JPS62192663A - 免疫反応物定量用多層分析要素 - Google Patents
免疫反応物定量用多層分析要素Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は抗原または抗体などの抗原・抗体反応をする免
疫反応物を定量する多層分析要素に関するものである。
疫反応物を定量する多層分析要素に関するものである。
(従来技術)
抗原抗体反応は互いに対応する抗原または抗体のみに特
異的に反応・結合する免疫反応であり。
異的に反応・結合する免疫反応であり。
生体内微量物質の検出、自己免疫疾患の診断など臨床検
査に広く利用されている。これらの操作は熟練を要する
ためルーティン化した臨床検査では、より簡便な操作で
再現性よく測定する方法が望まれている。また大量処理
のためには自動操作化も可能なようにwl、量試料で短
時間の内に分析できる方法が望まれる。
査に広く利用されている。これらの操作は熟練を要する
ためルーティン化した臨床検査では、より簡便な操作で
再現性よく測定する方法が望まれている。また大量処理
のためには自動操作化も可能なようにwl、量試料で短
時間の内に分析できる方法が望まれる。
このような簡便で自動操作化可能な抗原量測定方法とし
て多層分析要素を用いた測定方法が本出願人により既に
提案されている(特開昭57−200862、特開昭5
9−77356)。特開昭57−200862に記載の
多層分析要素は、固定化抗体を含有する反応層と親水性
高分子からなる検出層とを重ねたものである。この反応
層に被検物たる抗原と所定量の標識抗原との混合物を添
加すると、反応層中の固定化抗体との間の競争的抗原抗
体反応により固定化抗体と結合しなかった抗原と標識抗
原のみが検出層に移行することになる。この検出層に移
行した標識抗原を光学的に検出することにより被検物の
抗原量を測定するものである。
て多層分析要素を用いた測定方法が本出願人により既に
提案されている(特開昭57−200862、特開昭5
9−77356)。特開昭57−200862に記載の
多層分析要素は、固定化抗体を含有する反応層と親水性
高分子からなる検出層とを重ねたものである。この反応
層に被検物たる抗原と所定量の標識抗原との混合物を添
加すると、反応層中の固定化抗体との間の競争的抗原抗
体反応により固定化抗体と結合しなかった抗原と標識抗
原のみが検出層に移行することになる。この検出層に移
行した標識抗原を光学的に検出することにより被検物の
抗原量を測定するものである。
特開昭59−77356記載の多層分析要素は螢光標識
抗原を含有する展開層と、多孔質媒体からなる保液量の
大きな分配層と、固定化抗体を含有する反応層とを順次
重ねたものである。被検物たる抗原を展開層に滴下する
と、この抗原は展開層中の螢光標識抗原と共に分配層に
移動し保液される。反応層に抗体がなければ抗原と標識
抗原は分配層と反応層の保液量比に応じた量だけしか反
応層に移動し得ないが、反応層には予め固定化抗体があ
るため反応層の保液量に応じた量よりも抗体と結合した
抗原と標識抗原の量の分だけ多く反応層に移行する。従
って抗原と標識抗原との間の競争的抗原抗体反応により
、被検物たる抗原の量は反応層の螢光強度の減少として
測定できるというものである。
抗原を含有する展開層と、多孔質媒体からなる保液量の
大きな分配層と、固定化抗体を含有する反応層とを順次
重ねたものである。被検物たる抗原を展開層に滴下する
と、この抗原は展開層中の螢光標識抗原と共に分配層に
移動し保液される。反応層に抗体がなければ抗原と標識
抗原は分配層と反応層の保液量比に応じた量だけしか反
応層に移動し得ないが、反応層には予め固定化抗体があ
るため反応層の保液量に応じた量よりも抗体と結合した
抗原と標識抗原の量の分だけ多く反応層に移行する。従
って抗原と標識抗原との間の競争的抗原抗体反応により
、被検物たる抗原の量は反応層の螢光強度の減少として
測定できるというものである。
これらの多層分析要素は分析操作を簡素化し、自動操作
化を可能にする点で画期的なものであった。しかし両要
素とも抗原に標識された色素や螢光色素を直接検出する
ものであるため、検出感度を高めるのは原理的に限界が
あった。
化を可能にする点で画期的なものであった。しかし両要
素とも抗原に標識された色素や螢光色素を直接検出する
ものであるため、検出感度を高めるのは原理的に限界が
あった。
そこで、検出感度を上げる方法としてエンザイムイムノ
アッセイを応用することが考えられる。
アッセイを応用することが考えられる。
この方法は抗原(または抗体)を酵素標識し、抗原抗体
反応をした(またはしなかった)抗原(または抗体)に
標識された酵素の活性を検出するものである。この方法
では抗体と結合した酵素標識抗原(B)と抗体と未結合
の酵素標識抗原(F)とを分子ill!(いわゆるB/
F分#)するか、またはB、Fで活性が変化する酵素系
が必要となる。
反応をした(またはしなかった)抗原(または抗体)に
標識された酵素の活性を検出するものである。この方法
では抗体と結合した酵素標識抗原(B)と抗体と未結合
の酵素標識抗原(F)とを分子ill!(いわゆるB/
F分#)するか、またはB、Fで活性が変化する酵素系
が必要となる。
B/F分離を必要としない系としては、補酵素とアポ酵
素との親和性が、補酵素に予め結合した抗原に抗体が結
合することにより減少することを利用したものが知られ
ている(特開昭55−2997)。また同じ(または異
なる)担体に固定相を分離して酵素と抗体とを結合した
複合物と、抗原と酵素阻害剤(または酵素活性化剤)と
の結合物とを組合せて、競争的抗原抗体反応で抗体に結
合しない抗原に標識された酵素阻害剤等が酵素と結合し
て酵素活性を低下(または活性化)させる系も知られて
いる(特開昭58−209994)。これらはいずれも
被検物たる未標識抗原の量を、酵素活性の阻害率または
活性化率により測定するものであり、原理的に感度が低
く、感度を上げるためには酵素反応時間を長イしなけれ
ばならないという不都合があった。
素との親和性が、補酵素に予め結合した抗原に抗体が結
合することにより減少することを利用したものが知られ
ている(特開昭55−2997)。また同じ(または異
なる)担体に固定相を分離して酵素と抗体とを結合した
複合物と、抗原と酵素阻害剤(または酵素活性化剤)と
の結合物とを組合せて、競争的抗原抗体反応で抗体に結
合しない抗原に標識された酵素阻害剤等が酵素と結合し
て酵素活性を低下(または活性化)させる系も知られて
いる(特開昭58−209994)。これらはいずれも
被検物たる未標識抗原の量を、酵素活性の阻害率または
活性化率により測定するものであり、原理的に感度が低
く、感度を上げるためには酵素反応時間を長イしなけれ
ばならないという不都合があった。
従ってエンザイムイムノアッセイを適用した多層分析要
素には、要素内で実質的にB/F分離でき、短時間で感
度よく定量できるものが望まれる。
素には、要素内で実質的にB/F分離でき、短時間で感
度よく定量できるものが望まれる。
(発明の目的)
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、抗
原または抗体などの免疫反応物を少量の試料で簡便かつ
短時間に感度良く定量でき、自動操作化にも適した免疫
反応物定量用多層分析要素を提供することを目的とする
。
原または抗体などの免疫反応物を少量の試料で簡便かつ
短時間に感度良く定量でき、自動操作化にも適した免疫
反応物定量用多層分析要素を提供することを目的とする
。
(発明の構成)
本発明はこれらの目的を達成するため、被免疫反応物(
抗原または抗体)と酵素基質とをそれぞれ担体に固定化
した反応層で、被検物たる免疫反応物(抗体または抗原
)と、この免疫反応物と酵素との複合体とを競争反応さ
せ、固定化被免疫反応物と結合しなかった免疫反応物・
酵素複合体のみを固定化基質と反応させ、この結果生じ
る酵素反応生成物を検出層に移動させ、発色検出試薬に
より検出するようにした。
抗原または抗体)と酵素基質とをそれぞれ担体に固定化
した反応層で、被検物たる免疫反応物(抗体または抗原
)と、この免疫反応物と酵素との複合体とを競争反応さ
せ、固定化被免疫反応物と結合しなかった免疫反応物・
酵素複合体のみを固定化基質と反応させ、この結果生じ
る酵素反応生成物を検出層に移動させ、発色検出試薬に
より検出するようにした。
すなわち本発明の目的は、水不透過性透光性支持体と、
この支持体の片面に設けられた親水性高分子をバインダ
ーとして含有する発色試薬層と、この発色試薬層を被覆
する多孔性媒体からなる反応層とを備え、前記反応層は
、不溶性担体に固定された被免疫反応物と、別の不溶性
担体に固定された酵素基質とを含有し、前記発色試薬層
は、前記反応層内で前記酵素基質より生成される酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含有しているこ
とを特徴とする免疫反応物定量用多層分析要素により達
成される。
この支持体の片面に設けられた親水性高分子をバインダ
ーとして含有する発色試薬層と、この発色試薬層を被覆
する多孔性媒体からなる反応層とを備え、前記反応層は
、不溶性担体に固定された被免疫反応物と、別の不溶性
担体に固定された酵素基質とを含有し、前記発色試薬層
は、前記反応層内で前記酵素基質より生成される酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含有しているこ
とを特徴とする免疫反応物定量用多層分析要素により達
成される。
(作用)
固定化被免疫反応物(抗原または抗体)と固定化基質と
は反応層内で空間的に離れて存在する。
は反応層内で空間的に離れて存在する。
そのため、酵素と結合した免疫反応物(抗体または抗原
)が固定化被免疫反応物と結合すると、もはや酵素は固
定化基質に近付くことができず酵素反応を起こさない。
)が固定化被免疫反応物と結合すると、もはや酵素は固
定化基質に近付くことができず酵素反応を起こさない。
ここで被検物たる免疫反応物(酵素で標識されていない
)が併せて添加されると、競争反応により固定化被免疫
反応物に結合できなかった免疫反応物・酵素複合体は固
定化基質に近付くことができ、酵素反応が可能となる。
)が併せて添加されると、競争反応により固定化被免疫
反応物に結合できなかった免疫反応物・酵素複合体は固
定化基質に近付くことができ、酵素反応が可能となる。
こうして生じた酵素反応生成物は検出層(発色試薬層)
へ浸透・移動する。これを検出試薬で発色させ、透光性
支持体を介して比色測定する。
へ浸透・移動する。これを検出試薬で発色させ、透光性
支持体を介して比色測定する。
(第1実施態様)
第1図は本発明の一実施態様による免疫反応物定量用多
層分析要素の断面図である。
層分析要素の断面図である。
符号10は透光性支持体であり、この支持体上には親水
性高分子からなる発色試薬層12、多孔性媒体からなる
反応層14が順次積層されている。反応層14は水不溶
性担体に固定された抗体、別の水不溶性担体に固定され
た酵素基質とを含有する。発色試薬層12には反応層1
4で生じた酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬
を含有する。さらに本実施態様の反応層14は色を遮蔽
するルチル型またはアナターゼ型等の酸化チタンの微粒
子を併せて分散含有している。
性高分子からなる発色試薬層12、多孔性媒体からなる
反応層14が順次積層されている。反応層14は水不溶
性担体に固定された抗体、別の水不溶性担体に固定され
た酵素基質とを含有する。発色試薬層12には反応層1
4で生じた酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬
を含有する。さらに本実施態様の反応層14は色を遮蔽
するルチル型またはアナターゼ型等の酸化チタンの微粒
子を併せて分散含有している。
反応層14に含有される酵素基質と発色試薬層12に含
有される検出試薬はこの多層分析要素に滴下される抗原
と酵素によって定まる。すなわち酵素反応生成物の量が
発色色素量として検出できる検出試薬が適用できるよう
な酵素・基質・検出試薬の組合せを用いる。
有される検出試薬はこの多層分析要素に滴下される抗原
と酵素によって定まる。すなわち酵素反応生成物の量が
