JP4392486B2 - ハプトグロビンの分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
ハプトグロビン(Ｈｐ)は人間や動物の血中に存在するたんぱく質である。血液細胞を分離した後の血漿や血清中のＨｐ濃度はそれぞれの動物で異なり、その動物の健康状態に関係している。Ｈｐは感染、炎症または外傷によって濃度が劇的に増加するたんぱく類の一種である。これらのたんぱく質は急性期たんぱく質と呼ばれている。
【０００２】
血漿中のＨｐ濃度を測定することは、人を診断する臨床医及び獣医学にとって価値ある診断情報を提供する。獣医学において、Ｈｐを測定することは牛や羊の健康状態を評価する上で特に重要である。なぜならこれらの種ではＨｐが感染に対して特に強い反応を示し、循環血中濃度が１００倍にも増加する。他の種において、例えば人間、犬、猫及び豚においても、血漿濃度は２から３倍に増加し、これは診断情報を与えるのに十分であるため、Ｈｐの測定は重要である。さらにこれら他の種においては、Ｈｐ濃度の低下は溶血性貧血を示唆するので、診断情報として価値がある。さらに、Ｈｐの測定はげっ歯動物またはネズミといった実験室用動物の、炎症や感染のマーカーとしても同様に重要である。
【０００３】
現在Ｈｐの分析は、免疫検定法またはＨｐのヘモグロビン(Ｈｂ)への吸着能に基づいている。
【０００４】
人間の血漿中のＨｐの測定は、臨床生化学研究所において、急性期応答を調べるための慣用の試験法として、人間のＨｐに特異的な抗血清を用いて、抗体に基づく方法により行われている。最も汎用されている方法は免疫比濁分析であり、溶液中の抗体―Ｈｐ錯体の沈殿の形成を測定し、Ｈｐ濃度に関連付けている。しかし、免疫比濁分析評価は、適切な抗血清を連続的に供給するといった準備が必要であり、通常の生化学的試験に比べてコストがかかる。それに加えて、動物診断用施設においては、ある種に対する抗血清に基づく試験は、それぞれの種に対して検証しなければならず、そして新しい抗血清を用いたら、その都度検証を繰り返さなければならない。
【０００５】
ＨｐとＨｂの結合に基づく最初の分析は、Ｈｐ-Ｈｂ錯体（複合体）の形成が血漿試料中のＨｐ濃度に応じて、Ｈｂに特有な分光光学的な吸光度を変化させる、という発見に基づいている。しかしこの方法は、微かに酸性な条件下で検出される、錯体に固有のペルオキシダーゼ活性を利用する方法に取って替わられた。遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が阻害されて、錯体の活性がＨｐ含有量に比例的になるときは、これよりＨｐの標準試料に基づく検量線から、定量することができる。
【０００６】
この分析法は、現在Ｈｐ分析を行っている動物診断用施設の大部分において採用され、免疫分析システムよりも多用されている。なぜなら検証についての要求が穏やかで、全ての種に適用でき、そして試薬が安価なので、抗体を使う分析法に比べはるかにコストがかからないからである。しかしこの試験の自動化版はグアイアコールという試薬を用い、これは不快な臭気を発するため、多くの研究施設のスタッフに受け入れられなかった。この分析法が試薬提供業者に一般的に受け入れられなかったのもこの理由による。ペルオキシダーゼ反応に他の試薬を用いようとする試みがなされ、テトラメチルベンジジン(TMB)を用いる手作業による方法が開発された（Conner J. et al Research in Vet. Sci.(1988) 44, 82-88）。しかしＨｐの自動分析はまだ実用化されていない。これはTMBが不安定だからであろう。本発明者らによって、ハプトグロビンを含まない血清試料（ブランク）がかなりのレベルのペルオキシダーゼ活性を示し、TMBによる誤った陽性結果を示すと報告された。そしてこの見せかけのペルオキシダーゼ活性が、自動化または半自動化する際に障害になると考えられる。
【０００７】
米国特許第4,695,552号は上記の方法に似た、Ｈｐ-Ｈｂ錯体の定量方法を示している。しかし、ここでは酸性のｐＨが遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を完全に不活性化するのに十分ではないとして、遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に除去するために界面活性剤を加えている。しかしながら、血清または血漿中に存在する成分が分析の正確さに影響を与え得るという点は全く示されていない。
【０００８】
この発明の目的の一つは、これまで述べた、不利益を一つでも解消し、軽減することである。
【０００９】
この発明は、試料血液中に存在するアルブミン及び、おそらく他のたんぱく類が上記した形式の分析にとって有用でない「ペルオキシダーゼ効果」を示しているという本発明者による発見に一部基づいている。
【００１０】
よって、この発明は試料中のハプトグロビン濃度を決定する分析方法を提供する。その分析方法は以下に示す工程から成り立っている。
【００１１】
ａ）試料、ヘモグロビン、及び試料中に存在するアルブミン及び／またはその他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試薬を含む反応混合物を形成する工程；
【００１２】
ｂ）前記試料、ヘモグロビン、及び前記の少なくとも一つの反応試薬を反応させて、ハプトグロビン／ヘモグロビン錯体を形成させる工程；及び
【００１３】
ｃ）錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に減少させるか、実質的に不活性化するような酸性ｐＨ条件下で前記ハプトグロビン／ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量を測定する工程。
【００１４】
錯形成していないヘモグロビンは酸性ｐＨでペルオキシダーゼ活性を示すが、この活性はｐＨ4.1で不活性化されると以前報告された。（Makimura, S. and Suzuki, N. (1982) Jpn. J. Ven. Sci. 44, p15-21.）しかし米国特許第4,685,552号によって、そのようなｐＨにおいても低レベルのペルオキシダーゼ活性が残ることが示された。それゆえ本分析に於いてはｐＨを4.1以下に、例えば3.6〜4.0に、特に3.8とした。
【００１５】
一般的には試料は血漿や血清などの血液試料である。試料はどの動物から得られるものでも良いが特に、人間を含む霊長類と同様に、げっ歯動物、ウシ科動物、羊のような動物、イヌ科動物、ネコ科動物、豚のような動物、馬のような動物などの哺乳類由来のものが挙げられる。また試料はミルクや腹水その他の体液でもよいし、またはイン・ビトロ培養媒体でもよい。
【００１６】
もし試料中のハプトグロビン濃度が２ｇ／Ｌより大きいならば、試料は希釈する必要がある。なぜなら高濃度では標準プロットが直線にはならず、ハプトグロビン濃度を正確に求めることができないからである。しかし試験結果の直線性を増して、希釈を必要としなくなるような試験操作が開発され得ることは当業者には容易に理解できるだろう。例えば、適当な状況ではより少ない試料を用いてもよい。
【００１７】
ヘモグロビンは血液試料を採取した動物と同種の動物から採取したものでよい。つまり、もし試験対象がウシ科動物ならば、ウシ科動物のヘモグロビンが使用されることになる。しかし、有利なことに、試験試料の動物と異なる種類の動物のヘモグロビンを用いても分析できることがわかった。こうしてただ一種のヘモグロビンを用いることで、多種類にわたる動物に対して分析が可能であることがわかった。ヘモグロビンは好ましくはメトヘモグロビンであるが、場合によってはオキシヘモグロビンも使用できる。
【００１８】
全種動物から得られる血清や血漿にはアルブミンが含まれており、よってこのたんぱく質は、４０ｇ／Ｌほどの濃度で試験試料中に存在している。本発明者らはブランクとして測定する際のゼロ試料として用いる、最適溶媒を探索している際に、アルブミンが分析に大きく干渉していることがわかった。この干渉はアルブミン濃度が１、５、１０％(１０、５０、１００ｇ／Ｌ)において見られた。
【００１９】
