JPH052021A - 免疫反応装置及び免疫学的測定装置並びに免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 液体試料中の特定成分を、簡便な操作で、再
現性良く正確に定量できる技術を提供することである。 【構成】 免疫反応が行われる反応容器の少なくとも一
部が、力を加えた際に濾過機能が発揮されるフィルター
で構成されてなる免疫反応装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応装置及び免疫
学的測定装置並びに免疫学的測定法に関するものであ
る。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。すなわち、ＢｅｒｓｏｎとＹａｌｌｏｗが
放射性同位元素Ｉで標識したウシインシュリンと糖尿病
患者血清中の抗インシュリン抗体を用いて血清中のイン
シュリンを測定することに成功して以来、ラジオアイソ
トープを用いた免疫測定法が広く用いられて来た。そし
て、これ以後、標識物質として放射性同位元素以外のも
のも種々開発されて来た。例えば、酵素、酵素基質、補
酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ、循環反応
体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発
光性反応体及び螢光性分子等が挙げられる。

【０００３】このような免疫学的測定法は、均一免疫測
定法と非均一免疫測定法に大別される。すなわち、抗原
抗体反応生成物（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ
体）との分離（Ｂ／Ｆ分離）が必要な非均一免疫測定法
と、Ｂ／Ｆ分離の必要のない均一免疫測定法とに大別さ
れる。このうち、測定対象物質が高分子である場合に
は、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均一免疫測定法が利用されて
いる。

【０００４】ところで、この非均一免疫測定法は洗浄操
作、試薬の調整が必要であること、標識物質、基質、反
応停止液等の添加が必要であることから操作が煩雑であ
ること等の問題がある。これらの問題点に対して各種の
技術が提案されている。例えば、特開昭６４−６３８６
３号公報、特開昭６４−６３８６４号公報、特開平２−
８３４４号公報においては、乾式分析素子を用いること
により操作性はかなり簡便になっているものの、簡便性
に対する要求は高まる一方であり、改善が待たれてい
る。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、液体試料中の特定成分
を、簡便な操作で、再現性良く正確に定量できる技術を
提供することである。この本発明の目的は、免疫反応が
行われる反応容器の少なくとも一部が、力を加えた際に
濾過機能が発揮されるフィルターで構成されてなること
を特徴とする免疫反応装置によって達成される。

【０００６】又、力を加えた際に濾過機能が発揮される
フィルターで少なくともその一部が構成されてなる免疫
反応装置と、この免疫反応装置に併設されてなる分析素
子とを具備することを特徴とする免疫学的測定装置によ
って達成される。又、力を加えた際に濾過機能が発揮さ
れるフィルターで少なくともその一部が構成されてなる
免疫反応容器中で免疫反応を行わせた後、力を作用させ
て遊離状態の標識体を濾過させ、標識体を分析素子に滴
下し、標識体を分析素子で測定することを特徴とする免
疫学的測定法によって達成される。

【０００７】又、固定化担体に固定化された固定化抗体
（又は抗原）、酵素標識抗体（又は抗原）及び試料中の
抗原（又は抗体）による免疫反応を、力を加えた際に濾
過機能が発揮されるフィルターで少なくともその一部が
構成されてなる免疫反応容器中で行わせた後、力を作用
させて遊離状態の酵素標識抗体（又は抗原）を濾過さ
せ、分析素子に滴下し、標識酵素を分析素子で測定する
ことにより試料中の抗原（又は抗体）を分析することを
特徴とする免疫学的測定法によって達成される。

【０００８】以下、本発明をさらに詳しく説明する。免
疫反応が行われる反応容器の形状はどのようなものであ
っても良いが、その少なくとも一部、例えば底面部の一
部が、力を加えた際に濾過機能が発揮されるフィルター
で構成されている。例えば、筒状あるいはスポイト状の
ような反応容器の底面部には孔が形成されており、この
孔が前記のフィルターで覆われている。フィルターの素
材としては、例えばセルロースナイトレート、セルロー
スアセテート、ポリテトラフロロエチレン、ナイロン、
ポリビニリデンジフロライド等の素材が挙げられ、そし
てこのような素材を用いて孔径が５μｍ以下、より好ま
しくは約０．２ないし２μｍの中空繊維で構成すること
により前記のフィルターが得られる。

