JPH04303769A - 免疫学的測定装置及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定装置及び
免疫学的測定方法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】免疫学的測定法は、均一免疫測定法と非均
一免疫測定法に大別される。すなわち、抗原抗体反応生
成物（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ体）との分
離（Ｂ／Ｆ分離）が必要な非均一免疫測定法と、Ｂ／Ｆ
分離の必要のない均一免疫測定法とに大別される。この
うち、測定対象物質が高分子である場合には、Ｂ／Ｆ分
離が必要な非均一免疫測定法が利用されている。

【０００４】ところで、この非均一免疫測定法は洗浄操
作、試薬の調整が必要であること、標識物質、基質、反
応停止液等の添加が必要であることから操作が煩雑であ
ること等の問題がある。これらの問題点に対して各種の
技術が提案されている。例えば、特開昭６４−６３８６
３号公報、特開昭６４−６３８６４号公報、特開平２−
８３４４号公報においては、乾式分析素子を用いること
により操作性はかなり簡便になっているものの、簡便性
に対する要求は高まる一方であり、改善が待たれている
。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、液体試料中の特定成分
を、簡便な操作で、再現性良く正確に定量できる技術を
提供することである。この本発明の目的は、抗体（又は
抗原）が固定化された第１の吸水体と、酵素基質を有す
る第２の吸水体と、前記第１の吸水体と第２の吸水体と
の間に設けた弾撥材とを具備することを特徴とする免疫
学的測定装置によって達成される。

【０００６】尚、第１の吸水体に酵素標識抗体（又は抗
原）が設けられていることが好ましい。本発明の免疫学
的測定装置による測定試料としてはあらゆる形態の溶液
、コロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由
来の試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、
羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

【０００７】本発明に用いられる標識酵素としては、例
えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
タメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等が挙げられ、
これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、発色
系は公知のものを使用できる。具体的には、特開昭６１
−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３９号公報
、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６３−４５
５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明細書に記
載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。そして、これら標識物質の抗体（抗原
）への結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方
法で行うことができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠
、宮井　　潔編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院
、１９７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時
増刊特集第５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技
術と応用−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載
された方法を参考にすることができる。

【０００８】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるいは
、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓
細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることが
でき、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）２　といった活性抗体フラグメン
トにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一
で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【０００９】本発明の免疫測定装置による反応型式とし
ては、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、特に限定はされない。又、他の生物活性物質（
例えば、ビオチン、アビジン）を利用した免疫測定方法
も適用できる。本発明で使用する抗原は特異抗体と反応
するものであり、ハプテン及びその誘導体を含有する。

【００１０】抗体（又は抗原）が固定される不溶化担体
として、吸水性の素材、例えば吸水性シート（第１の吸
水体）が用いられる。このような吸水体の材料としては
アガロース、セルロース、架橋デキストラン、ポリアク
リルアミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガ
ロース、架橋ポリアクリルアミド、シリカゲル、発泡ポ
リスチレン等の発泡樹脂、濾紙、脱脂綿、パルプ、羊毛
、麻などの繊維などが挙げられる。抗体又は抗原は、こ
れらの素材の吸水体に化学的及び／又は物理的に直接、
あるいは間接的に結合させることができる。結合法につ
いては１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「
実験と応用　　アフィニティクロマトグラフィー」（第
１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「
アフィニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考に
できる。

【００１１】尚、結合反応後、標識抗体（又は抗原）の
非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に
関与しない蛋白質を担持させることができる。それらの
代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白
質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲ
ン及びそれらの分解物質等が挙げられる。このような非
特異吸着抑制蛋白質は、吸水体に担持させるだけでなく
、免疫反応時にその一定量を免疫反応溶液中に添加する
ことにより、一層非特異吸着の抑制効果が上がる。