アルブミンは固有のペルオキシダーゼ活性を示さないとされている。理論による裏付けは別として、血清、血漿または他の試験試料中に存在する、アルブミン及び他のたんぱく類がヘモグロビンまたはヘモグロビンから遊離したヘマチンに結合して、通常ヘモグロビンがペルオキシダーゼ活性を示さないようなｐＨ(ｐＨ3.6〜4.0)においてもペルオキシダーゼ活性を保持していることが考えられる。さらにこれが自動吸光分光分析が今まで一般的に採用されなかった理由である。つまりハプトグロビンが存在しない状態でペルオキシダーゼ活性がゼロにならないのである。以前は試料を大幅に希釈（５００倍）したり、不活性なクロモゲン（例えばグアイアコール）を使うことで、無意識にまたは偶発的にこの「ペルオキシダーゼ効果」が最小限にされていた。
【００２０】
しかし本発明によれば、試料中のアルブミンや他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試薬を用いることにより、試料の大幅な希釈を必要とせず、より活性なクロモゲンを使用できる。
【００２１】
試料中に存在するアルブミンまたは他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの前記反応試薬は、ａ）ジスルフィド結合に対して有効な還元剤、ｂ）たんぱく質結合阻害剤、及び／またはｃ）カオトロピック剤から独立して選択される。
【００２２】
好ましくは二種もしくはそれ以上の前記反応試薬が「ペルオキシダーゼ効果」を減少するために用いられる。しかし当業者ならわかるであろうが、前記の反応剤を多量に用いると、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯形成反応を阻害するので、避けなければならない。例えば、８-アニリノ-１-ナフチレンスルホン酸 (ANS)をたんぱく質結合阻害剤として、そしてジチオスレイトールをジスルフィド結合に対して効果的な還元剤として、それぞれ約１０ｍｍｏｌ／Ｌ、４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した場合、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性をほぼ完全に阻害する結果となる。このように当業者は適切に調整することにより、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量に実質上影響を与えずに、見せかけの「ペルオキシダーゼ効果」のみを減少させることができる。
【００２３】
通常、ジスルフィド結合に有効な還元剤はジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、４，４‘−ジチオジピリジン、または５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸）である。
【００２４】
典型的なたんぱく質結合阻害剤はANS、プロトポルフィリン、ビリルビン、タウロデオキシコール酸類 (胆汁塩類) 、ジクマロール、２−メルカプトベンゾチアゾールである。
【００２５】
典型的なカオトロピック剤はグアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウムである。
【００２６】
好ましくは、分析において界面活性剤も使用する。最初、本発明者らによって、界面活性剤の使用は試料中のアルブミンや他のたんぱく質によるペルオキシダーゼ効果を減少させるのに重要であると考えられていた。界面活性剤はこのような効果を有しているようであるが、それとともに分析において他の成分の可溶化を保持する上で重要であることがわかった。さらにまた、低濃度の界面活性剤が好ましい、なぜなら高濃度( 例えば、２５ｇ／Ｌ)ではみかけのペルオキシダーゼ効果を増加させるからである。このように、界面活性剤は好ましくは、２０ｇ／Ｌ以下の全濃度で、さらに好ましくは１０ｇ／Ｌ以下の全濃度で反応混合物に加えられる。
【００２７】
典型的な界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビトールエステル（Tween ２０，４０，６０，８０など）；ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチフェノール（Triton Ｘ−４５，Ｘ−１００など）；及び／またはポリオキシエチレン（ＰＥＧ）アルコール類（Brij ３５，３６など）のような非イオン性界面活性剤、またはドデシル硫酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、及びセトリミドのようなイオン性界面活性剤である。
【００２８】
典型的には試料中のハプトグロビンと添加したヘモグロビンは２０分以内で反応させる、好ましくは１０分以内、より好ましくは５分以内である。
【００２９】
一度、前記ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体が形成されれば、遊離ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性は分析における酸性ｐＨ条件により実質的に阻害されているので、錯体の固有のペルオキシダーゼ活性を利用し、錯体を検出することが可能である。次に、既知濃度のハプトグロビンを用いて作成した標準曲線を参照することにより、ペルオキシダーゼ活性レベルを試料中のハプトグロビンレベルに関連付けることができる。
【００３０】
典型的には前記ペルオキシダーゼ活性はクロモゲン（色原体）と過酸化水素を用い検出する。つまりペルオキシダーゼ活性は結果としてクロモゲンの色の変化として表され、これは特定波長で分光光学的に検出される。このようなクロモゲン基質を用いたペルオキシダーゼの検出は、ヘモグロビン濃度、グルコース濃度、そして以前のアルブミンが分析に対して影響を及ぼすことが知られていないときのハプトグロビン濃度の分析の分野においてよく知られている。以下に例を示す。Bauer, K. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981) Vol. 19 pp971-976; Reijic, R. et al, Clin. Chem. (1992) Vol. 38 pp522-525 and Conner, J.G. and Eckersall, P.D. Research in Vet. Sci. (1988), 44, pp82-88 。
【００３１】
上記論文中に記載された、クロモゲン基質（４−アミノフェノゾン、２−アミノ−４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸(AHBS)、テトラメチルベンジジン(TMB)）と同様に、当業者にとっては明らかであるが、本分析ではｏ−フェニレンジアミンジハイドロクロライド、ｏ−ジアニジジン、 Na−２−OH-３−５−ジクロロベンゼンスルホネート、２，２'−アジノ−ジ(３−エチルベンズチアゾリン)−６−スルホン酸(ABTS)、８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸（ＡＮＳ）及び４−ヨードフェノールを付随的に共反応試薬とする４−アミノアンチピリンクロモトロピック酸を使用できる。
【００３２】
この発明のおける、血液試料のハプトグロビン濃度を決める好ましい分析法は以下の工程を含んでいる。
【００３３】
a)試験に供される試料、ヘモグロビン及び界面活性剤、ジスルフィド結合に対して有効な還元剤またはカオトロピック剤、及びたんぱく質結合阻害剤を含有する反応混合物を形成する工程；
【００３４】
b)反応混合物の成分を反応させ、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体を形成させる工程；及び
【００３５】
c)錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に減少させるか、実質的に不活性化するような酸性下で前記ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性をクロモゲン基質を用いて分光光学手段により測定する工程。
【００３６】
