ES2313755T3 - Ensayo de haptogoblina. - Google Patents
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Abstract
Ensayo para la determinación del nivel de haptoglobina en una muestra, que comprende las etapas de: a) formación de una mezcla de reacción que comprende la muestra a analizar, un detergente, un inhibidor de la unión a proteínas para la inhibición de la unión de la albúmina y/o cualquier otra(s) proteína(s) presente(s) en la muestra a la hemoglobina o hematina liberada de la hemoglobina, y ya sea un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro o un agente caotrópico en el que el citado inhibidor de unión a la proteína y el agente reductor o caotrópico no están incluidos en una cantidad que darían lugar a la inhibición de una reacción haptoglobina/hemoglobina: b) dejar reaccionar los componentes de la mezcla, de manera que se permita la formación de un complejo haptoglobina/hemoglobina; y c) determinación del nivel de la actividad de la peroxidasa del citado complejo haptoglobina/hemoglobina usando un substrato cromogénico y medios espectrofotométricos, en donde la determinación se lleva a cabo a un pH ácido suficiente para reducir substancialmente o inactivar substancialmente cualquier actividad peroxidasa de la hemoglobina no complejada.
Description
Ensayo de haptoglobina.
La haptoglobina (Hp) es una proteína que está
presente en la sangre de los humanos y de los animales. La
concentración de Hp en el plasma o suero, después de la separación
de las células de la sangre, varía en cada animal individual y se
relaciona con el estado de salud del mismo. La Hp es una proteína de
un grupo de proteínas la concentración de la cual aumenta
dramáticamente con una infección, inflamación o trauma. Estas
proteínas se conocen como proteínas de la fase aguda.
La medida de la concentración de Hp en plasma
proporciona una información diagnóstica valiosa a los clínicos en
medicina humana y veterinaria. En medicina veterinaria, la medición
de Hp resulta particularmente importante para valorar el estado de
salud del ganado vacuno y ovino debido a que en estas especies la Hp
da lugar a una respuesta particularmente fuerte a la infección, con
un aumento de la concentración en circulación por encima de 100
veces. En otras especies, tal como los humanos, perros, gatos y
cerdos, la medida de la Hp también es importante ya que la
concentración en plasma aumenta de 2 a 3 veces, lo que resulta
suficiente para proporcionar información diagnóstica.
Adicionalmente, en estas otras especies una caída en la
concentración de Hp puede tener valor en el diagnóstico de la
hemólisis. Además, la medida de la Hp resulta de igual importancia
como marcador de la inflamación o infección en los animales de
laboratorio tales como roedores o ratones.
Los ensayos actuales para la Hp se basan ya sea
en un inmunoensayo o en la capacidad de la Hp para unirse a la
hemoglobina (Hb)
La Hp en plasma humano se mide en los
laboratorios de bioquímica clínica, en forma de un ensayo de
rutina, como una respuesta de fase aguda en los procedimientos
basados en anticuerpos con antisuero específico para Hp humana. La
aproximación más común es mediante inmunoturbidometría, en la que se
puede medir la formación de un precipitado de un complejo
anticuerpo-Hp en solución y se puede relacionar con
la concentración de Hp. Sin embargo, los ensayos de
inmunoturbidometría son caros cuando se comparan con los ensayos
bioquímicos de rutina ya que requieren la preparación de un
suministro continuo de antisuero adecuado. Además, para su uso en
los laboratorios de diagnóstico veterinario, los ensayos basados en
antisuero a una especie se deben validar para cada una de las
especies por separado y la validación se debe repetir para cada uno
de los lotes nuevos de antisuero usado.
Los ensayos originales basados en la unión
Hp-Hb dependían del hecho de que la formación del
complejo Hp-Hb altera la absorción
espectrofotométrica característica de la Hb en proporción a la
concentración de Hp en una muestra de sangre. Pero esto se ha
reemplazado haciendo uso de la actividad peroxidasa innata del
complejo, que se puede detectar a un pH ligeramente ácido cuando es
proporcional al contenido en Hp ya que se inhibe la actividad
peroxidasa de la hemoglobina libre, permitiendo que se puedan
cuantificar los ensayos mediante calibración con muestras standard
de Hp.
