JPH0599928A

JPH0599928A - 尿中銅イオン検出用試薬組成物

Info

Publication number: JPH0599928A
Application number: JP28711491A
Authority: JP
Inventors: Takehiko Umezawa; 毅彦梅沢; Yasushi Akiyoshi; 泰秋吉
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1991-10-07
Filing date: 1991-10-07
Publication date: 1993-04-23

Abstract

(57)【要約】【構成】尿中銅イオン検出用試薬組成物として、 a)4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N-
ジアルキル誘導体、 b)下記の化合物群Ｉの中から選ばれた少なくとも１種の
化合物、化合物群Ｉ：ジスルフィド化合物、ヒドロキシルアミ
ン、アミノフェノール、p-メチルアミノフェノール、p-
フェニレンジアミン及びそのアルキル誘導体、ハイドロ
キノン、カテコール、メトール、亜硫酸、ピロ亜硫酸、
トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、
L-システイン、ベンゼンスルフィン酸、及びこれらの
塩、 c)界面活性剤、 d)ｐＨを4.0 から8.0 の範囲とするｐＨ調節剤、を含有する。【効果】混合溶液のままで長期間保存が可能であり、
かつ尿検体添加により尿中銅イオンの有無を目視により
即時判定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は尿中銅イオンの検出用試
薬組成物に関する。詳しくは、尿中銅イオンの存在を多
数の検体について短時間に簡便な操作で検出できる試薬
組成物に関し、さらに詳しくは、4-(3,5- ジブロモ-2-
ピリジルアゾ）アニリンのN,N-ジアルキル誘導体を発色
剤とする銅イオン検出用試薬組成物において、その保存
性を改良したものに関する。

【０００２】

【発明の背景】先天性代謝異常疾患であるウイルソン症
は、臓器特に肝臓や脳に銅が過剰に沈着し、その障害を
招来する重大な疾患である。その患者には銅結合血清蛋
白であるセルロプラスミンの著しい減少が見られる。一
方、不安定なアルブミン結合銅は増加し、その多くは尿
中に排泄される。従って、血清セルロプラスミン値の減
少または尿中銅量の増加をスクリーニング等で早期に発
見すれば、銅キレート剤のＤ−ペニシラミン等の投与に
よりその治療が可能である。多数の検体を迅速に処理し
なければならないスクリーニングの観点からは、採血と
その後の遠心操作が検体を得ることに必要となる血清セ
ルロプラスミン測定よりも、特別の操作なしに容易に検
体を集めることができる尿検体を用いた尿中銅イオン測
定法の方が有利である。

【０００３】

【従来の技術】尿中銅イオンのスクリーニングテストに
は、簡単な操作で発色し、その色変化を目視で判定でき
るような簡便な比色法が好ましい。銅イオンの比色定量
用試薬としてには最もよく知られているのはバソクプロ
インであるが、これは測定感度が低い点で難点がある。
検出感度に最も寄与度の大きいのは発色剤の吸光係数で
あり、この点から、銅イオンと反応して最も大きな吸光
係数をもつ水溶性ポルフィン化合物を用いた血清銅の微
量比色定量法も提案されている（「臨床化学」8 巻、266
頁(1979 年) ）。しかし、この方法は反応前に煩雑な除
蛋白操作をしなければならず、多数の検体を処理するス
クリーニングテストには簡便性の点で難がある。また、
「J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 」19巻,541頁 (1981年)
に記載されている6-メチルピコリン酸チオアミドは、尿
中銅イオンの比色定量用に提案された高感度比色試薬で
あるが、生成色素を溶媒抽出した後、分光光度計を用い
て測定する必要があるので、スクリーニング検査には煩
雑に過ぎるという難点があった。

