JP2014501526A - アッセイ法 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料中のハプトグロビン濃度の定量アッセイ法において、（ｉ）ヘモグロビンをアッセイ対象試料と混合して、試料中に存在するハプトグロビンでハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成させるステップと、（ｉｉ）過酸化水素が試薬から生成され、存在するハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性の基質を形成し、緩衝液のｐＨが、複合体を形成していない任意のヘモグロビンのペルオキシジス活性が実質的に抑制されるには十分に低いが過酸化水素の生成が起こるには十分に高い範囲内であるという条件下で、緩衝液の存在下で、ステップ（ｉ）の生成物を、過酸化水素を生成する前記試薬と、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光学的に検出可能な変化をする１種又は複数種の色原体とに接触させるステップと、（ｉｉｉ）反応混合物の光学的性質における変化を測定することによって、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性を定量するステップと、（ｉｖ）ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性のレベルを試料中のハプトグロビンの量と関連づけるステップとを含むアッセイ法を提供する。かかる方法で使用するためのキットも提供される。

Description

本発明は、試料中のハプトグロビン濃度の定量アッセイ及びその定量用キットに関する。本発明は、特に、試薬を表面に乾燥させてからアッセイを実施する、乾燥形式で行うのに容易に適応可能なハプトグロビン濃度の定量アッセイに関する。

ハプトグロビンはタンパク質群の１つで、急性期タンパク質として知られ、その濃度は、感染症、炎症又は外傷によって顕著に上昇する。したがって、血漿中のハプトグロビン濃度を測定すると、試料を提供するヒト又は動物の健康状態に関して貴重な診断情報が得られるため、当該技術分野において、血漿、血清及び他の生体液中のハプトグロビンのアッセイを開発することについて高い関心が寄せられている。

試料中のハプトグロビン濃度を定量するために現在使用されているアッセイは、一般的に、免疫測定法又はハプトグロビンがヘモグロビンに結合する能力に依拠するヘモグロビン結合アッセイに基づいている。

ハプトグロビンに特異的な抗血清を用いる、抗体に基づいた方法を利用する免疫測定法が開発されており、当該技術分野において公知である。かかるアッセイは、共通して免疫比濁法に基づくものであり、ハプトグロビン濃度は、溶液中の抗体−ハプトグロビン凝結物の形成の測定によって定量される。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）はかかるアッセイの別の一般的な実施形態である。しかし、かかる免疫測定法は抗血清の継続的な供給を必要とするだけでなく、試験は検査中の個々の種毎に検証されなければならず、免疫測定法に基づいた方法は商業的に魅力の劣るものとなっている。

ハプトグロビンがヘモグロビンに結合する能力に基づくアッセイは、現在日常的に獣医の診断施設で使用されている。この方法は、必要な試薬が抗体に基づいた方法より安価であるため、経済的な実行可能度が高く、全ての種に対して実施することもできる。

欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書では、ヘモグロビンと結合するハプトグロビンの内在的活性を活用する、ヘモグロビン結合アッセイ系について記載されている。低ｐＨでは、得られるハプトグロビン−ヘモグロビン複合体はペルオキシダーゼ活性を保持しているが、非結合のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性は不活化されている。ペルオキシダーゼ活性を検出することによって、存在する複合したヘモグロビンの量、及びそれゆえに試料のハプトグロビン含有量を定量することができる。欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書に記載されているアッセイ系では、タンパク質結合阻害剤及びジスルフィド結合を抑える効果のある還元剤並びに／又はカオトロピック剤などの試薬を使用して、低血中濃度のハプトグロビンではアッセイに支障を来す血清アルブミンのペルオキシダーゼ活性を抑制する。

これまでに記載されたヘモグロビン結合アッセイ、例えば上記の欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書に記載されたアッセイに関連する主な不利点は、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性の基質として過酸化水素を必要とすることである。過酸化水素は高反応性で、アッセイ中に他の構成成分を酸化させるのを防止するために安定化が必要である。このため、アッセイの実用性が制限されるだけでなく、アッセイはドライケミストリー（ｄｒｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方式、例えば視覚的評価又は器具に基づいた評価用の「ディップスティック」装置などに適応することができない。

米国特許第４６９５５５２号明細書は、遊離ヘモグロビンの存在下でヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を定量する方法を記載しており、この方法はペルオキシダーゼ活性を定量するものである。しかし、ペルオキシダーゼ活性の基材は過酸化水素である。過酸化水素は、特開平２−２０８５６８号公報に記載されたハプトグロビン定量方法において、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと一緒に試薬としても使用されている。