Este ensayo es el que se usa en la mayoría de
los laboratorios de diagnóstico veterinario que en la actualidad
llevan a cabo ensayos de Hp y se prefiere a los sistemas de
inmunoensayo ya que se puede efectuar en todas las especies con tan
solo un requerimiento modesto para la validación y también resulta
considerablemente más barato que los procedimientos basados en
anticuerpos debido a que los reactivos no son caros. Sin embargo,
la versión automatizada de este ensayo utiliza un reactivo de
guayacol que tiene un olor nocivo y no se acepta por parte del
personal en muchos laboratorios. En general, este ensayo no se ha
adoptado por parte de los suministradores de reactivos comerciales
debido probablemente a esta razón. Se han hecho intentos con el fin
de usar otros substratos para la reacción de la peroxidasa, y
mientras ésto se puede conseguir para procedimientos manuales,
usando tetra metil benzidina (TMB), ver Conner J. et al.,
Research in Vet. Sci. (1988), 44, 82-88, todavía no
se ha conseguido un ensayo automatizado con éxito para la Hp. Ello
puede ser debido a la sensibilidad de la TMB. Por parte de los
presentes inventores se ha observado que las muestras de suero sin
nada de heptoglobina (blanco cero) muestran un nivel significativo
de actividad de peroxidasa capaz de dar lugar a resultados de
falsos positivos con TMB. Se aprecia que dicha actividad de
peroxidasa falsa no resulta deseable cuando se lleva a cabo un
ensayo automatizado o semi automa-
tizado.
tizado.
La patente US 4695552 describe un procedimiento
para la determinación del complejo Hp-Hb similar a
los procedimientos descritos anteriormente. Sin embargo, se ha
identificado que un pH ácido puede no ser suficiente para inactivar
completamente la actividad peroxidasa de la hemoglobina libre y se
añade un detergente para eliminar substancialmente cualquier
actividad peroxidasa de dicha hemoglobina libre. No obstante, no
existe ningún sugerimiento en el sentido de que los componentes
presentes en el suero de la sangre o en las muestras de plasma
puedan afectar la precisión de dicho ensayo.
Entre los objetivos de la presente invención se
encuentra el obviar y/o mitigar por lo menos una de las desventajas
anteriormente mencionadas.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento por parte de los presentes inventores de que la
albúmina y posiblemente otras proteínas presentes en las muestras de
sangre tienen un "efecto peroxidasa" indeseable sobre los
ensayos del tipo mencionado anteriormente.
Por tanto, la presente invención proporciona un
ensayo para la determinación del nivel de haptoglobina en una
muestra, tal como se define en la reivindicación 1.
Previamente se ha descrito que la hemoglobina
sin formar complejo muestra una actividad peroxidasa a un pH ácido,
pero que esta actividad se puede inactivar a un pH de 4,1, Makimura,
S. y Suzuki, N. (1982) Jpn. J. Ven. Sci. 44,
p.15-21. Sin embargo, la patente US 4695552 sugiere
que un bajo nivel de actividad peroxidasa debido a la hemoglobina
libre puede permanecer incluso a dicho pH. Por tanto, el presente
ensayo se lleva a cabo preferiblemente a un pH de menos de 4,1, por
ejemplo, a un pH 3,6-4,0, especialmente a un pH
3,8.
De manera típica, la muestra puede ser una
muestra de sangre, generalmente de plasma o suero. La muestra se
puede obtener de cualquier animal, en particular de los animales
mamíferos, incluyendo los animales roedores, bovinos, ovinos,
caninos, felinos, porcinos y equinos, así como los primates
incluyendo los humanos. La muestra también puede ser de otros
fluidos corporales tales como leche, o fluido ascítico o incluso un
medio de incubación in vitro.
Si la concentración de haptoglobina en la
muestra se encuentra por encima de aproximadamente 2 g/l, la
muestra puede requerir ser diluida, puesto que la concentración de
haptoglobina no se puede determinar con precisión debido a la no
linealidad de una curva estándar por encima de dichas
concentraciones. Sin embargo, la persona experta en la técnica
entenderá fácilmente que los protocolos de ensayo podrían
desarrollarse con una mejor linealidad para evitar cualquier
requerimiento de dilución. Por ejemplo, se puede usar un volumen de
muestra menor en unas condiciones apropiadas.
La hemoglobina puede ser del mismo origen que la
muestra de sangre que se debe analizar. Es decir, si el animal que
se ha de analizar es de origen bovino, se puede emplear hemoglobina
bovina. Sin embargo, se ha encontrado de manera ventajosa que el
ensayo se puede llevar a cabo usando hemoglobina de una especie
diferente de la especie de la que proviene la muestra. Por tanto, el
ensayo se puede efectuar en una gran variedad de especies
utilizando solamente una única fuente de hemoglobina. De manera
preferible, también la hemoglobina es
met-hemoglobina, aunque opcionalmente también se
puede usar oxi-hemoglobina.