この発明における特に好ましい分析は、たんぱく質結合阻害剤/クロモゲン共反応剤である８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸(ANS)をクロモゲン基質である４−アミノアンチピリン及びフェノールと共に用いる場合である。ANSは過酸化水素が４−アミノアンチピリンと共酸化反応するさいにフェノールを補充する。この共酸化反応で青色クロモゲンが形成され、これは６００ｎｍの光を吸収し、フェノールのみを共反応剤として用いた以外は同条件において生成した赤色クロモゲンよりも強い吸収を示す。ANSと４−アミノアンチピリンの組み合わせはペルオキサイドの定量において以前に報告されている。（Chung et al,(1993), Talanta 40, p981-988）。
【００３７】
本発明は本発明によるハプトグロビン分析に用いるキットもまた提供する。そのキットは下記のi)、ii)及びiii)を含む。
ｉ）ヘモグロビン；
ii) ａ）ジスルフィド結合に対して有効な還元剤、ｂ）たんぱく質結合阻害剤、及び／またはｃ）カオトロピック剤から独立して選択される、アルブミン及び／または他のたんぱく類が分析に与える影響を減少させるような少なくとも一つの反応剤試薬；及び
iii)ペルオキシダーゼ活性量を測定用のクロモゲン。
【００３８】
上記キットは更に分析に望ましいｐＨに維持するためのバッファー、界面活性剤及び/ または既知のハプトグロビン濃度の標準血清といった成分を含んでいても良い。当業者にとっては明らかなように、キットの成分は、試験管、微量滴定プレート、及び分光光度計といった機器を用いてハプトグロビンの分析を行うことができる。これは、ここで述べる自動生化学分析においても同様である。
【００３９】
本発明は以下の実施例によって説明されるが、本発明がこれらの実施例に限定されるわけではない。
【００４０】
実施例１ 本発明の分析法を用いたハプトグロビン濃度の自動定量方法
[反応試薬]
保存溶液
0.9％(ｗ／ｖ) NaCl (塩溶液)
ヘモグロビン(Ｈｂ)保存溶液（30ｇ／Ｌ）はMakimura及びSuzuki(1982, Jpn J Vet Sci, 44 15-21) の方法に従って準備された。
クロモゲンクエン酸緩衝溶液：ｐＨ3.8のクエン酸緩衝液(0.5ｍｏｌ／Ｌ)、0.01％のチオメルサレートを含む保存溶液
【００４１】
作業溶液
Ｈｂ作業溶液：Ｈｂ保存溶液を塩溶液で５００倍に薄める（５０μＬを２５ｍＬに）。
作業クロモゲン緩衝溶液：フェノール（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、４−アミノフェナゾン（４−アミノアンチピリン）（１．６ｍｍｏｌ／Ｌ）、８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ジチオエリスリトール（０．３９ｍｍｏｌ／Ｌ）、tween ２０(１％)を含むクロモゲンクエン酸緩衝溶液。
基質：過酸化水素（H2O2）１００μＬの過酸化水素水(３０％)を２５ｍＬのdH2Oに加える。
標準：ハプトグロビン濃度が2.05ｇ／Ｌの溶液をBSA(２％)に希釈して、濃度を1.03、0.51、0.125ｇ／Ｌとしたもの。及びゼロ（ブランク）としてBSA(２％)を用いる。
試料：血清または血漿。
対照用試料：Ｈｐ濃度が既知の血清（高濃度、低濃度）、それぞれの分析で繰り返し用いられる。
検定：１日１回。
【００４２】
[MIRA(Roche Diagnostics Ltd) 分析器を用いる方法]
自動分析器(MIRA)は３７℃に保持されている。
a) 反応試薬ラックにおいて、希釈されたヘモグロビンが反応試薬(２０ｍＬ)、クロモゲン緩衝作業溶液が初期反応試薬１(１０ｍＬ)、及び過酸化水素が初期反応試薬２(１０ｍＬ)である。
b) 7.5μＬの標準、試験用試料または対照用試料を２００μＬヘモグロビンと混合する。
c) ５０秒後、９０μＬのクロモゲンを加える。
d) さらに２５秒後、５０μＬの基質（H2O2）を加え、６００ｎｍでの吸光度増加を測定する。
e) 次の５０秒間にかけての吸収の変化は、標準と未知試料の吸収変化を比較することで結果を計算するのに用いた。
【００４３】
たいていのウシ科動物または羊のような動物試料においては、ハプトグロビン濃度が２ｇ／Ｌの場合、分析結果は十分に直線となる。他の種類の動物に対しては、２ｇ／Ｌ以上の試料は希釈が必要である。
【００４４】
[結果]
方法で述べた、完全なクロモゲン溶液を用いたMIRA分析器によるハプトグロビン分析の典型的な結果を表１に示した。標準試料ではハプトグロビン濃度と６００ｎｍにおける吸光度変化は直線的な関係を示した（表中には示していない）。
【００４５】
この結果からこのクロモゲン溶液がアルブミンの効果を除去するのに効果的であることが明らかになった。BSA（５％）及び胎児ウシ血清においても同様に、結果は0.01ｍｇ／ｍＬ以下であった。これはアルブミンの結合が除去されていない実施例２の結果と比較するとよい。
【００４６】
【表１】
【００４７】
２パーセントBSAが標準を希釈する溶媒として、そしてたんぱく質マトリックスを希釈するゼロ標準として用いられる。そしてこの実施例により、分析用ブランクとして用いたとき、NaCl溶液と比べて、ODの変化が小さく、違いは0.004吸収単位(ＡＵ)であった。
【００４８】
実施例２ アルブミンの結合を阻害しないで、ペルオキシダーゼ反応試薬を用いた場合
アルブミンの分析に対する影響を示すために、アルブミンの効果を阻害するのに使われていた反応剤（ANS 、ジチオエリスリトール、及びtween ２０）を除いて、比較分析を行った。
この実施例では、クロモゲン溶液が８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸、ジチオエリスリトール、またはtween ２０を含んでいないことを別にすれば、他の条件は実施例１と同様にして、分析を行った。反応試薬はフェノール(２０ｍｍｏｌ／Ｌ)を含み、クロモゲン共反応試薬として4-アミノフェナゾン（4-アミノアンチピリン）（1.6ｍｍｏｌ／Ｌ）を含んでいる。そして５００ｎｍでの吸収を測定した。
【００４９】
[結果]
表２に示すように、５％のアルブミンの吸光度に対する影響はかなり大きいい。試料中のハプトグロビン濃度の定量分析を行った場合、ハプトグロビン濃度は0.59ｍｇ/ｍＬであると間違った結果を示した。胎児ウシ血清もまた大きな反応を示し、ハプトグロビンの存在を示唆する間違った陽性結果を与えた。
【００５０】
この実施例で注目すべき点は更に、吸光度の最大変化は実施例１でANSを含む場合は1.0093ＡＵであったが、本実施例ではわずかに0.162ＡＵであった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
実施例３ 診断における本発明のハプトグロビン分析
実施例１に示した方法を用いて、乳腺の急性炎症反応を引き起こす感染症である乳腺炎にかかった９頭の乳牛から得た血清に対してハプトグロビン濃度が定量された。研究室に提出された、炎症や感染症を有していない乳牛からの１２の血清（Dr.J.L.Fitzpatrick, department of Veterinary Clinical studies, University of Glasgow Veterinary Schoolとの共同研究から）に対してもハプトグロビン分析を行った。
【００５３】
【表３】
【００５４】
乳腺炎である乳牛のハプトグロビン濃度の平均値は炎症を有していない乳牛の値に比べて10倍大きかった。感染動物において濃度に大きな幅があるのは、感染の段階の違う動物からの試料であり、急性期のピークにおけるものや回復期におけるものがあるからである。
【００５５】
感染していない動物のハプトグロビン濃度は全てが０ｍｇ／ｍＬではない。これはたぶん、炎症症状が明らかに見られない状態では、動物は準臨床的な状態にあり、濃度を少し上げるからである。無菌状態に置かれた動物以外の大部分の動物はこのような低レベルのハプトグロビンを有しているとが考えられる。しかし一般的にそれがどの程度のものかを明確にするには、更なる研究が必要である。しかしながら、この分析は乳腺炎における急性反応を証明するのに効果的であった。