したがって、従来技術のアッセイ法に関連する問題を克服する、試料中のハプトグロビン濃度を定量するための改良型アッセイの必要性が継続的に存続している。

本発明は、試料中のハプトグロビン濃度の定量アッセイ法において、
（ｉ）ヘモグロビンをアッセイ対象試料と混合して、試料中に存在するハプトグロビンでハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成させるステップと、
（ｉｉ）過酸化水素が試薬から生成され、存在するハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシジス（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）活性の基質を形成し、緩衝液のｐＨが、複合体を形成していない任意のヘモグロビンのペルオキシジス活性が実質的に抑制されるには十分に低いが過酸化水素の生成が起こるには十分に高い範囲内であるという条件下で、
緩衝液の存在下で、ステップ（ｉ）の生成物を、過酸化水素を生成する前記試薬と、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に光学的に検出可能な変化をする１種又は複数種の色原体とに接触させるステップと、
（ｉｉｉ）反応混合物の光学的性質における変化を測定することによって、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性を定量するステップと、
（ｉｖ）ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性のレベルを試料中のハプトグロビンの量と関連づけるステップと
を含むアッセイ法を提供する。

好適には、上記の方法において、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）は、例えばアッセイ対象試料、ヘモグロビン、過酸化水素を生成する試薬、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光学的に検出可能な変化をする１種又は複数種の色原体、及び好適な緩衝液の全てを含有する反応混合物を形成することによって、同時に実施される。

本発明は、ヘモグロビン、過酸化水素を生成する試薬、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に光学的に検出可能な変化をする１種又は複数種の色原体及び緩衝液を含む、本発明によるハプトグロビンアッセイで使用するためのキットも提供する。

本発明によって提供される試料中のハプトグロビン濃度の定量アッセイ法は、ハプトグロビンと複合体を形成したヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を定量することによって、ヘモグロビンと結合するハプトグロビンの内在的活性を活用するが、このペルオキシダーゼ活性の基質を用意するために過酸化水素を試薬として含む必要性を回避する。過酸化水素基質がｉｎ ｓｉｔｕで生成する、過酸化物を加えないハプトグロビン用のアッセイの開発は、不安定で高活性の過酸化水素が試薬として直接使用される場合にアッセイに課される実質的な制限を回避するため、特に有利であり、これによって、アッセイの使用が広範囲の状況及びアッセイ形式において容易になる。

本発明によるアッセイ法は、任意の動物の、血漿又は血清などの血液試料で好適に実施することができる。或いは、アッセイで使用する試料は、腹腔液、滑液、脳脊髄液乳汁などの他の生体液を含んでもよい。一実施形態では、試料はヒトを含む哺乳動物から得ることができる。

一実施形態では、試料中のハプトグロビン濃度は０．０２ｍｇ／ｍｌ〜１．４ｍｇ／ｍｌの範囲である。

本発明によるアッセイ法で使用するヘモグロビンは、アッセイ用の試料を得るのと同じ動物から得てもよいし、異なる種から得てもよい。

一実施形態では、ヘモグロビンはメト−ヘモグロビンである。

本発明によるアッセイ法において、試料中のハプトグロビン及び添加されたヘモグロビンは一緒に反応してハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成する。

一実施形態では、アッセイ反応混合物は、２０分まで、例えば５〜２０分間インキュベートされる。

本発明の方法によるハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の形成は、反応混合物の光学的性質の変化を測定することで、複合体のペルオキシダーゼ活性を定量することによって検出される。その後、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性のレベルは、試料中のハプトグロビンの量と関連づけることができる。

本発明によるアッセイ法では、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性は、アッセイ中にｉｎ ｓｉｔｕで過酸化水素を生成して複合体のペルオキシダーゼ活性の基質を形成し、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光学的に検出可能な変化をする色原体を使用してペルオキシダーゼ活性を検出することによって定量される。

本発明に従って使用するための過酸化水素を生成する試薬は、反応生成物として過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を、その酵素の基質とともに、好適には含む。

本発明の一実施形態では、過酸化水素を生成する試薬は、酵素グルコースオキシダーゼ及び基質グルコースを含む。

当然ながら、アッセイ中にｉｎ ｓｉｔｕで過酸化水素を生成するために、他の好適な酵素／基質の組合せを使用することができる。当該技術分野において慣用の、過酸化水素を生成する任意の酵素／基質の組合せ、例えばコレステロール／コレステロールオキシダーゼ又は尿素／尿素オキシダーゼなどを使用することができる。

ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光学的に検出可能な変化をする色原体は当該技術分野において周知であり、例えば、上記の欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書に記載されている。

ヘモグロビン濃度の検査用として当該技術分野において公知の任意の発色基質を、本発明によるアッセイで好都合には使用することができる。一実施形態では、本発明によるアッセイのヘモグロビン−ハプトグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性は、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光光度的に検出できる色変化をする、以下の色原体を使用して定量される。例えばフェノール、４−ヨードフェノール、３−アミノフェノゾン（ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｚｏｎｅ）、８−アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４−アミノアンチピリン（ＡＡＰ）、２−アミノ−４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＡＨＢＳ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩、Ｏ−ジアニシジン、ナトリウム−２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスルホナート、２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）又はこれらの混合物などである。