El suero y el plasma de todas las especies
contiene albúmina, por tanto, esta proteína se encuentra presente
en la muestra a analizar a concentraciones de hasta 40 g/l. Los
presentes inventores han encontrado mediante valoración del mejor
medio para su uso como la muestra cero, para ser usado como blanco,
que existe una significativa interferencia con el ensayo debido a
la albúmina. Esta interferencia se ha detectado a concentraciones
de albúmina de 1, 5 o 10% (10, 50, 100 g/l).
Se ha observado que la albúmina no tiene una
actividad peroxidasa innata. Sin desear que exista una relación de
manera teórica, se cree que la albúmina y posiblemente otras
proteínas presentes en el suero de la sangre, plasma u otras
muestras a analizar, se puede unir a la hemoglobina o posiblemente
hematina liberada por la hemoglobina y conservar una actividad
peroxidasa incluso a un pH (p.e., pH 3,6-4,0) que
generalmente eliminaría cualquier actividad peroxidasa de la
hemoglobina libre. Además, esto puede ser una razón de porqué los
ensayos espectrofotométricos automatizados para la haptoglobina no
se han adoptado hasta ahora de manera general, debido a la
incapacidad para obtener un nivel cero de actividad peroxidasa
cuando se conoce que la haptoglobina está ausente. Previamente,
este "efecto peroxidasa" se puede haber minimizado de manera
inadvertida o accidentalmente debido a una gran dilución de la
muestra (p.ej. 500 veces) o mediante el uso de un cromógeno no
sensible, p.ej. guayacol.
Sin embargo, la presente invención reduce el
requerimiento de una gran dilución de la muestra y permite el
empleo de cromógenos más sensibles, utilizando por lo menos dos
reactivos para la reducción del efecto peroxidasa debido a la
albúmina o a cualquier otra proteína presente en la muestra.
Los citados por lo menos dos reactivos para la
reducción del efecto peroxidasa debido a la albúmina o a cualquier
otra proteína(s) presente(s) en la muestra son a) un
inhibidor de la unión a la proteína, y b) un agente reductor
efectivo contra los enlaces disulfuro y/o un agente caotrópico.
Los reactivos anteriormente mencionados se usan
para reducir cualquier "efecto peroxidasa". Sin embargo, los
expertos en la técnica apreciarán que un exceso en cualquiera de los
reactivos antes mencionados dará lugar a una inhibición de la
reacción haptoglobina/hemoglobina que se debe evitar. Por ejemplo,
ensayos realizados utilizando el ácido
8-anilino-1-naftalen
sulfónico (ANS) como inhibidor de la unión a la proteína y
ditiotreitol como agente reductor efectivo contra los enlaces
disulfuro, a concentraciones de aproximadamente 10 mmol/l y 4
mmol/l respectivamente, da lugar a una inhibición casi completa de
la actividad peroxidasa del complejo haptoglobina/hemoglobina. Por
tanto, el experto en la técnica puede asegurar, mediante controles
apropiados, que solamente se reduzca el "efecto peroxidasa"
espurio sin afectar de manera substancial la actividad peroxidasa
del complejo haptoglobina/hemoglobina.
De manera conveniente, el agente reductor
efectivo contra los enlaces disulfuro puede ser ditiotreitol,
ditioeritritol, cisteina, mercaptoetanol, glutationa,
4,4'-ditiodipiridina o
5,5'-ditio(ácido
2-nitrobenzoico).
De manera típica, el inhibidor de la unión a
proteínas puede ser ANS, protoporfirina, bilirubina, ácidos
taurodeoxicólicos (sales biliares), dicumarol o
2-mercaptobenzotiazol.
Típicamente, el agente caotrópico puede ser
clorhidrato de guanidina, tiocianato potásico o cloruro sódico.
En el ensayo también se incluye un detergente.
Inicialmente, se creía por parte de los presentes inventores que el
uso de un detergente era importante para reducir el efecto
peroxidasa debido a la albúmina o a cualquier otra proteína
presente en la muestra. Aunque pueda parecer que un detergente tenga
dicho efecto, se ha observado ahora que el uso de un detergente
puede ser importante para asegurar que otros componentes del ensayo
permanezcan solubilizados cuando se lleva a cabo el ensayo. Además,
se prefieren tan sólo concentraciones bajas del detergente puesto
que parece que altas concentraciones (p.e. 25 g/l) aumentan el
efecto peroxidasa aparente. Por consiguiente, a la mezcla de
reacción se añade un detergente a una concentración total de menos
de 20 g/l, más preferiblemente menos de
10 g/l.