【０００４】4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾアニリ
ンのN,N-ジアルキル誘導体は銀及び銅の定量分析用試薬
として開発されたものであり（特開昭61-87664、Chemic
al Abstracts, 106:32842z）、そのうち4-(3,5- ジブロ
モ-2- ピリジルアゾ)-N-エチル-N-(3-スルホプロピル)
アニリン（以下、DiBr-PAESAと略記することがある）
は、ポルフィンに次いで銅イオンと結合したときの吸光
係数が高い高感度検出試薬である（「Clin.Chem.」35
巻、4号、522-554頁(1989 年))。しかも、この化合物と銅
とのキレート化合物の吸収曲線は、陰イオン性界面活性
剤存在下で長波長側にシフトする（「Anal.Chim.Acta」
176 巻41頁(1985 年) ）から、陰イオン性界面活性剤併
用により、キレート形成前後の色調の変化（赤から紫）
を目視で判別することができ、スクリーニングには適し
た検出試薬といえる。この化合物を用いた銅イオンの比
色定量法は、血清検体について、既に提案されている。
例えば、「Anal.Chim.Acta」176 巻41頁(1985 年) で
は、血清検体にＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を添加して蛋
白変性させ、血清セルロプラスミンに結合していた銅イ
オンを遊離させ、これを上記化合物により比色定量測定
している。一方、「Clin.Chem.」35巻、4号、522-554頁(1
989 年) 記載の方法は、上記ＴＣＡ処理を省くため、ア
スコルビン酸を添加することにより、血清セルロプラス
ミンに結合していた銅イオンを遊離させ、これを上記化
合物により比色定量測定している。

【０００５】尿中には血清セルロプラスミンは存在しな
いが、尿中の銅イオンでもやはり尿中の蛋白に配位した
ものも存在すると考えられる。従って、尿中の銅イオン
を測定する場合にも、「Clin.Chem.」35巻、4号、522頁(1
989 年) 記載の方法と同様、4-(3,5- ジブロモ-2- ピリ
ジルアゾ)-N,N-ジエチルアニリン誘導体を、アスコルビ
ン酸及び陰イオン性界面活性剤存在下で使用することが
感度の点で有利とも考えられる。しかし、反応時のｐＨ
が低い場合、フリーのアスコルビン酸が存在している
と、生成した色素の退色が極めて早く、30分前後で判別
困難となる。多数の検体を検査するスクリーニング検査
では反応させてから判定までに時間がかかる場合があっ
てフリーのアスコルビン酸を低いｐＨで用いることはで
きない。

【０００６】発明者らは既に、このような尿検体の場合
の特殊性を明らかにすると共に、その解決策として、ア
スコルビン酸の代わりにアスコルビン酸塩を用い、さら
に反応時のｐＨを4.5 から7.5 の範囲とすることを提案
した（特願平２−２２９９３４）。すなわち、ここで提
案した尿中銅イオン検出用試薬組成物は、4-(3,5- ジブ
ロモ-2- ピリジルアゾ)アニリンのN,N-ジアルキル誘導
体、アスコルビン酸塩、界面活性剤、及び、使用時にｐ
Ｈを4.5 から7.5 の範囲とするｐＨ調節剤又はｐＨ緩衝
剤を含むものである。またこの試薬組成物を含有する乾
式分析要素により尿中銅イオンのスクリーニング検査に
適した、操作が簡便で微量の銅イオン濃度を色変化によ
り目視等で判定できる分析要素を併せて提案した。

