酵素の
基質などを含有さＵ・た少なくとも一層の親水性コロイ
ドから成る層である。標識酵素の触媒反応によって発色
体を生成しないような標識酵素を用いる場合には、標識
酵素の反応生成物を基質として発色体を生成させる酵素
とその発色色原体を含む。試薬層に含有されろ基質や発
色色原体等の物質は、親水性コロイドから成るバインダ
ー中に溶解あるいは分散して塗布液とすることができる
。特に疎水性化合物の分散には、写真業界で多用されて
いるオイルプロテクト分散法、直接分散法等種々の公知
の分散法を用いることができる。

更に本発明に係る発色試薬層に用いられろ親水性コロイ
ドは、ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
、ポリビニルアルコール、ポリビニルビクリトン、ポリ
ビニルアルコ−ル、ポリアクリルアミＩＩ、ポリアクリ
ル酸ナトリ１ンム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセ
ルロース、カルホキジメチルセルロースナトリウム塩等
のセルロース誘導体の等の糖類等が挙げられる。そして
好ましくはゼラチン、７タル化ゼラチン等のゼラチン誘
導体が挙げられる。

更に、本発明に係る発色試薬層のバインダーは、その膜
物性、例えばＤ潤度や熱による溶解性の改良のために、
一部を他の水分散性高分子重合トド、即ち高分子ラテッ
クスと置換することができる。

好ましい高分子ラテックスの例としては、例えば特開昭
５７−１１６２５８号、同５８−９９７５２号に記載の
ものが有用である。これらの高分子ラテックスは、親水
性コロイドバインダーの最大７０％を置換することが可
能であるが、好ましくは約５５％以下の置換でよい。

発色試薬層には、他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、
界面活性剤、媒染剤等を、目的に応じて添加することが
できる。

また、その膜厚は約３〜５０μｍ１好ましくは約５〜３
０μｍである。

第３図においてさらに標識物含有層を設けることにより
、流体試料を一定量滴下するだけでその定量が容易にで
き、簡単な操作で再現性の良い結果を得ることができる
。標識物含有層は多孔性媒体に面積濃度が一定となるよ
うに標識物を含ｒＴさせた層であり、流体試料の一定量
を滴下すると一定量の標識物が溶出され、多孔質反応層
に試料と共に拡散するものである。素材としては、多孔
質反応層と同様のものが用いられ、これらの累°材を重
層塗布、製膜しても良いし、あるいはこれらの素材を別
々に塗布、製膜したものあるいは織物、不織布、合成紙
にしたものを標識吻合何層として貼付けてもよい。

また標識物含有層は多孔質反応層１と兼ねることもでき
る。

こうした多孔質反応層１、非多孔質層２、発色試薬層３
や標識吻合ａ層の位置関係は、第２図に限定されるもの
ではなく、多孔質反応層の信号の測定の障害にならない
限り、任ぎの位置に設けろことができる。

第２図において必要であれば、タイミング層を設けても
よい。すなわち第３図において、多孔質反応層１と非多
孔質層２または、非多孔質層２と発色試薬層３との間に
タイミング層５を設けることにより、さらに−暦本発明
による効果を発揮することができる。

タイミング層は写真化学の分野で広く知られている技術
であり、例えば硬膜度を適当に調節したゼラチン層など
が用いられる。

例えば、第３図のように非多孔質層２と発色試薬層３と
の間にタイミング層を設けた場合には、素子に流体試料
および標識物の一定量を滴下すると、多孔質反応層およ
び非多孔質層での充分な反応が進行した時点でタイミン
グ層が溶解することにより、試薬が拡散し、特定成分の
量に応じた標−織物による発色を抑えることができるた
め、バックグラウンドを最小限にとどめることができる
。

本発明の分析素子は、さらに流体試料を素子に適用した
際にそのＲ１１１を補助するｒｆｉ叩層、流体試料が血
液（全血）の際に必要となることがある血球分離層、必
要に応じて設ける接着層、保護層、といった）口助層を
設けることができる。これらの補助層及び前述の発色試
薬層、標識物含有層、タイミング層は独立して設けても
良く、あるいは曳数の機能を併わせもった層として設け
ても良い。これらの層はその機能に応じで設けられるべ
き位置が容易に決定できる。