10 g/l.
De manera típica, el detergente puede ser un
tensioactivo no iónico tal como los ésteres de polioxietilen
sorbitol (p.e. Tween 20, 40, 60, 80 etc),
polioxietilen-p-t-octilfenol
(p.e. Triton X-45, X-100, etc); y/o
alcoholes de polioxietileno (PEG) (p.e. Brij 35, 36, etc.), o
tensioactivos iónicos tales como dodecil sulfato sódico, CHAPS
y
cetrimida.
cetrimida.
De manera típica, se dejan reaccionar la
haptoglobina presente en la muestra y la hemoglobina añadida
durante menos de 20 minutos, preferiblemente menos de 10 minutos y
más preferiblemente menos de 5 minutos.
Se puede detectar que ya se ha formado el
complejo haptoglobina/hemoglobina mediante una actividad peroxidasa
innata del complejo ya que la actividad peroxidasa de la hemoglobina
se inhibe de manera substancial mediante el pH ácido del ensayo. A
continuación se puede correlacionar un nivel de actividad peroxidasa
con un nivel de haptoglobina en la muestra mediante referencia a
una curva standard generada usando concentraciones conocidas de
hapto-
globina.
globina.
De manera típica, la citada actividad peroxidasa
se puede detectar mediante el uso de un cromógeno y peróxido de
hidrógeno, donde la actividad peroxidasa da lugar a un cambio de
color del cromógeno, cambio que se puede detectar
estectrofotométricamente a una longitud de onda particular. La
citada detección de peroxidasa usando substratos cromogénicos
resulta bien conocida en la técnica para la determinación de los
niveles de hemoglobina, glucosa y previamente para los niveles de
haptoglobina cuando la influencia de la albúmina sobre el ensayo no
se conocía, ver por ejemplo Bauer K., J. Clin. Chem. and Clin.
Biochem., (1981) vol 19, pag. 971-976; Reijic, R.
et al., Clin. Chem. (1992), vol 38, pag.
522-525 y Conner, J.G.; Eckersall, P.D., Research
in Vet. Sci. (1988), 44, pag.82-88.
Para una persona experta en la técnica resultará
inmediatamente evidente que además de los substratos cromogénicos
mencionados en las anteriores referencias (es decir,
4-amino fenozona, ácido
2-amino-4-hidroxibencen
sulfónico (AHBS) y tetra metil bencidina (TMB), también se pueden
usar en el presente ensayo otros substratos cromogénicos tales como
diclorhidrato de o-fenilen diamina,
o-dianisidina,
2-OH-3,5-diclorobencen
sulfonato sódico,
2,2'-azino-di(ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
(ABTS) y ácido 4-aminoantipirina cromotrópico,
opcionalmente en co reacción con el ácido
8-anilino-1-naftilen
sulfónico (ANS) y 4-iodofenol.
Un ensayo particularmente preferido según la
presente invención comprende el inhibidor de la unión a
proteínas/co reactivo cromogénico, el ácido
8-anilino-1-naftalen
sulfónico (ANS) junto con el substrato cromogénico
4-aminoantipirna y fenol. Se ha observado que el ANS
puede complementar el fenol en la reacción de
co-oxidación del peróxido de hidrógeno con la
4-aminoantipirina formando un cromógeno azul que
absorbe a 600 nm y tiene una mayor absorbancia que el cromógeno
rojo producido en las mismas condiciones con sólo fenol como
co-reactivo. La combinación de ANS y
4-aminoantipirina ya se ha descrito previamente para
la determinación de peróxidos (ver por ejemplo Chung et al.,
(1993), Talanta 40, pag. 981-988).
La presente invención también proporciona un
equipo para su uso en un ensayo de haptoglobina según la presente
invención tal como se define en la reivindicación 17.
El equipo también puede comprender componentes
adicionales tales como una solución tampón para mantener el pH
deseado en el ensayo, y/o soluciones referencia de suero con
concentraciones conocidas de haptoglobina. Resulta inmediatamente
evidente para los expertos en la técnica que los componentes del
equipo se pueden usar para llevar a cabo el ensayo de haptoglobina
con equipamientos tales como tubos de ensayo o placas de
microvaloración y un espectrofotómetro, así como en analizadores
bioquímicos automatizados, tal como se describe en este
documento.
documento.