【００５６】
実施例４ ペルオキシダーゼ効果を減少させる反応剤を用いずに、界面活性剤のみを用いたハプトグロビン分析
血清中のハプトグロビン分析に対する、またはアルブミンの存在に対する界面活性剤のみの効果を評価するために、Schmitt et al の推奨する条件（米国特許第4,695,552号）を真似て反応試薬を用い、比較分析を行った。この実施例では反応剤と、分析器への仕込み条件を変更し、MIRA分析器を用いて、自動分析を行った。
【００５７】
[反応試薬]
Ｈｂ作業溶液：実施例１のようにＨｂ貯蔵溶液から調製した。
クロモゲン緩衝液：ｐＨ4.0のクエン酸ナトリウム（0.1ｍｏｌ／Ｌ）、２，２'−アジノ−ジ（３エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）(0.5ｍｏｌ／Ｌ)、サポニン(３ｇ／Ｌ)。
基質：過ホウ酸ナトリウム(３２ｍｍｏｌ／Ｌ)
標準：NaCl溶液を用いて希釈することを除けば、実施例１と同様。
対照試料は実施例１と同様。
【００５８】
[MIRA（Roche Diagnostic Ltd）分析器の使用方法]
自動分析器は３７℃に保たれている。
a) 反応試薬ラックでは希釈したＨｂが反応試薬(２０ｍＬ)で、ABS/サポニン クロモゲンが開始反応試薬１(１０ｍＬ)、及び過ホウ酸ナトリウムが開始反応試薬２(１０ｍＬ)である。
b) 2.5μＬの標準、試験用試料または対照用試料を２００μＬのヘモグロビンと混合する。
c) ５０秒後、９０μＬのクロモゲンを追加する。
d) さらに２５秒後、２０μＬ基質（過ホウ酸ナトリウム）を加え、４０５ｎｍにおける吸光度増加を測定する。
e) 続く５０秒間の吸収変化は、標準試料の吸光度の変化を対象用試料の吸光度の変化と比較した結果を計算するのに用いた。
【００５９】
[結果]
【表４】
表４に示すように、２％と５％(ｗ／ｖ)のウシ科動物血清アルブミンは、このクロモゲン/界面活性剤系の吸光度変化に大きな効果がある。そして、0.31〜0.72ｍｇ／ｍＬのハプトグロビンを含むという、間違った結果が、２０〜５０ｇ／Ｌのアルブミンを含み、ハプトグロビンを含まない血清試料に対して示された。多種の動物において、アルブミンの標準値は２５〜４０ｇ／Ｌのオーダーであり、この程度の濃度のアルブミンでは、ハプトグロビン分析は実質的に影響されない。
【００６０】
実施例５ ペルオキシダーゼ効果を減少させるような反応剤を含まず、界面活性剤濃度を増加させたハプトグロビン分析
血清や血漿中のハプトグロビンを、サポニンの濃度を２５ｇ／Ｌに増加させ、他の条件は実施例４（クロモゲンとしてABTS）と同様に分析した。結果を表５に示した。
【００６１】
【表５】
サポニンを２５ｇ／Ｌに増加することによって、アルブミン効果の顕著な増加が見られた。２％と５％のアルブミンにおける吸光度がそれぞれ変化し、見かけ上、高いレベルのハプトグロビンを示すに至った。
【００６２】
実施例６ 界面活性剤の不存在下における、本発明によるハプトグロビン分析
Tween ２０のような界面活性剤を反応試薬混合物から除いている以外は実施例１と同様な方法が使用された。試料量は2.5μＬ、過酸化水素反応試薬の量は２０μＬである。
【００６３】
【表６】
【００６４】
界面活性剤がない状態では、アルブミン効果は若干ながら明らかであった。すなわち、２％と５％のアルブミンや胎児ウシ血清の試料の６００ｎｍにおける吸光度はNaClのみの試料に比べて大きかった。反応後のセルの視覚的検査により、全ての反応混合物中で沈殿が起こっていることがわかった。このことは７５秒後の吸光度に反映されており、それぞれのセルの吸光度は同様に、tween ２０の存在下で反応した場合に比べ平均で４倍も大きくなっている。
（表７）
【００６５】
【表７】
【００６６】
７５秒後の吸光度はクロモゲン溶液を試料とヘモグロビンの混合物に加えた直後で、かつ過酸化水素の添加の直前に測定する。クロモゲン溶液とヘモグロビン溶液とを混合することで沈殿が生じることは明らかであり、この沈殿はtween ２０などの界面活性剤により生成を防ぐことができる。そして沈殿が吸光度に与える効果にはかなり幅があり、吸光度は0.1870から0.3151に及ぶ。沈殿は試料がNaCl溶液のときにも生成し、これらの結果により、界面活性剤は反応試薬の溶解性を保持するためにハプトグロビンの分析に必要となる場合があることがわかる。
【００６７】
実施例７ 実験室レベルにおける本発明によるハプトグロビン分析
実施例1に示した方法を用いて、ラットの血清中のハプトグロビン濃度を決定した。これはBordetella pertussis bacteria(百日咳)の病原性の実験的調査（Dr. R. Parton, Institute of Biochemical and Life Sciences, University of Glasgowとの共同研究）の一部である。感染から８日後、６匹の感染ラット（Sprague-Dawley）と６匹の非感染ラットからそれぞれ血清を採取し、ハプトグロビン分析まで-２０℃で保管した。
【００６８】
【表８】
実施例１と同様の分析により定量したハプトグロビン濃度はB pertussis の感染によって、４倍以上に増加したことがわかった。これにより宿主が感染に応答するという、実験室的研究において、ハプトグロビン分析の有用性を証明した。
【００６９】
実施例８ ジスルフィド結合還元剤に代えて、カオトロピック剤を用いたハプトグロビン濃度の自動分析方法
Ｈｂ作業溶液がグアニジン塩酸塩(0.5ｍｏｌ／Ｌ)を含む、食塩水として調製され、作業クロモゲン緩衝溶液がフェノール(２０ｍｍｏｌ／Ｌ)、４-アミノフェナゾン（４-アミノアンチピリン）(1.6ｍｍｏｌ／Ｌ) 、８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸、tween ２０(１％)を含んでいるクエン酸緩衝溶液であり（すなわち、ジチオエリスリトールは除いてある）、試料量は2.5μＬである。
【００７０】
【表９】
【００７１】
結果として以下のことが示された。グアニジン塩酸塩のようなカオトロピック試薬を用いると、ペルオキシダーゼ活性に対するアルブミンの影響が抑制される。そして２％までのアルブミンは分析に影響を与えない、一方５％までなら、微細な影響を与えるのみである。
ハプトグロビン(Ｈｐ)は人間や動物の血中に存在するたんぱく質である。血液細胞を分離した後の血漿や血清中のＨｐ濃度はそれぞれの動物で異なり、その動物の健康状態に関係している。Ｈｐは感染、炎症または外傷によって濃度が劇的に増加するたんぱく類の一種である。これらのたんぱく質は急性期たんぱく質と呼ばれている。
【０００２】
血漿中のＨｐ濃度を測定することは、人を診断する臨床医及び獣医学にとって価値ある診断情報を提供する。獣医学において、Ｈｐを測定することは牛や羊の健康状態を評価する上で特に重要である。なぜならこれらの種ではＨｐが感染に対して特に強い反応を示し、循環血中濃度が１００倍にも増加する。他の種において、例えば人間、犬、猫及び豚においても、血漿濃度は２から３倍に増加し、これは診断情報を与えるのに十分であるため、Ｈｐの測定は重要である。さらにこれら他の種においては、Ｈｐ濃度の低下は溶血性貧血を示唆するので、診断情報として価値がある。さらに、Ｈｐの測定はげっ歯動物またはネズミといった実験室用動物の、炎症や感染のマーカーとしても同様に重要である。
【０００３】
現在Ｈｐの分析は、免疫検定法またはＨｐのヘモグロビン(Ｈｂ)への吸着能に基づいている。
【０００４】
人間の血漿中のＨｐの測定は、臨床生化学研究所において、急性期応答を調べるための慣用の試験法として、人間のＨｐに特異的な抗血清を用いて、抗体に基づく方法により行われている。最も汎用されている方法は免疫比濁分析であり、溶液中の抗体―Ｈｐ錯体の沈殿の形成を測定し、Ｈｐ濃度に関連付けている。しかし、免疫比濁分析評価は、適切な抗血清を連続的に供給するといった準備が必要であり、通常の生化学的試験に比べてコストがかかる。それに加えて、動物診断用施設においては、ある種に対する抗血清に基づく試験は、それぞれの種に対して検証しなければならず、そして新しい抗血清を用いたら、その都度検証を繰り返さなければならない。
【０００５】