【００１２】前記酵素標識抗体（又は抗原）は、免疫反
応時に吸水体に存在しておれば良く、この点から液体試
料の添加時に存在させられても良い訳であるが、予め固
定化抗体（又は抗原）と共に内在させられていることが
、使用時の作業の簡便性から好ましい訳である。酵素基
質が内蔵された第２の吸水体は、標識体の検出素子とし
ての機能を有する。そして、この第２の吸水体の素材は
第１の吸水体と同様な素材を用いることが出来る。 尚、第２の吸水体には他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒
剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加すること
ができる。緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色
反応等に適したｐＨとする為に含有される。用いること
ができる緩衝剤としては日本化学会編「化学便覧基礎編
」（東京、丸善株式会社　　１９６６）ｐｐ１３１２な
いし１３２０、Ｎ，Ｅ，Ｇｏｏｄ等；　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　　Ｖｏｌ　　５、ｐ４６７（１９６６）、
今村、斎藤；　化学の領域、Ｖｏｌ３０（２）、ｐ７９
（１９７６）、Ｗ．Ｊ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等　　Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ　　１０４、ｐ３００（１
９８０）等の文献に記載されているものを挙げることが
できる。具体的な例としては、ホウ酸塩、クエン酸塩、
燐酸塩、炭酸塩、トリスバルビツール、グリシン、グッ
ド緩衝剤などが挙げられる。これらの緩衝剤は必要に応
じて単独で層を形成させてもよい。保恒剤は基質発色試
薬の保存安定化の為に含有され、酸化防止剤などがある
。その物質としては、日本生化学会編「生化学実験口座
１、蛋白質の化学１」（東京化学同人株式会社　　１９
７６）　ｐｐ６６，６７、実験と応用「アフィニティク
ロマトグラフィ」ｐｐ１６ないし１０４、特開昭６０−
１４９９２７号公報などに記載されているものが挙げら
れる。具体的例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、
アルブミン、シクロデキストリン類、非還元糖類（シュ
クロース、トレハロース）、ポリエチレングリコール、
アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられる。 界面活性剤としては、トライトンＸ−１００（ロームア
ンドハース社製、オクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール）、サーファクタント１０Ｇ（オリーン社製、ノ
ニルフェノキシポリグリシドール）等の非イオン性界面
活性剤が挙げられる。その他に含有される試薬としては
、溶解助剤、ブロッカー試薬などがある。これらの添加
剤は必要に応じて適当量添加する。媒染剤は、酵素活性
測定の為の検出物質を測光部側に集中的に集めたり、検
出物質が色素の場合吸光度係数を高めたり、波長をシフ
トさせる物質であり、検出物質と強い相互作用を示す。 カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー及びこれらの
ポリマーのラテックスが用いられる。

【００１３】上記のような第１の吸水体と第２の吸水体
とが用いられて免疫測定が行われる訳であるが、すなわ
ち抗体（又は抗原）が固定化された第１の吸水体に液体
試料を加えることにより固定化抗体（又は抗原）及び酵
素標識抗体（又は抗原）と液体試料中の抗原（又は抗体
）とによる免疫反応を第１の吸水体において行わせ、こ
の後第１の吸水体と第２の吸水体とを接触させて遊離の
酵素標識抗体（又は抗原）を第２の吸水体側に移行させ
、その後第１の吸水体と第２の吸水体とを分離させ、標
識酵素を測定することにより液体試料中の抗原（又は抗
体）が分析される訳であるが、この第１の吸水体と第２
の吸水体との間にバネ等の弾撥材が配設されていると、
第１の吸水体と第２の吸水体との接合はどちらか一方に
力を加えるだけで良く、そして第１の吸水体と第２の吸
水体との離間は加えていた力を解放するだけで良く、従
って免疫測定が極めて簡単な操作で行える。

【００１４】すなわち、図１に示す如く、枠体１に取り
付けられた抗体（又は抗原）が固定化され、かつ、酵素
標識抗体（又は抗原）を内在した第１の吸水体２と、枠
体３に取り付けられた酵素基質を内在した第２の吸水体
４とがバネ５で連結された装置を用い、第１の吸水体２
に試料を滴下して免疫反応を行わせた後、図２に示す如
く、バネ５の力に抗して第１の吸水体２と第２の吸水体
４とを接合させ、Ｂ／Ｆ分離を行い、遊離の酵素標識抗
体（又は抗原）を第２の吸水体４側に移行させ、その後
印加力を解除すると、図３に示す如く、バネ５の弾撥力
により第１の吸水体２から第２の吸水体４は分離するの
で、この後第２の吸水体４の下側から光を当てることに
より免疫測定が極めて簡単な操作で行える。

【００１５】標識酵素に起因した信号は、紫外線、可視
光、近赤外光などを利用した吸光度法（比色法）　など
で検出することができ、測定法としては信号の経時的変
化を測定するレート測定法または一定時間後の信号を測
定するエンドポイント測定法で測定することができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。 〔実施例１〕１−（１）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
標識ＣＲＰ抗体の作成 ＣＲＰ抗体（ヒツジＦ（ａｂ’）２　、カッペル社製）
２０ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ６．５）２．０
ｍｌに溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプロイル
オキシ）スクシンイミド（同仁化学研究所製）が２．５
ｍｇ／ｍｌのジメチルホルムアミド溶液７７μｌを加え
て、３０℃で２０分間反応後、５ｍＭのＥＤＴＡを含有
する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラムで精製し、マレイミド
化したＣＲＰ抗体を得た。

【００１７】次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（東洋紡
社製）が１０．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液１
．８ｍｌに、前記マレイミド化したＣＲＰ抗体を１３．
６ｍｇ含む溶液３．２ｍｌを加えて、４℃で４５時間反
応後、０．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン１７５μ
ｌを加えて３０℃で２０分間反応させ、０．１５Ｍの塩
化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．４）で平衡化したスーパーローズ６プレップグレード
（ファルマシア社製）カラムで分離、精製し、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を得た。