発色色素量として検出できる検出試薬が適用できるよう
な酵素・基質・検出試薬の組合せを用いる。
次に本発明による多層分析要素の各構成物質について説
明する。
明する。
支持体
支持体10は、光透過性(透明な)水不透過性物質、す
なわち波長的200nmから約900nmの範囲内の少
なくとも一部の波長範囲の電磁輻射線を投下させる物質
であればよく、例えばポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールAのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル(セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等)等のポリマーの平滑な表面を有するフィルム状(
シート状)または平板状の公知の支持体を用いることが
できる。その厚さは約50gmから約1 m m 、好
ましくは約80J、Lmから約300゜mの範囲である
。
なわち波長的200nmから約900nmの範囲内の少
なくとも一部の波長範囲の電磁輻射線を投下させる物質
であればよく、例えばポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールAのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル(セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等)等のポリマーの平滑な表面を有するフィルム状(
シート状)または平板状の公知の支持体を用いることが
できる。その厚さは約50gmから約1 m m 、好
ましくは約80J、Lmから約300゜mの範囲である
。
この支持体の中には必要に応じて二酸化チタン微粒子、
硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック等を分散含有さ
せて光学的性能を調節することができる。支持体の表面
には必要に応じて公知の下塗層を設けて支持体の上に設
けられている発色試薬層と支持体との接着を強固にする
ことができる。
硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック等を分散含有さ
せて光学的性能を調節することができる。支持体の表面
には必要に応じて公知の下塗層を設けて支持体の上に設
けられている発色試薬層と支持体との接着を強固にする
ことができる。
多孔性媒体
反応層14を構成する多孔性媒体は、これに点着される
試料液中の抗原、抗体、酵素等と実質的に反応せず、抗
体または基質を固定化する担体を保持できるものであれ
ばよく、繊維質多孔性シートまたは非繊維質多孔性シー
トを用いることができる。
試料液中の抗原、抗体、酵素等と実質的に反応せず、抗
体または基質を固定化する担体を保持できるものであれ
ばよく、繊維質多孔性シートまたは非繊維質多孔性シー
トを用いることができる。
繊維質多孔性シートとして、織物生地、編物生地、有機
ポリマー繊維パルプ含有抄造紙および濾紙、ガラス繊維
バルブ含有抄造紙および濾紙、繊維質不織布等を用いる
ことができる。
ポリマー繊維パルプ含有抄造紙および濾紙、ガラス繊維
バルブ含有抄造紙および濾紙、繊維質不織布等を用いる
ことができる。
織物生地としては、特開昭55−164356、同60
−222770等に記載の展開層用の平織物が好ましく
、平織物のうちでは細布生地。
−222770等に記載の展開層用の平織物が好ましく
、平織物のうちでは細布生地。
金山生地、ブロード生地、ボブリン生地等が好ましい。
織物生地を構成する糸としては紡績糸(加捻糸)が好ま
しい。織物生地の糸の太さは綿紡績糸番手で表わして約
2O5から約1505、好ましくは約403から約12
O3相当の範囲、または絹糸デニールで表わして約35
Dから約300D、好ましくは約45Dから約130D
の範囲、織物生地の厚さは約11001Lから約500
gm、好ましくは約120g、mから約350 Ji、
mの範囲、織物生地の空隙率は約40%から約90%、
好ましくは約50%から約85%の範囲である。
しい。織物生地の糸の太さは綿紡績糸番手で表わして約
2O5から約1505、好ましくは約403から約12
O3相当の範囲、または絹糸デニールで表わして約35
Dから約300D、好ましくは約45Dから約130D
の範囲、織物生地の厚さは約11001Lから約500
gm、好ましくは約120g、mから約350 Ji、
mの範囲、織物生地の空隙率は約40%から約90%、
好ましくは約50%から約85%の範囲である。
編物生地としては、特開昭60−222769、同60
−222770等に記載の展開層用の経(たて)メリヤ
ス編生地が好ましく、経メリヤス編生地のうちではトリ
コット編生地、ラッシェル編生地、ミラニーズ編生地、
ダブルトリコット編生地が好ましい。編物生地を構成す
る糸としては紡績糸(加捻糸)が好ましい。編物生地の
糸の太さは綿紡績糸番手で表わして約40Sから約l5
OS、好ましくは約6O8から約120S相当の範囲、
または絹糸デニールで表わして約35Dから約1300
、好ましくは約45Dから約90Dの範囲、編物生地の
編成工程時のゲージ数としては約20から約50の範囲
、編物生地の厚さは約100gmから約6007zm、
好ましくは約150ルmから約400ルmの範囲、編物
生地の空隙率は約40%から約90%、好ましくは約5
0%から約85%の範囲である。
−222770等に記載の展開層用の経(たて)メリヤ
ス編生地が好ましく、経メリヤス編生地のうちではトリ
コット編生地、ラッシェル編生地、ミラニーズ編生地、
ダブルトリコット編生地が好ましい。編物生地を構成す
る糸としては紡績糸(加捻糸)が好ましい。編物生地の
糸の太さは綿紡績糸番手で表わして約40Sから約l5
OS、好ましくは約6O8から約120S相当の範囲、
または絹糸デニールで表わして約35Dから約1300
、好ましくは約45Dから約90Dの範囲、編物生地の
編成工程時のゲージ数としては約20から約50の範囲
、編物生地の厚さは約100gmから約6007zm、
好ましくは約150ルmから約400ルmの範囲、編物
生地の空隙率は約40%から約90%、好ましくは約5
0%から約85%の範囲である。
抄造紙、濾紙、不織布、に用いられる繊維質素材として
は、ガラスla維1石綿等の無機繊維、木綿、麻、絹等
の天然有機繊維、銅アンモニアレーヨン、セルロースア
セテート、部分ホルマール化ポリビニルアルコール、ポ
リエチレン、ポリエステル類(例えばポリエチレンテレ
フタレート等)等の半合成fIj、m、合成繊維が用い
られる。
は、ガラスla維1石綿等の無機繊維、木綿、麻、絹等
の天然有機繊維、銅アンモニアレーヨン、セルロースア
セテート、部分ホルマール化ポリビニルアルコール、ポ
リエチレン、ポリエステル類(例えばポリエチレンテレ
フタレート等)等の半合成fIj、m、合成繊維が用い
られる。
また、繊維質素材としては、太さが0.1−5gmで長
さが500〜4000pmの範囲にあることが好ましい
。
さが500〜4000pmの範囲にあることが好ましい
。
有機ポリマーljlimパルプ含有抄造紙としては。
特開昭57−148250等に記載のポリエチレン繊維
だけのパルプからの抄造紙、およびポリエチレン繊a(
30〜70%)とセルロース繊維等に天然繊維の混合バ
ルブからの抄造紙が好ましい。紙の厚さは約80gmか
ら約400gm、好ましくは約1100pから約250
JLmの範囲、紙の空隙率は約20%から約80%、好
ましくは約50%から約70%の範囲である。
だけのパルプからの抄造紙、およびポリエチレン繊a(
30〜70%)とセルロース繊維等に天然繊維の混合バ
ルブからの抄造紙が好ましい。紙の厚さは約80gmか
ら約400gm、好ましくは約1100pから約250
JLmの範囲、紙の空隙率は約20%から約80%、好
ましくは約50%から約70%の範囲である。
fa#I質多孔性シートのうち織物生地および編物生地
(以下、両者をあわせて布ということがある)は水洗等
の脱脂処理により少なくとも糸製造時または布製造時に
供給または付着した油脂類を実質的に除去した布を用い
る。抄造紙および抄造濾紙は油脂類を実質的に付着して
いないものを用いる。繊維質多孔性シートは特開昭57
−66359等に記載の物理的活性化処理(好ましくは
グロー放電処理、またはコロナ放電処理)をその片面ま
たは両面に施すか、あるいは特開昭55−164356
、同57−66359、同57−148250等に記載
の界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤水溶液
の含浸処理、塗布またはスプレィ処理することができる
。
(以下、両者をあわせて布ということがある)は水洗等
の脱脂処理により少なくとも糸製造時または布製造時に
供給または付着した油脂類を実質的に除去した布を用い
る。抄造紙および抄造濾紙は油脂類を実質的に付着して
いないものを用いる。繊維質多孔性シートは特開昭57
−66359等に記載の物理的活性化処理(好ましくは
グロー放電処理、またはコロナ放電処理)をその片面ま
たは両面に施すか、あるいは特開昭55−164356
、同57−66359、同57−148250等に記載
の界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤水溶液
の含浸処理、塗布またはスプレィ処理することができる
。
セルロースアセテート等のセルロースエステル、ナイロ
ン−6、ナイロン−66等のポリアミド、ビスフェノー
ルAのポリカルボネート等からなるメンブレンフィルタ
(プラッシュポリマ一層)、第9回プラスチックフィル
ム研究会講座講演要旨集(高分子学会、 1984年2
月22日発行) 、Membrane、Inc、カタ
ログ(1!982年7月発行)等に記載のポリエチレン
微多孔性膜、ポリプロピレン 微多孔膜等のポリオレフ
ィン微多孔lり、特公昭53−21677、米国特許3
,992,158等に記載のポリマーミクロビーズ、ガ
ラスミクロビーズ、珪藻土等の微粒子が親木性ポリマー
バイングーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層、
特開昭55−90859に記載のポリマーミクロビーズ
が水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着され
てなる連続微空隙含有多孔性層(三次元格子状粒状構造
物層)等の非繊維質等方的多孔性層等を用いることがで
きる。
ン−6、ナイロン−66等のポリアミド、ビスフェノー
ルAのポリカルボネート等からなるメンブレンフィルタ
(プラッシュポリマ一層)、第9回プラスチックフィル
ム研究会講座講演要旨集(高分子学会、 1984年2
月22日発行) 、Membrane、Inc、カタ
ログ(1!982年7月発行)等に記載のポリエチレン
微多孔性膜、ポリプロピレン 微多孔膜等のポリオレフ
ィン微多孔lり、特公昭53−21677、米国特許3
,992,158等に記載のポリマーミクロビーズ、ガ
ラスミクロビーズ、珪藻土等の微粒子が親木性ポリマー
バイングーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層、
特開昭55−90859に記載のポリマーミクロビーズ
が水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着され
てなる連続微空隙含有多孔性層(三次元格子状粒状構造
物層)等の非繊維質等方的多孔性層等を用いることがで
きる。
非繊維質多孔性シートの空隙サイズは約20nmから約
30 、gm、好ましくは約50nmから約10JLm
の範囲、空隙率は約20%から約90%、好ましくは約
40%から約85%の範囲である、厚さは約20JLm
から約500 g、m、好ましくは約80gmから約3
50 pmの範囲である。
30 、gm、好ましくは約50nmから約10JLm
の範囲、空隙率は約20%から約90%、好ましくは約
40%から約85%の範囲である、厚さは約20JLm
から約500 g、m、好ましくは約80gmから約3
50 pmの範囲である。
非繊維質多孔性シート中には全血中のヘモグロビンの赤