ＨｐとＨｂの結合に基づく最初の分析は、Ｈｐ-Ｈｂ錯体（複合体）の形成が血漿試料中のＨｐ濃度に応じて、Ｈｂに特有な分光光学的な吸光度を変化させる、という発見に基づいている。しかしこの方法は、微かに酸性な条件下で検出される、錯体に固有のペルオキシダーゼ活性を利用する方法に取って替わられた。遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が阻害されて、錯体の活性がＨｐ含有量に比例的になるときは、これよりＨｐの標準試料に基づく検量線から、定量することができる。
【０００６】
この分析法は、現在Ｈｐ分析を行っている動物診断用施設の大部分において採用され、免疫分析システムよりも多用されている。なぜなら検証についての要求が穏やかで、全ての種に適用でき、そして試薬が安価なので、抗体を使う分析法に比べはるかにコストがかからないからである。しかしこの試験の自動化版はグアイアコールという試薬を用い、これは不快な臭気を発するため、多くの研究施設のスタッフに受け入れられなかった。この分析法が試薬提供業者に一般的に受け入れられなかったのもこの理由による。ペルオキシダーゼ反応に他の試薬を用いようとする試みがなされ、テトラメチルベンジジン(TMB)を用いる手作業による方法が開発された（Conner J. et al Research in Vet. Sci.(1988) 44, 82-88）。しかしＨｐの自動分析はまだ実用化されていない。これはTMBが不安定だからであろう。本発明者らによって、ハプトグロビンを含まない血清試料（ブランク）がかなりのレベルのペルオキシダーゼ活性を示し、TMBによる誤った陽性結果を示すと報告された。そしてこの見せかけのペルオキシダーゼ活性が、自動化または半自動化する際に障害になると考えられる。
【０００７】
米国特許第4,695,552号は上記の方法に似た、Ｈｐ-Ｈｂ錯体の定量方法を示している。しかし、ここでは酸性のｐＨが遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を完全に不活性化するのに十分ではないとして、遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に除去するために界面活性剤を加えている。しかしながら、血清または血漿中に存在する成分が分析の正確さに影響を与え得るという点は全く示されていない。
【０００８】
この発明の目的の一つは、これまで述べた、不利益を一つでも解消し、軽減することである。
【０００９】
この発明は、試料血液中に存在するアルブミン及び、おそらく他のたんぱく類が上記した形式の分析にとって有用でない「ペルオキシダーゼ効果」を示しているという本発明者による発見に一部基づいている。
【００１０】
よって、この発明は試料中のハプトグロビン濃度を決定する分析方法を提供する。その分析方法は以下に示す工程から成り立っている。
【００１１】
ａ）試料、ヘモグロビン、及び試料中に存在するアルブミン及び／またはその他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試薬を含む反応混合物を形成する工程；
【００１２】
ｂ）前記試料、ヘモグロビン、及び前記の少なくとも一つの反応試薬を反応させて、ハプトグロビン／ヘモグロビン錯体を形成させる工程；及び
【００１３】
ｃ）錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に減少させるか、実質的に不活性化するような酸性ｐＨ条件下で前記ハプトグロビン／ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量を測定する工程。
【００１４】
錯形成していないヘモグロビンは酸性ｐＨでペルオキシダーゼ活性を示すが、この活性はｐＨ4.1で不活性化されると以前報告された。（Makimura, S. and Suzuki, N. (1982) Jpn. J. Ven. Sci. 44, p15-21.）しかし米国特許第4,685,552号によって、そのようなｐＨにおいても低レベルのペルオキシダーゼ活性が残ることが示された。それゆえ本分析に於いてはｐＨを4.1以下に、例えば3.6〜4.0に、特に3.8とした。
【００１５】
一般的には試料は血漿や血清などの血液試料である。試料はどの動物から得られるものでも良いが特に、人間を含む霊長類と同様に、げっ歯動物、ウシ科動物、羊のような動物、イヌ科動物、ネコ科動物、豚のような動物、馬のような動物などの哺乳類由来のものが挙げられる。また試料はミルクや腹水その他の体液でもよいし、またはイン・ビトロ培養媒体でもよい。
【００１６】
もし試料中のハプトグロビン濃度が２ｇ／Ｌより大きいならば、試料は希釈する必要がある。なぜなら高濃度では標準プロットが直線にはならず、ハプトグロビン濃度を正確に求めることができないからである。しかし試験結果の直線性を増して、希釈を必要としなくなるような試験操作が開発され得ることは当業者には容易に理解できるだろう。例えば、適当な状況ではより少ない試料を用いてもよい。
【００１７】
ヘモグロビンは血液試料を採取した動物と同種の動物から採取したものでよい。つまり、もし試験対象がウシ科動物ならば、ウシ科動物のヘモグロビンが使用されることになる。しかし、有利なことに、試験試料の動物と異なる種類の動物のヘモグロビンを用いても分析できることがわかった。こうしてただ一種のヘモグロビンを用いることで、多種類にわたる動物に対して分析が可能であることがわかった。ヘモグロビンは好ましくはメトヘモグロビンであるが、場合によってはオキシヘモグロビンも使用できる。
【００１８】
全種動物から得られる血清や血漿にはアルブミンが含まれており、よってこのたんぱく質は、４０ｇ／Ｌほどの濃度で試験試料中に存在している。本発明者らはブランクとして測定する際のゼロ試料として用いる、最適溶媒を探索している際に、アルブミンが分析に大きく干渉していることがわかった。この干渉はアルブミン濃度が１、５、１０％(１０、５０、１００ｇ／Ｌ)において見られた。
【００１９】
アルブミンは固有のペルオキシダーゼ活性を示さないとされている。理論による裏付けは別として、血清、血漿または他の試験試料中に存在する、アルブミン及び他のたんぱく類がヘモグロビンまたはヘモグロビンから遊離したヘマチンに結合して、通常ヘモグロビンがペルオキシダーゼ活性を示さないようなｐＨ(ｐＨ3.6〜4.0)においてもペルオキシダーゼ活性を保持していることが考えられる。さらにこれが自動吸光分光分析が今まで一般的に採用されなかった理由である。つまりハプトグロビンが存在しない状態でペルオキシダーゼ活性がゼロにならないのである。以前は試料を大幅に希釈（５００倍）したり、不活性なクロモゲン（例えばグアイアコール）を使うことで、無意識にまたは偶発的にこの「ペルオキシダーゼ効果」が最小限にされていた。
【００２０】
しかし本発明によれば、試料中のアルブミンや他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試薬を用いることにより、試料の大幅な希釈を必要とせず、より活性なクロモゲンを使用できる。
【００２１】
試料中に存在するアルブミンまたは他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの前記反応試薬は、ａ）ジスルフィド結合に対して有効な還元剤、ｂ）たんぱく質結合阻害剤、及び／またはｃ）カオトロピック剤から独立して選択される。
【００２２】
好ましくは二種もしくはそれ以上の前記反応試薬が「ペルオキシダーゼ効果」を減少するために用いられる。しかし当業者ならわかるであろうが、前記の反応剤を多量に用いると、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯形成反応を阻害するので、避けなければならない。例えば、８-アニリノ-１-ナフチレンスルホン酸 (ANS)をたんぱく質結合阻害剤として、そしてジチオスレイトールをジスルフィド結合に対して効果的な還元剤として、それぞれ約１０ｍｍｏｌ／Ｌ、４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した場合、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性をほぼ完全に阻害する結果となる。このように当業者は適切に調整することにより、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量に実質上影響を与えずに、見せかけの「ペルオキシダーゼ効果」のみを減少させることができる。