【０００７】しかし、このようなフリーのアスコルビン
酸の代わりにその塩を用いても克服できない問題が残っ
ていた。すなわち、アスコルビン酸やアスコルビン酸塩
を発色剤（4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ)アニリ
ンのN,N-ジアルキル誘導体）などの他の試薬と一緒に混
合して検出試薬を調製すると、保存中に発色剤が変質し
て、銅イオンの検出感度が著しく損なわれるという問題
があった。このように従来の試薬組成物はその溶液にす
ると保存安定性に欠けていた。このため、試薬組成物を
用時溶解したり、アスコルビン酸（又はその塩）溶液と
他の試薬溶液と別々に調製し使用時にこれらを混合しな
ければならず、面倒であった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような事
情に鑑みなされたものであり、混合溶液のままで長期間
保存が可能で用時調製の必要がなく、かつ目視検査によ
り即時判定可能なスクリーニングに適した尿中銅イオン
検出用試薬組成物を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記の課題は、以下のも
のを含有することを特徴とする尿中銅イオン検出用試薬
組成物： a)4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N-
ジアルキル誘導体、 b)下記の化合物群Ｉの中から選ばれた少なくとも１種の
化合物、化合物群Ｉ：ジスルフィド化合物、ヒドロキシルアミ
ン、アミノフェノール、p-メチルアミノフェノール、p-
フェニレンジアミン及びそのアルキル誘導体、ハイドロ
キノン、カテコール、メトール、亜硫酸、ピロ亜硫酸、
トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、
L-システイン、ベンゼンスルフィン酸、及びこれらの
塩、 c)界面活性剤、 d)ｐＨを4.0 から8.0 の範囲とするｐＨ調節剤、により解決された。

【００１０】すなわち本発明は、発色剤である4-(3,5-
ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N-ジアルキル
誘導体と相互作用して保存中に変質させるアスコルビン
酸（又はその塩）の代わりに、そのような変質作用がな
いジスルフィド化合物等の還元性を有する化合物を使用
することにより、混合試薬を調製後長期にわたり保存可
能にしたものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段の詳細な説明】発色剤銅イオンと結合して発色する化合物（発色剤）である4-
(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ) アニリンのN,N-ジア
ルキル誘導体は、下記一般化学式で示されるものを使用
する。

【００１２】

【化１】

【００１３】式中、Ｒはアルキル基（例えば、メチル、
エチル、プロピル基等）又はスルホアルキル基（例え
ば、スルホメチル、2-スルホエチル、3-スルホプロピル
基等）であり、Ｒ’は低級アルキル基（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル基等）である。このうち特に好ま
しい化合物として、下記化学式で示される4-(3,5- ジブ
ロモ-2- ピリジルアゾ)-N,N-ジエチルアニリン(Chemica
l Abstracts 登録番号(CASRNと略記)100743-66-6) 、

【００１４】

【化２】

【００１５】及び、下記化学式で示される4-(3,5- ジブ
ロモ-2- ピリジルアゾ)-N-エチル-N-(3-スルホプロピ
ル) アニリン(CASRN:100743-65-5; 略称、DiBr-PAESA)が
ある。

【００１６】

【化３】

【００１７】還元剤還元剤として使用される化合物には以下の化合物があ
る。化合物群Ｉ：ジスルフィド化合物、ヒドロキシルアミ
ン、アミノフェノール、p-メチルアミノフェノール、p-
フェニレンジアミン及びそのアルキル誘導体、ハイドロ
キノン、カテコール、メトール、亜硫酸、ピロ亜硫酸、
トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、
L-システイン、ベンゼンスルフィン酸、及びこれらの
塩、このうち、ジスルフィド化合物として、ジチオジグ
リコール酸、L-システイン塩酸塩、3,3'- ジチオジプロ
ピオン酸、3-カルボキシプロピルジスルフィド、2,2'-
ジチオジ安息香酸、ジチオビス(2- ナフトール) などが
挙げられる。これらの化合物群Ｉの化合物の中から選ば
れた化合物を使用することにより、検出試薬を調製した
溶液を長期間にわたり保存経時して使用しても銅イオン
検出の感度は損なわれない。なお化合物群Ｉの中からの
選択は１種或いは任意に２種以上を組み合せて用いるこ
とができる。