一実施形態では、本発明によるアッセイで使用する発色基質は、フェノールと８−アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）と４−アミノアンチピリンとの組合せを含む。

検出可能な色変化は、当該技術分野において慣用の種々の濃度範囲で存在する色原体によって検出することができる。

ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性とｉｎ ｓｉｔｕで過酸化水素を生成する試薬の活性の双方ともｐＨ依存的であり、したがって、本発明が取り組む課題は、双方の活性が有効であるｐＨ範囲を見出すことである。

複合体を形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が低ｐＨで不活化できることは、当該技術から既知である。Ｊｐｎ．Ｊ Ｖｅｔ．Ｓｃｉ，４４，ｐ１５〜２１（１９８２）で報告されているように、この活性は、ｐＨ４．１で不活化することができる。しかし、遊離ヘモグロビンから発生するペルオキシダーゼ活性はかかるｐＨで残存することがあると示唆されており、上記の欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書に記載されているアッセイは、好ましくはｐＨ４．１未満、特にｐＨ３．８で実施される。

しかし、本発明者らは、ｐＨ３．９〜４．５の範囲の緩衝液の存在下で本発明のアッセイ法を実施することによって、アッセイ混合物中に残存する、複合体を形成していない任意のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が、ｉｎ ｓｉｔｕでの過酸化水素の生成を阻害することなく、実質的に抑制されうることを発見した。

一実施形態では、本発明によるアッセイ法はｐＨ４〜４．５の範囲の緩衝液の存在下で実施される。

特定の実施形態では、本発明のアッセイ法はｐＨ４．１で実施される。

当該技術分野において慣用の、任意の緩衝液を使用して、アッセイ用に所望するｐＨを維持することができる。好都合には、混合したクエン酸−リン酸緩衝液を使用することができる。これはリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）とが所望のｐＨに滴定されているものである。

欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書から、血液試料中に存在するアルブミン及び他のタンパク質が、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の本来のペルオキシダーゼ活性に依拠するハプトグロビンアッセイに対して望ましくない「ペルオキシダーゼ効果」を及ぼすことが知られている。

したがって、一実施形態では、本発明のアッセイ法は、試料中の任意のアルブミン又は他のタンパク質によるペルオキシダーゼ効果を低減するための１種又は複数種の追加の試薬の存在下で実施される。当然ながら、かかる追加の１種又は複数種の試薬は、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の形成を実質的に阻害するには不十分な量で添加されることになろう。

試料中の任意のアルブミン又は他のタンパク質によるペルオキシダーゼ効果を低減するための好適な追加の試薬は、欧州特許第１０３１０３５Ｂ１号明細書に記載されている通りであり、例えば、タンパク質結合阻害剤、ジスルフィド結合を抑える効果のある還元剤及びカオトロピック剤を含む。

一実施形態では、追加の１種又は複数種の試薬は濃度０．１〜０．５ｍＭで存在することができる。

一実施形態では、本発明によるアッセイ法は、８−アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、プロトポリリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｈｙｒｉｎ）、ビリルビン、タウロデオキシコール酸（胆汁塩）、ジクマロール又は２−メルカプトベンゾチアゾールなどのタンパク質結合阻害剤の存在下で実施される。

別の実施形態では、ジスルフィド結合を抑える効果のある追加の還元剤は、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、４，４’−ジチオピリジン又は５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸）から選択される。

別の実施形態では、本発明によるアッセイ法は、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム又は塩化ナトリウムなどの好適なカオトロピック剤の存在下で実施される。

本発明によるアッセイは、好適には、溶液中の他の構成成分を維持するのを助けるために界面活性剤をさらに含む。

一実施形態では、界面活性剤は、アッセイ混合物に、低濃度で、好適には０．３％（ｖ／ｖ）までの量で添加される。

使用することができる好適な界面活性剤には、当該技術分野において慣用の非イオン界面活性剤及びイオン界面活性剤が含まれる。

一実施形態では、アッセイ混合物に添加するための界面活性剤には、非イオン界面活性剤、例えばポリオキシレンソルビトールエステル（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０）、ポリオキシエチレンアルコール（例えばＢｒｉｊ（商標）３５，３６）又はこれらの混合物などが含まれる。

別の実施形態では、界面活性剤は、１種又は複数種のイオン界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム又はセトリミドなどを含む。

当然ながら、色原体における分光学的に検出可能な変化がアッセイの開始前に発生しないという条件で、アッセイ試薬は任意の順序で一緒に添加することができる。例えば、試薬を種々の安定した組合せで予め混合し、試料と一緒にしてアッセイを実施することができる。

抗菌剤を、試薬又は試薬混合物のうち１種又は複数種とともに含めて、防腐剤として作用させることができる。好適な成分には、例えば、トリクロサン又はチオメルサラートが含まれる。