色等の反射光学濃度測定の光学的妨害排除のために特公
昭53−21677、米国特許3.992,158.特
開昭55−90859等に記載の方法に従って光遮蔽性
微粒子及び(または)光反射性微粒子をいずれか1層ま
たは2層に含有させることができる。3次元格子状粒状
構造物層を用いる場合には光遮蔽性及び(または)光反
射性微粒子が接着剤で点接触状に接着されてなる3次元
格子状粒状構造物層を用いることができる。光遮蔽性及
び(または)光反射性微粒子の例として二酸化チタン微
粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック、アルミ
ニウム微粒子または微小フレーク等がある。これらのう
ちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ま
しい。
色等の反射光学濃度測定の光学的妨害排除のために特公
昭53−21677、米国特許3.992,158.特
開昭55−90859等に記載の方法に従って光遮蔽性
微粒子及び(または)光反射性微粒子をいずれか1層ま
たは2層に含有させることができる。3次元格子状粒状
構造物層を用いる場合には光遮蔽性及び(または)光反
射性微粒子が接着剤で点接触状に接着されてなる3次元
格子状粒状構造物層を用いることができる。光遮蔽性及
び(または)光反射性微粒子の例として二酸化チタン微
粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック、アルミ
ニウム微粒子または微小フレーク等がある。これらのう
ちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ま
しい。
非繊維質多孔性シート層には公知の界面活性剤、好まし
くはノニオン性界面活性剤を含浸保持させることができ
る。これにより水性液体試料の拡散、浸透、通過が均一
になる。
くはノニオン性界面活性剤を含浸保持させることができ
る。これにより水性液体試料の拡散、浸透、通過が均一
になる。
担体
抗体または酵素基質を固定する担体は、水不溶性で、抗
原抗体反応や酵素反応に影響を与えないものであり、抗
体または基質を固定化し得る官能基を有するもの、また
このような官能基を導入できるものであればよい。
原抗体反応や酵素反応に影響を与えないものであり、抗
体または基質を固定化し得る官能基を有するもの、また
このような官能基を導入できるものであればよい。
一般にはアガー、アガロース、デキストランなどの多糖
類;ポリアクリルアミド、または重合可能なエチレン系
モノマーの重合(もしくは共重合)により形成されたラ
テックス;セルロースパウダーなどの非繊維質微粒子状
物質を用いる。この内でも、アガー、アガロースのよう
な非繊維質微粒子状物質は、反応層の厚さ当りの保液量
を増大させることができるために好ましい。
類;ポリアクリルアミド、または重合可能なエチレン系
モノマーの重合(もしくは共重合)により形成されたラ
テックス;セルロースパウダーなどの非繊維質微粒子状
物質を用いる。この内でも、アガー、アガロースのよう
な非繊維質微粒子状物質は、反応層の厚さ当りの保液量
を増大させることができるために好ましい。
なお担体を繊維質素材で構成して、これを抄いて得られ
る抄造紙を反応層14としての多孔性シートとしてもよ
い。
る抄造紙を反応層14としての多孔性シートとしてもよ
い。
担体と抗体または基質との結合・固定は特開昭53−7
237、同53−7238、同53−7239などに記
載の公知技術により行なうことができる。例えばカルポ
ニルジイミダンール処理によるアシル化処理を含む方法
、CNBr(ブロムシアン)による活性化処理を含む方
法、さらにはグルタルアルデヒド等の官能基架橋剤によ
る処理を含む方法などがある。
237、同53−7238、同53−7239などに記
載の公知技術により行なうことができる。例えばカルポ
ニルジイミダンール処理によるアシル化処理を含む方法
、CNBr(ブロムシアン)による活性化処理を含む方
法、さらにはグルタルアルデヒド等の官能基架橋剤によ
る処理を含む方法などがある。
被検物たる抗原の特異抗体を用いる。常法により得られ
る抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いればより感
度が向上する。
る抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いればより感
度が向上する。
発色試薬層
発色試薬層12は水を吸収して膨潤する親水性高分子を
バインダー成分とする層で、反応層で生成された酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含む。この発色
試薬層は吸水層としても機能する層である。
バインダー成分とする層で、反応層で生成された酵素反
応生成物を検出して発色する検出試薬を含む。この発色
試薬層は吸水層としても機能する層である。
発色試薬層に用いられる親水性高分子は水吸水時の膨潤
率が30°Cで約150%から約2000%、好ましく
は約250%から約1500%の範囲の高分子である。
率が30°Cで約150%から約2000%、好ましく
は約250%から約1500%の範囲の高分子である。
親水性高分子の具体例としての特開昭59−17186
4、特開昭60−115859等に開示の酸処理ゼラチ
ン、脱イオンゼラチン等のゼラチン、フタル化ゼラチン
、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等のゼラチ
ン誘導体、特開昭59−171864、特開昭60−1
15859等に開示のアガロース、プルラン、プルラン
誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等がある。これらの親木性高分子
は単独で、あるいは2種以上を組合せて用いることがで
きる。発色試薬層には一般的にはゼラチンまたはゼラチ
ン誘導体が好ましいが、被検物が抗体である場合や、被
検物を抗原とする場合でも、この抗原が蛋白質である場
合等には、蛋白誘導体のゼラチン以外の親水性高分子、
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を用いる
のが好ましい。
4、特開昭60−115859等に開示の酸処理ゼラチ
ン、脱イオンゼラチン等のゼラチン、フタル化ゼラチン
、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等のゼラチ
ン誘導体、特開昭59−171864、特開昭60−1
15859等に開示のアガロース、プルラン、プルラン
誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等がある。これらの親木性高分子
は単独で、あるいは2種以上を組合せて用いることがで
きる。発色試薬層には一般的にはゼラチンまたはゼラチ
ン誘導体が好ましいが、被検物が抗体である場合や、被
検物を抗原とする場合でも、この抗原が蛋白質である場
合等には、蛋白誘導体のゼラチン以外の親水性高分子、
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を用いる
のが好ましい。
発色試薬層の乾燥時の厚さは約3ALmから約50gm
、好ましくは約5pLmから約301Lmの範囲、被覆
量では約3g/mlから約50g/rn’の範囲、好ま
しくは約5 g/rn’から約30g/m”の範囲であ
る。発色試薬層には公知のpH緩衝剤、有機カルボン酸
、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有させて使用時
(分析操作実施時)のpHを調節することができる。さ
らには発色試薬層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等
を含有させることができる。発色試薬層は実質的に透明
であることが好ましいが、必要に応じて発色試薬層中に
二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブ
ラック等を少量分散含有させて光学的性能を調節するこ
とができる。
、好ましくは約5pLmから約301Lmの範囲、被覆
量では約3g/mlから約50g/rn’の範囲、好ま
しくは約5 g/rn’から約30g/m”の範囲であ
る。発色試薬層には公知のpH緩衝剤、有機カルボン酸
、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有させて使用時
(分析操作実施時)のpHを調節することができる。さ
らには発色試薬層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等
を含有させることができる。発色試薬層は実質的に透明
であることが好ましいが、必要に応じて発色試薬層中に
二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブ
ラック等を少量分散含有させて光学的性能を調節するこ
とができる。
なお発色試薬層と支持体との間には吸水層を設けること
ができる。吸水層は発色試薬層と同様な親木性高分子を
主成分とする層で、その乾燥時の厚さは約IJLmから
約100gm、好ましくは約3gmから約307pmの
範囲、被覆量では約1 g/m″から約100g/m’
の範囲、好ましくは約3 g/rrfから約30g/m
’の範囲である。吸水層には公知のpH1衝剤、有機カ
ルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有させ
て使用時(分析操作実施時)のpHを調節することがで
きる。吸水層にの媒染剤、ポリマー媒染剤、塩基性ポリ
マーまたは酸性ポリマーを含有させた場合には、検出層
としても機能する。
ができる。吸水層は発色試薬層と同様な親木性高分子を
主成分とする層で、その乾燥時の厚さは約IJLmから
約100gm、好ましくは約3gmから約307pmの
範囲、被覆量では約1 g/m″から約100g/m’
の範囲、好ましくは約3 g/rrfから約30g/m
’の範囲である。吸水層には公知のpH1衝剤、有機カ
ルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリマー等を含有させ
て使用時(分析操作実施時)のpHを調節することがで
きる。吸水層にの媒染剤、ポリマー媒染剤、塩基性ポリ
マーまたは酸性ポリマーを含有させた場合には、検出層
としても機能する。
酵素−基質−検出試薬
反応層14に含有される酵素基質と、発色試薬層に含有
される検出試薬は、この多層分析要素で分析する抗原に
標識する酵素との関係で定まる。
される検出試薬は、この多層分析要素で分析する抗原に
標識する酵素との関係で定まる。
すなわち酵素反応生成物量が発色色素量として検出でき
る検出試薬が適用できるような酵素・基質拳検出試薬の
組合せを用いる。
る検出試薬が適用できるような酵素・基質拳検出試薬の
組合せを用いる。
検出試薬例1
抗原の標識酵素にβ−D−ガラクトシダーゼ、基質にガ
ラクトースオリゴマーを用いた場合には、ガラクトース
オキシダーゼとベルオキダーゼと発色試薬組成物との組
合せを検出試薬とすることができる。ガラクトースオキ
シダーゼはガラクトースオリゴマーの酵素反応生成物(
分解物)であるD−ガラクトースを脱水素し、その副生
成物としてH2O2を生成する。ペルオキシダーゼの作
用によりこのH202と発色試薬組成物とが反応し、呈
色物質(色素)が生成される。なおガラクト−スオキシ
ダーゼはガラクトースオリゴマーとも反応するが、本発
明ではこのガラクトースオリゴマーが固定化基質として
反応層に隔離されているから、発色試薬層内でのD−ガ
ラクトースを検出する邪魔にはならない。
ラクトースオリゴマーを用いた場合には、ガラクトース
オキシダーゼとベルオキダーゼと発色試薬組成物との組
合せを検出試薬とすることができる。ガラクトースオキ
シダーゼはガラクトースオリゴマーの酵素反応生成物(
分解物)であるD−ガラクトースを脱水素し、その副生
成物としてH2O2を生成する。ペルオキシダーゼの作
用によりこのH202と発色試薬組成物とが反応し、呈