【００１８】ｐＨ調節剤ｐＨが4.0 未満の酸性側では前記発色剤と銅イオンの結
合により生成した色素の色が消失する。ｐＨ8.0 を越え
るアルカリ性側では、尿検体の場合前記発色剤と銅との
結合により生成した色素の色安定性が悪い。したがっ
て、試薬組成物には、ｐＨを4.0 から8.0 の範囲とする
ｐＨ調節剤が含有される。ｐＨ調節剤としては、水酸化
ナトリウムのようなアルカリ剤や、酢酸、リン酸、くえ
ん酸など酸剤を適宜使用できる。またｐＨ調節剤として
ｐＨ緩衝剤を用い、ｐＨを4.0 から8.0 の範囲とするこ
ともできる。ｐＨ緩衝剤としては酢酸、リン酸、コハク
酸、くえん酸、フタル酸、Goodの緩衝剤（「Biochemist
ry」5 巻,467-477頁(1966 年) 、「Anal.Biochem. 」10
4 巻,300-310頁(1980 年) に記載) のうちのＭＥＳ（2-
(N- モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＢＩＳ−Ｔｒｉ
ｓ、ＡＤＡ（N-(2- アセトアミド）イミノジ酢酸）、Ｐ
ＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2- エタンスルホン
酸）、ＡＣＥＳ（N-( アセトアミド)-2-アミノエタンス
ルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（3-(N- モルホリノ)-2-ヒドロ
キシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2- ヒド
ロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）などを用い
ることができる。

【００１９】界面活性剤界面活性剤は銅とキレートした発色剤の発色濃度を高
め、さらに吸収曲線を長波長側にシフトさせるために用
いる。そのための界面活性剤としては、陰イオン性界面
活性剤のみならず、非イオン性界面活性剤も使用でき
る。用いられる陰イオン性界面活性剤として、アルキル
硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル
硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンフェニルエーテル
硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アル
カンスルホン酸塩等がある。代表的なものとして、ドデ
シル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナト
リウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
硫酸エステルナトリウム等がある。非イオン性界面活性
剤としてはソルビタン脂肪酸エステル、ペンタエリスリ
トール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ
脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸モノエステル、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン
アルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオ
キシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸
部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸
部分エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂
肪酸ジエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミ
ド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミドなどを用いること
ができる。好ましい非イオン性界面活性剤の具体例とし
て、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Tri
ton X-100 など) 、p-ノニルフェノキシポリグリシドー
ルなどがある。

【００２０】各試薬の濃度範囲本発明の尿中銅イオン検出用試薬組成物の試薬成分は次
の濃度範囲にあることが好ましい。 (1) 発色剤 4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N-ジ
アルキル誘導体は溶液1mL に40ナノモルから140 ナノモ
ルの濃度範囲とするのが好ましい。4-(3,5- ジブロモ-2
- ピリジルアゾ)-N-エチル-N-(3-スルホプロピル) アニ
リン（DiBr-PAESA）の場合、溶液1mL 中に20μg から70
μg の範囲である。これより少ない濃度では、銅イオン
結合による色変化が少なく目視判定が困難となる。また
この範囲を越える濃度では、発色剤そのものの着色濃度
が高く、微量の銅イオン結合による色変化が判りにく
く、目視判定が困難となる。

【００２１】(2) 化合物群Ｉに属する化合物は、試薬組
成物溶液 1mL中に0.020 ミリモルから0.50ミリモルの範
囲を含有することが好ましい。化合物の濃度が低い場
合、発色剤に銅イオンが結合して生成した色の安定性が
低く、短時間内に退色する。濃度の上限は特にないが、
溶解性から限られる。

【００２２】(3) ｐＨ調節剤又はｐＨ緩衝剤は、溶液1m
L 中に0.04ミリモルから0.8 ミリモルの範囲を含有する
ことが好ましい。この濃度以下では生成した色の安定性
が悪い。濃度の上限は特にないが、高い場合溶解時間が
かかるので自ずから限界がある。