【００２３】
通常、ジスルフィド結合に有効な還元剤はジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、４，４‘−ジチオジピリジン、または５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸）である。
【００２４】
典型的なたんぱく質結合阻害剤はANS、プロトポルフィリン、ビリルビン、タウロデオキシコール酸類 (胆汁塩類) 、ジクマロール、２−メルカプトベンゾチアゾールである。
【００２５】
典型的なカオトロピック剤はグアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウムである。
【００２６】
好ましくは、分析において界面活性剤も使用する。最初、本発明者らによって、界面活性剤の使用は試料中のアルブミンや他のたんぱく質によるペルオキシダーゼ効果を減少させるのに重要であると考えられていた。界面活性剤はこのような効果を有しているようであるが、それとともに分析において他の成分の可溶化を保持する上で重要であることがわかった。さらにまた、低濃度の界面活性剤が好ましい、なぜなら高濃度( 例えば、２５ｇ／Ｌ)ではみかけのペルオキシダーゼ効果を増加させるからである。このように、界面活性剤は好ましくは、２０ｇ／Ｌ以下の全濃度で、さらに好ましくは１０ｇ／Ｌ以下の全濃度で反応混合物に加えられる。
【００２７】
典型的な界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビトールエステル（Tween ２０，４０，６０，８０など）；ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチフェノール（Triton Ｘ−４５，Ｘ−１００など）；及び／またはポリオキシエチレン（ＰＥＧ）アルコール類（Brij ３５，３６など）のような非イオン性界面活性剤、またはドデシル硫酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、及びセトリミドのようなイオン性界面活性剤である。
【００２８】
典型的には試料中のハプトグロビンと添加したヘモグロビンは２０分以内で反応させる、好ましくは１０分以内、より好ましくは５分以内である。
【００２９】
一度、前記ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体が形成されれば、遊離ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性は分析における酸性ｐＨ条件により実質的に阻害されているので、錯体の固有のペルオキシダーゼ活性を利用し、錯体を検出することが可能である。次に、既知濃度のハプトグロビンを用いて作成した標準曲線を参照することにより、ペルオキシダーゼ活性レベルを試料中のハプトグロビンレベルに関連付けることができる。
【００３０】
典型的には前記ペルオキシダーゼ活性はクロモゲン（色原体）と過酸化水素を用い検出する。つまりペルオキシダーゼ活性は結果としてクロモゲンの色の変化として表され、これは特定波長で分光光学的に検出される。このようなクロモゲン基質を用いたペルオキシダーゼの検出は、ヘモグロビン濃度、グルコース濃度、そして以前のアルブミンが分析に対して影響を及ぼすことが知られていないときのハプトグロビン濃度の分析の分野においてよく知られている。以下に例を示す。Bauer, K. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981) Vol. 19 pp971-976; Reijic, R. et al, Clin. Chem. (1992) Vol. 38 pp522-525 and Conner, J.G. and Eckersall, P.D. Research in Vet. Sci. (1988), 44, pp82-88 。
【００３１】
上記論文中に記載された、クロモゲン基質（４−アミノフェノゾン、２−アミノ−４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸(AHBS)、テトラメチルベンジジン(TMB)）と同様に、当業者にとっては明らかであるが、本分析ではｏ−フェニレンジアミンジハイドロクロライド、ｏ−ジアニジジン、 Na−２−OH-３−５−ジクロロベンゼンスルホネート、２，２'−アジノ−ジ(３−エチルベンズチアゾリン)−６−スルホン酸(ABTS)、８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸（ＡＮＳ）及び４−ヨードフェノールを付随的に共反応試薬とする４−アミノアンチピリンクロモトロピック酸を使用できる。
【００３２】
この発明のおける、血液試料のハプトグロビン濃度を決める好ましい分析法は以下の工程を含んでいる。
【００３３】
a)試験に供される試料、ヘモグロビン及び界面活性剤、ジスルフィド結合に対して有効な還元剤またはカオトロピック剤、及びたんぱく質結合阻害剤を含有する反応混合物を形成する工程；
【００３４】
b)反応混合物の成分を反応させ、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体を形成させる工程；及び
【００３５】
c)錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に減少させるか、実質的に不活性化するような酸性下で前記ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性をクロモゲン基質を用いて分光光学手段により測定する工程。
【００３６】
この発明における特に好ましい分析は、たんぱく質結合阻害剤/クロモゲン共反応剤である８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸(ANS)をクロモゲン基質である４−アミノアンチピリン及びフェノールと共に用いる場合である。ANSは過酸化水素が４−アミノアンチピリンと共酸化反応するさいにフェノールを補充する。この共酸化反応で青色クロモゲンが形成され、これは６００ｎｍの光を吸収し、フェノールのみを共反応剤として用いた以外は同条件において生成した赤色クロモゲンよりも強い吸収を示す。ANSと４−アミノアンチピリンの組み合わせはペルオキサイドの定量において以前に報告されている。（Chung et al,(1993), Talanta 40, p981-988）。
【００３７】
本発明は本発明によるハプトグロビン分析に用いるキットもまた提供する。そのキットは下記のi)、ii)及びiii)を含む。
ｉ）ヘモグロビン；
ii) ａ）ジスルフィド結合に対して有効な還元剤、ｂ）たんぱく質結合阻害剤、及び／またはｃ）カオトロピック剤から独立して選択される、アルブミン及び／または他のたんぱく類が分析に与える影響を減少させるような少なくとも一つの反応剤試薬；及び
iii)ペルオキシダーゼ活性量を測定用のクロモゲン。
【００３８】
上記キットは更に分析に望ましいｐＨに維持するためのバッファー、界面活性剤及び/ または既知のハプトグロビン濃度の標準血清といった成分を含んでいても良い。当業者にとっては明らかなように、キットの成分は、試験管、微量滴定プレート、及び分光光度計といった機器を用いてハプトグロビンの分析を行うことができる。これは、ここで述べる自動生化学分析においても同様である。
【００３９】
本発明は以下の実施例によって説明されるが、本発明がこれらの実施例に限定されるわけではない。
【００４０】
実施例１ 本発明の分析法を用いたハプトグロビン濃度の自動定量方法
[反応試薬]
保存溶液
0.9％(ｗ／ｖ) NaCl (塩溶液)