【００１８】１−（２）　　抗ＣＲＰ抗体が固定化され
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を内在（
含浸）した第１の吸水体の作成 トラベロン（ＮＰ３００、金井重要工業社製）を図１に
示す如く凸形状に構成し、これを０．１５Ｍの塩化ナト
リウムを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４
）４０ｍｌ中に分散し、これにＣＲＰ抗体（ウサギＩｇ
Ｇフラクション、タウンズ社製）１２０ｍｇを入れ、４
０℃で２０時間攪拌し、反応させ、固定化した。反応後
、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）と０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ８．０）を交互に用い、充分に洗浄した。

【００１９】次いで、洗浄した後、３％スキムミルク添
加の０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）中で４℃で２０時間攪拌した。そして
、凍結乾燥した後、前記で作成したβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体の溶液（１０μｇ／ｍｌ）５ｍ
ｌ中に浸し、所定時間後に取り出し、凍結乾燥し、抗Ｃ
ＲＰ抗体が固定化され、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識
抗ＣＲＰ抗体を含浸した抗原−抗体反応用の第１の吸水
体２を作成した。

【００２０】１−（３）　　第２の吸水体の作成厚さ１
８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタレート
フィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を塗布し、
乾燥させ、ゼラチン層を作成させた。 　　　　　　塗布液−（１） 　　　　脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　６．０ｇ　　　　トライ
トンＸ−１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１５ｇ　　　　１，２−ビス（ビニル
スルホニル）エタン　　　　　　０．０１ｇ　　　　純
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５４．０ｇ次に、塗布液
−（２）を前記ゼラチン層の上に塗布し、乾燥した。

【００２１】 　　　　　　塗布液−（２） 　　　　粉末ろ紙Ｃ（東洋濾紙社製）　　　　　　　　
　　　　　　　　２１．６ｇ　　　　ピロリドン−酢酸
ビニル（２対８）共重合体　　１１．０ｇ　　　　クロ
ロフェニルレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ベーリ
ンガー社製）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３６５ｍｇ　　　　ｎ−ブタノール　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４９．４
ｇこれを１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに裁断し、第
２の吸水体４を作成した。

【００２２】１−（４）　　免疫測定キットの作成前記
１−（２）で作成した第１の吸水体２と前記１−（３）
で作成した第２の吸水体４との間に、図１に示す如く、
弾撥材（バネでもスポンジのようなものでも良い）５を
配設し、本発明になる免疫測定キットを組み立てた。 １−（５）　　ＣＲＰの測定 １ｍＭの塩化マグネシウム及び３重量％のウシ血清アル
ブミンを含有する０．３Ｍのビストリス緩衝液５０μｌ
に、ＣＲＰ溶液（０、３、１０、３０、１００、３００
μｇ／ｍｌ）５μｌを添加混合し、その５０μｌを前記
１−（４）で作成した免疫測定キットの第１の吸水体２
上に滴下し、１０分間免疫反応させた。

【００２３】この後、第１の吸水体２に下方向の力を印
加し、弾撥材５の力に抗して第１の吸水体２を第２の吸
水体４に接合させ、１０秒間保持する。この後、印加力
を解除し、弾撥材５の力により第１の吸水体２を第２の
吸水体４から離間させ、３７℃でインキュベートし、５
４６ｎｍの反射濃度を第２の吸水体４の下側から測定し
た。３分３０秒及び７分の反射濃度差（ΔＤｒ）を用い
て検量線を作成したので、その結果を図４に示す。尚、
図４は、本発明装置により作成されたＣＲＰの検量線を
示すものである。

【００２４】これによればＣＲＰが正確に測定されるこ
とが判り、又、測定は試料を第１の吸水体２に垂らし、
力を印加して第２の吸水体４に接合し、一定時間後に力
を解除するだけの手軽な作業で行える。すなわち、バッ
クグラウンドノイズは小さく、ＣＲＰが正確に測定でき
るものであり、かつ、Ｂ／Ｆ分離の為の特別な操作や液
の移し換えの操作をせずとも測定が行える。

【００２５】

【効果】本発明によれば、試料の滴下、そして力の印加
といった手軽な操作で、すなわちＢ／Ｆ分離の為の特別
な操作や液の移し換えの操作をせずとも簡単な操作で測
定が行え、しかもその測定結果はバックグラウンドノイ
ズが小さく、正確なといった特長を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫学的測定装置の原理図である。

【図２】本発明の免疫学的測定装置による測定工程図で
ある。

【図３】本発明の免疫学的測定装置による測定工程図で
ある。

【図４】本発明により作成されたＣＲＰの検量線を示す
ものである。

【符号の説明】

２　　第１の吸水体 ４　　第２の吸水体 ５　　弾撥材

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗体（又は抗原）が固定化された第１
   の吸水体と、酵素基質を有する第２の吸水体と、前記第
   １の吸水体と第２の吸水体との間に設けた弾撥材とを具
   備することを特徴とする免疫学的測定装置。
2. 【請求項２】　　第１の吸水体に酵素標識抗体（又は抗
   原）が有ることを特徴とする請求項１の免疫学的測定装
   置。
3. 【請求項３】　　請求項１又は請求項２の免疫学的測定
   装置を用いる免疫学的測定方法。