【０００９】そして、このように構成された反応容器中
で免疫反応が行われる訳であるが、本発明の免疫反応に
用いられる試料としてはあらゆる形態の溶液、コロイド
溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、
例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、
尿、汗、肉汁等が挙げられる。免疫反応において用いら
れる標識物質としては、例えば酵素、酵素基質、酵素及
び酵素前駆体の活性を変化させる物質（酵素阻害物質、
補欠分子族、補酵素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物
質などが挙げられるが、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、
アミラーゼ等の酵素が好ましく、これらの酵素を標識物
質とする場合、酵素反応系、発色系は公知のものを使用
できる。具体的には、特開昭６１−２９２０６０号公
報、特開昭６２−９０５３９号公報、特開昭６３−１３
１０６２号公報、特開昭６３−４５５６２号公報、特願
昭６３−２１９８９３号明細書に記載の物質（物質群）
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そ
して、標識物質の抗体（抗原）への結合は、当業者間で
知られている公知の試薬と方法で行うことができ、例え
ば石川 栄治、河合忠、宮井 潔 編「酵素免疫測定法
（第２版）、医学書院、１９７８年」や日本臨床病理学
会編「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為
のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、１
９８３年」などに記載された方法を参考にすることがで
きる。

【００１０】本発明の免疫反応で使用される抗体は、そ
の由来を特に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗
原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液をそのまま
か、あるいは従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱
法、硫酸アンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによ
るゲル濾過法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ
法、電気泳動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐ
ｐ７４ないし８８参照）で精製して用いることができ
る。あるいは、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマ
ウス）の脾臓細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種
細胞（ハイブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を作
成し、これを特定成分と特異的に結合しうる物質として
使用すると特異性が向上し、好ましい。又、これらの抗
体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を
用いることができ、或いはこれらの抗体を酵素処理して
Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂ といった活性抗体
フラグメントにして使用しても良い。さらに、これらの
抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使
用しても良い。

【００１１】本発明の免疫測定法による反応型式として
は、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げられ
るが、特に限定はされない。又、他の生物活性物質（例
えば、ビオチン、アビジン）を利用した免疫測定法も適
用できる。本発明においては、試料中の特定成分を測定
する反応型式として免疫反応を挙げているが、免疫反応
に準ずる生物活性を示す物質の特異反応（本明細書で
は、この特異反応も免疫反応に包含）を利用することも
可能である。この特異的に結合する物質の組み合わせと
しては、次のようなものが挙げられる。

【００１２】酵素と基質（生成物） 酵素と阻害剤 酵素と補欠分子族 酵素と補酵素 酵素とアロステリックエフェクター 抗体と抗原 抗体とプロテインＡ レクチンと多糖類 レクチンと糖タンパク質 核酸と相補性の塩基配列 核酸とヒストン 核酸と核酸 核酸とポリメラーゼ ホルモンと受容体 ピオチンとアビジン（ストレプトアビジン） ビオチシンとアビジン（ストレプトアビジン） デスチオビオチンとアビジン（ストレプトアビジン） オキシビオチンとアビジン（ストレプトアビジン） 本発明で使用される抗原は特異抗体と反応するものであ
り、ハプテン及びその誘導体を含有する。