一実施形態では、第１の試薬混合物及び第２の試薬混合物が用意され、アッセイは、アッセイ対象試料と第１の試薬混合物及び第２の試薬混合物との混合物を形成することによって実施される。

一実施形態では、第１の試薬混合物は、ヘモグロビン、及び過酸化水素を反応生成物として生成する反応を触媒する酵素を含み、第２の試薬混合物は、１種又は複数種の色原体及び第１の混合物の酵素の基質を含む。好適には、酵素はグルコースオキシダーゼを含み、酵素の基質はグルコースを含む。

別の実施形態では、１種又は複数種の色原体は、第１の試薬混合物中に、ヘモグロビン、及び過酸化水素を反応生成物として生成する反応を触媒する酵素とともに含まれる。

一実施形態では、アッセイを実施するために、構成成分としてのアッセイ試薬の一部又は全部を乾燥形態で組み合わせ、次いで水性試料に添加することができる。

好適には、アッセイ試薬の組合せは、溶液で調製され、紙又はアッセイスティックなどの固体表面上に凍結乾燥させることができる。

このような乾燥形式は、保管及び携帯に特に便利であり、これは試薬の１つとして過酸化水素が必要である場合には実現することができないため、従来技術の方法と比較すると本発明の方法にとって顕著な利点である。

本発明によるアッセイ法において定量した、形成したハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性レベルは、既知のハプトグロビン濃度を使用して作成した標準曲線を参照して、試料中のハプトグロビン濃度と関連づけることができる。

本発明による方法で使用するキットは、好適には、既知のハプトグロビン濃度を伴う血清の標準物などのさらなる構成成分を含むことができる。

一実施形態では、本発明によるアッセイ法は、試験管又はマイクロタイタープレートなどの器具を使用して好適に実施することができる。別法として、アッセイは生化学自動分析装置を使用して実施することができる。

本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」並びにこれらの単語の変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれらに限定されない」を意味し、他の部分、添加物、構成成分、整数又はステップを排除するものではない。

本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味が要求されない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞を使用する場合、文脈上他の意味が要求されない限り、本明細書は単数形のみならず複数形も企図しているものと理解されるべきである。

本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して説明される通りとする場合がある。本発明の他の特徴は以下の実施例から明らかになるであろう。

概して、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面のいずれも含む）に開示する特徴の、任意の新規な１つ、又は任意の新規な組合せにも適用される。したがって、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と関連して記載する特徴、整数、特性、化合物、化学的部分又は化学基は、本明細書に記載する任意の他の態様、実施形態又は実施例と矛盾するものではない限り、これらに適用可能であると理解されるべきである。

さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示するいずれの特徴も、同一の又は同様の目的にかなう代替の特徴で置き換えることができる。

以下に、本発明を、以下の非限定的実施例を参照しながらさらに例示することにする。

以下の溶液及び一般的な手順を使用した。

ストック溶液：
試薬Ａ：ヘモグロビン及びグルコースオキシダーゼ

リン酸緩衝液０．０５Ｍ ｐＨ７．４
マキムラ（Ｍａｋｉｍｕｒａ）及びススキ（Ｓｕｓｕｋｉ）、（１９８２．Ｊａｐ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ ４４：１５〜２１）に従って調製した、ウマヘモグロビン３０ｍｇ／ｍｌの超純水溶液
グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝溶液

試薬Ｂ：色原体／グルコース

ストック溶液：
クエン酸緩衝液０．５Ｍ、ｐＨ３．８
リン酸緩衝液０．０５Ｍ、ｐＨ７．４
塩化ナトリウム０．１５Ｍ、１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０（生理食塩水／ｔｗｅｅｎ）
４−アミノアンチピリン（ＡＡＰ）１５８ｍＭの生理食塩水／ｔｗｅｅｎ溶液
８−アニリノ−１−ナフタリン（ｎａｐｈｔｈａｌｉｎｅ）スルホン酸（ＡＮＳ） ３３ｍＭの生理食塩水／ｔｗｅｅｎ溶液
フェノール１．１Ｍの生理食塩水／ｔｗｅｅｎ溶液
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）６５ｍＭの生理食塩水／ｔｗｅｅｎ溶液
システイン（Ｃｙｓ）１２９．６５ｍＭの生理食塩水／ｔｗｅｅｎ溶液
グルコース（Ｇｌｕ）０．５Ｍのリン酸緩衝溶液

試料
ブランクとしての水
陰性対照血清としてのウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｓｉｇｍａ）
陰性対照としてのウシ血清アルブミン２％（ｗ／ｖ）（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）
ハプトグロビンを１．４ｍｇ／ｍｌで含むウシ血清
ウシ及びイヌの血清試料。