ヘモグロビン(Ｈｂ)保存溶液（30ｇ／Ｌ）はMakimura及びSuzuki(1982, Jpn J Vet Sci, 44 15-21) の方法に従って準備された。
クロモゲンクエン酸緩衝溶液：ｐＨ3.8のクエン酸緩衝液(0.5ｍｏｌ／Ｌ)、0.01％のチオメルサレートを含む保存溶液
【００４１】
作業溶液
Ｈｂ作業溶液：Ｈｂ保存溶液を塩溶液で５００倍に薄める（５０μＬを２５ｍＬに）。
作業クロモゲン緩衝溶液：フェノール（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、４−アミノフェナゾン（４−アミノアンチピリン）（１．６ｍｍｏｌ／Ｌ）、８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ジチオエリスリトール（０．３９ｍｍｏｌ／Ｌ）、tween ２０(１％)を含むクロモゲンクエン酸緩衝溶液。
基質：過酸化水素（H2O2）１００μＬの過酸化水素水(３０％)を２５ｍＬのdH2Oに加える。
標準：ハプトグロビン濃度が2.05ｇ／Ｌの溶液をBSA(２％)に希釈して、濃度を1.03、0.51、0.125ｇ／Ｌとしたもの。及びゼロ（ブランク）としてBSA(２％)を用いる。
試料：血清または血漿。
対照用試料：Ｈｐ濃度が既知の血清（高濃度、低濃度）、それぞれの分析で繰り返し用いられる。
検定：１日１回。
【００４２】
[MIRA(Roche Diagnostics Ltd) 分析器を用いる方法]
自動分析器(MIRA)は３７℃に保持されている。
a) 反応試薬ラックにおいて、希釈されたヘモグロビンが反応試薬(２０ｍＬ)、クロモゲン緩衝作業溶液が初期反応試薬１(１０ｍＬ)、及び過酸化水素が初期反応試薬２(１０ｍＬ)である。
b) 7.5μＬの標準、試験用試料または対照用試料を２００μＬヘモグロビンと混合する。
c) ５０秒後、９０μＬのクロモゲンを加える。
d) さらに２５秒後、５０μＬの基質（H2O2）を加え、６００ｎｍでの吸光度増加を測定する。
e) 次の５０秒間にかけての吸収の変化は、標準と未知試料の吸収変化を比較することで結果を計算するのに用いた。
【００４３】
たいていのウシ科動物または羊のような動物試料においては、ハプトグロビン濃度が２ｇ／Ｌの場合、分析結果は十分に直線となる。他の種類の動物に対しては、２ｇ／Ｌ以上の試料は希釈が必要である。
【００４４】
[結果]
方法で述べた、完全なクロモゲン溶液を用いたMIRA分析器によるハプトグロビン分析の典型的な結果を表１に示した。標準試料ではハプトグロビン濃度と６００ｎｍにおける吸光度変化は直線的な関係を示した（表中には示していない）。
【００４５】
この結果からこのクロモゲン溶液がアルブミンの効果を除去するのに効果的であることが明らかになった。BSA（５％）及び胎児ウシ血清においても同様に、結果は0.01ｍｇ／ｍＬ以下であった。これはアルブミンの結合が除去されていない実施例２の結果と比較するとよい。
【００４６】
【表１】
２パーセントBSAが標準を希釈する溶媒として、そしてたんぱく質マトリックスを希釈するゼロ標準として用いられる。そしてこの実施例により、分析用ブランクとして用いたとき、NaCl溶液と比べて、ODの変化が小さく、違いは0.004吸収単位(ＡＵ)であった。
【００４８】
実施例２ アルブミンの結合を阻害しないで、ペルオキシダーゼ反応試薬を用いた場合
アルブミンの分析に対する影響を示すために、アルブミンの効果を阻害するのに使われていた反応剤（ANS 、ジチオエリスリトール、及びtween ２０）を除いて、比較分析を行った。
この実施例では、クロモゲン溶液が８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸、ジチオエリスリトール、またはtween ２０を含んでいないことを別にすれば、他の条件は実施例１と同様にして、分析を行った。反応試薬はフェノール(２０ｍｍｏｌ／Ｌ)を含み、クロモゲン共反応試薬として4-アミノフェナゾン（4-アミノアンチピリン）（1.6ｍｍｏｌ／Ｌ）を含んでいる。そして５００ｎｍでの吸収を測定した。
【００４９】
[結果]
表２に示すように、５％のアルブミンの吸光度に対する影響はかなり大きいい。試料中のハプトグロビン濃度の定量分析を行った場合、ハプトグロビン濃度は0.59ｍｇ/ｍＬであると間違った結果を示した。胎児ウシ血清もまた大きな反応を示し、ハプトグロビンの存在を示唆する間違った陽性結果を与えた。
【００５０】
この実施例で注目すべき点は更に、吸光度の最大変化は実施例１でANSを含む場合は1.0093ＡＵであったが、本実施例ではわずかに0.162ＡＵであった。
【００５１】
【表２】
実施例３ 診断における本発明のハプトグロビン分析
実施例１に示した方法を用いて、乳腺の急性炎症反応を引き起こす感染症である乳腺炎にかかった９頭の乳牛から得た血清に対してハプトグロビン濃度が定量された。研究室に提出された、炎症や感染症を有していない乳牛からの１２の血清（Dr.J.L.Fitzpatrick, department of Veterinary Clinical studies, University of Glasgow Veterinary Schoolとの共同研究から）に対してもハプトグロビン分析を行った。
【００５３】
【表３】
乳腺炎である乳牛のハプトグロビン濃度の平均値は炎症を有していない乳牛の値に比べて10倍大きかった。感染動物において濃度に大きな幅があるのは、感染の段階の違う動物からの試料であり、急性期のピークにおけるものや回復期におけるものがあるからである。
【００５５】
感染していない動物のハプトグロビン濃度は全てが０ｍｇ／ｍＬではない。これはたぶん、炎症症状が明らかに見られない状態では、動物は準臨床的な状態にあり、濃度を少し上げるからである。無菌状態に置かれた動物以外の大部分の動物はこのような低レベルのハプトグロビンを有しているとが考えられる。しかし一般的にそれがどの程度のものかを明確にするには、更なる研究が必要である。しかしながら、この分析は乳腺炎における急性反応を証明するのに効果的であった。
【００５６】
実施例４ ペルオキシダーゼ効果を減少させる反応剤を用いずに、界面活性剤のみを用いたハプトグロビン分析
血清中のハプトグロビン分析に対する、またはアルブミンの存在に対する界面活性剤のみの効果を評価するために、Schmitt et al の推奨する条件（米国特許第4,695,552号）を真似て反応試薬を用い、比較分析を行った。この実施例では反応剤と、分析器への仕込み条件を変更し、MIRA分析器を用いて、自動分析を行った。
【００５７】
[反応試薬]
Ｈｂ作業溶液：実施例１のようにＨｂ貯蔵溶液から調製した。
クロモゲン緩衝液：ｐＨ4.0のクエン酸ナトリウム（0.1ｍｏｌ／Ｌ）、２，２'−アジノ−ジ（３エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）(0.5ｍｏｌ／Ｌ)、サポニン(３ｇ／Ｌ)。
基質：過ホウ酸ナトリウム(３２ｍｍｏｌ／Ｌ)
標準：NaCl溶液を用いて希釈することを除けば、実施例１と同様。
対照試料は実施例１と同様。
【００５８】
[MIRA（Roche Diagnostic Ltd）分析器の使用方法]
自動分析器は３７℃に保たれている。
a) 反応試薬ラックでは希釈したＨｂが反応試薬(２０ｍＬ)で、ABS/サポニン クロモゲンが開始反応試薬１(１０ｍＬ)、及び過ホウ酸ナトリウムが開始反応試薬２(１０ｍＬ)である。
b) 2.5μＬの標準、試験用試料または対照用試料を２００μＬのヘモグロビンと混合する。
c) ５０秒後、９０μＬのクロモゲンを追加する。
d) さらに２５秒後、２０μＬ基質（過ホウ酸ナトリウム）を加え、４０５ｎｍにおける吸光度増加を測定する。
e) 続く５０秒間の吸収変化は、標準試料の吸光度の変化を対象用試料の吸光度の変化と比較した結果を計算するのに用いた。
【００５９】
[結果]
【表４】
【００６０】
実施例５ ペルオキシダーゼ効果を減少させるような反応剤を含まず、界面活性剤濃度を増加させたハプトグロビン分析
血清や血漿中のハプトグロビンを、サポニンの濃度を２５ｇ／Ｌに増加させ、他の条件は実施例４（クロモゲンとしてABTS）と同様に分析した。結果を表５に示した。
【００６１】
【表５】
【００６２】