【００１３】抗体（又は抗原）は不溶化担体に固定化さ
れる。不溶化担体としては、フィルターにより濾過され
ないことが大事であり、粒状体が好ましい。不溶化担体
（微粒子）の材料としては、アガロース、セルロース、
架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、セルロース、
微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋ポリアクリル
アミド、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタ
ン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂、ポリス
チレン等の各種の合成樹脂のほか、多孔質な素材、さら
には磁性微粒子が利用できる。好ましくはアガロース、
架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミ
ド、架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ポ
リスチレン、セルロース、微結晶セルロース等であり、
更に好ましくはポリアクリルアミド、架橋ポリアクリル
アミド、ポリスチレン、微結晶セルロース等である。こ
れらの不溶化担体は数種を混合して用いても良い。抗体
又は抗原は、これら不溶化担体に、当業者で公知の方法
で化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的に結
合させることができる。結合法については１９７６年、
講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と応用 アフィ
ニティクロマトグラフィー」（第１刷）、１９７５年、
講談社発行、山崎 誠ほか２名編「アフィニティクロマ
トグラフィー」（第１版）を参考にできる。結合反応
後、標識抗体（又は抗原）の非特異反応を排除する目的
で、測定すべき特異的反応に関与しない蛋白質を担持さ
せることができる。それらの代表的な例としては、哺乳
動物及び鳥類の正常血清蛋白質、アルブミン、スキムミ
ルク、乳酸醗酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質等
が挙げられる。尚、非特異吸着抑制蛋白質は、不溶化担
体に担持させるだけでなく、免疫反応時に、その一定量
を免疫反応溶液中に添加することにより、一層非特異吸
着の抑制効果が上がる。

【００１４】そして、上記したような固定化抗体（又は
抗原）、酵素標識抗体（又は抗原）及び試料中の抗原
（又は抗体）による免疫反応が前記したような反応容器
中で行われた後、所定時間後に力を作用させることによ
り、例えば圧力あるいは遠心分離力を印加することによ
り、遊離状態の酵素標識抗体（又は抗原）を濾過させ、
下方の分析素子に滴下する。

【００１５】本発明に用いる分析素子は、少なくとも一
層以上の多孔質層を持つことが好ましい。多孔質層の素
材は特に限定されないが、好ましい例としてはサイズ１
ないし３５０μｍの粒状体あるいは４０ないし４００メ
ッシュの繊維から一つ以上選ばれた素材により構成され
る構造体が挙げられる。該粒状体の材料としては、ケイ
藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化
鉛、微結晶セルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、
架橋デキストリン、架橋ポリアクリルアミド、アガロー
ス、架橋アガロース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂
のほか、ポリ（スチレン−グリシジルメタクリレー
ト）、ポリ（スチレン−メチルアクリレート−グリシジ
ルメタクリレート）のような反応性基を持つ化合物から
成る自己結合型粒子が挙げられる。

【００１６】又、多孔質層に用いる繊維としては、パル
プ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、
セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモニ
アレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６，６−ナイ
ロン、６，１０−ナイロン等）、ポリエステル（ポリエ
チレンテレフタレート等）、ポリオレフィン（ポリプロ
ピレン、ビニロン等）、ガラス繊維、石綿などの植物
性、動物性、合成、半合成、再生繊維を用いることがで
き、あるいはこれらを混合して用いても良い。あるいは
別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、ブラッシ
ュポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維（石綿な
ど）、植物性繊維（木綿、麻、パルプ等）、動物性繊維
（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロ
ン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン
等）、再生繊維（レーヨン、セルロースエステル等）な
どを単独あるいは混合して製造した織物、不織布、合成
紙などを該多孔質層に用いることもできる。

【００１７】このような粒状体、繊維、あるいは粒状体
と繊維の混合物を塗布及び／又は製膜することにより、
自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が
存在する多孔質層を形成する。自己結合性を有しない粒
子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で製
膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８号公
報、特開昭５５−９０８５９号公報、特開昭５７−６７
８６０号公報に記載の方法を適用することができる。自
己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭５７−１０
１７６０号公報、特開昭５７−１０１７６１号公報、特
開昭５８−７０１６３号公報に記載の方法により同様に
製膜できる。繊維又は繊維及び粒子の混合物については
特開昭５７−１２５８４７号公報、特開昭５７−１９７
４６６号公報に記載された繊維分散液を塗布することに
より多孔質層を形成できる。又、特開昭６０−１７３４
７１号公報で行われている方法のようにゼラチンやポリ
ビニルピロリドンのような水溶性バインダーを使用した
繊維分散液を塗布することも可能である。又、このとき
のバインダーは水溶性に限らず、疏水性のバインダーの
使用も可能である。このような分散液を製造する為に
は、多くの方法を単独又は組み合わせて用いることが可
能である。例えば、有用な方法の一つとして、界面活性
剤を液体キャリヤーへ添加し、粒状体及び／又は繊維の
分散液中に分布及び安定化を促進することができる。