色物質(色素)が生成される。なおガラクト−スオキシ
ダーゼはガラクトースオリゴマーとも反応するが、本発
明ではこのガラクトースオリゴマーが固定化基質として
反応層に隔離されているから、発色試薬層内でのD−ガ
ラクトースを検出する邪魔にはならない。
抗原を標識するβ−D−ガラクトシダーゼとしては馬場
、和国、北村、奥田編著「臨床酵素ハンドブックJ
G’11談社、1982年) 、T、 E、 Barm
an著rEnzyme Handbook J (S
pringer Verlag、 1969年)等に
記載のβ−D−ガラクトシダーゼ(EC3,2,1,2
3)を用いることができる。特にDiploc。
、和国、北村、奥田編著「臨床酵素ハンドブックJ
G’11談社、1982年) 、T、 E、 Barm
an著rEnzyme Handbook J (S
pringer Verlag、 1969年)等に
記載のβ−D−ガラクトシダーゼ(EC3,2,1,2
3)を用いることができる。特にDiploc。
ccus pneumoniae起源のβ−D−ガラク
トンダーゼが好ましい。
トンダーゼが好ましい。
ガラクトースオキシダーゼとしては、馬場、和国、北村
、奥田編著「臨床酵素ハンドブックJ(講談社、 19
82年)、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」 (朝
倉書店、 1982年) 、 T、E、Barman著
rEnzyme Handbook J (Sprin
ger Verlag、1969年)等に記載のPo1
yporus circinatus、 Dactyl
ium dendoroides等微生物起原のガラク
トースオ超厚ダーゼ(EC1,1,1,48)を用いる
ことができる。ガラクトースオキシダーゼは必要に応じ
てその補酵素、 Cu2°イオンとともに用いることが
できる。分析操作時にpH13,5からpH8,0、好
ましくはpH6,8からpH7,5の範囲に維持される
ようにガラクトースオキシダーゼが含有される層または
その隣接層等に公知のpHW衝剤を含有させることがで
きる。ガラクトースオキシダーゼの含有量は通常多層分
析要素1m″当り約l千Uから約10万U、好ましくは
約2千Uから約5万Uの範囲である。
、奥田編著「臨床酵素ハンドブックJ(講談社、 19
82年)、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」 (朝
倉書店、 1982年) 、 T、E、Barman著
rEnzyme Handbook J (Sprin
ger Verlag、1969年)等に記載のPo1
yporus circinatus、 Dactyl
ium dendoroides等微生物起原のガラク
トースオ超厚ダーゼ(EC1,1,1,48)を用いる
ことができる。ガラクトースオキシダーゼは必要に応じ
てその補酵素、 Cu2°イオンとともに用いることが
できる。分析操作時にpH13,5からpH8,0、好
ましくはpH6,8からpH7,5の範囲に維持される
ようにガラクトースオキシダーゼが含有される層または
その隣接層等に公知のpHW衝剤を含有させることがで
きる。ガラクトースオキシダーゼの含有量は通常多層分
析要素1m″当り約l千Uから約10万U、好ましくは
約2千Uから約5万Uの範囲である。
ペルオキシダーゼとしては、馬場、和国、北村、奥田編
著[臨床酵素ハンドブック」 (講談社、 1982年
)、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」 (朝倉書店
、 1982年) 、 T、E、Barman著rEn
zyme Handbook J (Springer
Verlag、1989年)、特公昭5G−4559
9,特公昭57−5520等に記載の植物超厚および動
物超厚のペルオキシダーゼ(EC1,11゜1.7)、
特公昭58−5035等に記載の微生物起原のペルオキ
シダーゼ(EC1,11,1,7)を用いることができ
る。これらのうちでは植物超厚または微生物起原の非特
異的ペルオキシダーゼが好ましい。
著[臨床酵素ハンドブック」 (講談社、 1982年
)、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」 (朝倉書店
、 1982年) 、 T、E、Barman著rEn
zyme Handbook J (Springer
Verlag、1989年)、特公昭5G−4559
9,特公昭57−5520等に記載の植物超厚および動
物超厚のペルオキシダーゼ(EC1,11゜1.7)、
特公昭58−5035等に記載の微生物起原のペルオキ
シダーゼ(EC1,11,1,7)を用いることができ
る。これらのうちでは植物超厚または微生物起原の非特
異的ペルオキシダーゼが好ましい。
好ましいペルオキシダーゼの例として、西洋わさびペル
オキシダーゼ、大根ペルオキシダーゼ、 C。
オキシダーゼ、大根ペルオキシダーゼ、 C。
chliobolus[、Cur+rularia属の
微生物から抽出したペルオキシダーゼがある。
微生物から抽出したペルオキシダーゼがある。
分析操作時にpH5,0からpH8,0、好ましくはp
H6,0からpH7,oの範囲に維持されるようにペル
オキシダーゼが含有される層またはその隣接層等に公知
のpHR衝剤を含有させることができる。ペルオキシダ
ーゼの含有量は通常多層分析要素1 m’当り約1千U
から約10万U、好ましくは約2千Uから約6万Uの範
囲である。
H6,0からpH7,oの範囲に維持されるようにペル
オキシダーゼが含有される層またはその隣接層等に公知
のpHR衝剤を含有させることができる。ペルオキシダ
ーゼの含有量は通常多層分析要素1 m’当り約1千U
から約10万U、好ましくは約2千Uから約6万Uの範
囲である。
ペルオキシダーゼは必要に応じて特公昭55−2584
0等に記載のへキサシアノ鉄(II)酸イオンを含む化
合物またはへキサシアノ鉄(II )酸イオンヲ放出し
うる化合物とともに用いることができる。
0等に記載のへキサシアノ鉄(II)酸イオンを含む化
合物またはへキサシアノ鉄(II )酸イオンヲ放出し
うる化合物とともに用いることができる。
発色試薬組成物は、H202とペルオキシダーゼとの存
在下において呈色物質(色素)を形成するものであって
、酸化発色色素(ロイコ色素)を含むもの(特公昭58
−45599 、同58−18828等に記載)、酸化
カップリングにより呈色物¥1(色素)を形成するもの
(rAnnales of clinical che
mistry J 、 8.24−27(19H)、
米国特許第3,992,158、特公昭55−25
840.同513−45599.同58−18Ei28
.特開昭59−54962等に記載)、自己カップリン
グ等により発色または変色する色素前駆体化合物(特公
昭58−45599 、同58−18828等に記載)
等を用いることができる。
在下において呈色物質(色素)を形成するものであって
、酸化発色色素(ロイコ色素)を含むもの(特公昭58
−45599 、同58−18828等に記載)、酸化
カップリングにより呈色物¥1(色素)を形成するもの
(rAnnales of clinical che
mistry J 、 8.24−27(19H)、
米国特許第3,992,158、特公昭55−25
840.同513−45599.同58−18Ei28
.特開昭59−54962等に記載)、自己カップリン
グ等により発色または変色する色素前駆体化合物(特公
昭58−45599 、同58−18828等に記載)
等を用いることができる。
好ましい発色試薬組成物の例として次の化合物がある。
水素供与体(色原体)とカプラーの組合せ;[水素供与
体]4−アミノアンチピリン、4−アミノ−2−メチル
−3−フェニル−1−(2゜4.6−)リクロロフェニ
ル)−3−ピラゾリン−5−オン等の4−アミノアンチ
ピリンホモログまたは誘導体 [カプラー31,7−シヒドロキシナフタレン、1−ヒ
ドロキシナフタレン−2−スルホン酸ナトリウム(また
はカリウム)等の1−ヒドロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素;4.5−ビス
[4−(ジエチルアミノ)フェニル] −2−(4−ヒ
ドロキシ−3,5−ジメトキシフエニル)イミダゾール
、4−(ジメチルアミノ)フェニル−2−(4−ヒドロ
キシ−3,5−ジメトキシフェニル)−5−フェネチル
イミダゾール等 色素110駆体化合物; ジアニシジン、4−メトキシ−1−ナフトール等 検出試薬例2 検出試薬としてガラクトースデヒドロゲナーゼとNAD
とNADH検出試薬との組合せを用いてもよい。ガラク
トースデヒドロゲナーゼは、固定化基質の分解物、D−
ガラクトースを脱水素して、その際NADをNADHに
還元する。従っこのNAD減少量またはN A D)l
生成量を測定することにより標識酵素の酵素反応生成物
の量を測定できる。
体]4−アミノアンチピリン、4−アミノ−2−メチル
−3−フェニル−1−(2゜4.6−)リクロロフェニ
ル)−3−ピラゾリン−5−オン等の4−アミノアンチ
ピリンホモログまたは誘導体 [カプラー31,7−シヒドロキシナフタレン、1−ヒ
ドロキシナフタレン−2−スルホン酸ナトリウム(また
はカリウム)等の1−ヒドロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素;4.5−ビス
[4−(ジエチルアミノ)フェニル] −2−(4−ヒ
ドロキシ−3,5−ジメトキシフエニル)イミダゾール
、4−(ジメチルアミノ)フェニル−2−(4−ヒドロ
キシ−3,5−ジメトキシフェニル)−5−フェネチル
イミダゾール等 色素110駆体化合物; ジアニシジン、4−メトキシ−1−ナフトール等 検出試薬例2 検出試薬としてガラクトースデヒドロゲナーゼとNAD
とNADH検出試薬との組合せを用いてもよい。ガラク
トースデヒドロゲナーゼは、固定化基質の分解物、D−
ガラクトースを脱水素して、その際NADをNADHに
還元する。従っこのNAD減少量またはN A D)l
生成量を測定することにより標識酵素の酵素反応生成物
の量を測定できる。
NADまたはNADHの量を比色定量する呈色試薬組成
物の例として、C11nica Chimica Ac
ta。
物の例として、C11nica Chimica Ac
ta。
12、 zlo(18,、U) 、特開昭59−448
58 、同59−88097 ニ記載のラクテートデヒ
ドロゲナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、C11nic
a Ghimica Acta、 28,431(19
?0)、特開昭50−44894 、同57−2089
98 、同58−44658 。
58 、同59−88097 ニ記載のラクテートデヒ
ドロゲナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、C11nic
a Ghimica Acta、 28,431(19
?0)、特開昭50−44894 、同57−2089
98 、同58−44658 。
同59−88097記載のアスパルテートアミノトラン
スフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、アラニンアミ
ノトランスフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公
昭4B−!3988に記載のクレアチンキナーゼ活性測
定用呈色試薬組成物、特開昭49−113i95゜同5
9−44858.同59−88097記載のタレアチン
ホスホキナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、米国特許3
゜791.933に記載のテストステロン活性測定用呈
色試薬組成物およびアンドロステロン活性測定用呈色試
薬組成物、特公昭56−3!31337に記載のアミラ
ーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公昭53−2187
7に記載のグリセロール分析用呈色試薬組成物、特開昭
50−126494.同53−24883、特公昭51
3−38199に記載のトリグリセリド分析用呈色試薬