また、必要に応じて緩衝剤は、保恒剤、界面活性剤、媒
染剤などの添加剤をこれらの層に含有させてもよい。

緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適
したＩ）　＋（とするために使用ｉする。使用可能なｔ
ｌ　ｆ！Ｊｉ　Ｍ’ｌの例としては、日本化学会場「化
学便覧　基礎編」〔丸８（株）１９６６年刊〕第１３１
２〜１３２０頁、Ｎ、Ｅ、グツド（Ｎ、Ｅ、Ｇｏｏｄ）
はが、バイオケミストリ　（口１ｏｃｌ＋ｅｍｉｓＬｒ
ｙ）　　ｔｊｓ　　５　％　第４（３７頁　（１９６Ｇ
）、金材、斉藤、化学の頭載、１３０巻（２）第７９頁
（１９７Ｇ）、誓、Ｊ。

７Ｔ−グソン（Ｗ、　Ｊ、　Ｆｅｒｇｕａ。１．）ほか
アナリチ力ルバイ　　オ　ケ　　ミ　　ス　　ト　　リ
　（＾ｎａ　Ｉ　　、Ｄ　１ｏｃｌ＋ｅ＋ｎ、ｔ５　１
０４χ！ｕｎ３００ｐて（１り８０）等の文献に記載さ
れているものを挙げることができる。

具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、バルビタール
、グリシン、グツｌ’　１１ｉ□剤等が挙げられる。こ
れらの緩衝剤は、必要に応じて、発色試薬層以外の層に
含有させでもよい。

保恒剤は、基質光、色試薬の保存安定化のために含有さ
れ、酸化防止剤などがある。

また、固定化された物質、及び酵素標識物の活性保持の
ために、固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイー
の吸着体、固定化抗体及びタンパク質や酵素等の保存に
用いられる保恒剤を含有される。その物質としては、日
本化学会場「生化学実験講座１、タンパク質の化学１」
〔東京、東京化学同人（株）１９７Ｇ１年刊〕第６６〜
６７頁、前述の「実験と応用アフイニテイクロマトグラ
フイーＪｒ５１０３−　＋ｎ４ＴＴ　−ａ５１ＴＩ　１
７？　ｆｌＯ−１４！ＩＱ２７ｇ−等に記載すれでいる
ものが挙げられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン、ウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）、シクロデキス
トリン類、非還元糖類（ショ糖、トレハロース）、ポリ
エチレングリコール、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソ
ーダ等が挙げられる。

これらの保恒剤は、固定化された物質及び酵素標識の近
傍に存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用い
ることができ、ＴＨノエイムス（Ｔ、Ｉｌ、Ｊａｍｅｓ
）編「ザ・セオリ・オブ・ザ・フォトグラフィックプロ
セスｊ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｈ
ｏｔｏｇｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ）（第４版）第７
７〜８７頁に記載されている乙のを挙げることができる
。具体的な例としては、アルデヒド類、活性オレフィン
類、活性エステル類等があげられる。

界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。

媒染剤は、酵素活性測定のための検出物質を、発色試薬
層に集中的に集めたり、検出物質が色素の場合吸光度係
数を高めたり、波長をソフトさせる物質であり、検出物
質と強いｔ０互作用を示めすカヂオン性ポリマー、アニ
オン性ポリマー及びこれらのポリマーのラテックスが用
いられろ。

またＴ　ｉｏ　ｔ、　Ｂ　ａＳ○４．マイカなどの白色
顔料等を含有させることにより、光反射層の機能を持た
せることができる。

その他の層中に含有させる試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカ−試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応
じて適当量添加する。

第４図及び第５図は、本発明の好ましい態様の１例につ
いて断面図、その斜視図を示したものである。分析素子
の取扱いが容易になるよう、全体がプラスデック製のマ
ウント６で覆われており、マウント上部に試料注入孔、
下部に信号測定孔が開いている。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例によって限定されるものでは
ない。

実施例　１ （１）　　標識物（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識
ヒトＴｇＧ）の作成 ヒトＩ　ｇＧ　（米国力・ソベル社製）１０ｍｇを、０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ（ｔ３．５）　ｌ　ｍＱに溶解
し、これに１２ｍｙ／ｍρ濃度のＳ−アセデルメルカプ
ト無水コハク酸のジメチルホルムアミド溶液２０μＱを
加えて室温で３０分放置し、さらに０．１Ｍ　Ｅ　Ｄ　
ＴＡ　４０μＱど、ＯＩＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣＱｍｍ
液液ｔｌ）８７．０）０．２ｍ１２とヒドロギンアミン
塩酸塩（ｐ■■７．０）０．２ｍＱを加えて３０℃で５
分放置した後、Ｏ、１，Ｍリン酸緩衝液（１）Ｉ（６，
０，５ｍＭＥＤＴＡ）で平衡化したセファデックスＧ−
２５でゲル濾過を行ない、メルカプト基を導入しノニヒ
トＩｇＧを得た。