【００１８】使用可能な代表的な界面活性剤の例として
は、トライトンＸ−１００（ロームアンドハース社製、
オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、サーフ
ァクタント１０Ｇ（オリーン社製、ノニルフェノキシポ
リグリシドール）等の非イオン性界面活性剤がある。こ
れらの界面活性剤は広範に選択された量を用いることが
可能であるが、粒状体及び／又は繊維の重量に対して
０．００５ないし１０重量％、好ましくは０．１５ない
し６重量％用いることができる。更に、別の方法とし
て、該粒子単位と液体キャリヤーの音波処理、物理的混
合、及び物理的攪拌処理、ｐＨ調整がある。これらは前
記の方法と組み合わせることにより、更に有用である。

【００１９】乾式分析素子の形態は分析を行いうるもの
であればよく、特に制限されるものではないが、製造上
及び測定操作上、フィルム状あるいはシート状であるこ
とが好ましい。乾式分析素子は一層から成っていても、
多層から成っていてもよい。例えば、酵素基質を内蔵し
た多孔質層のみからなるものとか、吸水層上に多孔質層
（基質が少なくともどちらかの層に内蔵）が設けられて
なるものとか、吸水層上に複数の多孔質層（基質が少な
くとも何れかの層に内蔵）が設けられてなるものとかが
考えられ、必要に応じて、それらは光透過性支持体上に
設けられたり、光反射性支持体上に設けられたり、光透
過性支持体上に設けられ、その上に光反射性層が設けら
れたりする。

【００２０】尚、吸水層の素材としては、例えばゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダ
ゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム塩などのセルロース
誘導体の多糖類などが挙げられる。好ましくは、ゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体である。

【００２１】光透過性支持体の素材としては、例えば酢
酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカー
ボネート及びホリビニル化合物（例えばポリスチレン）
のような透明高分子化合物あるいはガラスのような透明
無機化合物が挙げられる。光反射性支持体の素材として
は、例えばセラミックス、金属、あるいは樹脂被覆され
た紙などが挙げられ、必要に応じてこれらの素材中には
ＴｉＯ₂ 、ＢａＳＯ₄ 、マイカなどの白色顔料などを含
有又は塗布させたものでも良い。

【００２２】そして、例えば光透過性支持体上に基質を
内蔵した多孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用い
られる場合には、遊離状態の酵素標識抗体は乾式分析素
子の多孔質層側に滴下され、発色信号の測定は両側から
行われる。又、光反射性支持体上に基質を内蔵した多孔
質層が設けられてなる乾式分析素子が用いられる場合に
は、遊離状態の酵素標識抗体は乾式分析素子の多孔質層
側に滴下され、信号の測定は多孔質層側から行われる。
尚、光透過性支持体上に基質を内蔵した多孔質層が設け
られ、その上に光反射性層が設けられてなる乾式分析素
子が用いられる場合には、遊離状態の酵素標識抗体は乾
式分析素子の光反射性層側に滴下され、信号の測定は光
透過性支持体側から行われる。