組成物等がある。
スフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、アラニンアミ
ノトランスフェラーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公
昭4B−!3988に記載のクレアチンキナーゼ活性測
定用呈色試薬組成物、特開昭49−113i95゜同5
9−44858.同59−88097記載のタレアチン
ホスホキナーゼ活性測定用呈色試薬組成物、米国特許3
゜791.933に記載のテストステロン活性測定用呈
色試薬組成物およびアンドロステロン活性測定用呈色試
薬組成物、特公昭56−3!31337に記載のアミラ
ーゼ活性測定用呈色試薬組成物、特公昭53−2187
7に記載のグリセロール分析用呈色試薬組成物、特開昭
50−126494.同53−24883、特公昭51
3−38199に記載のトリグリセリド分析用呈色試薬
組成物等がある。
これらの内では、遊離NADH量を特公昭56−381
99.同56−46799に記載されたように、テトラ
ゾリウム塩を用いてジアホラーゼ存在下、ホルマザン色
素を生成させ比色定量するのが有利である。
99.同56−46799に記載されたように、テトラ
ゾリウム塩を用いてジアホラーゼ存在下、ホルマザン色
素を生成させ比色定量するのが有利である。
ガラクトースデヒドロゲナーゼ(EC1,1,1,48
)。
)。
NADは公知のものを用いることができる。
迭辿」シ1銑l
抗原の標識酵素にβ−D−グルコシダーゼ、基質にグル
コースオリゴマーを用いた場合には、検出試薬例1.2
のガラクトースオキシダーゼをグルコースオキシダーゼ
に代えたものを用いることができる。
コースオリゴマーを用いた場合には、検出試薬例1.2
のガラクトースオキシダーゼをグルコースオキシダーゼ
に代えたものを用いることができる。
β−D−グルコシダーゼCEC3,2,1,21)は従
来公知のものを用いることができる。
来公知のものを用いることができる。
グルコースオリゴマーはβ−D−グルコースよりなるオ
リゴマーが最も好ましく、次いで2−デオキシ−D−グ
ルコースが好ましい。
リゴマーが最も好ましく、次いで2−デオキシ−D−グ
ルコースが好ましい。
グルコースオキシダーゼとしては、馬場、和国、北村、
奥田編著「臨床酵素ハンドブック」(講談社、 198
2年)、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」 (朝食
書店、 1982年) 、 T、E、Barman著r
Enzyme Handbook J (Spring
er Verlag、1989年)等に記載のAspe
rgillus niger、 Penicilliu
mnotatum、 Penicillium ama
gasakiense等微生物起原のグルコースオキシ
ダ超厚(EC1,C3,4)を用いることができる。グ
ルコースオキシダーゼは必要に応じてその補酵素FAD
、鉄イオンとともに用いることができる。分析操作時
にpH4,0からpH8,0、好ましくはpH5,0か
らpH6,5の範囲に維持されるようにグルコースオキ
シダーゼが含有される層またはその隣接層等に公知のp
H緩衝剤を含有させることができる。グルコースオキシ
ダーゼの含有量は通常多層分析要素1m’当り約1千U
から約10万U、好ましくは約2千Uから約5万Uの範
囲である。
奥田編著「臨床酵素ハンドブック」(講談社、 198
2年)、丸尾、田宮監修「酵素ハンドブック」 (朝食
書店、 1982年) 、 T、E、Barman著r
Enzyme Handbook J (Spring
er Verlag、1989年)等に記載のAspe
rgillus niger、 Penicilliu
mnotatum、 Penicillium ama
gasakiense等微生物起原のグルコースオキシ
ダ超厚(EC1,C3,4)を用いることができる。グ
ルコースオキシダーゼは必要に応じてその補酵素FAD
、鉄イオンとともに用いることができる。分析操作時
にpH4,0からpH8,0、好ましくはpH5,0か
らpH6,5の範囲に維持されるようにグルコースオキ
シダーゼが含有される層またはその隣接層等に公知のp
H緩衝剤を含有させることができる。グルコースオキシ
ダーゼの含有量は通常多層分析要素1m’当り約1千U
から約10万U、好ましくは約2千Uから約5万Uの範
囲である。
爽区区粂上1
抗原の標識酵素にβ−アミラーゼ(EC3,2,1,2
)を、基質にデンプンを用いた場合には、特公昭58−
39f337に記載のアミラーゼ活性測定用呈色試薬組
成物を検出試薬としてもよい。
)を、基質にデンプンを用いた場合には、特公昭58−
39f337に記載のアミラーゼ活性測定用呈色試薬組
成物を検出試薬としてもよい。
なおこの場合デンプンとして水不溶性デンプンを用いれ
ば、この不溶性デンプン自体を担体かつ固定化基質とす
ることができ、本発明はこのようなものも包含する。
ば、この不溶性デンプン自体を担体かつ固定化基質とす
ることができ、本発明はこのようなものも包含する。
致11
本発明の一体型多層分析要素には液体試料を適用しての
分析操作実施時のpH値を6.5から8.0゜好ましく
は 7.0 から7.5の範囲の所望の値に緩衝でき
る公知の緩衝剤から適宜選択して含有させることができ
る。
分析操作実施時のpH値を6.5から8.0゜好ましく
は 7.0 から7.5の範囲の所望の値に緩衝でき
る公知の緩衝剤から適宜選択して含有させることができ
る。
用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学便覧 基
礎編」 (東京、丸首■、 19813年発行)131
2−1320頁、R,M、C,Dawson et a
t編rData forBiochemical Re
5earchJ第5earchJrd at theC
larendon Press、1969年発行) 4
?Ei−508頁、rBiochemistryJ 5
,46?頁以降(1966年) 、 rAnaly
tical BiochemistryJ104.30
0−310頁(1980年)等に記載のpH緩衝剤系が
ある。
礎編」 (東京、丸首■、 19813年発行)131
2−1320頁、R,M、C,Dawson et a
t編rData forBiochemical Re
5earchJ第5earchJrd at theC
larendon Press、1969年発行) 4
?Ei−508頁、rBiochemistryJ 5
,46?頁以降(1966年) 、 rAnaly
tical BiochemistryJ104.30
0−310頁(1980年)等に記載のpH緩衝剤系が
ある。
pH4,5から8.0の範囲のpHW衝剤の具体例とし
てトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris
)を含む緩衝剤:燐酸塩を含む緩衝剤;ホウ酸塩を含む
緩衝剤;クエン酸またはクエン酸塩を含む緩衝剤;グリ
シンを含む緩衝剤;リンゴ酸;コハク酸;マロン酸;酒
石酸;グルタル酸;3,3−ジメチルグルタル酸;、N
、N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bic
ine) ; N−2−ヒドロキシエチルピペラジン
−N”−2−エタンスルホン酸(HEPES) 。
てトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris
)を含む緩衝剤:燐酸塩を含む緩衝剤;ホウ酸塩を含む
緩衝剤;クエン酸またはクエン酸塩を含む緩衝剤;グリ
シンを含む緩衝剤;リンゴ酸;コハク酸;マロン酸;酒
石酸;グルタル酸;3,3−ジメチルグルタル酸;、N
、N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bic
ine) ; N−2−ヒドロキシエチルピペラジン
−N”−2−エタンスルホン酸(HEPES) 。
およびこれらのいずれかと必要により組合せられる酸、
アルカリまたは塩がある。好ましい緩衝剤の具体例とし
て、リンゴ酸;コハク酸;マロン酸;酒石酸;3,3−
ジメチルグルタル酸;燐酸二水素カリウム−燐酸水素二
ナトリウム; Tris−ホウ酸ナトリウム; Tri
s−ホウ酸ナトリウムーEDTA−2Na塩; Tri
s−クエン酸;酢酸−酢酸ナトリウム;クニン酸−燐酸
二水素ナトリウム; Bicine ;)!EPES等
がある。
アルカリまたは塩がある。好ましい緩衝剤の具体例とし
て、リンゴ酸;コハク酸;マロン酸;酒石酸;3,3−
ジメチルグルタル酸;燐酸二水素カリウム−燐酸水素二
ナトリウム; Tris−ホウ酸ナトリウム; Tri
s−ホウ酸ナトリウムーEDTA−2Na塩; Tri
s−クエン酸;酢酸−酢酸ナトリウム;クニン酸−燐酸
二水素ナトリウム; Bicine ;)!EPES等
がある。
一体1多層分析要素の製造方法
本発明の乾式多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。
の公知の方法により調製することができる。
本発明の多層分析要素は一辺約15mmから約30mm
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭57−28331 、実開昭56−14245
、特開昭57−83452 、実開昭58−32350
、特表昭58−501144等に記載のスライド枠に
収めて化学分析スライドとして用いることが、製造、包
装、輸送、保存、測定操作等の観点で好ましい。使用目
的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジン
に収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭57−28331 、実開昭56−14245
、特開昭57−83452 、実開昭58−32350
、特表昭58−501144等に記載のスライド枠に
収めて化学分析スライドとして用いることが、製造、包
装、輸送、保存、測定操作等の観点で好ましい。使用目
的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジン
に収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。
一体−1層 析戸素による被検物 tj法木本発明多層
分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の
操作により水性液体試料中の被検物(抗原)の定量分析
ができる。
分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の
操作により水性液体試料中の被検物(抗原)の定量分析
ができる。
まず被検物たる抗原と同じまたは少なくとも1以上の共
通する抗原決定決定基を有する抗原を用意し、この抗原
と酵素との結合体を作る。この結合体は前記した抗体と
担体とを結合する従来技により作ることができる。
通する抗原決定決定基を有する抗原を用意し、この抗原
と酵素との結合体を作る。この結合体は前記した抗体と
担体とを結合する従来技により作ることができる。
この抗原酵素複合体の水溶液と、被検物たる抗原を含む
全血、血漿、血清等の水性液体試料を混合し、この混合
液を約5g1〜約30.1、好ましくは8〜15.1を
反応層14に点着する。点着した多層分析要素を約5g
1〜約40°Cの範囲の−・定温度で、好ましくは37
°C近傍の一定温度で1〜10分間インキュベーション
すると、競争的抗原抗体反応で抗体に結合しなかった抗
原に結合された酵素のみが固定化基質を分解し、この分
解物は発色試薬層12に浸透・移動し、検出試薬を発色
させる。こうして試料液中の抗原量は、発色試薬層12
で生成した呈色物質(色素)量を透光性支持体10を通
して反射光学ミ誕度を測定することにより、比色法の原
理から定量することができる。なお本実施態様では色を
遮蔽する微粒子を反応層14に分散含有させたので、全
血などの有色試料液との混合液を用いて発色試薬層に侵
入できない赤血球等によって反射光学濃度の測定が妨害
されることはない。
全血、血漿、血清等の水性液体試料を混合し、この混合