【００２３】(4) 界面活性剤は溶液1mL 中に0.01ミリモ
ルから0.10ミリモルの濃度範囲とするのが好ましい。ド
デシルスルホン酸ナトリウムを用いる場合、溶液1mL 中
に3mg から60mgの範囲とするのが好ましい。界面活性剤
濃度が低い場合は、発色剤への銅イオン結合による色変
化が少ない。濃度の上限は特にないが、溶液を保存中に
内容物が析出しない範囲から限られる。

【００２４】これらの試薬成分の相互の量比は次のとお
りである。4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリ
ンのN,N-ジアルキル誘導体１に対しモル比で、化合物群
Ｉは0.15×10³ から12×10³ の範囲、界面活性剤は0.1
×10³ から2.5 ×10³ の範囲、ｐＨ調節剤又はｐＨ緩衝
剤を用いる場合は0.3 ×10³ から20×10³ の範囲であ
る。

【００２５】使用方法本発明の試薬組成物は水溶液の形にして、多数並べた試
験管列或いはマイクロプレートのウェルに分注される。
これら試験液群に尿検体を順次分注する。検体中に銅イ
オンが存在すれば、試験液の色が赤色から紫色に変色す
る。これにより銅イオン存在の有無を検出することがで
きる。試験液の呈色の程度を、標準液の呈色或いは標準
色票と比較することにより半定量的測定が可能である。
また、マイクロプレートを用いた場合、マイクロプレー
ト各穴の反応液の着色をその吸収スペクトルの575nm 付
近の吸収極大波長の光によりマイクロリーダーで読み取
ることにより、吸光度分析を行うことも可能である。

【００２６】

【好ましい実施態様】本発明の好ましい実施態様として
以下のものがある。 (1)以下のものを含有することを特徴とする尿中銅イオ
ン検出用試薬組成物： a)4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N-
ジアルキル誘導体、 b)下記の化合物群Ｉの中から選ばれた少なくとも１種の
化合物、化合物群Ｉ：ジスルフィド化合物、ヒドロキシルアミ
ン、アミノフェノール、p-メチルアミノフェノール、p-
フェニレンジアミン及びそのアルキル誘導体、ハイドロ
キノン、カテコール、メトール、亜硫酸、ピロ亜硫酸、
トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、
L-システイン、ベンゼンスルフィン酸、及びこれらの
塩、 c)界面活性剤、 d)ｐＨを4.0 から8.0 の範囲とするｐＨ調節剤。 (2)化合物Ｉ群の中から選ばれた２種以上の化合物を含
む組成物である(1) に記載の試薬組成物。 (3)4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N
-ジアルキル誘導体の１に対しモル比で、化合物群Ｉか
ら選ばれた少なくとも一つの化合物が0.15×10³から12
×10³ の範囲、界面活性剤は0.1 ×10³ から2.5 ×10³
の範囲である(1)に記載の試薬組成物。 (4)前記4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリン
のN,N-ジアルキル誘導体が、4-(3,5- ジブロモ-2- ピリ
ジルアゾ)-N-エチル-N-(3-スルホプロピル) アニリン又
は4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ)-N,N-ジエチルア
ニリンである(1)に記載の試薬組成物。

【００２７】

【実施例１】組成物溶液の調製（組成物Ａ）（本発明） 4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ)-N-エチル-N-(3-ス
ルホプロピル) アニリン（DiBr-PAESA）25μg 、ドデシ
ル硫酸ナトリウム30mg、ジエチルジチオジグリコール酸
5mg を1mL の0.4M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)
に溶解した。（組成物Ｂ）（本発明） DiBr-PAESA25μg 、p-ノニルフェノキシポリグリシドー
ル50mg、ジエチルジチオジグリコール酸5mg を1mL の0.
2MのMES-水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.5) に溶解した。（組成物Ｃ）（比較例）組成物Ａでジエチルジチオジグリコール酸5mg をアスコ
ルビン酸ナトリウム25mgに置き換えた組成物の溶液を比
較例とした。。