また０、１Ｍリン酸緩衝液　（１−１７，０）で透析し
た１０ｍｙ／　ｍ夕（タンパク濃度）のグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，４，１，４東洋紡社製）０．
６ｍＣに７．５ｍｇ／ｍｃａ度のＮ−（ε−マレイミド
カブロイロキン）−ザクンイミドのジメチルホルムアミ
ド溶液１２μＱ＋加えて、室温で３０分放置した後、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５でゲル濾過を行ないマレイミド基を導
入したグルタミン酸デヒドロゲナーゼを得た。

次に、メルカプト基を導入したヒトｌ　ｇＧ　（３０ｎ
ｍｏρ、／ｍｊ）と、マレイミド基を導入したグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（３０ｎｍｏＱ／　ｍ（２）とを
混合し、４℃で２２時間反応させ、０．１Ｍメルカプト
エヂルアミンを加えて３０℃２０分放置した後、０．０
５Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ　−１１（１１衝液（ｐｒ＋　７．８
．５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）で弔衡化したＵ　（！ｔ
ｒｏｇｅｃ　Ａ　ｃＡ　３４．　ＣＬ、に、Ｂ社製）で
ゲルｄ！！、過を行ない、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ標識したヒトＩｇＧを得た。

（２）生物活性物質（アビジン）固定化セルロース繊維
の作成 粉末濾紙Ｄ（東洋濾紙社製）１００９を、ブタンノオー
ルジグリシジルエーテル（アルドリッチ社製）２５０ｍ
ρと、２ｍｌ？／ｍ＋；！の水素化ホウ素ナトリウムを
含む０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５０ｍ（ｉとの
混合液中に懸濁し、４０℃で６時間振盪撹拌した後、純
水およびアセトン洗浄し乾燥してエポキシ基を導入１，
７′−節丈ｌ＃谷［ｎ本？１ン一この粉末濾紙Ｄ　１０
９を、１００ｍｇアビジン　（カッベル社製）を含む０
．５ＭＩＪン酸水素二ナトリウムー水酸化ナトリウム衝
液　（ｐＨ１１，５）１００ｍＱ、に懸局し、４０°Ｃ
で２４時間振盪撹拌した。これを濾取し、純水５００ｍ
ｆ２．０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４，０）５００ｍＲにて交互に洗浄
した後、Ｉ　ＭＴｒｉｓ−ＨＣ（ｌ緩衝液（１）Ｉ−１
８，５）３００ｍ＆に懸濁し、室温にて２４時間振盪撹
拌して未反応Ｊ１（をブロックした。これを濾取し、純
水２０００ｍｆ！で十分に洗浄し、アビノン固定化粉末
濾紙【〕を得た。

下記に記載の素子の作成には、このアビジ、・固定化粉
末濾紙りを、０　、０５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７４）
中に再ｐＢし、つ／血清アルブミン（１３ＳＡ）おＪ：
びショ糖を加えて、凍結乾燥した乙のを用いた。

（３）耐拡散性基を導入したｐ−アミノフェニルマーキ
ュリツクアセテートの作成 ｐ−アミノフェニルマーキュリツクアセテート３．５ｇ
と、２−（２，４−ジ−ｔ−アミルフェノキノ）ブヂロ
イルクロライド４．１ｇとをノメチルスルポキンド８０
ｍＱ中に加え、さらに５ｍＣのビリノンを！＋ｎえて室
温で３時間反応させた。反応液を純水５００ｍ１２中に
注ぎ、粗生成物を析出させた。水を排棄して、残留物を
キシレンにより十分に洗浄した後、酢酸エチルで目的物
を抽出後、酢酸エチルを留去して４（２−（２，４−ジ
−ｔ−アミルフェノキシ）ブチロイルアミノ）フェニル
マーキュリツクアセテートを得た。

（４）　ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体の作成抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体（カッベル社）１０ｍｉＦを０．１５Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）５
ｍ（に溶解し、これに５０ｍ９／１ｎ１２のジメヂルホ
ルムアミド溶液のビオチニル−ｎ−ヒドロキシサクシイ
ミドエステル（ＥＹ・ラボラトリーズ社製）１ｍＱを加
えて、室温で３時間反応させた。析出した白色沈澱物を
０．２２μｍのフィルタで濾別した後、０．１５Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７，
４）で透析して、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体を得た。