液を約5g1〜約30.1、好ましくは8〜15.1を
反応層14に点着する。点着した多層分析要素を約5g
1〜約40°Cの範囲の−・定温度で、好ましくは37
°C近傍の一定温度で1〜10分間インキュベーション
すると、競争的抗原抗体反応で抗体に結合しなかった抗
原に結合された酵素のみが固定化基質を分解し、この分
解物は発色試薬層12に浸透・移動し、検出試薬を発色
させる。こうして試料液中の抗原量は、発色試薬層12
で生成した呈色物質(色素)量を透光性支持体10を通
して反射光学ミ誕度を測定することにより、比色法の原
理から定量することができる。なお本実施態様では色を
遮蔽する微粒子を反応層14に分散含有させたので、全
血などの有色試料液との混合液を用いて発色試薬層に侵
入できない赤血球等によって反射光学濃度の測定が妨害
されることはない。
(第2実施態様)
第2図は本発明の第2実施態様による多層分析要素であ
る。この実施態様では、反応層24は、担体に固定され
た抗体を含有する第1反応層24Aと、担体に固定され
た酵素基質を含有する第2反応層24Bとからなり1発
色試薬層22の上面を第2反応層24B、第1反応層2
4Aの順に積層している。
る。この実施態様では、反応層24は、担体に固定され
た抗体を含有する第1反応層24Aと、担体に固定され
た酵素基質を含有する第2反応層24Bとからなり1発
色試薬層22の上面を第2反応層24B、第1反応層2
4Aの順に積層している。
前記第1実施態様では同一反応層14内に固定化抗体と
固定化基質を混在させ、抗原・抗体間の親和力が極めて
大きいことを利用して抗原・酵素複合体を固定化抗体と
の結合する方向に乎衡をずらし、実質的にB/F分離す
るものであった。
固定化基質を混在させ、抗原・抗体間の親和力が極めて
大きいことを利用して抗原・酵素複合体を固定化抗体と
の結合する方向に乎衡をずらし、実質的にB/F分離す
るものであった。
これに対し第2実施態様は第1反応層24Aの固定体、
抗体に結合しなかった抗原・酵素複合体のみを第2反応
層24B内の固定化基質と反応させるものであり、物理
的なり/F分離を達成するものである。従って親和力の
差を利用した第1実施態様にくらべて、より完全にB/
F分離ができ、検出感度がさらに向上する。
抗体に結合しなかった抗原・酵素複合体のみを第2反応
層24B内の固定化基質と反応させるものであり、物理
的なり/F分離を達成するものである。従って親和力の
差を利用した第1実施態様にくらべて、より完全にB/
F分離ができ、検出感度がさらに向上する。
なお第2実施態様の多層分析要素の各構成物質は第1実
施態様と同じものを用いることができる。
施態様と同じものを用いることができる。
(第3実施態様)
第1実施態様の反応層14には予め抗原・酵素複合体を
含有させてもよい。この場合には被検物たる水性液体試
料をそのまま反応層14に点着すればよく、さらに簡便
に抗原量を定量測定することができる。
含有させてもよい。この場合には被検物たる水性液体試
料をそのまま反応層14に点着すればよく、さらに簡便
に抗原量を定量測定することができる。
なお水性液体試料点着前は、反応層14は乾燥保持され
ているから、反応層14内で抗原・酵素複合体中の酵素
と固定化基質とが反応することはない。′752実施態
様のように反応層24を第1反応層24Aと第2反応層
24Bとの2層にする場合は、固定化基質が含まれてい
ない第1反応層24Aのみに抗原・酵素複合体を含有さ
せておくのが好ましい。
ているから、反応層14内で抗原・酵素複合体中の酵素
と固定化基質とが反応することはない。′752実施態
様のように反応層24を第1反応層24Aと第2反応層
24Bとの2層にする場合は、固定化基質が含まれてい
ない第1反応層24Aのみに抗原・酵素複合体を含有さ
せておくのが好ましい。
(第4実施態様)
第1実施態様の発色試薬層12に予め抗原・酵素複合体
を含有させてもよい。
を含有させてもよい。
この場合は、反応層14に点着された水性液体試料が発
色試薬層12に浸透し、この発色試薬層12から反応層
14へ抗原・酵素複合体が移動する。すなわち、被検物
たる抗原は抗原・酵素複合体よりも早く固定化抗体と接
触することができ、単なる競争的抗原抗体反応の場合よ
りも優位に固定化抗体と結合できる。
色試薬層12に浸透し、この発色試薬層12から反応層
14へ抗原・酵素複合体が移動する。すなわち、被検物
たる抗原は抗原・酵素複合体よりも早く固定化抗体と接
触することができ、単なる競争的抗原抗体反応の場合よ
りも優位に固定化抗体と結合できる。
従ってこの第4実施態様によれば、より簡便に抗原量を
測定できるばかりでなく、S/N比に優れ、より鋭敏に
抗原を検出することが可能となる。
測定できるばかりでなく、S/N比に優れ、より鋭敏に
抗原を検出することが可能となる。
(第5実施態様)
第3,4実施態様のようにより簡便に測定するため、抗
原拳酵素複合体を含有する展開層を反応層14または第
1反応層24Aの上面に設けてもよい。
原拳酵素複合体を含有する展開層を反応層14または第
1反応層24Aの上面に設けてもよい。
この場合の展開層は、その上面に点着された水性液体試
料が展開層内を単位面積当り一定容量に分配されて反応
層14または第1反応層24Aに浸透・到達し、この反
応層14または第1反応層24Aに単位面積当り一定容
量の割合で供給する作用(展開作用またはメータリング
作用)を有するものであればよい。
料が展開層内を単位面積当り一定容量に分配されて反応
層14または第1反応層24Aに浸透・到達し、この反
応層14または第1反応層24Aに単位面積当り一定容
量の割合で供給する作用(展開作用またはメータリング
作用)を有するものであればよい。
展開層には、前記多孔性媒体に用いられる繊維質多孔性
シートや非繊維質多孔性シート等を用いることができる
。とくに織物、編物からなる布を点着する水性液体試料
の量を厳密に一定にする必要がなく、さらに簡便な操作
になるという効果もある。
シートや非繊維質多孔性シート等を用いることができる
。とくに織物、編物からなる布を点着する水性液体試料
の量を厳密に一定にする必要がなく、さらに簡便な操作
になるという効果もある。
以上の各実施態様では反応層と発色試薬層とを別の層と
したが、反応層と発色試薬層とを同一層にしてもよい。
したが、反応層と発色試薬層とを同一層にしてもよい。
例えば固定化抗体と固定化基質を保持する布に検出試薬
を含有するゼラチン等の親水性高分子を含浸・保持させ
たり、あるいは検出試薬を含浸・保持させたりすること
により反応層と発色試薬層を同一層にすることができる
。
を含有するゼラチン等の親水性高分子を含浸・保持させ
たり、あるいは検出試薬を含浸・保持させたりすること
により反応層と発色試薬層を同一層にすることができる
。
以上の実施態様では被検物を抗原とした場合の抗原定量
方法とその多層分析要素について説明したが、被検物を
抗体とした場合には、上記実施態様において固定化抗体
の代りに固定化抗原を、酵素と抗原との複合体の代りに
酵素と抗体との複合体を用いればよく、本発明はこれら
も包含するものである。
方法とその多層分析要素について説明したが、被検物を
抗体とした場合には、上記実施態様において固定化抗体
の代りに固定化抗原を、酵素と抗原との複合体の代りに
酵素と抗体との複合体を用いればよく、本発明はこれら
も包含するものである。
以下実施例により本発明をより詳細に説明する。
(実施例1)
(1) T4−MEM I D Aの調製T4(チロキ
シン)を抗原として用いる。低分子であるT4を酵素と
結合させるため、また効率よく抗T4抗体をつくるため
スペーサを導入したN−メチル−N−力ルボキシメチル
グリシルチロキシンメチルエステル(T4− ME M
I D A)を調製する。
シン)を抗原として用いる。低分子であるT4を酵素と
結合させるため、また効率よく抗T4抗体をつくるため
スペーサを導入したN−メチル−N−力ルボキシメチル
グリシルチロキシンメチルエステル(T4− ME M
I D A)を調製する。
チロキシンメチルエステル塩酸塩2 g’t 15m
9゜のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、これ
に500puのトリエチルアミンを加え一15°Cに冷
却下で、クロロギ酸イソブチル460g1を添加反応さ
せた。10分後に、この溶液にN−メチルイミノニ酢酸
0.55gをテトラヒドロフラン(THF)5mMに溶
解したものを加え、o′cで1o分間、さらに室温30
分間反応させた後、減圧濃縮した。この残存を50m
lのTHFに溶解し、さらに酢酸エチル150m文を加
え、振とう攪拌し、酢酸エチル層を分取した。これを蒸
留水で3回、飽和食塩水で1回洗浄し、酢酸エチル層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた
残存を20znQのTHFに溶解し、n−へキサンを少
量加え結晶化させた。結晶を濾別し減圧乾燥したところ
2.3gの標品を得た(収率68%)。
9゜のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、これ
に500puのトリエチルアミンを加え一15°Cに冷
却下で、クロロギ酸イソブチル460g1を添加反応さ
せた。10分後に、この溶液にN−メチルイミノニ酢酸
0.55gをテトラヒドロフラン(THF)5mMに溶
解したものを加え、o′cで1o分間、さらに室温30
分間反応させた後、減圧濃縮した。この残存を50m
lのTHFに溶解し、さらに酢酸エチル150m文を加
え、振とう攪拌し、酢酸エチル層を分取した。これを蒸
留水で3回、飽和食塩水で1回洗浄し、酢酸エチル層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた
残存を20znQのTHFに溶解し、n−へキサンを少
量加え結晶化させた。結晶を濾別し減圧乾燥したところ
2.3gの標品を得た(収率68%)。
(2)抗Ta(チロキシン)血清の調製上記(1)テ調
製り、りT4−MEMI DA 100mgを乾燥した
D M F 2.0m lに溶解し、これにN−ヒドロ
キシコハク酢イミド15mg加え、さらに25mgの1
−エチル−3−(3−ジメチルアミンプロピル)カルボ
ジイミド(ECDI)を水冷下に加え、4°Cで一夜反
応させた。この反応液を水冷下、牛血清アルブミン(マ
イルス・ラボラトリーズ製、フラツジ、7V)100m
gを含む 0.05M炭酸緩衝液(pH9,0) 20
m文中に滴下し、反応させた。この反応液を同じ緩衝液
に対し2日間透析(2MXA回)し、さらに蒸留水に対
し2日間(2uXA回)透析を行ない脱塩したのち凍結
乾燥し、固形分130m gを得た。この固形分を赤外
吸収スペクトルおよび塩酸加水分解後アルカリ中で紫外
吸収スペクトル測定したところ、牛血清アルブミン1分
子に対し約20個の74−MEM I D Aがハブテ
ンとして導入されたいることがわかった。
製り、りT4−MEMI DA 100mgを乾燥した
D M F 2.0m lに溶解し、これにN−ヒドロ
キシコハク酢イミド15mg加え、さらに25mgの1
−エチル−3−(3−ジメチルアミンプロピル)カルボ
ジイミド(ECDI)を水冷下に加え、4°Cで一夜反
応させた。この反応液を水冷下、牛血清アルブミン(マ
イルス・ラボラトリーズ製、フラツジ、7V)100m
gを含む 0.05M炭酸緩衝液(pH9,0) 20
m文中に滴下し、反応させた。この反応液を同じ緩衝液
に対し2日間透析(2MXA回)し、さらに蒸留水に対
し2日間(2uXA回)透析を行ない脱塩したのち凍結
乾燥し、固形分130m gを得た。この固形分を赤外
吸収スペクトルおよび塩酸加水分解後アルカリ中で紫外
吸収スペクトル測定したところ、牛血清アルブミン1分
子に対し約20個の74−MEM I D Aがハブテ
ンとして導入されたいることがわかった。
上記方法で得られた乾燥固形分を用い常法に従いウサギ
に免疫処理し、抗チロキシン(抗T4 )血清を得た。
に免疫処理し、抗チロキシン(抗T4 )血清を得た。
(3)T4−β−ガラクトシダーゼ複合体の調製(1)
で調製したT4− M E M I D A 50mg
をDMF2m文に溶解し、これを−15°c(ミ冷却下
、クロロ蟻酸イソブチルlJL文とトリエチルアミン8