La presente invención se describe a continuación
con más detalle mediante referencia a los siguientes ejemplos no
limitantes.
0,9% (p/v) NaCl (salino)
Solución stock de hemoglobina (Hb) a 30 g/l
preparada según Makimura y Suzuki (1982, Jpn J Vet Sci, 44,
15-21).
Solución tampón de citrato cromógeno: solución
stock con 0,5 mol/l de solución tampón de citrato pH 3,8;
tiomersalato 0,01%.
Solución de trabajo de Hb: Solución stock de Hb
diluida 500 veces en suero salino (50 \mul diluidos hasta 25
ml).
Solución tampón de cromógeno de trabajo:
solución tampón de citrato cromógeno que contiene 20 mmol/l de
fenol; 1,6 mmol/l de 4-aminofenazona
(4-aminoantipirina), 1 mmol/l de ácido
8-anilino-1-naftalen
sulfónico, 0,39 mmol/l de ditioeritritol, 1% de Tween 20.
Substrato: Peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) añadir 100 \mul de H_{2}O_{2} del 30% a 25 ml
de H_{2}O.
Standard: suero con haptoglobina,
concentraciones de 2,05 g/l diluidas en BSA al 2% hasta 1,03, 0,51,
0,125 y el BSA al 2% como cero.
Muestras: suero o plasma.
Muestras de control: suero con concentraciones
conocidas de Hp (altas y bajas) repetidas en cada ensayo.
Calibración: una vez al día.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- En el bastidor de reactivos, la hemoglobina diluida es el reactivo (20 ml), la solución tampón de cromógeno de trabajo es el reactivo de inicio 1 (10 ml) y el peróxido de hidrógeno es el reactivo de inicio 2 (10 ml).
- b)
- Se mezclan 7,5 \mul de estándar, muestra o control con 200 \mul de hemoglobina.
- c)
- Después de 50 s se añaden 90 \mul de cromógeno.
- d)
- Después de otros 25 s, se añaden 50 \mul de substrato (H_{2}O_{2}) y se mide el aumento de la absorbancia a 600 nm.
- e)
- La diferencia en absorción a lo largo de los siguientes 50 s se usa para calcular los resultados por comparación del cambio de absorbancia en los estándares respecto a la muestra desconocida.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo es lineal hasta 2 g/l de haptoglobina,
suficiente para la mayoría de las muestras bovinas y ovinas. Para
otras especies, se puede requerir dilución para muestras por encima
de 2 g/l.
En la Tabla 1 se muestran los resultados típicos
para un ensayo de haptoglobina en el analizador MIRA con la
solución de cromógeno completa descrita en los procedimientos. Un
gráfico de las muestras estándar indica una relación lineal entre
la concentración de haptoglobina y el cambio de absorbancia a 600 nm
(no indicado).
Los resultados también muestran la efectividad
de esta solución de cromógeno para eliminar el efecto de la
albúmina, ya que tanto el BSA al 5% como el suero de ternero fetal
dan resultados que son < 0,01 mg/ml. Esto se puede comparar con
los resultados del ejemplo 2 en el que no se ha eliminado la unión a
la albúmina.
Se ha elegido el BSA al dos por ciento como
medio para diluir los estándares y ser usados como estándar cero
para proporcionar una matriz de proteína para esta dilución y este
ejemplo confirma que cuando se usa como un blanco del ensayo da
lugar a una diferencia mínima en el cambio de OD cuando se compara
con el suero salino, siendo la diferencia de 0,004 unidades de
absorbancia.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencia ejemplo
2
Con el fin de mostrar el efecto que la albúmina
tiene sobre el ensayo, se lleva a cabo un ensayo comparativo en el
que se omiten los reactivos (es decir, ANS, ditioeritritol y Tween
20) usados para inhibir el efecto de la albúmina.
En este ejemplo el ensayo se lleva a cabo de
manera similar a la descrita en el ejemplo 1 con la excepción de
que la solución de cromógeno no contiene el ácido
8-anilino-1-naftalen
sulfónico, ditioeritritol o Tween 20. El reactivo contiene fenol a
20 mmol/l y 4-aminofenazona
(4-aminoantipirina) a 1,6 mmol/l como los
co-reactivos del cromógeno, con la absorbancia
leida a 500 nm.