【００２８】尿検体による色変化の観察で調製した組成物Ａ−Ｃの各40μL を平底ウェルのマ
イクロプレートに分注し、これに尿検体Ｓ１、Ｓ２、Ｓ
３を各40μL を加え、色変化を観察した。色変化は数秒
以内に起こった。被検者Ｓ１は健常人で、原子吸光法により測定した尿中
の銅量は0.1ppm以下であった。Ｓ２、Ｓ３はウィルソン
症患者の尿で、尿中の銅量はそれぞれ1.1 、2.1ppmであ
った。検体添加後の各組成物溶液の呈色結果を次の表１
に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】組成物Ａ、Ｂ、Ｃはいずれも、被験者Ｓ
２、Ｓ３の検体で明瞭な色変化が観察され、健常人Ｓ１
と明確に区別できた。

【００３１】

【実施例２】実施例１で調製した試薬組成物Ａ、Ｂ、Ｃ
の各溶液を密栓して5 ℃の冷蔵庫に６カ月間保存経時
後、実施例１と同様な操作で、尿検体の色変化を観察し
た。結果を次の表２に示す。

【００３２】

【表２】 ───────────────────────── 尿検体組成物（銅含量）ＡＢＣ ───────────────────────── Ｓ１ 0.1 ppm 以下赤赤淡赤色Ｓ２ 1.1 ppm 紫紫淡赤色Ｓ３ 2.1 ppm 紫紫淡赤色 ─────────────────────────

【００３３】本発明の試薬組成物Ａ、Ｂは冷蔵庫で６カ
月経時した後でも被験者Ｓ２、Ｓ３で明瞭な色変化が観
察され、健常人Ｓ１と明確に区別できた。しかし、比較
例の試薬組成物Ｃは６カ月経時した後では健常人との区
別は困難であった。

【００３４】

【実施例３】DiBr-PAESA25μg 、p-ノニルフェノキシポ
リグリシドール50mg、亜硫酸ナトリウム40mg、ハイドロ
キノン9mg を1mL の0.2Mの燐酸緩衝液(pH6.5) に溶解し
た（本発明）。本組成物調製直後、硫酸銅水溶液を調製
し、実施例１と同様な操作で色変化を観察し、表３の結
果を得た。

【００３５】

【表３】

【００３６】本組成物を室温で６カ月経時後同様な操作
で硫酸銅水溶液の色変化を観察し、下記表４の結果を得
た。

【００３７】

【表４】

【００３８】化合物群Ｉの化合物を２種混合した本発明
の試薬組成物は室温で６カ月経時した後でも、健常人レ
ベルと患者レベルとの銅濃度の差による色変化が明瞭に
区別できた。

【００３９】

【発明の効果】以上のように、本発明の尿中銅イオン検
出用試薬組成物は、試薬調製後長期にわたり保存可能
で、尿検体の銅イオンの存否のスクリーニング検査に用
い、簡単な操作で、短時間で多数の検体について目視に
よる判定を確実に実施することができる、という優れた
効果を有する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のものを含有することを特徴とする
尿中銅イオン検出用試薬組成物： a)4-(3,5- ジブロモ-2- ピリジルアゾ）アニリンのN,N-
ジアルキル誘導体、 b)下記の化合物群Ｉの中から選ばれた少なくとも１種の
化合物、化合物群Ｉ：ジスルフィド化合物、ヒドロキシルアミ
ン、アミノフェノール、p-メチルアミノフェノール、p-
フェニレンジアミン及びそのアルキル誘導体、ハイドロ
キノン、カテコール、メトール、亜硫酸、ピロ亜硫酸、
トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、
L-システイン、ベンゼンスルフィン酸、及びこれらの
塩、 c)界面活性剤、 d)ｐＨを4.0 から8.0 の範囲とするｐＨ調節剤。