手順
開発中、原理実証及びアッセイ試薬の最適化のために、手順をマイクロタイタープレートのウェルにて室温で行い、１０分後又は２０分後に吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｕｌｔｒａｓｔａｒ、ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）にて６００ｎｍで測定した。その後、生化学自動分析装置（ＭＩＲＡ、Ｒｏｃｈｅ）又はＰｒｅｓｔｉｇｅ分析装置（Ｔｒｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ）にて３７℃で開発を実施した。

実施例１：マイクロタイタープレートにて
試薬Ａ
ウマヘモグロビンストック溶液のアリコート５０μｌをリン酸緩衝液２５ｍｌに添加した。グルコースオキシダーゼストック溶液１．２５ｍｌを、希釈したヘモグロビン溶液１０ｍｌに添加した。

試薬Ｂｉ
１％Ｔｗｅｅｎ２０含有クエン酸緩衝液ｐＨ３．８、１．０ｍｌに、ＡＡＰ ０．０１ｍｌ、フェノール０．０２ｍｌ、ＡＮＳ ０．０３ｍｌ、ＤＴＴ ０．００６ｍｌを添加した。

試薬Ｂｉｉ
リン酸緩衝液ｐＨ７．４、１．０ｍｌに、ＡＡＰ ０．０１ｍｌ、フェノール０．０２ｍｌ、ＡＮＳ ０．０３ｍｌ、ＤＴＴ ０．００６ｍｌを添加した。

作業用試薬Ｂ
試薬Ｂｉ１ｍｌを試薬Ｂｉｉ１ｍｌと混合し、０．５Ｍグルコースのリン酸緩衝溶液０．５６ｍｌを添加した。

試料（６μｌ）をウェルに入れ、次いでヘモグロビン／グルコースオキシダーゼ試薬Ａ１００μｌ及び色原体試薬Ｂ１００μｌを入れ、１０分間室温でインキュベートし、吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにて５９５ｎｍで測定した。

得られた結果を下の表１に示す。

血清中のハプトグロビンは反応して暗青色を呈し、ＦＣＳ及び水の反応は最小限であった。

実施例２ 還元剤としてのＤＴＴとＣｙｓとの比較
ＤＴＴは試薬混合物中で最も不安定であるとして知られる。ＳＳ二重結合を還元することができる代替の試薬がハプトグロビンアッセイの安定性を高めることになろう。

バックグラウンドのペルオキシジス活性の阻害におけるシステイン及びＤＴＴの効力を比較する実験において、試料（４μｌ）をウェルに入れ、次いでヘモグロビン／グルコースオキシダーゼ試薬Ａ７５μｌ及び色原体ＢｉＤＴＴ又はＢｉｉＣｙｓ７５μｌを入れ、３０分間室温でインキュベートし、吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにて６００ｎｍで測定した。

作業用溶液
作業用試薬Ａ
リン酸緩衝液２．５ｍｌに、ヘモグロビン５μｌ及びグルコースオキシダーゼ溶液３０μｌを添加した。

作業用試薬Ｂｉ ＤＴＴ
クエン酸緩衝液１０ｍｌ＋リン酸緩衝液１０ｍｌ（ｐＨ４．１）
次いで、混合緩衝液１ｍｌにつき、以下を添加：
０．０１ｍｌ ＡＡＰ
０．０３ｍｌ ＡＮＳ
０．０２ｍｌ フェノール
０．００６ｍｌ ＤＴＴ
０．２５ｍｌ Ｇｌｕ

作業用試薬Ｂｉｉ Ｃｙｓ
クエン酸緩衝液１０ｍｌ＋リン酸緩衝液１０ｍｌ（ｐＨ４．１）
次いで、混合緩衝液１ｍｌにつき、以下を添加：
０．０１ｍｌ ＡＡＰ
０．０３ｍｌ ＡＮＳ
０．０２ｍｌ フェノール
０．０１２ｍｌ Ｃｙｓ
０．２５ｍｌ Ｇｌｕ

得られた結果を以下の表２に示す。

この結果は、バックグラウンドのペルオキシダーゼ活性を阻害するためにシステインを還元剤として使用することは、ＤＴＴと同様に効果があることを示している。

実施例３：ｐＨ最適化
（ａ）ｐＨ３．９〜４．５
ｐＨを変化させることによる、ハプトグロビン反応に対する効果をマイクロタイタープレートアッセイで定量した。試薬Ｂの緩衝液を、クエン酸緩衝液とリン酸緩衝液とを下記（表３）の通り混合し、還元剤としてＤＴＴを伴う実施例２におけるＢｉ ＤＴＴのような他の化学物質を添加することによって調製した。

緩衝液混合物（Ｂ２〜Ｂ５）のｐＨを、全ての化学物質を添加した後で定量した。試料（５μｌ）をウェルに入れ、次いでヘモグロビン／グルコースオキシダーゼ試薬Ａを９０μｌ、及び色原体Ｂ３〜Ｂ６を９０μｌ入れ、２０分間室温でインキュベートし、吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにて６００ｎｍで測定した。