【００２３】標識に起因した信号は、紫外線、可視光、
近赤外光などを利用した吸光度法（比色法) などで検出
することができ、測定法としては信号の経時的変化を測
定するレート測定法または一定時間後の信号を測定する
エンドポイント測定法で測定することができる。乾式分
析素子は、展開層を有するものであっても良い。展開層
の素材としては、多孔質層と同様なものを塗布、製膜、
貼付しても良い。又、展開層内に基質等を内蔵させ、反
応層としての役目を持たせても良い。乾式分析素子に
は、他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、
媒染剤等を目的に応じて添加することができる。緩衝剤
は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適したｐ
Ｈとする為に含有される。用いることができる緩衝剤と
しては日本化学会編「化学便覧基礎編」（東京、丸善株
式会社 １９６６）ｐｐ１３１２ないし１３２０、Ｎ．
Ｅ．Ｇｏｏｄ等; Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ
５、ｐ４６７（１９６６）、今村、斎藤; 化学の領域、
Ｖｏｌ３０（２）、ｐ７９（１９７６）、Ｗ．Ｊ．Ｆｅ
ｒｇｕｓｏｎ等 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ
１０４、ｐ３００（１９８０）等の文献に記載されてい
るものを挙げることができる。具体的な例としては、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリスバルビツ
ール、グリシン、グッド緩衝剤などが挙げられる。これ
らの緩衝剤は必要に応じて単独で層を形成させてもよ
い。保恒剤は基質発色試薬の保存安定化の為に含有さ
れ、酸化防止剤などがある。その物質としては、日本生
化学会編「生化学実験口座１、蛋白質の化学１」（東京
化学同人株式会社 １９７６) ｐｐ６６，６７、実験と
応用「アフィニティクロマトグラフィ」ｐｐ１６ないし
１０４、特開昭６０−１４９９２７号公報などに記載さ
れているものが挙げられる。具体的例としては、ゼラチ
ン、ゼラチン分解物、アルブミン、シクロデキストリン
類、非還元糖類（シュクロース、トレハロース）、ポリ
エチレングリコール、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソ
ーダ等が挙げられる。界面活性剤としては、前述のもの
が挙げられる。その他の層中に含有される試薬として
は、溶解助剤、ブロッカー試薬などがある。これらの添
加剤は必要に応じて適当量添加する。媒染剤は、酵素活
性測定の為の検出物質を測光部側に集中的に集めたり、
検出物質が色素の場合吸光度係数を高めたり、波長をシ
フトさせる物質であり、検出物質と強い相互作用を示
す。カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー及びこれ
らのポリマーのラテックスが用いられる。乾式分析素子
は、さらに生体試料が血液（全血）の場合に有用な血球
分離層、必要に応じて設ける接着層、保護層、タイミン
グ層といった補助層を設けることができる。これらの層
は、その機能に応じて設けられるべき位置が決定され
る。

【００２４】

〔実施例１〕

１−（１） 乾式分析素子の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を塗
布し、乾燥させ、ゼラチン層を形成した。

【００２５】 塗布液−（１） 脱イオン化ゼラチン ６．０ｇ トライトンＸ−１００ ０．１５ｇ １，２−ビス（ビニルスルホニル）エタン ０．０１ｇ 純水 ５４．０ｇ 次に、塗布液−（２）を前記ゼラチン層の上に塗布し、
乾燥した。

【００２６】 塗布液−（２） 粉末ろ紙Ｃ（東洋濾紙社製） ２１．６ｇ ピロリドン−酢酸ビニル（２対８）共重合体 １１．０ｇ クロロフェニルレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ベーリンガー社製） ３６５ｍｇ ｎ−ブタノール ４９．４ｇ これを１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに裁断し、乾式
分析素子とした。

【００２７】１−（２） β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標
識抗ＣＲＰ抗体及び標識ＣＲＰの作成 抗ＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社
製）２０ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ６．５）
２．０ｍｌに溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプ
ロイルオキシ）スクシンイミド（同仁化学研究所製）が
２．５ｍｇ／ｍｌのジメチルホルムアミド溶液７７μｌ
を加えて、３０℃で２０分間反応後、５ｍＭのＥＤＴＡ
を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平
衡化したセファデックスＧ−２５カラムで精製し、マレ
イミド化した抗ＣＲＰ抗体を得た。

【００２８】次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（東洋紡
社製）が１０．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液
１．８ｍｌに、前記マレイミド化した抗ＣＲＰ抗体を１
３．６ｍｇ含む溶液３．２ｍｌを加えて、４℃で４５時
間反応後、０．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン１７
５μｌを加えて３０℃で２０分間反応させ、０．１５Ｍ
の塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したスーパーローズ６プレップグレ
ード（ファルマシア社製）カラムで分離、精製し、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を得た。