glを加え混合した。β−D〜ガラクトシダーゼ(E、
C:oli由来: Sigma社製) 2.0 gを5
0 mM炭酸緩衝液(pH8,5) 10m文に溶解し
、水冷下でこれにT4−MEMI DA反応物を滴下反
応させた。2時間反応後、反応液を20mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液(pH8,5)に−・夜4°Cで透析し、さ
らに蒸留水で1日透析脱塩した。この脱塩溶液をセファ
ロースCL−4B (ファルマシア・ファインケミカル
ズ社製)を用いてクロマトグラフィーを行いT4−β−
ガラクトシダーゼ分画を得た。溶出には50 mM燐#
緩衝液(pH7,0)を用いた。
で調製したT4− M E M I D A 50mg
をDMF2m文に溶解し、これを−15°c(ミ冷却下
、クロロ蟻酸イソブチルlJL文とトリエチルアミン8
glを加え混合した。β−D〜ガラクトシダーゼ(E、
C:oli由来: Sigma社製) 2.0 gを5
0 mM炭酸緩衝液(pH8,5) 10m文に溶解し
、水冷下でこれにT4−MEMI DA反応物を滴下反
応させた。2時間反応後、反応液を20mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液(pH8,5)に−・夜4°Cで透析し、さ
らに蒸留水で1日透析脱塩した。この脱塩溶液をセファ
ロースCL−4B (ファルマシア・ファインケミカル
ズ社製)を用いてクロマトグラフィーを行いT4−β−
ガラクトシダーゼ分画を得た。溶出には50 mM燐#
緩衝液(pH7,0)を用いた。
(4)抗T4抗体固定化アガロースの調製水冷下、抗チ
ロキシン(T4)抗血清1.5m lに飽和硫安溶液1
m文を添加して、IgG分画を硫安沈殿させた。得られ
たIgG分画を透析脱塩して抗T4抗体とした。
ロキシン(T4)抗血清1.5m lに飽和硫安溶液1
m文を添加して、IgG分画を硫安沈殿させた。得られ
たIgG分画を透析脱塩して抗T4抗体とした。
アガロースとしてセファロースを用いた。
CNBr活性下セファロース4B(ファルマシア働ファ
インケミカルズ社製)15gを水100mAで膨潤させ
、グラスフィルタ上で0.0OIN塩酸2見で洗浄した
。次に、 0.1M重炭酸緩衝液(pH8,5、0,5
MNaCI含有)30mJlに溶解した上記抗T4抗体
1gGフラクションを、洗浄済のCNBr活性化セファ
ロース4Bに加え、4℃にて攪拌下16時間反応させた
。反応後、グラスフィルタ上で反応液を除去し、次に1
Mエタノールアミン(塩酸でpH8〜8.5に調製)5
0m文を加え、再び4°Cにて2〜5時間反応させた。
インケミカルズ社製)15gを水100mAで膨潤させ
、グラスフィルタ上で0.0OIN塩酸2見で洗浄した
。次に、 0.1M重炭酸緩衝液(pH8,5、0,5
MNaCI含有)30mJlに溶解した上記抗T4抗体
1gGフラクションを、洗浄済のCNBr活性化セファ
ロース4Bに加え、4℃にて攪拌下16時間反応させた
。反応後、グラスフィルタ上で反応液を除去し、次に1
Mエタノールアミン(塩酸でpH8〜8.5に調製)5
0m文を加え、再び4°Cにて2〜5時間反応させた。
次いでグラスフィルタ上で0.1M酢酸緩衝液pH4,
0(IMNaCI含有)と0.1Mホウ酸緩衝液pH8
,0(LMNaCl含有)で交互に3回ずつ洗浄した。
0(IMNaCI含有)と0.1Mホウ酸緩衝液pH8
,0(LMNaCl含有)で交互に3回ずつ洗浄した。
洗浄後、0.1Mグリシン緩衝液pH9,0(0,1M
Na引および0.1%アジ化ナトリウム含有)により1
mi中に、アガロース乾燥型ff1200gg含有する
ように懸濁液を調製した。
Na引および0.1%アジ化ナトリウム含有)により1
mi中に、アガロース乾燥型ff1200gg含有する
ように懸濁液を調製した。
(5)ガラクトースオリゴマー固定化アガロース常法(
生化学実験講座 4巻、日本生化学全編)により、ガラ
クトースのオリゴマーを合成した。
生化学実験講座 4巻、日本生化学全編)により、ガラ
クトースのオリゴマーを合成した。
このオリゴマーを(4)と同様の方法によりCNBr活
性化セファロース4Bと反応させ、アガロース(セファ
ロース)に固定化したガラクトースオリゴマーを調製し
た。さらにこの液を蒸留水で希釈し、1m文中に乾燥重
量200JLgのアガロースを含有するように調製した
。
性化セファロース4Bと反応させ、アガロース(セファ
ロース)に固定化したガラクトースオリゴマーを調製し
た。さらにこの液を蒸留水で希釈し、1m文中に乾燥重
量200JLgのアガロースを含有するように調製した
。
(Ei)Taの分析
下記の組成からなる発色液および試料液を調製した。
・発色液
オルトフェニレンジアミン 2 mg/m1H20
20,03% を含む0.1M Trs−HCI緩衝液 (pH8,
5)。
20,03% を含む0.1M Trs−HCI緩衝液 (pH8,
5)。
・試料液
ヒト血清アルブミン(Sigma社製)l mg/m1
1−アニリノナフタレン−8−スルホン酸ナトリウム
1 mg/m1T4−β−
ガラクトシダーゼ 10ルg /m1T4
0〜2 ILg/mlを含む0.1M
Trs−HCI緩衝液 (pH8,5)。
1 mg/m1T4−β−
ガラクトシダーゼ 10ルg /m1T4
0〜2 ILg/mlを含む0.1M
Trs−HCI緩衝液 (pH8,5)。
(4)で調製した抗T4抗体固定化アガロース懸濁液2
mM、(5)で調製したガラクトースオリゴマー固定化
アガロース懸濁液2mJ1.上記発色液0.5mJ1お
よび上記試料液0.5mJLを混合して反応液とした。
mM、(5)で調製したガラクトースオリゴマー固定化
アガロース懸濁液2mJ1.上記発色液0.5mJ1お
よび上記試料液0.5mJLを混合して反応液とした。
なおガラクトースオリゴマー固定化アガロース懸濁液の
代わりに、同濃度のガラクトースオリゴマー水溶液を用
いたものを比較用反応液とした。
代わりに、同濃度のガラクトースオリゴマー水溶液を用
いたものを比較用反応液とした。
この反応液と比較用反応液を25°C下、60分間転転
倒台して反応させた。2N硫酸2mMを加えて反応を停
止し、蛋白沈殿、アガロース等を遠心分離(3000r
pm、20分)して、その上清の490nmにおける吸
光度を測定した。その結果を以下の表に示す。
倒台して反応させた。2N硫酸2mMを加えて反応を停
止し、蛋白沈殿、アガロース等を遠心分離(3000r
pm、20分)して、その上清の490nmにおける吸
光度を測定した。その結果を以下の表に示す。
0 0.35 0.680.04
0.38 0.690.12 0
.42 0.700.36 0.48
0.702.0 0.52 0.72
このように抗体と酵素基質双方が固定化されると、抗原
・酵素複合体の酵素活性が減少すること、すなわち固定
化抗体に結合した抗原会酵素複合体(B)と未結合の抗
原・酵素複合体(F)とを物理的にB/F分離しなくて
も、これらは微視的にB/F分離でき、同−溶液内にB
/F分敲したものとして検出できることが示された。
0.38 0.690.12 0
.42 0.700.36 0.48
0.702.0 0.52 0.72
このように抗体と酵素基質双方が固定化されると、抗原
・酵素複合体の酵素活性が減少すること、すなわち固定
化抗体に結合した抗原会酵素複合体(B)と未結合の抗
原・酵素複合体(F)とを物理的にB/F分離しなくて
も、これらは微視的にB/F分離でき、同−溶液内にB
/F分敲したものとして検出できることが示された。
また競争的抗原抗体反応により生じる酵素活性の差とし
て、抗原を検出できることが示された。
て、抗原を検出できることが示された。
(実施例2)
(1)検出シート(試′層)の作製
ゼラチン用の下塗処理を施した厚さ185 gmの無色
透明ポリエチレンテレフタレー) (PET)フィルム
上に下記組成からなるガラクトース定量用の試薬層を乾
燥後の厚さがおよそ15gmになるように塗布した。
透明ポリエチレンテレフタレー) (PET)フィルム
上に下記組成からなるガラクトース定量用の試薬層を乾
燥後の厚さがおよそ15gmになるように塗布した。
ガラクトースオキシダーゼ 2重量部ペルオキシダ
ーゼ 1重量部1.7−シヒドロキシナフ
タレン 5重量部4−アミノアンチピリン
5重量部アルカリ処理ゼラチン 200重量部ノニ
オンHS210(日本油脂■製セフ剤:ポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテル)2重帯部 この試薬層の上に更に乾燥ゼラチン1に対して二酸化チ
タン微粉末8(重量比)の割合で混合された水分散液を
用いて色遮蔽層を乾燥後の厚さがおよそ15gmになる
ように塗布し、更にその旧に0.2%ノニオン界面活性
剤(H3210)を含むゼラチン層を乾燥後の厚さが約
5gmになるように塗布し、検出シート(発色試薬層)
とした。
ーゼ 1重量部1.7−シヒドロキシナフ
タレン 5重量部4−アミノアンチピリン
5重量部アルカリ処理ゼラチン 200重量部ノニ
オンHS210(日本油脂■製セフ剤:ポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテル)2重帯部 この試薬層の上に更に乾燥ゼラチン1に対して二酸化チ
タン微粉末8(重量比)の割合で混合された水分散液を
用いて色遮蔽層を乾燥後の厚さがおよそ15gmになる
ように塗布し、更にその旧に0.2%ノニオン界面活性
剤(H3210)を含むゼラチン層を乾燥後の厚さが約
5gmになるように塗布し、検出シート(発色試薬層)
とした。
(2)反応シート(反応層)の作製
ガラス繊維濾紙GA−100(東洋濾紙製)2gを3m
m角に切って、400mMの水中でホモゲナイザー(日
本精機製)にかけて分散させた(15000rpm、
10分間)。分散物を2 m / m角及び1m/m角
のステンレス製メツシュで順にこしわけ、1 m /
mメツシュ上のガラス繊維を0.1Mグリシ75衝液p
H9,0(0,5MNaC1含有)500mlに分散さ
せた。この液の一定容量を取り、メンブレンフィルター
でガラス繊維をこしとり、水切り乾燥後、秤量してガラ
ス#Il維濃度(m g/mfL)を測定した。
m角に切って、400mMの水中でホモゲナイザー(日
本精機製)にかけて分散させた(15000rpm、
10分間)。分散物を2 m / m角及び1m/m角
のステンレス製メツシュで順にこしわけ、1 m /
mメツシュ上のガラス繊維を0.1Mグリシ75衝液p
H9,0(0,5MNaC1含有)500mlに分散さ
せた。この液の一定容量を取り、メンブレンフィルター
でガラス繊維をこしとり、水切り乾燥後、秤量してガラ
ス#Il維濃度(m g/mfL)を測定した。
上記の分散液からガラス繊維30 m gを含む容量を
ビーカーにはかり取り、これに実施例1の(4)で調製
した抗T4抗体固定化アガロース懸濁液1m文および実
施例1の(5)で調製したガラクトースオリゴマー固定
化アガロース懸濁液1m4Qをよく混合し、この混合液
をメンブレンフィルター濾過器(フィルター二ミリボア
社製HAWPO,457pm孔径、47mmφ)上に展
開、抄紙し反応シート(反応層)とした。
ビーカーにはかり取り、これに実施例1の(4)で調製
した抗T4抗体固定化アガロース懸濁液1m文および実
施例1の(5)で調製したガラクトースオリゴマー固定
化アガロース懸濁液1m4Qをよく混合し、この混合液
をメンブレンフィルター濾過器(フィルター二ミリボア
社製HAWPO,457pm孔径、47mmφ)上に展
開、抄紙し反応シート(反応層)とした。
なお抗T4抗体固定化アガロースのかわりに7ガロース
(セファロース4B)を用いたものを比較用検出シート
とした。
(セファロース4B)を用いたものを比較用検出シート
とした。
(3)多層分析要素の作製
(1)、(2)で作製した反応シート及び検出シートを
直径12mmの円に裁断した後、検出シートのPETフ
ィルムとは反対側に反応シートを重ね、多層分析要素を
作製した。
直径12mmの円に裁断した後、検出シートのPETフ
ィルムとは反対側に反応シートを重ね、多層分析要素を
作製した。
さらに比較用反応シートを用いて同様に比較用多層分析
要素を作製した。
要素を作製した。
(4)工り立見!