得られた結果を下の表４に示す。

この結果から、ｐＨ４．１及び４．４でハプトグロビンの反応性が最も高く、ｐＨ４．４４でブランク及び陰性血清試料の反応性が最小限であることがわかる。

（ｂ）ｐＨ４．１〜６．０
表５に列挙した種々のｐＨの緩衝液（Ｂ６〜Ｂ１０）を、リン酸緩衝液ｐＨ７．４をクエン酸緩衝液ｐＨ３．８で滴定し、実施例２における試薬Ｂｉ ＤＴＴと同様の試薬を添加することによって調製した。試料（４μｌ）をウェルに入れ、次いでヘモグロビン／グルコースオキシダーゼ試薬Ａを７５μｌ、及び色原体Ｂ２〜Ｂ５を７５μｌ入れ、３０分間室温でインキュベートし、吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにて６００ｎｍで測定した。

ｐＨ４．５を超えると反応が進行しないことがわかった。ｐＨ４．１４及び４．５では反応があり、この試薬セットではｐＨ４．１４での反応の方が優位であった。

実施例４ 自動分析
マイクロタイタープレートにて最適化した試薬を、以下の方法に従い、生化学自動分析装置（ＭＩＲＡ、Ｒｏｃｈｅ）にて使用した。

試薬Ａ
リン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ４．５１）９ｍｌに、ヘモグロビン溶液１８μｌ及びグルコースオキシダーゼ溶液１０８μｌを添加した。

試薬Ｂ
０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４、１５ｍｌを０．５Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．８（約５．３ｍｌ）でｐＨ４．１４に滴定した。

混合緩衝液１ｍｌにつき以下の試薬を添加した。
０．０１ｍｌ ＡＡＰ
０．０３ｍｌ ＡＮＳ
０．０２ｍｌ フェノール
０．００６ｍｌ Ｃｙｓ
０．２５ｍｌ Ｇｌｕ

ＭＩＲＡ分析装置に、試薬Ａを第１の試薬として入れ、試薬Ｂ１２を添加すべき第２の試薬として入れた。アッセイパラメーターを次のように設定した。
試料体積＝０．００５２ｍｌ
第１の試薬（Ａ）＝０．０９ｍｌ
第２の試薬（Ｂ１２）＝０．０９ｍｌ
添加は第１の試薬、試料添加、試薬Ｂ１２添加とすべきであり、サイクル１〜１５（２５秒おき）にて６００ｎｍで測定すべきである。サイクル２とサイクル１５の間（３５０秒）の６００ｎｍでの吸光度の変化を測定値（ΔＡ_６００）とする。

試料：
標準曲線の血清中Ｈｐ、１．４、０．７、０．３５及び０ｇ／Ｌ
対照の生理食塩水、ＦＣＳ、４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
試料：Ｈｐ濃度が上昇している血清

得られた結果を表６に示す。

アッセイ系に過酸化物を生成するためにグルコースオキシダーゼ及びグルコースを使用する試薬によってハプトグロビン標準値との線形曲線が得られ、結果が自動出力される。４％アルブミン及びＦＣＳで観察された明らかなハプトグロビンの低濃度は（ｓ残存するバックグラウンド活性及び分析において）、ここで使用しているアッセイ法におけるように、これら（４％ＢＳＡ又はＦＣＳ）のいずれかをゼロ標準として使用することによって克服することができる。

実施例５ ハプトグロビンのドライケミストリー試験
反応のために過酸化物を用意する必要がないため、試薬はドライケミストリー方式で使用可能である。乾燥前の試薬の相互作用を最小限にするために、試薬を順番に添加し、最後の試薬の添加後、直ちに凍結してから真空で乾燥した（凍結乾燥）。

実施例１におけるものと同様の試薬Ａ
実施例１におけるものと同様の試薬Ｂ

試薬Ａ（０．０２５ｍｌ）を濾紙（Ｂｉｏｒａｄ）上に点状に配分し、風乾し、ポリ袋に入れてドライアイス上で６０分間放置した。氷冷した試薬Ｂ（０．０２５ｍｌ）を、予め配分した試薬Ａの上に点状に配分し、再びポリ袋に入れてドライアイス上で３０分間放置した。濾紙を凍結乾燥器中に一晩放置した。

ハプトグロビンを０．７４及び０．３５ｇ／ｌ（実施例４で使用した標準１．４ｇ／ｌの１：２及び１：４希釈物）で含むウシ血清（０．０１ｍｌ）並びに５ｇ／ｌ及び２．５ｇ／ｌのＢＳＡを、乾燥した点の上につけ、約５分間インキュベートして顕色をスキャニングによって記録した。