実施例６ 界面活性剤の不存在下における、本発明によるハプトグロビン分析
Tween ２０のような界面活性剤を反応試薬混合物から除いている以外は実施例１と同様な方法が使用された。試料量は2.5μＬ、過酸化水素反応試薬の量は２０μＬである。
【００６３】
【表６】
界面活性剤がない状態では、アルブミン効果は若干ながら明らかであった。すなわち、２％と５％のアルブミンや胎児ウシ血清の試料の６００ｎｍにおける吸光度はNaClのみの試料に比べて大きかった。反応後のセルの視覚的検査により、全ての反応混合物中で沈殿が起こっていることがわかった。このことは７５秒後の吸光度に反映されており、それぞれのセルの吸光度は同様に、tween ２０の存在下で反応した場合に比べ平均で４倍も大きくなっている。
（表７）
【００６５】
【表７】
７５秒後の吸光度はクロモゲン溶液を試料とヘモグロビンの混合物に加えた直後で、かつ過酸化水素の添加の直前に測定する。クロモゲン溶液とヘモグロビン溶液とを混合することで沈殿が生じることは明らかであり、この沈殿はtween ２０などの界面活性剤により生成を防ぐことができる。そして沈殿が吸光度に与える効果にはかなり幅があり、吸光度は0.1870から0.3151に及ぶ。沈殿は試料がNaCl溶液のときにも生成し、これらの結果により、界面活性剤は反応試薬の溶解性を保持するためにハプトグロビンの分析に必要となる場合があることがわかる。
【００６７】
実施例７ 実験室レベルにおける本発明によるハプトグロビン分析
実施例1に示した方法を用いて、ラットの血清中のハプトグロビン濃度を決定した。これはBordetella pertussis bacteria(百日咳)の病原性の実験的調査（Dr. R. Parton, Institute of Biochemical and Life Sciences, University of Glasgowとの共同研究）の一部である。感染から８日後、６匹の感染ラット（Sprague-Dawley）と６匹の非感染ラットからそれぞれ血清を採取し、ハプトグロビン分析まで-２０℃で保管した。
【００６８】
【表８】
【００６９】
実施例８ ジスルフィド結合還元剤に代えて、カオトロピック剤を用いたハプトグロビン濃度の自動分析方法
Ｈｂ作業溶液がグアニジン塩酸塩(0.5ｍｏｌ／Ｌ)を含む、食塩水として調製され、作業クロモゲン緩衝溶液がフェノール(２０ｍｍｏｌ／Ｌ)、４-アミノフェナゾン（４-アミノアンチピリン）(1.6ｍｍｏｌ／Ｌ) 、８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸、tween ２０(１％)を含んでいるクエン酸緩衝溶液であり（すなわち、ジチオエリスリトールは除いてある）、試料量は2.5μＬである。
【００７０】
【表９】
結果として以下のことが示された。グアニジン塩酸塩のようなカオトロピック試薬を用いると、ペルオキシダーゼ活性に対するアルブミンの影響が抑制される。そして２％までのアルブミンは分析に影響を与えない、一方５％までなら、微細な影響を与えるのみである。
Claims (17)
- 下記のａ）、ｂ）及びｃ）：
ａ）試験に供される試料、ヘモグロビン、界面活性剤、試料中に存在するアルブミン及び／またはその他のたんぱく類がヘモグロビンまたはヘモグロビンから遊離したヘマチンに結合するのを阻害するたんぱく質結合阻害剤、及びジスルフィド結合に有効な還元剤またはカオトロピック剤を含有する反応混合物を形成する工程；
ｂ）反応混合物の成分を反応させ、ハプトグロビン／ヘモグロビン錯体を形成させる工程；及び
ｃ）錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を減少させるか、不活性化するような酸性ｐＨ条件下で前記ハプトグロビン／ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量をクロモゲン基質を用いて、分光光学的手法により測定する工程を含む血液試料中のハプトグロビン濃度を測定する分析方法。 - 分析がｐＨが3.6から4.0の間で実施される請求項１記載の分析方法。
- 試料が血液試料である請求項１または２記載の分析方法。
- 血液試料が血漿または血清試料である請求項３記載の分析方法。
- 試料がミルク、腹水、またはイン・ビトロ培養媒体である請求項１または２記載の分析方法。
- ヘモグロビンが、試験に供される試料を採取した動物と同一の動物から取得されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の分析方法。
- ヘモグロビンが、試験に供される試料を採取した動物と異種の動物から取得されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の分析方法。
- ジスルフィド結合に対して有効な還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオーン、４，４’−ジチオジピリジン、または５，５’−ジチオ（２−ニトロ安息香酸）から独立して選択される請求項１〜７のいずれかに記載の分析方法。
- たんぱく質結合阻害剤が、８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸（ＡＮＳ）、プロトポルフィリン、ビリルビン、タウロデオキシコール酸類（胆汁塩類）、ジクマロール、または２−メルカプトベンゾチアゾールから独立して選択される請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法。
- カオトロピック剤がグアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリウムまたは塩化ナトリウムから独立して選択される請求項１〜９のいずれかに記載の分析方法。
- 界面活性剤が、反応混合物に０ｇ／Ｌを超えて２０ｇ／Ｌ未満の濃度で添加される請求項１〜１０のいずれかに記載の分析方法。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール、及びポリオキシエチレンアルコール類から選択される非イオン性界面活性剤、またはドデシル硫酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、及びセトリミドから選択されるイオン性界面活性剤である請求項１〜１１のいずれかに記載の分析方法。
- ペルオキシダーゼ活性がクロモゲンと過酸化水素を使用して検出され、ペルオキシダーゼ活性が特定の波長での分光光学的なクロモゲンの色の変化として認められる請求項１〜１２のいずれかに記載の分析方法。
- クロモゲン基質が、４−アミノフェノゾン、２−アミノ−４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ｏ−ジアニシジン、Ｎａ−２−ＯＨ−５−ジクロロベンゼンスルホネート、２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、及び４−アミノアンチピリンクロモトロピック酸から選択される請求項１３に記載の分析方法。
- クロモゲン基質が、４−アミノアンチピリンクロモトロピック酸であり、さらに８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸（ＡＮＳ）及び４−ヨードフェノールを含む請求項１４に記載の分析方法。
- たんぱく質結合阻害剤／クロモゲン共反応剤の８−アニリノ−１−ナフチレンスルホン酸（ＡＮＳ）、及びクロモゲン基質の４−アミノアンチピリン及びフェノールを使用する請求項１記載の分析方法。
- 下記のｉ）〜v)：
ｉ）ヘモグロビン；
ii）界面活性剤；
iii）試料中に存在するアルブミン及び／またはその他のたんぱく類がヘモグロビンまたはヘモグロビンから遊離したヘマチンに結合するのを阻害するたんぱく質結合阻害剤；
iv）ジスルフィド結合に有効な還元剤またはカオトロピック剤；及び
v）ペルオキシダーゼ活性量を測定するのに用いるクロモゲンを含有する請求項１〜１６のいずれかに記載の分析方法で使用されるキット。
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