Tal como se muestra en la Tabla 2, existe un
efecto considerable de la albúmina al 5% sobre el cambio de la
absorbancia, lo que puede conllevar una lectura errónea de 0,59
mg/ml para la concentración de haptoglobina si este ensayo se ha
usado para cuantificar las concentraciones de haptoglobina en una
muestra. El suero fetal de ternero también presenta una reacción
significativa y da lugar a un resultado positivo indicando de manera
falsa la presencia de haptoglobina.
Debe remarcarse también que en este ejemplo el
máximo cambio en la absorbancia es solamente de 0,162 AU en
comparación con 1,0093 AU cuando se incluye ANS como en el Ejemplo
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Usando el procedimiento descrito en el ejemplo
1, se determina la concentración de haptoglobina en el suero de
nueve vacas lecheras con mastitis, una infección de las ubres que
causa una reacción inflamatoria aguda. También se han analizado,
para ver su concentración de haptoglobina, doce muestras de suero de
vacas lecheras (a partir de un estudio llevado a cabo en
colaboración con el Dr J.L. Fitzpatrick, Departamento de Estudios
de Veterinaria Clínica, Universidad de Glasgow, Escuela de
Veterinaria) suministradas al laboratorio pero que no padecían la
enfermedad infecciosa o inflamatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración media de haptoglobina en los
animales con mastitis es 10 veces la de los animales sin
condiciones de inflamación. El amplio margen de concentraciones
encontradas en los animales infectados se debe a que proceden de
animales en diferentes grados de la infección, que pueden estar en
el pico de la fase aguda o procedentes del periodo de
recuperación.
La concentración de haptoglobina no es de 0
mg/ml en cada una de las muestras procedentes de animales no
infectados y se debe probablemente a que los animales se encontraban
en condiciones sub-clínicas aunque aparentemente
las condiciones inflamatorias estaban ausentes y ello daba lugar a
una concentración ligeramente elevada. Es posible que muchos o la
mayoría de los animales fuera de medios libres de patógenos
presenten los citados niveles bajos de haptoglobina pero serían
necesarios más estudios para clarificar los niveles encontrados en
las poblaciones normales. Sin embargo, los ensayos resultan
efectivos para demostrar una reacción aguda a la mastitis.
\newpage
Ejemplo 4 de
Referencia
Con el fin de conocer el efecto de sólo
detergente sobre el ensayo de la haptoglobina en el suero en
presencia de albúmina, se ha llevado a cabo un ensayo comparativo en
el que se usan los reactivos para simular las condiciones
recomendadas por Schimitt et al. (Patente US 4695552). En
este ejemplo se efectúa un ensayo automatizado en un analizador
MIRA con modificaciones en los reactivos y condiciones en el
analizador.
Solución de trabajo de Hb: preparada a partir de
solución stock de Hb como en el ejemplo 1.
Solución tampón de cromógeno: citrato sódico pH
4,0 0,1 mol/l; 2,2'-azino-di(ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
(ABTS) 0,5 mmol/l; saponina 3 g/l.
Substrato: perborato sódico 32 mmol/l.
Standards: como en el ejemplo 1 con la excepción
de que los standards se diluyen en suero salino.
Control de las muestras como en el Ejemplo
1.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- En el bastidor de reactivos, la hemoglobina diluida es el reactivo (20 ml), ABTS/saponina es el reactivo de inicio 1 (10 ml) y el perborato de sodio es el reactivo de inicio 2 (10 ml).
- b)
- Se mezclan 2,5 \mul de standard, muestra o control con 200 \mul de Hb.
- c)
- Después de 50 s se añaden 90 \mul de cromógeno.
- d)
- Después de otros 25 s, se añaden 20 \mul de substrato (perborato sódico) y se mide el aumento de la absorbancia a 405 nm.
- e)
- La diferencia en absorción a lo largo de los siguientes 50 s se usa para calcular los resultados por comparación del cambio de absorbancia en los estándares respecto a las muestras de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la Tabla 4, existe un
considerable efecto de la albúmina de suero bovino en ambas
soluciones del 2 y del 5% (p/v) en el cambio de la absorbancia de
este sistema cromógeno/detergente y se indican resultados erróneos
de 0,31-0,72 mg/ml de haptoglobina en las muestras
de suero que contienen de 20-50 g/l de albúmina
pero no contienen haptoglobina. El margen de referencia para la
albúmina en muchas especies es del orden de 25-40
g/l para la albúmina y, por tanto, el ensayo para la haptoglobina no
está afectado de manera substancial por dichas concentraciones de
albúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 de
Referencia
Se determina la haptoglobina en suero o plasma
efectuando el ensayo como en el Ejemplo 4 (ABTS como cromógeno) con
la excepción de que se aumenta la concentración de saponina a 25
g/l. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
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Con la saponina aumentada hasta 25 g/l se
observa un marcado incremento en el efecto de la albúmina, que dan
como resultado niveles aparentemente altos de haptoglobina en los
cambios en la absorbancia con albúmina del 2 y 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 de
Referencia
Se usa el procedimiento descrito en el Ejemplo 1
con la excepción de que se omite en la mezcla de reactivos el
detergente tal como Tween 20, el volumen de muestra es de 2,5 \mul
y el volumen del reactivo de peroxidasa es de
20 \mul.