（５）分析素子（Ｉ）の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルム上に下記の組成の発色試薬層を塗布・乾
燥により作成した。

「Ｌ−グルタミン酸ナトリウム　　　　　３．０９／ｍ
’Ｌ脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　２５．０９７
ｍ”＊Ｎｅｏ−ＴＢ；　　３，３’−（４，４’−ビフ
ェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２１１−テト
ラゾリウムクロライド） 次に、上記発色試薬層の上に、下記の組成の塗布液によ
り非多孔質層を設けた。

「コポリ（酢酸ビニル−ビニルピロリドン）Ｌｎ−ブタ
ノール　　　　　　　　　　　８５．０９さらに、上記
非多孔質層の上に、下記の組成の塗布液により多孔質反
応層を設けた。

ロコボリ（スチレンーグリレジルメタクリレート）Ｌキ
シレン　　　　　　　　　　　　　　　４０９この塗布
試料１．５ｃｍＸ　１．５ｃｍの大きさに裁断し、本発
明による分析素子（Ｉ）を作成した。

（６）　ヒトＩｇＧの測定 前記（１）で作成したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ標
識ヒトＩｇＧと、ヒトＩｇＧ溶液〔Ｏ〜１２８０μ９／
ｍＱ、　０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　）と
を混合後、６％ウシ血清アルブミンを含有する０、５Ｍ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（１）ＨｌＯ，０）
で化抗ヒトＩｇＧ抗体を加えて混合後、その１０μＱを
前記（５）で作成した分析素子（１）に滴下し、３７℃
で１０分間密閉状態でインキ、ユベーション後、支持体
側から５４７ｎｍの反射濃度を測定した。

その結果を下表に示す。

実施例　２ （１）高分子に結合そせたｐ−アミノフェニルマーキュ
リツクアセテートの作成 コポリ（グリシジルメタクリレート−メチルメタクリレ
ート）　（３０／７０　）　１０ｙをジメチルホルムア
ミド１５０ｍｆｆ中に入れ、これに５０ｍ＆のジメチル
スルホキンドに溶解したｐ−アミノフェニルマーキュリ
ツクアセテート３．０９を加え、５０℃で６時間反応さ
せた後、２−エタノールアミン１０ｍｆ２を加えて、室
温で２４時間放置した。この反応液を純水２１２に注ぎ
、反応物を析出させ、さらに純水で充分に洗浄し、高分
子に結合させたｐ−アミノフェニルマーキュリツクアセ
テートを得た。

（２）分′＋ｆｒ素子（ＩＩ）の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に実施例１−（５）と同様に発色試
薬層を塗布した。次に、この発色試薬層の上に下記の組
成の塗布液により非多孔質層を設げた。

「コポリ（酢酸ビニル−ビニルピロリドン）１　（１）
で作成した高分子に結合させた■ Ｌｎ−ブタノール　　　　　　　　　　　８５．０ｙさ
らに、上記非多孔質層の上に、実施例１−（５）で用い
たのと同様にして、多孔質反応層を設けた。この塗布試
料を１．５ｃ…Ｘ　１．５ｃｍの大きさに裁断し、本発
明による分析素子（１１）とした。

（３）　ヒトＩｇＧの測定 実施例１−（６）と同様の方法によりヒトＩｇＧの測定
を行った。その結果を下表に示す。

実施例１および２の結果から、本発明による分析素子を
用いることにより、分析素子中で、効率よ＜　Ｂ／Ｆ分
離を行うことができ、ヒトＩｇＧ１度０〜６４０μ９／
ｍ（ｌの範囲で良好な検量線を得ることができた。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は、本発明の分析素子の層構成の態様
例を示す断面図である。 第４図及び第５図は、夫々本発明の分析素子の断面図及
び斜視図である。 １：　多孔質反応層 ２：　非多孔質層 ３：　試薬層 ４：　光透過性支持体 ５：　タイミング層 ６：　マウント 出願人　小西六写真工業株式会社 第１図　　　　第。図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 流体試料中の特定成分と結合しない生物活性物質または
   該生物活性物質と特異的に結合し得る物質のいずれか一
   方を含有する少なくとも一層の多孔質反応層と酵素によ
   り標識された標識物に特異的に結合して該酵素に起因す
   る信号を変調させる物質を含有する少なくとも一層の非
   多孔質層とを有する分析素子。