【００２９】同様にして、ＣＲＰ（カナディアン・バイ
オクリニカル社）について標識化を行い、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ標識ＣＲＰを得た。 １−（３） 抗ＣＲＰ抗体固定化微粒子担体の作成 オイパーギットＣ（ロームファーマ社製）３ｇを０．１
５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４０ｍｌ中に分散し、これに抗ＣＲＰ抗
体（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社製）１３６
ｍｇを入れ、４℃で２０時間攪拌し、反応させる。反応
後、濾取し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）と０．
１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）を交互に用い、充分洗
浄した。

【００３０】次いで、水洗した後、口径３８μｍのメッ
シュでふるいをかけた。オイパーギットＣの非特異的結
合部位をブロックする為、上記のふるいをかけたオイパ
ーギットＣを３％脱脂乳添加の０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム含有０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中におい
て４℃で２０時間攪拌した。次いで水洗し、抗ＣＲＰ抗
体固定化微粒子担体を得た。

【００３１】１−（４） 免疫反応装置 図１に示す如く、外径９．５ｍｍ、高さ１５ｍｍのガラ
ス製の容器１の下方部に構成された孔２に、孔径０．４
５μｍのセルロースアセテート製のメンブランフィルタ
ー（アドバンテック社製）３を充填してなる免疫反応容
器Ａを用意した。

【００３２】そして、この容器内に前記１−（３）で作
成した抗ＣＲＰ抗体固定化微粒子担体３０ｍｇのＰＢＳ
懸濁液４００μｌと、前記１−（２）で作成したβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体の溶液（１０μｇ
／ｍｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、３％ＢＳＡ、０．３
Ｍビストリス緩衝液）５０μｌとを免疫反応容器Ａ内に
入れ、凍結乾燥しておいた。

【００３３】１−（５） ＣＲＰの測定 前記１−（４）の免疫反応装置の免疫反応容器Ａ内にＣ
ＲＰ溶液（０．３、１０、３０、１００、３００μｇ／
ｍｌ）２０μｌを添加した０．３Ｍビストリス緩衝液４
５０μｌを入れ、室温下で１２分間免疫反応させる。反
応後、免疫反応容器Ａを内径１０ｍｍの図２に示す容器
Ｂに入れ、１分間３０００ｇで遠心分離し、メンブラン
フィルター３を介して容器Ｂ内に移った遊離の標識抗体
を含む溶液１０μｌを採取し、前記１−（１）の乾式分
析素子に滴下し、３分３０秒及び７分後に５４６ｎｍの
反射濃度を測定したので、その結果を図３に示す。

【００３４】これによればＣＲＰが正確に測定されるこ
とが判り、又、測定は手軽な作業で行える。 〔実施例２〕実施例１で用意した免疫反応容器Ａ内に、
１−（３）で作成した抗ＣＲＰ抗体固定化微粒子担体３
０ｍｇと１−（２）で作成したβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ標識抗ＣＲＰ抗体（１０μｇ／ｍｌ）５０μｌ及びＣ
ＲＰ溶液（０．３、１０、３０、１００、３００μｇ／
ｍｌ）２０μｌを１ｍＭ塩化マグネシウム、３％ＢＳ
Ａ、０．３Ｍビストリス緩衝液に加えて４５０μｌとし
たものを入れ、閉蓋し、室温下で１２分間免疫反応を行
わせた。

【００３５】反応後、蓋を押し込んで圧力を印加し、メ
ンブランフィルター３を介して濾過された遊離の標識抗
体を含む溶液一滴（２０μｌ）を前記１−（１）の乾式
分析素子に滴下し、３分３０秒及び７分後に５４６ｎｍ
の反射濃度を測定したので、その結果を図４に示す。こ
れによればＣＲＰが正確に測定されることが判り、又、
測定は手軽な作業で行える。