20 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
En ausencia de detergente se observa que el
efecto de la albúmina es aparente en una pequeña extensión en el
cambio en la absorbancia a 600 nm, que es mayor en la albúmina al 2
y 5% y en el suero de ternera fetal que en el suero salino sólo.
Una inspección visual de las cubetas de reacción después de la
reacción revela que ha tenido lugar precipitación en todas las
mezclas de reacción. Este hecho se refleja en las lecturas a los 75
s, que son similares en todas las cubetas, y cuyo valor premedio es
cuatro veces mayor que en la reacción que tiene lugar en presencia
de Tween 20 (Tabla 7).
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\vskip1.000000\baselineskip
La lectura de la absorbancia a los 75 seg se
hace inmediatamente después de la adición de la solución de
cromógeno a la mezcla de la muestra más hemoglobina e inmediatamente
antes de la adición del peróxido de hidrógeno. Resulta aparente que
la mezcla de la solución de cromógeno con la solución de la
hemoglobina da lugar a una precipitación que se puede evitar con la
presencia de un detergente tal como Tween 20, y que existe una
variación considerable en el efecto del precipitado sobre la
absorbancia con un margen de 0,1870 a 0,3151. La precipitación
tiene lugar incluso cuando la muestra es suero salino y estos
resultados indican que el detergente puede ser necesario en el
ensayo de la haptoglobina para mantener la solubilidad de los
reactivos.
Ejemplo
7
Utilizando el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1, se determina la concentración de haptoglobina en el
suero de ratas que forman parte de una investigación experimental de
la patogenicidad de la bacteria Bordetella pertussis (tos
ferina) (de un estudio en colaboración con Dr R. Parton, Instituto
de Ciencias Biomédicas y de la Vida, Universidad de Glasgow). Ocho
días después de la infección se recogen muestras de suero de las
seis ratas infectadas (Sprague-Dawley) y de seis
ratas control no infectadas y se guardan a -20ºC hasta su análisis
usando el ensayo de la hapto-
globina.
globina.
La concentración de haptoglobina, tal como se
determina mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 1, se aumenta
con un factor de unas cuatro veces después de la infección con B.
pertussis, lo que demuestra el uso del ensayo para la
haptoglobina en estudios experimentales de la respuesta del huésped
a la infección.
Ejemplo
8
El procedimiento se lleva a cabo en un
analizador MIRA, tal como en el Ejemplo 1, con la excepción de que
la solución de trabajo de Hb se prepara en solución salina que
contiene 0,5 mol/l de clorhidrato de guanidina, que la solución
tampón de cromógeno de trabajo es la solución de citrato que
contiene 20 mmol/l de fenol; 4-aminofenazona
(4-aminoantipirina) 1,6 mmol/l; ácido
8-anilino-1-naftalona
sulfónico 1 mmol/l; Tween 20 1% (es decir, se ha omitido
ditioeritritol) y el volumen de la muestra es de 2,5 \mul.
Los resultados demuestran que un agente
caotrópico tal como el clorhidrato de guanidina se puede usar para
inhibir el efecto de la albúmina sobre la actividad peroxidasa y que
la albúmina hasta un 2% no afecta al ensayo, mientras que hasta el
5% solamente tiene un efecto marginal.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se incluye solamente para la conveniencia del lector.
No forma parte del documento de la patente Europea. Aunque se ha
tenido sumo cuidado en la compilación de las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la EPO declina toda
responsabilidad en este aspecto.
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\bullet Dr R. Parton, Instituto de
Ciencias Biomédicas y de la Vida, Universidad de Glasgow,
[0057].