下記の成分を含有するO、1Mグリシンン緩衝液(pH
8)を作り試料液とした。
8)を作り試料液とした。
ヒト血清アルブミン(Siga+a社製)1mg/mu
l−アニリノナフタレン−8−スルホン酸ナトリウム
1 m g / m文T4−β
−ガラクトシダーゼ複合体 50絡g/m文 T a O〜l OJj、g
/ m 1この試料液100ル文を(3)で作製した多
層分析要素に点着し、この多層分析要素を37°Cで8
分間インキュベーション後、PETフィルム側から中心
波長500nmの可視光で反射光学濃度を測定した。
l−アニリノナフタレン−8−スルホン酸ナトリウム
1 m g / m文T4−β
−ガラクトシダーゼ複合体 50絡g/m文 T a O〜l OJj、g
/ m 1この試料液100ル文を(3)で作製した多
層分析要素に点着し、この多層分析要素を37°Cで8
分間インキュベーション後、PETフィルム側から中心
波長500nmの可視光で反射光学濃度を測定した。
測定結果を第3図に示す。本実施例の多層分析要素は図
中の工で示されるようにT4e度変化に対応して反射光
学濃度が変化し、T4を定量するための検量線を作成す
ることができた。このように本発明の多層分析要素を用
いることによりB/F分離操作をすることなくT4 を
きわめて短時間で測定できた。また従来発明のように酵
素活性の阻害率等を測定するのではなく、酵素活性その
ものから定量するので検出感度に優れている。
中の工で示されるようにT4e度変化に対応して反射光
学濃度が変化し、T4を定量するための検量線を作成す
ることができた。このように本発明の多層分析要素を用
いることによりB/F分離操作をすることなくT4 を
きわめて短時間で測定できた。また従来発明のように酵
素活性の阻害率等を測定するのではなく、酵素活性その
ものから定量するので検出感度に優れている。
なお第3図のII (黒丸)は比較用多層分析要素の実
験結果である。
験結果である。
(発明の効果)
以りのように本発明の免疫反応物定量用多層分析要素は
、被免疫反応物(抗体または抗原)と基質とを別の担体
に固定化・含有した反応層で被検物たる免疫反応物(抗
原または抗体)と、この免疫反応物と酵素との複合体と
を競争反応させ固定化被免疫反応物と結合しなかった免
疫反応物・酵素複合体の酵素活性のみを測定するように
したので、少量の試料で筒便かつ短時間に感度よく免疫
反応物を定量測定することができる。
、被免疫反応物(抗体または抗原)と基質とを別の担体
に固定化・含有した反応層で被検物たる免疫反応物(抗
原または抗体)と、この免疫反応物と酵素との複合体と
を競争反応させ固定化被免疫反応物と結合しなかった免
疫反応物・酵素複合体の酵素活性のみを測定するように
したので、少量の試料で筒便かつ短時間に感度よく免疫
反応物を定量測定することができる。
第1図は本発明の一実施態様による多層分析要素の断面
図、第2図は他の実施態様による多層分析要素の断面図
、第3図は実施例のJl11定結果を示す図である。 10.20・・・透光性支持体、 12.22・・・親水性高分子をバインダーとして含有
する発色試薬層 14.24・・・多孔性媒体からなる反応層。 特許出願人 富士写真フィルム株式会社代 理 人 弁
理士 山 1)文 雄 第3図 T4濃度兜9bnl)
図、第2図は他の実施態様による多層分析要素の断面図
、第3図は実施例のJl11定結果を示す図である。 10.20・・・透光性支持体、 12.22・・・親水性高分子をバインダーとして含有
する発色試薬層 14.24・・・多孔性媒体からなる反応層。 特許出願人 富士写真フィルム株式会社代 理 人 弁
理士 山 1)文 雄 第3図 T4濃度兜9bnl)
Claims (15)
- (1)水不透過性透光性支持体と、この支持体の片面に
設けられた親水性高分子をバインダーとして含有する発
色試薬層と、この発色試薬層を被覆する多孔性媒体から
なる反応層とを備え、 前記反応層は、不溶性担体に固定された被免疫反応物と
、別の不溶性担体に固定された酵素基質とを含有し、 前記発色試薬層は、前記反応層内で前記酵素基質より生
成される酵素反応生成物を検出して発色する検出試薬を
含有していることを特徴とする免疫反応物定量用多層分
析要素。 - (2)前記反応層が、前記酵素基質と反応する酵素と免
疫反応物との複合体を含有していることを特徴とする特
許請求の範囲第1項記載の免疫反応物定量用多層分析要
素。 - (3)前記発色試薬層が、前記酵素基質と反応する酵素
と免疫反応物との複合体を含有していることを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の免疫反応物定量用多層分
析要素。 - (4)前記反応層の上面は、前記酵素基質と反応する酵
素と免疫反応物との複合体を含有する展開層で被覆され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の免
疫反応物定量用多層分析要素。 - (5)前記免疫反応物が抗原であり、前記被免疫反応物
が抗体である特許請求の範囲第1〜4項のいずれかに記
載の免疫反応物定量用多層分析要素。 - (6)前記免疫反応物が抗体であり、前記被免疫反応物
が抗原である特許請求の範囲第1〜4項のいずれかに記
載の免疫反応物定量用多層分析要素。 - (7)前記反応層が、不溶性担体に固定化された被免疫
反応物を含有する第1反応層と、不溶性担体に固定化さ
れた酵素基質を含有する第2反応層とからなり、前記発
色試薬層の上を第2反応層、第1反応層の順に被覆して
いる特許請求の範囲第1、3、4項のいずれかに記載の
免疫反応物定量用多層分析要素。 - (8)前記反応層が、前記酵素基質と反応する酵素と免
疫反応物との複合体および不溶性担体に固定化された被
免疫反応物を含有する第1反応層と、不溶性担体に固定
化された酵素基質を含有する第2反応層とからなり、前
記発色試薬層の上を第2反応層、第1反応層の順に被覆
している特許請求の範囲第2項に記載の免疫反応物定量
用多層分析要素。 - (9)前記免疫反応物が抗原であり、前記被免疫反応物
が抗体である特許請求の範囲第7項または第8項に記載
の免疫反応物定量用多層分析要素。 - (10)前記免疫反応物が抗体であり、前記被免疫反応
物が抗原である特許請求の範囲第7項または第8項に記
載の免疫反応物定量用多層分析要素。 - (11)前記反応層が、色を遮蔽する微粒子を含有して
いる特許請求の範囲第1〜6項のいずれかに記載の免疫
反応物定量用多層分析要素。 - (12)前記第2反応層が、色を遮蔽する微粒子を含有
している特許請求の範囲第7〜10項記載の免疫反応物
定量用多層分析要素。 - (13)前記多孔性媒体が、繊維質多孔性媒体である特
許請求の範囲第1〜12項のいずれかに記載の免疫反応
物定量用多層分析要素。 - (14)前記多孔性媒体が、非繊維質多孔性媒体である
特許請求の範囲第1〜12項のいずれかに記載の免疫反
応物定量用多層分析要素。 - (15)前記多孔性媒体が、前記不溶性担体によって構
成されている特許請求の範囲第1〜12項いずれかに記
載の免疫反応物定量用多層分析要素。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61033988A JPH0814582B2 (ja) | 1986-02-20 | 1986-02-20 | 免疫反応物定量用多層分析要素 |
DE8787101884T DE3765138D1 (de) | 1986-02-20 | 1987-02-11 | Mehrschichtiges element zur quantitativen analyse von immunoreagenzien. |
EP87101884A EP0236768B1 (en) | 1986-02-20 | 1987-02-11 | Multi-layered element for quantitative analysis of immuno-reactant |
US07/015,916 US4975366A (en) | 1986-02-20 | 1987-02-18 | Multi-layered element for quantititative analysis of immuno reactant |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61033988A JPH0814582B2 (ja) | 1986-02-20 | 1986-02-20 | 免疫反応物定量用多層分析要素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62192663A true JPS62192663A (ja) | 1987-08-24 |
JPH0814582B2 JPH0814582B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=12401860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61033988A Expired - Fee Related JPH0814582B2 (ja) | 1986-02-20 | 1986-02-20 | 免疫反応物定量用多層分析要素 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4975366A (ja) |
EP (1) | EP0236768B1 (ja) |
JP (1) | JPH0814582B2 (ja) |
DE (1) | DE3765138D1 (ja) |
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