【００３６】〔実施例３〕 ３−（１） 免疫反応測定装置 図５に示す如く、プラスチック製の筒（高さ７ｍｍ、内
径５ｍｍ）５の底面開口部に孔径０．４５μｍのセルロ
ースアセテート製のメンブランフィルター（アドバンテ
ック社製）６が設けられ、そしてメンブランフィルター
６と前記１−（１）の乾式分析素子７とが間に介したリ
ング（厚さ０．７ｍｍ、内径５ｍｍ）８で一体化されて
なる免疫反応測定装置Ｃを用意した。

【００３７】そして、この免疫反応測定装置Ｃの筒５内
に前記１−（３）で作成した抗ＣＲＰ抗体固定化微粒子
担体２０ｍｇ及び前記１−（２）で作成したβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ標識ＣＲＰ（２０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ塩
化マグネシウム、０．１Ｍビストリス緩衝液を含む）５
０μｌを入れ、凍結乾燥しておいた。 ３−（２） ＣＲＰの測定 前記３−（１）の免疫反応測定装置の筒５内にＣＲＰ溶
液（０．３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌ）
１０μｌを添加し、室温下で１０分間免疫反応させる。

【００３８】反応後、圧力を印加すると、メンブランフ
ィルター６を介して溶液一滴が乾式分析素子７に滴下さ
れ、３分３０秒及び７分後に５４６ｎｍの反射濃度を測
定したので、その結果を図６に示す。これによればＣＲ
Ｐが正確に測定されることが判り、又、測定も極めて手
軽な作業で行える。すなわち、バックグラウンドノイズ
は小さく、ＣＲＰが正確に測定できるものであり、か
つ、Ｂ／Ｆ分離の為の特別な操作や液の移し換えの操作
をせずとも測定が行える。

【００３９】尚、上記の作業において圧力を印加する代
わりに遠心分離の手段によっても、同様な結果が得られ
た。又、免疫反応の容器は筒形状のもので説明している
が、これに限られることはなく、例えばスポイト形状を
したものでも良い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫反応容器Ａの概略図である。

【図２】本発明の免疫反応容器Ａが入れられる容器の概
略図である。

【図３】検量線を示すグラフである。

【図４】検量線を示すグラフである。

【図５】本発明の免疫反応測定装置Ｃの概略図である。

【図６】検量線を示すグラフである。

【符号の説明】

Ａ 免疫反応容器 １ 容器 ２ 孔 ３ メンブランフィルター Ｃ 免疫反応測定装置 ５ 筒 ６ メンブランフィルター ７ 乾式分析素子 ８ リング

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫反応が行われる反応容器の少なくと
   も一部が、力を加えた際に濾過機能が発揮されるフィル
   ターで構成されてなることを特徴とする免疫反応装置。
2. 【請求項２】 力を加えた際に濾過機能が発揮されるフ
   ィルターで少なくともその一部が構成されてなる免疫反
   応装置と、この免疫反応装置に併設されてなる分析素子
   とを具備することを特徴とする免疫学的測定装置。
3. 【請求項３】 力を加えた際に濾過機能が発揮されるフ
   ィルターで少なくともその一部が構成されてなる免疫反
   応容器中で免疫反応を行わせた後、力を作用させて遊離
   状態の標識体を濾過させ、標識体を分析素子に滴下し、
   標識体を分析素子で測定することを特徴とする免疫学的
   測定法。
4. 【請求項４】 固定化担体に固定化された固定化抗体
   （又は抗原）、酵素標識抗体（又は抗原）及び試料中の
   抗原（又は抗体）による免疫反応を、力を加えた際に濾
   過機能が発揮されるフィルターで少なくともその一部が
   構成されてなる免疫反応容器中で行わせた後、力を作用
   させて遊離状態の酵素標識抗体（又は抗原）を濾過さ
   せ、分析素子に滴下し、標識酵素を分析素子で測定する
   ことにより試料中の抗原（又は抗体）を分析することを
   特徴とする免疫学的測定法。