この新たな試薬は、濾紙上に乾燥した場合、ハプトグロビンを含有する試料をつけると５分で濃青／紫に反応したが、ＢＳＡでは陰性反応を示した。

実施例６ 最適化した湿式化学アッセイ ウシ試料
試薬濃度の調節を必要とするさらなる最適化試験を、試薬Ａ中にアミノアンチピリンを加えて実施した。Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（Ｔｒｉｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ）生化学分析装置を使用してウシ血清試料中のハプトグロビンを定量した。

試薬Ａ：ヘモグロビン／グルコースオキシダーゼ／アミノアンチピリン
脱イオン水中に以下を溶解：
塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）０．１５４Ｍ
グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）０．６ｍｇ／ｍｌ（１０５Ｕ／ｍｌ）
ウマヘモグロビン０．２６ｍｇ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ）３．１ｍＭ
トリクロサン（Ｆｌｕｋａ）０．０００１％（ｖ／ｖ）

試薬Ｂ
脱イオン水中に以下を溶解、ｐＨ４．１
クエン酸（Ｓｉｇｍａ）０．０６Ｍ
リン酸水素二ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）０．０８Ｍ
グルコース（Ｓｉｇｍａ）０．５Ｍ
Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）１％（ｖ／ｖ）
フェノール（Ｓｉｇｍａ）０．０２Ｍ
８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ｆｌｕｋａ）１．５ｍＭ
Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ）０．８２ｍＭ
トリクロサン（Ｆｌｕｋａ）０．０００１％（ｖ／ｖ）

Ｐｒｅｓｔｉｇｅ分析装置プロトコル：
試料：４μｌ
希釈用水：１０μｌ
試薬１＝Ａ２：２００μｌ
試薬２＝Ｂ１３：９０μｌ

ブランク：正常なウシ血清

キャリブレーター：正常なウシ血清中１．４８ｇ／Ｌ、０．７４ｇ／Ｌ、０．３７ｇ／Ｌ、０．１９ｇ／Ｌ、０．０４８ｇ／Ｌのハプトグロビン

計算方法：Ｌｏｇｉｔ２

得られた結果を表７に示す。

試料１〜５は急性期反応中の仔ウシ由来のものである。

実施例７ 最適化した湿式化学アッセイ イヌ試料
実施例６におけるものと同様の試薬をＰｅｎｔｒａ４００（Ｈｏｒｉｂａ Ａｂｘ Ｌｔｄ）分析装置で使用し、イヌ血清試料中のハプトグロビンを定量した。試料を１：１０に希釈してから０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で二重反復試験にて分析した。得られた結果は、希釈に対して調整する計算をした後のものであり、二重反復試験の平均値である。

Ｐｅｎｔｒａ分析装置プロトコル：
試料：７．５ｕｌ
希釈用水：５ｕｌ
試薬１＝Ａ２：１５０ｕｌ
試薬２＝Ｂ１３：６０ｕｌ

ブランク及びキャリブレーター希釈液（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｄｉｌｕｅｎｔ）：２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）０．１５４Ｍ
ＢＳＡ Ｆｒａｃ Ｖ（Ｓｉｇｍａ）２０．０ｇ／Ｌ
トリクロサン（Ｆｌｕｋａ）０．０００１％（ｖ／ｖ）

キャリブレーター：キャリブレーター希釈液中１．４８ｇ／Ｌ、０．７４ｇ／Ｌ、０．３７ｇ／Ｌ、０．１９ｇ／Ｌに希釈したハプトグロビン

計算方法：Ｌｏｇｉｔ／Ｌｏｇ４

得られた結果を表８に示す。

試料６〜７は健常なイヌにおいて見られる範囲のハプトグロビンを有するイヌ由来のものであり、試料８〜９は炎症状態又は感染症状態のイヌ由来のものである。

Claims (27)