Claims (17)
1. Ensayo para la determinación del nivel de
haptoglobina en una muestra, que comprende las etapas de:
- a)
- formación de una mezcla de reacción que comprende la muestra a analizar, un detergente, un inhibidor de la unión a proteínas para la inhibición de la unión de la albúmina y/o cualquier otra(s) proteína(s) presente(s) en la muestra a la hemoglobina o hematina liberada de la hemoglobina, y ya sea un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro o un agente caotrópico en el que el citado inhibidor de unión a la proteína y el agente reductor o caotrópico no están incluidos en una cantidad que darían lugar a la inhibición de una reacción haptoglobina/hemoglobina:
- b)
- dejar reaccionar los componentes de la mezcla, de manera que se permita la formación de un complejo haptoglobina/hemoglobina; y
- c)
- determinación del nivel de la actividad de la peroxidasa del citado complejo haptoglobina/hemoglobina usando un substrato cromogénico y medios espectrofotométricos, en donde la determinación se lleva a cabo a un pH ácido suficiente para reducir substancialmente o inactivar substancialmente cualquier actividad peroxidasa de la hemoglobina no complejada.
2. Ensayo según la reivindicación 1 en el que el
ensayo se lleva a cabo a un pH entre 3,6 y 4,0.
3. Ensayo según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2 en el que la muestra es una muestra de sangre.
4. Ensayo según la reivindicación 3 en el que la
muestra de sangre es una muestra de plasma o suero.
5. Ensayo según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2 en el que la muestra es leche, fluido ascítico o
medio de incubación in vitro.
6. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la hemoglobina se obtiene a
partir de un animal de la misma especie de la muestra de la que se
está efectuando el ensayo.
7. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en el que la hemoglobina se obtiene a partir
de un animal de una especie diferente de la muestra de la que se
está efectuando el ensayo.
8. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el agente reductor efectivo
contra los enlaces disulfuro se selecciona independientemente entre
ditiotreitol, ditioeritritol, cisteina, mercaptoetanol, glutationa,
4,4'-ditiodipiridina o
5,5'-ditio(ácido
2-nitrobenzoico).
9. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el inhibidor de la unión a la
proteína se selecciona independientemente entre el ácido
8-anilino-a-naftilen
sulfónico (ANS), protoporfirina, bilirubina, ácidos
taurodesoxicólicos (sales biliares), dicumarol o
2-mercaptobenzotiazol.
10. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el agente caotrópico se
selecciona independientemente entre clorhidrato de guanidina,
tiocianato de potasio o cloruro sódico.
11. Ensayo según la reivindicación 1 en el que
el detergente se añade a la mezcla de reacción a una concentración
total de menos de 20 g/l.
12. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el detergente se selecciona
entre un tensioactivo no iónico entre ésteres de polioxietilen
sorbitol, de
polioxietilen-p-t-octilfenol;
y/o alcoholes de polioxietileno (PEG), o tensioactivos iónicos
seleccionados entre sulfato dodecil sódico, CHAPS y cetrimida.
13. Ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la actividad peroxidasa se
detecta mediante el uso de un cromógeno y de peróxido de hidrógeno,
en donde la actividad peroxidasa da lugar a un cambio de color del
cromógeno que se puede detectar espectrofotométricamente a una
longitud de onda particular.
14. Ensayo según la reivindicación 13 en el que
el substrato cromogénico se selecciona entre 4-amino
fenozona, ácido
2-amino-4-hidroxibencensulfónico,
tetra metil benzidina, diclorhidrato de o-fenilen
diamina, o-dianisidina,
2-OH-3,5-diclorobencen
sulfonato sódico,
2,2'-azino-di(ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
(ABTS) y ácido 4-aminoantipirina cromotrópico.
15. Ensayo según la reivindicación 14 en el que
el substrato cromogénico es el ácido
4-aminoantipirina cromotrópico y el ensayo
comprende además el ácido
8-anilino-1-naftilen
sulfónico (ANS) y 4-iodofenol.
16. Ensayo según la reivindicación 1 que
comprende el inhibidor de unión a la proteina/el con reactivo
cromogénico ácido
8-anilino-1-naftilen
sulfónico (ANS) y el substrato cromogénico
4-aminoantipirina y fenol.
17. Equipo para su uso en un ensayo de
haptoglobina según una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes en el que el equipo comprende:
- i)
- hemoglobina
- ii)
- un detergente
- iii)
- un inhibidor de la unión a proteínas para la inhibición de la unión de la albúmina y/o otra(s) proteína(s) presentes en una muestra a la hemoglobina o hematina liberada de la hemoglobina;
- iv)
- un agente reductor efectivo contra los enlaces disulfuro o un agente caotrópico; y
- v)
- un cromógeno para su uso en la determinación del nivel de la actividad peroxidasa.
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