1. 試料中のハプトグロビン濃度の定量アッセイ法において、
   （ｉ）ヘモグロビンをアッセイ対象の前記試料と混合して、前記試料中に存在するハプトグロビンでハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成させるステップと、
   （ｉｉ）過酸化水素が試薬から生成され、存在する前記ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性の基質を形成し、緩衝液のｐＨが、複合体を形成していない任意のヘモグロビンのペルオキシジス活性が実質的に抑制されるには十分に低いが過酸化水素の生成が起こるには十分に高い範囲内であるという条件下で、
   前記緩衝液の存在下で、ステップ（ｉ）の生成物を、過酸化水素を生成する前記試薬と、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に光学的に検出可能な変化をする１種又は複数種の色原体とに接触させるステップと、
   （ｉｉｉ）前記反応混合物の光学的性質における変化を測定することによって、前記ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性を定量するステップと、
   （ｉｖ）前記ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性のレベルを前記試料中のハプトグロビンの量と関連づけるステップと
   を含むことを特徴とするアッセイ法。
2. 請求項１に記載のアッセイ法において、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が同時に実施されることを特徴とするアッセイ法。
3. 請求項１又は２に記載のアッセイ法において、前記アッセイがｐＨ３．９〜ｐＨ４．５の範囲のｐＨで実施されることを特徴とするアッセイ法。
4. 請求項３に記載のアッセイ法において、前記アッセイがｐＨ４〜ｐＨ４．５の範囲のｐＨで実施されることを特徴とするアッセイ法。
5. 請求項４に記載のアッセイ法において、前記アッセイがｐＨ４．１で実施されることを特徴とするアッセイ法。
6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載のアッセイ法において、過酸化水素を生成する前記試薬が、反応生成物として過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を、前記酵素の基質とともに含むことを特徴とするアッセイ法。
7. 請求項６に記載のアッセイ法において、過酸化水素を生成する前記試薬が酵素グルコースオキシダーゼ及び基質グルコースを含むことを特徴とするアッセイ法。
8. 請求項１乃至７の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記色原体が、ペルオキシジス活性が存在する場合に分光学的に検出することができる色変化をすることを特徴とするアッセイ法。
9. 請求項８に記載のアッセイ法において、前記色原体が、フェノール、４−ヨードフェノール、３−アミノフェノゾン、８−アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、４−アミノアンチピリン（ＡＡＰ）、２−アミノ−４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（ＡＨＢＳ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩、Ｏ−ジアニシジン、ナトリウム−２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスルホナート及び２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）又はこれらの混合物を含むことを特徴とするアッセイ法。
10. 請求項９に記載のアッセイ法において、前記色原体が、フェノールと８−アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）と４−アミノアンチピリンとの組合せを含むことを特徴とするアッセイ法。
11. 請求項１乃至１０の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記アッセイが、前記試料中のアルブミン又は他のタンパク質によるペルオキシダーゼ効果を低減するための１種又は複数種の追加の試薬の存在下で実施されることを特徴とするアッセイ法。
12. 請求項１１に記載のアッセイ法において、前記１種又は複数種の追加の試薬が、タンパク質結合阻害剤、ジスルフィド結合を抑える効果のある還元剤及びカオトロピック剤又はこれらの混合物から選択されることを特徴とするアッセイ法。
13. 請求項１２に記載のアッセイ法において、前記タンパク質結合阻害剤が８−アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、プロトポリリン、ビリルビン、タウロデオキシコール酸（胆汁塩）、ジクマロール又は２−メルカプトベンゾチアゾールを含むことを特徴とするアッセイ法。
14. 請求項１２又は１３に記載のアッセイ法において、前記還元剤が、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、４，４’−ジチオピリジン又は５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸）を含むことを特徴とするアッセイ法。
15. 請求項１２乃至１４の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記カオトロピック剤が、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム又は塩化ナトリウムを含むことを特徴とするアッセイ法。
16. 請求項１乃至１５の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記アッセイ混合物が界面活性剤をさらに含むことを特徴とするアッセイ法。
17. 請求項１乃至１６の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記アッセイ混合物が抗菌剤をさらに含むことを特徴とするアッセイ法。
18. 請求項１乃至１７の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記アッセイがアッセイ対象の前記試料と第１の反応混合物及び第２の反応混合物との混合物を形成することによって実施されることを特徴とするアッセイ法。
19. 請求項１８に記載のアッセイ法において、前記第１の試薬混合物が、ヘモグロビン、及び過酸化水素を反応生成物として生成する反応を触媒する酵素を含み、前記第２の試薬混合物が、１種又は複数種の色原体及び前記第１の混合物の前記酵素の基質を含むことを特徴とするアッセイ法。
20. 請求項１９に記載のアッセイ法において、前記１種又は複数種の色原体が前記第１の反応混合物中に含まれることを特徴とするアッセイ法。
21. 請求項１乃至２０の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記アッセイを実施するために、構成成分としての前記アッセイ試薬の一部又は全部を乾燥形態で組み合わせ、次いで前記水性試料に添加することを特徴とするアッセイ法。
22. 請求項２１に記載のアッセイ法において、前記アッセイ試薬の組合せが、溶液で調製され、固体表面上に凍結乾燥されることを特徴とするアッセイ法。
23. 請求項２２に記載のアッセイ法において、前記固体表面が紙又はアッセイスティックであることを特徴とするアッセイ法。
24. 請求項１乃至２３の何れか１項に記載のアッセイ法において、前記ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性レベルが、既知のハプトグロビン濃度を使用して作成した標準曲線を参照して、前記試料中のハプトグロビン量と関連づけられることを特徴とするアッセイ法。
25. 請求項１乃至２４の何れか１項に記載のハプトグロビンアッセイで使用するためのキットにおいて、ヘモグロビン、過酸化水素を生成する試薬、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に光学的に検出可能な変化をする１種又は複数種の色原体及び緩衝液を含むことを特徴とするキット。
26. 実質的に本明細書に記載されている通りのアッセイ法。
27. 実質的に本明細書に記載されている通りのキット。